CN1163311A

CN1163311A - 制固定化蛋白质超薄膜反应器的和用其进行化学反应的方法

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Publication number: CN1163311A
Application number: CN96117293A
Authority: CN
Inventors: M·恩田; Y·利沃夫; K·有贺; T·国竹
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1995-10-19
Filing date: 1996-10-19
Publication date: 1997-10-29
Anticipated expiration: 2016-10-19
Also published as: AU709355B2; DE19642882A1; CN1121494C; DE19642882B4; US6107084A; JPH09107952A; JP2909959B2; AU6815796A

Abstract

一种用于制备固定化蛋白质超薄膜式反应器的方法，通过以下步骤来进行：将一种固相支持体交替浸入一种蛋白质水溶液和一种带有与所述蛋白质相反电荷的聚离子水溶液中，并在固相支持体上制备一种结构上受控制的单或多蛋白质层的超薄膜，它具有分子水平的精密度。一种用于底物化学反应的方法，通过以下步骤来进行：通过上述方法制备一种固定化蛋白质的超薄膜式反应器，该反应器由固相支持体上的多层蛋白质组成，并使用所得的固定化蛋白质超薄膜式反应器来引发一种底物分子的化学变化。

Description

制固定化蛋白质超薄膜反应器和用其进行化学反应的方法

本发明涉及一种用于制备固定化蛋白质超薄膜式反应器的方法，该反应器能够引起底物分子发生化学反应，特别是酶促反应，这些反应在蛋白质的超薄膜上进行，所述的蛋白质超薄膜装配在一种固相支持体上。

一般来说，在生物反应中，通过唯一的或协同的官能度或通过诸如酶这样的蛋白质的连接功能来进行高效力和高选择性的物理和化学过程。为了人工地模拟这些功能，即，为了研制一种诸如酶反应器或生物传感器这样的新分子器件，有必要使用一种多层蛋白质结构，将它以一种适当的顺序进行装配。在一种固相支持体上使蛋白质分子固定的方法大体上分成以下类；i)通过吸附或灌制将蛋白质直接固定在一种底物上，ii)将蛋白质从液体的表面转变成一种薄膜，例如，Langmuir-Blodgett法(LB法)和iii)通过交替与其它成分吸附而将蛋白质固定。

当应用这种方法时，将该方法中的一种蛋白质直接吸附在一种底物上，蛋白质层的厚度只限于这样的范围，即在该范围中，与固体底物的相互作用是有效的。因此，使用这种方法难以重复蛋白质的吸附，并且按照特定的顺序制备多种成分蛋白质膜是不可能的。

在灌制法中，能够将一种蛋白质水溶液本身，或者一种蛋白质水溶液和生物分子的混合物进行灌制，将它们的脂类层浇注在一种固相支持体上，使蛋白质分子固定，然后将溶剂蒸发。通过这种方法也难以按照理想的顺序来固定多种蛋白质。

作为一种以预定顺序装配分子层薄膜的精确制备性方法，LB法已被广泛使用。这种方法具有以下特征：将一种具有高溶解度的物质(诸如一种脂类)溶解在一种有机溶剂中，并使该溶液扩散在水面的表面上，然后将所得的薄膜转移到一种固体底物上。能够控制装配薄膜的顺序和它们的厚度。然而，由于典型的蛋白质在空气-水的界面处有变性和失活的倾向，因此，不能将这种方法广泛应用于多数种类的蛋白质。此外，在这种方法中，由于在水相中的分散，蛋白质很容易损耗。因此，特别是当使用昂贵的蛋白质时，这不是一种经济地令人满意的方法。再者，由于LB法存在很多问题，诸如生产力低，仪器中包括昂贵的设备且操作困难，因此，没有将这种方法认可成一种用于固定蛋白质的通用方法。

近来，为使蛋白质的变性减至最低程度而提出了下述方法：将一种由脂类或类似物包裹的酶溶解在一种有机溶剂中，然后将必需的量扩散至水中。通过这种方法获得的未来的膜是脂类分子的致密填充物，所述的脂类分子可以干扰底物扩散至膜中。因此，这种方法不适用于一种酶促反应系统。有一个报导中指出在将一种用LB膜来固定葡糖氧化酶(GOD)的情况中，底物或产物扩散困难妨碍了反应过程的进展。LB膜的装配一般只限于一种平坦的和非多孔的支持体，并且没有将它认可成一种用于在不同类型且功能不同的支持体上固定蛋白质的合适方法。

