CN116333063A - 胸膜肺炎放线杆菌的三个候选抗原及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)三个候选抗原及其在制备胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒和亚单位疫苗中的应用。申请人通过联合使用细菌表面蛋白组学、反向疫苗学，结合噬菌体展示文库、免疫共沉淀、二代高通量测序等技术进行APP抗原蛋白的筛选，共获得3个胸膜肺炎放线杆菌候选抗原(PotA、SRP和FtsN)，这三个抗原具有很高的反应性和免疫原性，可用于APP的临床诊断和治疗，本发明的研究成果对于检测和防控胸膜肺炎放线杆菌具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于动物传染病防治与生物技术领域，具体涉及胸膜肺炎放线杆菌的3个候选抗原及其在临床诊断和疫苗研发中的应用。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起猪的一种高度传染性、接触性的呼吸道疾病，主要临床特征是急性出血性、纤维素性肺炎和慢性纤维素性、坏死性胸膜肺炎。由于高发病率和死亡率、平均日增重和饲料转化率的降低、屠宰损失和干预成本，该病对动物福利和经济生产具有重大影响。
胸膜肺炎的精准诊断对于防控该病具有重要意义。虽然市场上已有一些基于毒素ApxIV的商业试剂盒用于检测APP，但试剂盒成本较高，每个试剂盒检测的样品有限，极大限制了试剂盒检测的应用。若鉴定出新的候选抗原用于检测临床APP感染情况，一次纯化即可对样品进行大规模检测，不受试剂盒成本和样品的限制，对于疫病的精准诊断十分重要。
疫苗接种是防控胸膜肺炎的重要手段。然而，APP有19种血清型，开发有效的APP疫苗仍然是一个重大挑战。基于血清1、2和7型的三价灭活疫苗能够对同源菌株提供有效的保护，却对异源菌株效果较差。一些缺失APP毒素的减毒突变体活疫苗虽能对同源或异源菌株提供交叉保护，但仍需要提高其安全性和功效。克服这些限制的方法是使用在不同血清型之间高度保守的抗原来开发多价形式的亚单位疫苗，以提供对多种血清型甚至多种病原体的保护。研究人员根据毒素蛋白和外膜蛋白已经开发出商业化的APP亚单位疫苗PleuroStar APP和
APP，对部分血清型感染提供了良好的保护。然而，这些商业化的亚单位疫苗成本较高，需要注重对新工艺新方法的研究，不断寻找新的疫苗靶标，降本增效，提高产品质量。
因此，鉴定胸膜肺炎放线杆菌新的候选抗原对于临床诊断和疫苗研发将具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供新的APP候选抗原，为研发新型疫苗和诊断制剂提供靶标。
本发明的技术方案如下：
申请人首先通过细菌表面蛋白组学、反向疫苗学从APP中鉴定出若干个表面蛋白和分泌蛋白，然后将这些蛋白与已知的其它蛋白进行截短，随后针对这些截短片段设计引物并以APP基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物双酶切后与噬菌体载体臂连接并通过体外包装方式构建了细菌抗原噬菌体展示文库。接着，申请人运用免疫共沉淀、二代高通量测序技术从APP细菌全基因组水平进行高通量免疫原性抗原蛋白的筛选，一共筛选出16个能与血清结合的APP抗原。最后，通过血清反应和免疫验证，进一步筛选出其中有三个抗原具有血清反应能力且具有免疫保护效果。
这三个抗原分别是PotA、SRP、FtsN蛋白，它们的功能已被注释，分别为亚精胺/腐胺ABC转运体ATP结合蛋白，信号识别颗粒、激活间隔肽聚糖合成和细胞收缩的必需细胞分裂蛋白，氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。
申请人将编码上述三种蛋白的基因分别命名为HBS1_10、HBS1_15和HBS1_16，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。
