CN116328050A

CN116328050A - 基于网状补片的原位可交联组合物

Info

Publication number: CN116328050A
Application number: CN202310289961.8A
Authority: CN
Inventors: 奥莱恩·普里斯-布鲁姆; 盖伊·托莫; 阿米尔·哈迪德; 阿龙·波拉克维奇; 阿里尔·麦兹勒; 丹尼斯·克拉马连科; 丹妮拉·古黛尔; 丹尼·约苏弗
Original assignee: Lifebond Ltd
Current assignee: Lifebond Ltd
Priority date: 2016-05-09
Filing date: 2017-05-09
Publication date: 2023-06-27
Also published as: JP2019520112A; US20220126000A1; EP3454781A1; JP2022095767A; US20190125936A1; JP7143222B2; WO2017195198A1; CN109475400A; JP2024026313A; EP3454781A4

Abstract

本申请涉及基于网状补片的原位可交联组合物。根据至少一些实施方案的包括可交联蛋白或多肽和一种或更多种交联材料的基于网状补片(mesh)的组合物。

Description

基于网状补片的原位可交联组合物

本申请是申请日为2017年05月09日，申请号为201780042792.0，发明名称为“基于网状补片的原位可交联组合物”的申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及涂覆的外科用网状补片(mesh)，而涂层基于包括可交联蛋白和诱导可交联蛋白交联的酶的交联组合物，其被涂敷有背衬层。

发明背景

可在原位形成凝胶的生物材料对各种应用是有用的。在许多情况下，原位凝胶形成材料被用作用于受控药物递送的可注射基质或用于组织工程的可注射支架。(GutowskaA,Jeong B,Jasionowski M.Anat Rec 2001,263,342-349.Silva EA,Mooney DJ.J ThrombHaemost 2007,5,590-8.Mahoney MJ,Anseth KS.J Biomed Mater Res A 2007,81,269-78)原位凝胶形成材料还可用作粘合剂以在生理环境中粘结组织或密封泄漏(气体或流体)。

由于对更换或补充用于伤口闭合的缝线的渴望(Glickman M,Gheissari A,MoneyS,Martin J,Ballard J.Arch Surg 2002,137,326-31；discussion 332.Pursifull NF,Morey AF.Curr Opin Urol 2007,17,396-401)、朝着微创和美容手术的趋势(TissueAdhesives in Clinical Medicine；2nd ed.；Quinn,J.V.,Ed.；BC Decker:Hamilton,Ontario Canada,2005.Tissue Glue in Cosmetic Surgery；Saltz,R.；Toriumi,D.M.,Eds.；Quality Medical Publishing,Inc.,:St.Louis,Missouri,USA2004)以及对紧急止血的需要(Pusateri AE,Holcomb JB,Kheirabadi BS,Alam HB,Wade CE,Ryan KL.Journalof Trauma-Injury Infection and Critical Care 2006,60,674-682.Acheson EM,Kheirabadi BS,Deguzman R,Dick EJ,Holcomb JB.Journal of Trauma-InjuryInfection and Critical Care 2005,59,865-874.Kheirabadi BS,Acheson EM,DeguzmanR,Sondeen JL,Ryan KL,Delgado A,Dick EJ,Holcomb JB.Journal of Trauma-InjuryInfection and Critical Care 2005,59,25-34)，对软组织粘合剂的兴趣正在增长。

原位凝胶形成可以通过多种方法开始。凝胶形成的化学方法包括通过接触引发聚合，如在氰丙烯酸盐粘结剂中的，或外部刺激例如光引发。此外，凝胶形成可以通过使用低分子量交联剂例如戊二醛或碳二亚胺(Otani Y,Tabata Y,Ikada Y.Ann Thorac Surg1999,67,922-6.Sung HW,Huang DM,Chang WH,Huang RN,Hsu JC.J Biomed Mater Res1999,46,520-30.Otani,Y.；Tabata,Y.；Ikada,Y.Biomaterials 1998,19,2167-73.Lim,D.W.；Nettles,D.L.；Setton,L.A.；Chilkoti,A.Biomacromolecules 2008,9,222-30.)或在聚合物上的活化取代基(Iwata,H.；Matsuda,S.；Mitsuhashi,K.；Itoh,E.；Ikada,Y.Biomaterials 1998,19,1869-76)化学地交联预先形成的聚合物来实现。