通过与其它成分交替吸附蛋白质，并通过将蛋白质层层固定，按照预定顺序固定不同种类的蛋白质已成为可能。近来，已经报导了有关这种方法的几个具体实例。通过使用一种特异性配体(诸如生物素/亲合素)聚集多(两)种蛋白质是这种方法的一个公知具体实例。然而，这需要通过很大努力来标记蛋白质，并且由于这种方法仅能应用于有限的蛋白质组合物，因此还不能说它是一种普及的方法。此外，提出了通过与磷酸钌或极性两亲合物(bolaamphiphiles)的静电相互作用来交替吸附蛋白质的方法。然而，由于在这种方法中，蛋白质间的连接成分过于刚性，因此装配的层数非常局限并且能够应用的蛋白质只限于特异的种类。即，通过所述的方法，难以按照预定的顺序来固定必需的蛋白质种类，这些方法不适于制备使用多种类蛋白质的酶促反应系统。

进一步来说，近来已经公开了一个报导，它揭示了通过使用一种产物来固定蛋白质的方法，所述的产物是通过结合一种称作双阳离子剂(boladication)(在两端是阳离子并能与阴离子蛋白质结合)的刚性表面活性剂样物质来生产(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1994，1297-1298)。由于双阳离子剂(baladication)太坚硬，因此作为底物，不能将它很容易地渗入一种蛋白质基体。所以，认为这种方法具有缺陷。首先，生产的反应器与反应底物的反应速度慢，第二，通过使用双阳离子剂(baladication)而能够固定的蛋白质只限于阴离子蛋白质。

本发明的发明人已经进行了有助于改进常规方法缺陷的充分研究，并且发现了一种按照一种理想的顺序固定和装配多种类不同蛋白质的方法，同时不伴随蛋白质分子层的变性，该方法可以引发一种与底物分子的化学反应，从而完成本发明。即，本发明人发现通过在蛋白质带电荷的条件下装配蛋白质，例如，在pH值远离等电点的条件下，不管蛋白质的种类如何，能够获得按预定顺序装配的超薄蛋白质膜。于是，本发明的目的是提供一种用于制备固定化蛋白质超薄膜式反应器的方法，该反应器可以引发底物分子的化学反应，特别是酶促反应。并且本发明的另一个目的是提供一种方法，它通过使用一种固定化蛋白质超薄膜反应器的生产方法而用于一种化学反应。

通过一种方法可以达到上述目的，该方法用于制备一种固定化蛋白质超薄膜式反应器，它由以下步骤组成：将一种固相支持体交替浸入一种蛋白质水溶液和一种有机聚离子的水溶液中，所述的有机聚离子带有与所述蛋白质相反的电荷；并在所述的固相支持体上制备一种结构上受控制的蛋白质超薄膜，它具有分子水平的精密度。上述目的还可以通过一种方法来达到，该方法用于制备一种固定化蛋白质超薄膜式反应器，它包括以下步骤：将一种具有带电荷表面的固相支持体浸入一种带有与所述支持体相反电荷的聚离子或蛋白质水溶液中，通过中和和再饱和使表面电荷转换，然后，将这种具有带电荷表面的固相支持体浸入一种重新带有与所述支持体相反电荷的聚离子或蛋白质水溶液中，通过中和和再饱和使表面电荷转换，通过重复所述的步骤，制备一种超薄膜，其中至少装配有两种蛋白质。

本发明的咖一个目的可以通过一种方法来达到，该方法用于一种底物分子的化学反应，它包括以下步骤：使用上述方法制备一种固定化蛋白质的超薄膜式反应器，该反应器由固相支持体上的多层蛋白质组成，并使用所得的固定化蛋白质超薄膜式反应器来引发一种底物分子的化学变化。此外，所述的目的通过一种方法可以达到，该方法用于一种底物分子的化学反应，它包括以下步骤：在一种支持体上固定一种蛋白质的薄膜，所述的支持体具有分离功能，并且将一种底物和化学反应产物分离，且所述的方法，其中蛋白质是一种酶。