然后通过大肠杆菌原核表达系统进行表达纯化，成功获得了3个蛋白。
以获得的3个蛋白作为包被抗原，经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测发现它们均能够区分APP的阳性和阴性血清，与商业化检测试剂盒检测结果一致。与不同种属细菌来源的蛋白进行同源性分析，发现FtsN蛋白与其他细菌同源性较低。此外，通过ELISA检测发现，三种蛋白与其它病原阳性血清交叉反应率较低，说明可以作为特异性检测APP的诊断靶标。
将3个蛋白与来源于其他APP不同血清型的蛋白进行同源性分析，发现它们在12种APP不同血清型中高度保守。将3个蛋白与佐剂混合后免疫动物，ELISA检测发现它们均能诱导高水平的体液免疫反应，且偏向于诱导Th2型免疫反应。筛选的三个蛋白PotA、SRP和FtsN能为小鼠提供免疫保护，从而为APP亚单位疫苗的研发提供了新的候选抗原。
综上，本发明所获得的三个蛋白、或编码任一个蛋白的基因、或含有任一个基因的表达载体、或含有任一个表达载体的宿主菌都可用于APP的检测和免疫治疗。
本发明在说明书中还提供了一种利用所述蛋白对APP抗体进行间接ELISA检测的具体实施例，当然，本发明的实施例不局限于此，例如，也可使用本发明所提供的蛋白或基因制备抗体，并利用抗体对APP抗原进行直接ELISA检测。
本发明在说明书中还提供了一种利用所述蛋白制备亚单位疫苗并对动物进行免疫保护的具体实施例。
本发明具有以下优点：
1、本发明首次运用表面蛋白组学、反向疫苗学，结合噬菌体展示文库、免疫共沉淀、二代测序等技术进行APP抗原蛋白的筛选，该筛选是在细菌全基因组水平上进行的一种高通量、无偏见、低成本的筛选，结果具有很高的准确性，为其它细菌抗原蛋白的筛选作出了示范。
2、本发明一次性筛选出三种APP抗原蛋白，经验证，这三种蛋白具有很高的反应性和免疫原性，可用于APP的临床诊断和治疗，本发明为此提供了三种新的抗原靶标。
附图说明
图1：三个目的基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。M为2kb的DNA marker；10、15和16分别表示PCR扩增的HBS1_10、HBS1_15和HBS1_16片段。
图2：三个目的基因表达质粒的PCR鉴定结果。使用2kb、5kb的两个DNA marker；10-1/-2、15-1/-2和16-1/-2分别代表菌落PCR鉴定的3个质粒。
图3：三个纯化蛋白的SDS-PAGE电泳条带。MW为高分子量蛋白marker。
图4：三个重组蛋白对APP感染血清的ELISA检测结果。A-C分别表示包被PotA、SRP和FtsN蛋白检测猪血清感染APP情况；D表示商业化试剂盒检测情况。
图5：三个蛋白与来源于其他不同种属细菌蛋白的同源性分析。
图6：三个蛋白与猪链球菌(A)和副猪嗜血杆菌(B)猪阳性血清的反应性。
图7：三个蛋白与来源于其他12种不同血清型胸膜肺炎放线杆菌蛋白的同源性分析。
图8：动物免疫流程图。
图9：三个蛋白免疫后的IgG抗体水平检测。
图10：间接ELISA检测IgG1和IgG2a的抗体滴度以及IgG亚型分析。
图11：三个蛋白免疫小鼠攻毒后的存活率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
申请人前期以噬菌体展示文库、免疫共沉淀、二代高通量测序等多种技术为手段，建立了一种在细菌全基因组水平上无偏见、高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法，该方法已于本专利申请日前申请了另一项中国发明专利，专利申请号为202310239675.0，名称为“一种细菌全基因组水平高通量筛选免疫原性抗原蛋白的方法”。