除了化学方法之外，凝胶形成还可以通过使用自组装肽的物理方法(Ellis-Behnke RG,Liang YX,Tay DK,Kau PW,Schneider GE,Zhang S,Wu W,So KF.Nanomedicine2006,2,207-15.Haines-Butterick L,Rajagopal K,Branco M,Salick D,Rughani R,Pilarz M,Lamm MS,Pochan DJ,Schneider JP.Proc Natl Acad Sci U S A 2007,104,7791-6.Ulijn RV,Smith AM.Chem Soc Rev 2008,37,664-75)来实现。

最后，已经基于来自海洋粘合剂例如贻贝胶的交联组分(Strausberg RL,LinkRP.Trends Biotechnol 1990,8,53-7)或如在纤维蛋白密封剂中的血凝固(Jackson MR.AmJ Surg 2001,182,1S-7S.Spotnitz WD.Am J Surg 2001,182,8S-14S Buchta C,HedrichHC,Macher M,Hocker P,Redl H.Biomaterials 2005,26,6233-41.27-30)来研究引发凝胶形成的生物方法。

各种仿生方法也已被考虑用于原位凝胶形成。在这些方法中，聚合物交联和凝胶形成在生物学中发现的交联操作之一之后被建模。可能吸引最大的技术兴趣的生物模型是在潮湿条件下凝固的贻贝胶(Silverman HG,Roberto FF.Mar Biotechnol(NY)2007,9,661-81.Deacon MP,Davis SS,Waite JH,Harding SE.Biochemistry 1998,37,14108-12)。贻贝胶的交联通过粘性蛋白的酚(即多巴)残基到反应性醌残基的酶促转化来引发，该反应性醌残基可以经历随后的蛋白间交联反应(Burzio LA,Waite JH.Biochemistry 2000,39,11147-53.McDowell LM,Burzio LA,Waite JH,Schaefer JJ.Biol Chem 1999,274,20293-5)。用作技术模型的第二生物交联操作是在血凝固期间出现的转谷氨酰胺酶催化反应(Ehrbar M,Rizzi SC,Hlushchuk R,Djonov V,Zisch AH,Hubbell JA,Weber FE,LutolfMP.Biomaterials 2007,28,3856-66)。用于原位凝胶形成的仿生方法已经研究了因子XHIa或其他组织转谷氨酰胺酶的使用(Sperinde J,Griffith L.Macromolecules 2000,33,5476-5480.Sanborn TJ,Messersmith PB,BarronAE.Biomaterials 2002,23,2703-10)。

一种特别感兴趣的用于原位凝胶形成的仿生方法是通过钙不依赖性的微生物转谷氨酰胺酶(mTG)进行的明胶的交联。mTG催化与因子XIIIa类似的交联反应，但是微生物酶的活性既不需要凝血酶也不需要需要钙。对mTG的初步研究以在食品工业中的应用(BabinH,Dickinson E.Food Hydrocolloids 2001,15,271-276.Motoki M,Seguro K.Trends inFood Science&Technology 1998,9,204-210)为目标，而后来的研究考虑潜在的医学应用。先前的体外研究表明，mTG可在几分钟内使明胶交联以形成凝胶，明胶-mTG粘合剂可与潮湿或润湿的组织粘结，且粘附强度比得上或优于基于纤维蛋白的密封剂(Chen TH、Payne GF等人的Biomaterials 2003,24,2831-2841。McDermott MK、Payne GF等人的Biomacromolecules 2004,5,1270-1279。Chen T、Payne GF等人的J Biomed Mater Res BAppl Biomater2006,77,416-22。)

如上所讨论的各种生物相容材料的应用也被外科用网状补片和背衬层增强。

外科用网状补片是可以从各种有机的和合成的材料编织或纺织的多孔片状材料。制造外科用网状补片的材料必须是生物相容的、在化学上和物理上惰性的、非致癌的、在机械上坚固的、容易制造的和无菌的。