本发明的这些目的将通过下面描述的本发明优选的实施例，参照附图加以阐述，其中：

图1是一种图解表示法，它表示随实施例1的蛋白质吸附时间进展，石英晶体微量天平的频率变化。

图2是一种图解表示法，它表示随实施例3和4的蛋白质吸附时间进展石英晶体微量天平的频率变化。

图3是实施例5的量器示意图。

图4是实施例5的紫外光谱的一种图解表示。

图5是一种图解表示法，它表示实施例6-10的吸附变化。

图6是实施例10-15的转化率变化的一种图解表示法。

图7是实施例16和17的转化率变化的一种图解表示法。

图8是实施例20-22的紫外光谱的一种图解表示法。

图9是实施例23-25中葡萄糖和产生H₂O₂的量的一种图解表示法。

在本发明中，制备一种蛋白质分子的超薄膜是可能的，所述的蛋白质分子具有预定的层数和分子水平的厚度，而能保持原有活性。所述超薄膜的制备是基于下述原理。当将一种带有与蛋白质相反电荷的固相支持体浸入一种蛋白质水溶液时，通过静电作用将蛋白质吸附在固相支持体的表面。在这时，蛋白质不仅能中和支持体表面带有的电荷，而且还能过量地吸附电荷，从而，将表面重新带有相反电荷。然后，将它浸入带有与所述蛋白质相反电荷的聚离子水溶液中。因此，通过中和和过量吸附该聚离子，一种新的相反电荷出现在表面上。这种蛋白质和聚离子交替吸附的过程能够无限地持续进行。由于电荷的饱和，在每一步骤中过量吸附的量受到限制，因此能够在每一步骤固定蛋白质或有机聚离子的恒定量。

正如在上述制备原理所清楚说明的，使用一种天然状态的蛋白质溶液是可能的。从而能够避免蛋白质的变性。鉴于用来固定蛋白质的常规公知方法有时导致蛋白质变性，由此妨碍蛋白质的活性，因此，可以说用于本发明蛋白质固定的方法是一种极好的方法，它可用于一种酶促反应系统的制备。

此外，鉴于蛋白质的吸附是基于静电作用且每种蛋白质都有一些表面电荷，因此可以说这种方法是一种能够广泛应用于水溶性蛋白质的方法。由于通过溶液的pH能够控制蛋白质的表面电荷，因此通过选择一种具有适当pH的蛋白质水溶液和一种带有相反电荷的适合聚离子，许多种类蛋白质的固定是可能的。这就是说，本发明不局限于制备用于特殊反应的酶促反应系统，而且能够广泛应用于顺序反应。

此外，根据本发明，能够按照预定顺序固定多种类蛋白质，并通过不同蛋白质官能度的组合物来制备一种具有极好反应性的组合的酶促反应系统。

进一步来说，由于用来固定蛋白质的软聚离子能够改变它的结构以适应蛋白质分子的形状，因此与一种诸如脂类这样的刚性成分的情况相比，底物或膜中产物的扩散是非常容易的。这是本发明的另一个值得注意的优点，它超过了那些由刚性成分制成的物质。

另外，这种用于制备本发明的蛋白质薄膜的方法可以通过一种简单的过程在短时间内进行，所述的简单过程，其特征仅在于将一种支持体浸入一种蛋白质或有机聚离子的水溶液中，并且不需要特殊的设备。因此，能够选择许多不同类型的固相支持体，且能够将诸如分离功能这样的附加功能加入到酶促反应系统中。

下面对本发明做更具体地说明。本发明的有机聚离子表明一种聚合物在其主或侧链上具有带电荷的官能团。一般来说，能够提及的聚阴离子化合物具有一种带有负电荷的官能团，例如磺酸，硫酸和羧酸，能够使用的具体实例有：聚苯乙烯磺酸钠(PSS)，聚乙烯硫化钠(PVS)，葡聚糖硫化钠，软骨素硫化钠，聚丙烯酸(PAA)，聚甲基丙烯酸(PMA)，聚马来酸和聚富马酸。能够提及的聚阳离子化合物具有一种带有正电荷的官能团，例如，季铵基和氨基，能够使用的具体实例有：聚乙烯亚胺(PEI)，盐酸聚丙烯酰胺(PAH)，聚二烯丙基二甲铵氯化物(PDDA)，聚乙烯吡啶(PVP)和聚赖氨酸。所有这些有机聚离子的特征在于水溶性或可溶解于一种水和有机溶剂的混合物中。另外，还有可能使用导电的聚合物，诸如聚(苯胺-N-丙烷磺酸)(PAN)这样的官能聚离子，几种类型的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的生物聚合物，以及诸如果胶这样的带电荷的多糖生物聚合物。