利用上述方法，申请人从猪链球菌的基因组中共筛选出多个免疫原性抗原蛋白。然而，对于临床分离的或基因组已知序列较少的细菌如APP来说，很难通过寻找核心基因的方法来对其进行抗原筛选。为此，申请人先通过联合使用生物素标记、胰酶消化、链霉亲和素富集和质谱分析的方法(即表面蛋白组学)鉴定出333个APP的表面蛋白，接着又通过反向疫苗学鉴定出APP的129个分泌蛋白，然后将这些表面蛋白、分泌蛋白和文献报道的7个蛋白分割成200个氨基酸的片段，每个片段中间重叠100个氨基酸，一共分割成1359个片段。然后将这些片段进行PCR扩增，扩增产物等量混合后进行双酶切处理，随后与酶切的噬菌体载体臂T7 10-3b连接，将连接产物通过体外包装方式包装成有感染性的噬菌体文库。最后，对增殖的噬菌体文库进行高通量测序分析，发现大于80％的片段都在文库中，说明文库构建成功。
为了便于后续噬菌体免疫沉淀测序分析，申请人制备了自然感染的小鼠康复血清，将血清与噬菌体文库共孵育，孵育结束后，加入protein A/G磁珠继续孵育，洗去未结合的噬菌体，加入ddH2O煮沸以释放与血清结合的噬菌体。最后通过两轮PCR扩增，将第二轮PCR扩增产物回收后进行高通量测序分析，从而筛选被显著富集的片段。
申请人通过细菌表面蛋白组学、反向疫苗学和BacScan技术一共筛选出16个与血清结合的APP抗原，分别将其命名为HBS1_01、HBS1_02……和HBS1_16。其中，三个抗原PotA(HBS1_10)、SRP(HBS1_15)和FtsN(HBS1_16)被证实具有与血清反应的能力且具有免疫保护效果。
PotA，即亚精胺/腐胺ABC转运体ATP结合蛋白，是ABC转运复合物PotABCD的一部分参与亚精胺/腐胺的导入，负责运输系统的能量耦合。信号识别颗粒(SRP)是一种核糖核蛋白颗粒，用于将含有信号肽的蛋白靶向到原核质膜或真核内质网膜上进行分泌或膜插入。FtsN是激活间隔肽聚糖合成和细胞收缩的必需细胞分裂蛋白，作用于膜的两侧，通过与细胞质中的FtsA相互作用以及与周质中的FtsQBL复合物相互作用。这三个蛋白或其同源家族蛋白未被报道过有免疫保护效果或作为诊断靶标的潜力，因此，申请人以本实验室分离的胸膜肺炎放线杆菌APP HBS1株为模板，设计引物，克隆了3个基因并表达了其编码的3个蛋白。通过血清学检测，发现这三个蛋白都具有检测胸膜肺炎放线杆菌的潜力。通过动物实验评估，结果发现三个蛋白也都能诱导高水平的体液免疫反应，且对小鼠提供部分免疫保护，从而研发胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗提供了新的候选靶标。
关键材料来源及说明：
胸膜肺炎放线杆菌APP HBS1株：胸膜肺炎放线杆菌血清1型HBS1株由本实验室分离并保存，全基因组序列已上传至NCBI数据库，基因登录号GenBank Accession：CP115971。
pET32a载体：由本实验室改造并保存。
大肠杆菌BL21(DE3)RIPL感受态：购自上海唯地生物技术有限公司。
Balb/c小鼠：购自华中农业大学实验动物中心。
序列表说明：
SEQ ID NO：1：胸膜肺炎放线杆菌PotA蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：2：胸膜肺炎放线杆菌SRP蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3：胸膜肺炎放线杆菌FtsN蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO：4：胸膜肺炎放线杆菌PotA蛋白编码基因(HBS1_10)的核苷酸序列；
SEQ ID NO：5：胸膜肺炎放线杆菌SRP蛋白编码基因(HBS1_15)的核苷酸序列；
SEQ ID NO：6：胸膜肺炎放线杆菌FtsN蛋白编码基因(HBS1_16)的核苷酸序列；
SEQ ID NO：7-8：扩增HBS1_10基因的上、下游引物序列；
SEQ ID NO：9-10：是扩增HBS1_15基因的上、下游引物序列；
SEQ ID NO：11-12：是扩增HBS1_16基因的上、下游引物序列。
实施例1：重组蛋白的制备
1.1PCR扩增目的片段