在许多外科手术中，外科用网状补片变得整合到在手术部位周围的组织中是合乎需要的。这种外科手术包括腹壁、横隔膜和胸壁的解剖缺损的修补、在泌尿生殖系统中的缺损的矫正以及修补创伤性受损的器官例如脾、肝或肾。这种外科手术的另一个例子是疝形成的加强。在疝的修补中，适当大小和形状的外科用网状补片被放置在疝上，并使用任何合适的连接手段被固定在适当的地方。当在手术部位周围的组织愈合时，在手术部位处和周围生长的肉芽组织开始产生细胞外基质，该基质在被称为纤维化的工艺中渗透并附着到固定在手术部位上的外科用网状补片的材料上。细胞外基质将外科用网状补片整合到手术部位内强化了在手术部位处的组织，并有助于防止复发的损伤。

通常采用的网状补片固定的方法是放置与可吸收或不可吸收的经腹缝线组合的金属固定装置(大头钉)以及在不使用缝线的情况下插入两圈大头钉(双冠技术)。使用大头钉或缝线将网状补片固定到腹壁经由引起直接的神经和组织损伤被认为是术后疼痛的一个偶然因素，并且已经发现，经历腹腔镜腹侧和切口疝修补术的患者往往在术后早期中比在任何其他微创手术后有更多的疼痛(Wassenaar,E.等人的Mesh-fixation method andpain and quality of life after laparoscopic ventral or incisional herniarepair:arandomized trial of three fixation techniques.Surgical endoscopy,2010.24(6):p.1296-1302。Champault,G.等人的A self-adhering mesh for inguinalhernia repair:preliminary results of a prospective,multicenter study.Hernia,2011.15(6):p.635-641)。慢性疼痛的所估计的比率从0％相当大地改变到53％。多达三分之一的患者将在手术后一年内抱怨某种程度的疼痛，且在3-4％的患者中，这种疼痛将是严重的和使人残疾的，明显影响患者的生活质量(Champault,G.等人的A self-adheringmesh for inguinal hernia repair:preliminary results of a prospective,multicenter study.Hernia,2011.15(6):p.635-641)。在腹股沟疝的网状补片修补情况下，越来越多的临床医生和研究人员现在认为术后疼痛是腹腔镜腹侧和切口疝修补手术的最重要的不利影响(Wassenaar,E.等人的Mesh-fixation method and pain and qualityof life after laparoscopic ventral or incisional hernia repair:a randomizedtrial of three fixation techniques.Surgical endoscopy,2010.24(6):p.1296-1302)。最近的研究聚焦于找到新的和较不引起疼痛的网状补片固定技术，包括外科粘合剂的使用。Olmi等人在一系列40名患者中观察到较低的术后疼痛率，在这些患者中纤维蛋白胶用于在小和中等尺寸的腹壁缺损的腹腔镜修补期间固定网状补片(Wassenaar,E.等人的Mesh-fixation method and pain and quality of life after laparoscopic ventralor incisional hernia repair:a randomized trial of three fixationtechniques.Surgical endoscopy,2010.24(6):p.1296-1302。Olmi,S.等人的Use offibrin glue

in laparoscopic repair of abdominal wall defects:preliminary experience.Surgical endoscopy,2007.21(3):p.409-413)。

常规的组织粘合剂通常不适合于范围广泛的粘合剂应用。虽然目前在外科手术活动场所中使用许多外科粘合剂，但是没有现有的市售产品既使用起来安全又足够坚固，以提供使疝网状补片固定所必需的机械和生物支持。此外，没有现有的市售产品可提供足够的粘附强度以将可植入医疗装置牢固地粘附到组织部位，同时允许快速的组织向内生长。

例如，基于氰基丙烯酸酯的粘合剂用于局部伤口闭合，但是有毒降解产物的释放限制了它们对内部应用的使用。在任何情况下，这种粘合剂都不允许组织整合。基于纤维蛋白的粘合剂固化缓慢，具有差的机械强度，并造成病毒感染的风险。Wilkie等人(美国专利申请公布号2002/0022588)和Tammishetti等人(WO 99/66964)描述了在添加聚胺、特别是聚赖氨酸或壳聚糖或者聚羧酸盐、特别是柠檬酸或聚丙烯酸的情况下与碳二亚胺交联的基于蛋白的组织粘合剂例如基于白蛋白的粘合剂的领域中的进步以提高交联速率，但是在粘合剂组合物中的碳二亚胺的使用引起毒性问题。毒性问题通过毒性聚胺如聚赖氨酸的使用而加剧。Otani等人描述了通过使明胶和聚(L-谷氨酸)与水溶性碳二亚胺交联而制备的组织粘合剂(Otani,Y.,Y.Tabata和Y.Ikada,A new biological glue from gelatin andpoly(L-glutamic acid).Journal of biomedical materials research,1996.31(2):p.157-166)。尽管该粘合剂比上述白蛋白-聚赖氨酸粘合剂毒性小，但它缺乏粘附强度。