一般来说，由于任何水溶性蛋白质的表面是带有电荷的，因此能够将它们用在本发明中，而与其它特性无关。例如，能够使用葡糖氧化酶(GOD；分子量186000，等电点4.2)，过氧化物酶(POD；分子量42000，等电点7.2)，葡糖淀粉酶(GA；分子量100000，等电点4.2)。乙醇脱氢酶(ADH；分子量100000，等电点9)，心肌黄酶(DA；分子量700000，等电点4)，细胞色素(Cyt；分子量12400，等电点10.1)，溶菌酶(Lys；分子量14000，等电点11)，组蛋白f3(His；分子量15300，等电点11)，肌红蛋白(Mb；分子量17800，等电点7.0)和血红蛋白(Hb；分子量64000，等电点6.8)。

作为固相支持体，可以使用表面带有电荷的物质，诸如银(阴离子表面)，玻璃，石英(阴离子表面)和表面已带电荷的聚合物薄膜，或者使用能够引入电荷的物质，诸如金这样的物质(通过疏基丙酸或其它物质的吸附能够将电荷引入到表面上)，以及各种类型的电极。此外，这种方法在理论上是基于简单的吸附，因此，对于固相支持体来说，不需要固定成平滑样，且能够选择各种材料用于固相支持体。例如：除了一种平滑的固体底物外，还能够使用一种多孔的固体底物，诸如滤器，硅胶或树脂大理石粉末。

基本上将蛋白质和聚离子用在水溶液中，然而，能够将有机溶剂以各种比例混合。每种溶液的浓度取决于蛋白质和有机聚离子的溶解度，由于吸附过程是基于固定化电荷的中和和再饱和，因此不需要精确地配制浓度。典型的浓度是：1mg/ml表示蛋白质溶液，1-3mg/ml表示有机聚离子溶液。然而，并不限制在这一范围内。另外，通过加入HCl水溶液或通过使用一种缓冲剂，将溶液的pH值调整到蛋白质或聚离子充分带有电荷的pH水平。

在第一步骤时，将一种表面带有电荷的固相支持体交替浸入两种类型的有机聚离子(聚阳离子和聚阴离子)溶液中，通过进行这一步骤，将一种聚离子的柔性薄层固定在所述固相支持体的表面。对于聚离子薄层来说，如果省略这一固定程序，那么下面的蛋白质超薄膜的制备是永远不可能进行的。将带有与蛋白质(是最终吸附剂)相反电荷的聚离子薄膜固定在最外层的表面。然后，重复进行以下步骤：浸入一种蛋白质水溶液，用水洗涤；浸入一种聚离子水溶液并用水洗涤，制备出蛋白质多层超薄膜。普通的浸入时限是约10-20分钟，然而，在这种过程中，由于能够得到一种吸附平衡，因此，不需要精确固定的浸入时限。

如果上述方法制备的蛋白质超薄膜用于一种酶促反应系统时，有必要将一种固定有薄膜的固相支持体浸入一种含有底物的水溶液中，但是制备过程不需要特殊的设备。此外，经过使得一种底物的水溶液通过一种多孔支持体，能够引发反应，所述的多孔支持体上固定有一种蛋白质薄膜。