首先对3个蛋白的氨基酸序列进行跨膜区和信号肽预测，然后找到与三个蛋白氨基酸对应的核苷酸序列，去除信号肽序列，选择位于细胞膜外的区域，分别设计3对引物，引物包括保护性碱基、酶切位点以及与模板结合的核苷酸序列，将设计好的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
APP HBS1_10基因片段的扩增：上游引物10F：5’-CGCGGATCCATGGAACAGTTAGAACA-3’(SEQ ID NO：7；下划线为限制性酶切位点BamHI)；下游引物10R：5’-CCGCTCGAGGCAATCTTCATCGTTGAGTA-3’(SEQ ID NO：8；下划线为限制性酶切位点XhoI)。
APP HBS1_15基因片段的扩增：上游引物15F：5’-CGCGGATCCATGTTTGAAAACTTATCCG-3’(SEQ ID NO：9；下划线为限制性酶切位点BamHI)；下游引物15R：5’-CCGCTCGAGGCGTTTACCGAACATATTG-3’(SEQ ID NO：10；下划线为限制性酶切位点XhoI)。
APP HBS1_16基因片段的扩增：上游引物16F：5’-CGCGGATCCGAAAATGCGCCCGCACCG-3’(SEQ ID NO：11；下划线为限制性酶切位点BamHI)；下游引物16R：5’-CCGCTCGAGCATCGAAATAATTACACA-3’(SEQ ID NO：12；下划线为限制性酶切位点XhoI)。
挑取胸膜肺炎放线杆菌的单菌落至含5％ FBS和0.1‰NAD的TSB液体培养基中，37℃培养过夜，按照说明书提取APP的基因组。以基因组DNA为模板，通过PCR扩增胸膜肺炎放线杆菌的第10、15和16个片段，扩增产物的长度分别为1131bp，1408bp，820bp。
PCR反应扩增体系如下：模板DNA 1μL，高保真酶10μL，上下游引物各1μL，超纯水8μL。混合均匀后，设置PCR扩增程序，95℃预变性3min，95℃变性15s，50-60℃退火15s，72℃延伸15-30s，72℃后延伸5min，其中变性至延伸过程30个循环，16℃保存备用。
1.2构建表达质粒
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析(图1)，在相应位置切割目的片段，通过试剂盒回收3个基因扩增产物，分别用BamHI和XhoI进行双酶切处理，同时将pET32a空载体用相同的酶进行双酶切。酶切反应体系如下：10x快切酶buffer 5μL，BamHI 2.5μL，XhoI2.5μL，目的片段或载体2μg，ddH2O补齐至50μL。37℃酶切30-60min，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将切割的目的片段进行DNA回收，测定浓度。
将酶切后的产物分别和pET32a载体通过T4连接酶进行连接，连接反应体系如下：10x buffer 1μL，T4连接酶0.5μL，酶切片段与酶切载体按照摩尔比3:1计算所需的体积，ddH2O补齐至10μL。对照组不加酶切的片段，其余与实验组相同处理。16℃连接过夜，将连接产物分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，步骤如下：
1)从﹣80℃冰箱取4只DH5α感受态至冰上解冻3～5min，将3个5μL连接产物分别加入3只50μL感受态中，最后一只感受态加入未加酶切片段的产物，冰浴30min；
2)提前将水浴锅打开，调至42℃，冰浴结束后，将带有连接产物的感受态置于42℃水浴锅热激90s，立即放入冰上，冰浴2min；
3)每管加入无菌LB液体培养基500μL，37℃摇床孵育45-60min；
4)孵育结束后，室温5,000rpm/min离心3min，弃掉450μL上清液，用剩余液体重悬菌体，菌液加入含氨苄青霉素抗性的平板中，涂布棒涂均匀，37℃温箱倒置培养过夜。