实施例

参照下面的实施例将更清楚地理解本发明。

实施例1，2

作为实施例1和2，进行固定实验，以此证明将蛋白质层重复地并层层不断地加以固定。在覆盖有银电极的石英晶体微量天平表面上，将一种蛋白质超薄膜固定。石英晶体微量天平是一种公知的微量天平，通过测定频率移动，这种装置能够测定所固定的量，其精密度可达到10-9g的水平。由于部分氧化作用，银电极的表面(表面积约是0.2cm²)带有负电荷。在第一个步骤时，将少量聚阳离子和聚阴离子的前体层交替固定在银电极石英晶体微量天平上，然后将一种蛋白质吸附在所述的表面上。在实施例1中，测定PSS和POD的交替吸附量，作为实施例2，测定PEI和GOD的交替吸附量。图1表示的石英晶体微量天平的频率变化是基于实施例1的吸附。如图1表示：除了最初的少数层外，在重复吸附时，每层的吸附量几乎是恒定的。即，这一结果表示：根据本发明，在每一固定步骤时，能够观测到恒定量的蛋白质吸附。并且计算出在每一固定步骤时蛋白质吸附的量以符合蛋白质单分子层的吸附。此外，从图1中，还可以判明，能够反复不断地重复这些交替吸附过程，直到层数符合所需要的一种酶促反应系统为止。

实施例3，4

作为实施例3和4，将多种蛋白质固定在一种薄膜中。在实施例3中，在一种前体层上制备一种薄膜，它由PEI和GOD的交替层构成，然后将PSS和POD交替吸附在所述的薄膜上。作为实施例4，按照相反的顺序将来自实施例3的两种蛋白质进行装配。即，在实施例4中，在一种前体层上制备一种薄膜，它由交替吸附的PSS和POD构成，然后将PEI和GOD交替吸附在这种薄膜上。所得结果在图2中表示。在这一图中清楚地表明：用于制备每一蛋白质层的过程不会受到制备另一蛋白质层的过程影响，并且实施例3和4相应部分的频率变化是同样的。这一事实表明能够独立地制备蛋白质层，并表示能够按照预定顺序装配蛋白质层。这是一项很重要的技术，它可用来建立一种对于持续的化学变化具有高反应的极好的酶促反应系统。

实施例5

在实施例5中，制备一种由一种单层的GOD单层组成的蛋白质薄膜。将这种薄膜浸入一种水溶液中，该水溶液包括葡萄糖，POD和氧化还原染料DA67，并引发一种酶促反应。这些化学反应用下面的反应式表示，在图3中说明了测定系统的示意图表示法。在反应中，作为反应的进展，将DA67氧化，并在607nm和665nm处检测到吸收的增加。图4表示本实施例的光谱变化。随着时间的进展，这些吸收峰增加得很快，这表明反应通过固定在薄膜中的GOD活性介质而平稳地进行，并且还表示GOD保持了它的活性。

实施例6-9

在实施例6-9中，按照与实施例5中类似的方式制备一种GOD固定的薄膜(单层膜)。将所述的薄膜浸入许多种溶液中，并证明图4中表示的光谱变化是基于通过固定的GOD催化的反应。将这些结果概括在图5中。在图5中，表示了在665nm处监测吸收的监测结果。在实施例6中，将一种POD(0.0004mg/ml)和DA67(0.0001mg/ml)的溶液保温5分钟(图5，从步骤0至A)。在这一期限中，没有检测到吸收的增加，并且证明DA67的自发氧化作用不影响吸收的增加。将GOD固定的薄膜浸入(实施例7，图5从步骤A至步骤B)溶液中。在这一步骤中，也没有检测到吸收的增加，这表明仍然可以忽略DA67的自发氧化作用。这由在溶液中缺少葡萄糖来解释，所述的葡萄糖是一种GOD的底物。可以清楚地理解除非由GOD引发一种葡萄糖的氧化作用，否则不能引发整个反应(图3)。作为下一个步骤，在从溶液中除去GOD固定的薄膜后(图5步骤B)，将0.01mg/ml葡萄糖加入到溶液中(实施例8，图5步骤C)。由于在溶液中缺少GOD，所以在这期间几乎没有检测到吸收的增加(图5，步骤C至D)。这些结果表示，在GOD固定薄膜的第一次浸入步骤期间，GOD分子不会泄漏到溶液中(实施例7)，证明了在薄膜中固定的GOD的稳定性。作为实施例9，将固定GOD的薄膜浸入一种水溶液(包括葡萄糖，POD和DA67)中。将这一过程重复两次。即，将薄膜在图5的步骤D处浸入并在步骤E处除去。从图5的观测中，能够清楚地理解仅在GOD薄膜存在时可以检测到吸收的增加，且当将薄膜从溶液中除去时，吸收不会增加。这一事实清楚地说明所观测的吸收增加是基于由GOD催化的反应。将这一实验重复两次，且结果表示一种类似的吸收增加。因此，阐明了用于将GOD薄膜再循环的可能性。最后，作为实施例10，分别制备一种固定GOD的薄膜(双层膜)，并且将它浸入相同的底物水溶液中(图5，步骤F)。在这种情况中，观测到两倍于在实施例9中从单层膜中观测到的速率，这表明反应速率与薄膜中GOD的层数成正比。这一结果还表示甚至固定在最内层和远离支持体表面的GOD参与了反应。