比较四个平板上的菌落，发现对照平板上只有几个单菌落，说明载体双酶切完全，无自连、重组等现象发生。而三个实验组平板均长出了数百个单菌落，每个平板随机挑取2个克隆进行PCR鉴定，结果发现菌落PCR鉴定的大小与预计大小相同(图2)。按照小提质粒试剂盒提取6个质粒后送去公司测序，将测序结果与质粒图谱进行blast分析，发现6个质粒测序均正确，每个质粒各取一个，分别命名为：pET32a-HBS1_10，pET32a-HBS1_15和pET32a-HBS1_16。
1.3蛋白表达与纯化
将构建的3个重组质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)RIPL表达感受态中，转化步骤参考1.2转化步骤，热激时间改为45s，最后涂布至含氨苄青霉素和氯霉素的双抗平板中，37℃培养箱倒置培养过夜。
分别挑取阳性克隆于含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基37℃过夜培养，第二天以1:100的比例转接至新鲜LB培养基中，37℃培养2.5-3h至OD值达到0.6左右，提前将摇床温度降至30℃，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃诱导4h，7,000rpm/min离心10min收集菌体，并用PBS洗涤3次后，用binding buffer(50mM Tris，300mM NaCl，10mM咪唑，用浓盐酸调至pH为8.0)重悬菌体，将菌液进行低温高压破碎，34,000xg离心30min，收集上清，经过0.22μm孔径滤器过滤后，通过上样泵蠕动将上清液与Ni-NTA His树脂结合，用Washing buffer(50mM Tris，300mM NaCl，20mM咪唑，用浓盐酸调至pH为8.0)洗涤20min左右去除未结合的蛋白，最后通过Elution buffer(50mM Tris，300mM NaCl，400mM咪唑，用浓盐酸调至pH为8.0)洗脱与His柱结合的蛋白。
将大约5mL的洗脱液通过超滤管浓缩置换高浓度的盐和咪唑。选择超滤管过滤浓缩蛋白时，一般选择蛋白的约三分之一大小的超滤管，如蛋白为30～40kDa，可以选择10kDa的超滤管。超滤管用之前首先用超纯化离心洗涤2次，将蛋白加至超滤管中，4℃4,000rpm离心，离心时间根据不同蛋白而定。每次离心后，加入一定体积的GE buffer(20mM Tris，100mM NaCl，用浓盐酸调至pH为8.0)，用来置换蛋白中高浓度的盐和咪唑。大约离心置换约4-5次后，离心后的体积约为置换前体积的十分之一，即500μL左右，从超滤管中吸出蛋白，放至1.5mL离心管中，50μL/管进行分装，分装后放至-80℃冰箱保存。取10μL纯化的蛋白加入2.5μL 5x SDS sample buffer煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳，80v电泳30min，120v电泳90～120min。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色1h，然后脱色。结果发现3个全长蛋白均在预测位置出现目的条带，且蛋白条带清晰无明显降解现象(图3)，说明已成功纯化3个蛋白。
将纯化的三个蛋白用BSA定量，称取5mg BSA，加入5mL PBS，混匀后取40μL1μg/μL的BSA加入10μL蛋白上样缓冲液，分别取10μL纯化的三个蛋白分别加入2.5μL蛋白上样缓冲液，煮沸5min，BSA上样量分别为1.25μL、2.5μL、3.75μL、5μL和6.25μL，分别对应1～5μg BSA蛋白。三个蛋白上样量分别为1.25μL、2.5μL和3.75μL，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝染色和脱色，脱至背景干净即可。通过凝胶成像系统采集图片，将图片进行IPWIN分析，测定BSA和待测蛋白的IOD值，将BSA的IOD值与蛋白量作标准曲线，计算PotA浓度为2.3μg/μL，SRP浓度为4.2μg/μL，FtsN浓度为3μg/μL。
实施例2：鉴定临床诊断靶标
1.1ELISA检测猪血清胸膜肺炎放线杆菌感染情况
将用于感染血清筛选的3个蛋白定量后分别用包被液稀释至2μg/mL，酶标板每孔加入200ng蛋白，4℃包被过夜。用3％ BSA 37℃封闭1h后，弃净封闭液，洗涤5次，1:400稀释猪血清加入各孔中，37℃封闭1h。然后加入HRP标记的羊抗猪IgG(1:6,000稀释)，37℃封闭1h，弃净二抗，加入100μL TMB显色液，室温避光显色10min，最后加入100μL终止液终止显色反应，通过酶标仪测定各孔OD450的吸光值。商业化胸膜肺炎放线杆菌毒素IV检测试剂盒检测猪血清的步骤按照说明书进行操作。结果显示，26份猪血清中，检测16份为胸膜肺炎放线杆菌阳性血清，10份为阴性血清，检测结果与商业化试剂盒检测结果一致(图4)，说明这16份猪血清均感染了胸膜肺炎放线杆菌，同时还说明筛选的3个蛋白与16份猪阳性血清发生了特异性结合反应。
1.2候选抗原同源性分析
为了进一步分析3个蛋白能否全部作为特异性检测胸膜肺炎放线杆菌的靶标，将3个蛋白与来源于其他不同种属细菌的蛋白进行同源性分析。以其中一个蛋白为例，首先将蛋白的氨基酸序列粘贴至NCBI protein blast中的Enter accession number(s),gi(s),or FASTA sequence(s)方框处，Database选择Non-redundant protein sequences(nr)，Organism Optional处去除Actinobacillus(taxid：713)，选择Escherichia coli(taxid：562)、Glaesserella parasuis(taxid：738)、Streptococcus suis(taxid：1307)、和Pasteurella multocida(taxid：747)，进行BLAST分析。每个物种只选择一种代表性的细菌进行同源性分析，将同源性结果以热图形式展示，纵坐标为四种不同的细菌，横坐标为胸膜肺炎放线杆菌的三个候选蛋白。结果发现，PotA和SRP与来源于副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌和大肠杆菌蛋白的同源性均较高，与来源于猪链球菌蛋白的同源性较低。FtsN蛋白与来源于猪链球菌蛋白的同源性未检测到，与来源于其他三种不同细菌蛋白的同源性较低(图5)，说明FtsN蛋白可能作为特异性检测APP的靶标。
1.3检测与其他病原体猪阳性血清的交叉反应
仅仅根据同源性比对结果确定特异性检测胸膜肺炎放线杆菌的靶标证据不充分，为了初步应用3个蛋白作为特异性检测胸膜肺炎放线杆菌的靶标，将3个蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA检测其与猪链球菌和副猪嗜血杆菌猪阳性血清的反应性。结果发现，PotA、SRP和FtsN蛋白均不与猪链球菌和副猪嗜血杆菌猪的阳性血清发生交叉反应(图6)，说明这三个蛋白都可以作为检测APP的候选靶标，但结合与其他细菌同源性结果分析，FtsN更适合作为特异性检测APP的靶标。
实施例3：评估候选抗原的免疫保护效果
1.1 3个候选抗原同源性分析
为了研发具有交叉保护力的胸膜肺炎放线杆菌疫苗，将3个蛋白与来源于其他12种不同血清型胸膜肺炎放线杆菌的蛋白进行同源性分析。首先通过NCBI数据库下载12种已测通并拼接完整的APP全基因序列，从每个全基因组序列中找到这三个蛋白的同源蛋白。在NCBI blastp页面，勾选Align two or more sequences选项，上方框粘贴HBS1其中一个蛋白的氨基酸序列，下方框粘贴12种不同血清型的同源蛋白，点击BLAST分析。经过比对分析，发现3个蛋白在各种血清型中同源性均在99％至100％之间，高度保守(图7)。
1.2ELISA检测抗原的体液免疫反应