实施例10-15

作为实施例10-15，进行下面的实验。将单层固定GOD的薄膜(实施例10和11)，双层固定GOD的薄膜(实施例12和13)和三层固定GOD的薄膜(实施例14和15)浸入一种水溶液中，该水溶液包括葡萄糖(0.01mg/ml)，POD(0.0004mg/ml)和DA67(0.004mg/ml)，并测定反应速率。结果见图6，其中转化率在竖轴上表示。通过实施例10和11，实施例12和13以及实施例14和15，在相同条件下重复两种实验，表现出良好的重现性。这一良好的重现性表明，当将这种蛋白质薄膜用作一种传感器时，能够获得精确的响应值。当比较不同层数的样品时，反应速率随层数的增加而成比例地明显增加。这一事实表明固定在薄膜最内层的GOD如实施例9所示而完全参与了反应。这一事实还表明底物分子或产物分子的扩散不会限制速率。当通过不同方法固定蛋白质时，有许多报导公开了在一种膜中，底物分子的扩散限制了反应性。通过使用经这种方法固定的蛋白质薄膜解决了所述的难题，将这一原因解释如下。因为固定蛋白质的聚离子的离子是柔性的，所以它们不会形成一种高密度结构和具有几乎是分子厚度的大小，基本上能够忽略底物分子扩散的距离。

实施例16

作为实施例16，制备一种POD薄膜(单层膜)并将它浸入一种底物溶液(0.2wt％ H₂O₂和0.08mg/ml的DA67)中。反应的进展见图(7a)。转化率随时间增加，且POD的活性没有丧失。显然可以理解由一种POD催化的H₂O₂还原反应引发了这一反应。

实施例17

在实施例17中，制备多成分蛋白质，它由在POD薄膜(双层膜)上叠层的GOD薄膜(双层膜)装配，并将所述的多成分蛋白质浸入一种葡萄糖1(0.01mg/ml)和DA67(0.008mg/ml)的水溶液中。反应的进展见图(7b)，通过观测该图得知，转化率随时间增加。这一事实表明，在图3所示的复杂酶促反应中，当将GOD和POD固定在薄膜中时，能够引发一种反应。即，这一事实说明在一种薄膜中能够进行连续的酶促反应，在所述的薄膜中固定有多种蛋白质。

实施例18和19

在实施例18和19中，如在实施例5中那样制备薄膜，将其中一种贮存在空气条件中，而将另一种保存在pH7的缓冲水溶液中，时间是2个月。2个月后，按照类似于实施例5的方式测定蛋白质的活性。所得结果表明，在上述两种贮存条件中，蛋白质保持了几乎100％的活性。这些结果表明了蛋白质超薄膜反应的长期稳定性。

实施例20-22

在实施例20中，将一种GOD薄膜(四层膜)固定在一种多孔滤器上，并将1ml 10wt％的葡萄糖水溶液通过它过滤。然后，将POD/DA67加入到所述的滤液中，并测定紫外吸收光谱。结果见图8。可以确定表示反应进展的紫外吸收。即，这一实施例说明能够使用一种多孔滤器作为固相支持体而用于一种酶促反应系统。在实施例21中，不使用聚离子，直接将一种多孔滤器浸入一种GOD水溶液中。在实施例22中，不用任何改变，制备一种多孔滤器，实验在与实施例20中的相同条件下进行。结果见图8，这表明在实施例21和22的所有情况中，反应都没有进展。能够理解通过实施例21或22的方法，没有将GOD固定在一种多孔滤器上，因此反应没有进行。

实施例23-25

在实施例23中，将一种葡糖淀粉酶(GA)和GOD的多成分薄膜固定在一种多孔滤器上，并将0.25％的淀粉水溶液通过它过滤。检测葡萄糖和产生的H₂O₂的量(图9)。GA是一种酶，它能将淀粉转化成葡萄糖，葡萄糖是GOD的底物。在实施例23中，将十层交替装配的PEI/PSS装配在一种滤器的表面上，所述的滤器上叠加有一种GOD薄膜前体，并将GA薄膜固定在最外层。实施例24与实施例23类似，但GOD和GA的装配顺序相反，即，GA位于滤器的最内层上而将GOD层固定在最外的表面。在实施例25中，制备一种薄膜，在该薄膜中，同时在一层中固定有GOD和GA。将所得结果概括在图9中，从该图中，显然看出仅在一种反应器上有效地引发了反应，该反应器由实施例23的方法制成，在其最外的表面有一GA层。将这一事实解释如下，即，淀粉是一种GA的底物，它与GA层接触并产生葡萄糖，通过在内层中定位的GOD将葡萄糖氧化。反之，在实施例24的薄膜情况下，能够解释为既然将GA(它的底物是淀粉)定位在内层，那么它没有机会接触淀粉且不会引发整个连续的酶促反应。此外，在实施例25的情况下，因为在固定化过程中，仅有一种蛋白质具有优先权，所以不会引发需要两种蛋白质的连续反应。

这些结果表明，根据反应的顺序进行蛋白质薄膜的装配对于制备一种有效的连续酶促反应系统是必不可少的。在如本发明公开的固定化蛋白质的方法中，可以控制蛋白质的装配顺序，该方法区别于常规的蛋白质固定方法。在常规的方法中，蛋白质固定顺序的控制是困难的。通过碘淀粉反应来分析在实施例23-25中获得的滤液，结果显示，无论反应进展如何，在滤液中没有检测到淀粉底物。这一结果表明，淀粉底物聚合物没有通过用作固相支持体的多孔滤器而泄漏到滤液中。即，在这一系统中，在刚刚反应完后，就将产物从底物中分离。

尽管将所述的实施例看成是本发明中出现的优选实施例，但底物分子的化学变化是由于蛋白质薄膜作为由交替吸附法固定的催化剂而产生。所述的底物分子限于蛋白质。并且通过使用一种薄膜在薄膜中进行一种复杂的酶促反应是可能的，所述的薄膜中固定有多种蛋白质。此外，通过使用一种作为固相支持体的多孔滤器，在刚刚反应完后，就能将反应产物从底物中分离。本发明的方法适用于广泛的各种蛋白质的固定，因此，有可能研制各种组合物的人工反应器，它可以模拟酶促系统，或者有可能研制新型的传感器系统，它基于酶反应。

Claims

1 一种用于制备固定化蛋白质超薄膜式反应器的方法，由以下步骤组成：将一种固相支持体交替浸入一种蛋白质的水溶液和一种聚离子的水溶液中，所述的聚离子带有与所述的蛋白质相反的电荷，并且在所述的固相支持体上制备一种结构上受控制的超薄蛋白质膜，它具有分子水平的精密度。

2 一种用于制备固定化蛋白质超薄膜式反应器的方法，包括的步骤有：将一种具有带电荷表面的固相支持体浸入一种带有与所述支持体相反电荷的聚离子或蛋白质的水溶液中，通过中和和再饱和使表面电荷转换；然后将具有相反电荷表面的固相支持体浸入一种重新带有与所述支持体相反电荷的聚离子或蛋白质的水溶液中，通过中和和再饱和使表面电荷转换；重复所述的步骤；并制备一种超薄膜，在该膜中至少装配有两种蛋白质。

3 一种用于底物分子化学反应的方法，包括的步骤有：使用权利要求1和2的方法制备一种固定化蛋白质的超薄膜式反应器，该反应器由固相支持体上的多层蛋白质组成，并且使用固定化蛋白质的超薄膜式反应器来引发底物分子的化学变化。

4 一种用于底物分子化学反应的方法，包括以下步骤：通过使用权利要求1和2的方法，将一种蛋白质薄膜固定在一种支持体上，该支持体具有分离功能，并且分离化学反应的底物和产物。

5 用于权利要求1，2，3和4的底物分子化学反应的方法，其中蛋白质是一种酶。