将20只小鼠随机分成4组，包括三组实验组和一组对照组，每组5只小鼠，将3个蛋白分别免疫雌性Balb/c小鼠，每只小鼠免疫50μg，根据免疫剂量以及蛋白浓度算出所用各个蛋白的体积，并与等体积矿物油佐剂ISA 201混合乳化完全，肌肉注射，对照组小鼠用等量的PBS与佐剂混合后免疫，每两周免疫一次，共免疫两次(图8)。
第二次免疫后两周，小鼠尾静脉采血并分离血清，采用间接ELISA法检测总的IgG抗体水平。封闭结束后，血清开始以1:400的比例进行2倍比稀释至18孔，37℃孵育1h，二抗加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:8,000稀释)，其余步骤与实施例2中1.1的ELISA步骤相同。结果发现，与对照组相比，FtsN蛋白诱导的IgG抗体水平最高，SRP次之，PotA虽然诱导的IgG抗体水平不如前两个蛋白高，但每个蛋白的终点滴度高达106(图9)。说明3个蛋白均诱导了高水平的体液免疫反应。
为了对IgG亚型进行分析，以三个蛋白为包被抗原，通过间接ELISA检测IgG1和IgG2a的抗体滴度。二抗将IgG换成HRP标记的羊抗鼠IgG1和IgG2a(1：3,000稀释)，其余步骤同上。结果发现，与对照组相比，三个蛋白与佐剂混合后诱导的IgG1抗体水平比IgG2抗体水平高(图10A、B)。以1为标准，对照组诱导的IgG1和IgG2a水平相当，而三个蛋白的IgG2a/IgG1比值小于1，说明这三个蛋白与佐剂混合后诱导高水平的IgG1抗体(图10C)。IgG1抗体与Th2型反应相关，也就是说这三个蛋白与佐剂混合后诱导偏向于Th2型免疫反应。
1.3攻毒试验评估三个蛋白对小鼠的免疫保护效果
第二次免疫后两周，对所有小鼠进行腹腔攻毒，菌株为血清1型HBS1，攻毒剂量为2.5x 107CFU。攻毒后连续观察7天，结果发现攻毒后6h，各组小鼠出现被毛耸立、聚团扎堆、食欲减退的现象。攻毒后12h，对照组小鼠全部死亡，PotA、SRP和FtsN组小鼠虽然精神状态较差，但均存活(图11)。攻毒后24h，SRP组小鼠存活2只，PotA和FtsN组小鼠各存活1只。从攻毒结果来看，新抗原PotA、SRP和FtsN蛋白均能对小鼠提供部分免疫保护，后续可以通过特定的抗原递送系统，将抗原运送给机体的免疫系统，诱导高效免疫应答从而增强单个蛋白的免疫保护效果，或者作为亚单位疫苗的成分之一。总之，三个抗原有望成为研发APP疫苗的重要候选靶标。
Claims (7)
1.胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)的3个候选抗原，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示。
2.编码权利要求1所述胸膜肺炎放线杆菌3个候选抗原中任一个抗原的基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4-6所示。
3.包含权利要求2所述3个基因中任一个基因的表达载体。
4.包含权利要求3所述3个表达载体中任一个表达载体的宿主菌。
5.权利要求1所述的蛋白，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的表达载体，或权利要求4所述的宿主菌在制备胸膜肺炎放线杆菌检测试剂盒中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述试剂盒是检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接ELISA试剂盒，试剂盒中含有权利要求1所述3个候选抗原中的任一个。
7.权利要求1所述的蛋白，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的表达载体，或权利要求4所述的宿主菌在制备胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗中的应用。
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