目前在市场上有两种自固定疝网状补片。

(以前是Cousin Biotech，现在是Bard-Davol)是被涂覆有一层聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和PEG的网状补片。其在被湿润时变为粘性的。/>

网状补片被显示为在14天和90天后在大鼠疝在线模型中在50％的时间错位(Gruber-Blum S.等人的(2014)Acomparison of/>

and/>

self-adhering hernia meshes in an onlay model in the rat,Hernia 18:761-9)。ProGrip^TM(Medtronic)是一种自固定疝网状补片。它依赖于由聚乳酸(PLA)制成的微夹具的机械原理。由于内脏粘附保护层的缺乏和对腹膜组织的差的固定，该产品不能在腹膜疝修补术中使用。

已经发现对外科用网状补片成问题的另一个问题是与网状补片的粘附的形成。在用Pro-Tack做实验时，LeBlanc等人已经观察到网状补片的边缘在固定装置的放置的部位处“翻转”到自身上。在他们的研究中，他们确定这似乎增强了与假体的被暴露边缘的粘附的实例(LeBlanc,K.等人的Comparison of adhesion formation associated with Pro-Tack(US Surgical)versus a new mesh fixation device,Salute(ONUX Medical).Surgical Endoscopy And Other Interventional Techniques,2003.17(9):p.1409-1417)。更多的研究发现，与对在一侧上被涂覆有防粘附屏障的聚丙烯网状补片的粘附相比，对裸聚丙烯网状补片的粘附的百分比明显更高(Borrazzo,E.等人的Effect ofprosthetic material on adhesion formation after laparoscopic ventral herniarepair in a porcine model.Hernia,2004.8(2):p.108-112)。

美国专利申请号20100305589描述了一种被涂覆有生物粘合剂的织物植入物。生物粘合剂包括各种合成聚合物和增塑剂，但不是蛋白，例如明胶。美国专利申请号20120197415描述了一种植入物，但不涉及明胶的酶促交联。美国专利申请号20130158571也不涉及明胶。

发明概述

背景技术没有教导或建议不需要额外的固定装置的自粘附网状补片，但然而同时防止任何“翻转”和裸网状补片的暴露，导致粘附的最小化。

背景技术没有教导或建议使用起来安全且足够坚固以提供例如使疝网状补片固定所必需的机械和生物支持的基于网状补片的组合物。此外，没有现有的市售产品可提供足够的粘附强度以将可植入医疗装置牢固地粘附到组织部位，同时允许快速的组织向内生长。

本发明根据至少一些实施方案提供了包括可交联蛋白或多肽和一种或更多种交联材料的基于网状补片的组合物。

基于网状补片的组合物任选地且优选地包括自粘附外科用网状补片，其不需要额外的固定装置，而同时最小化粘附。任选地，网状补片可以包括复合网状补片，其以例如(且没有限制地)可交联蛋白和可交联材料的交联的无毒材料的发泡组合物为特征。复合网状补片可以任选地呈片状形式。可交联蛋白或多肽可任选地包括明胶，明胶可任选地发泡，任选地也以层存在。

根据一些示范性实施方案，上文描述的明胶层可以任选地例如通过在干燥之前将明胶溶液与加压空气和/或其它气体混合而发泡。在一些实施方案中，明胶泡沫可以在1至100mg/cm³的密度范围内，且优选地在1至50mg/cm³的范围内。

根据至少一些实施方案，优选地，复合网状补片以整合的(incorporated)疝网状补片为特征。该结构优选地以两个部分为特征，一个部分由包括围在粘合剂组合物内的网状补片，而另一个部分只包含粘合剂组合物，而在它内没有网状补片。这种设计允许自固定粘附最小化疝网状补片装置，防止网状补片移位、迁移、卷起它的边缘，或者改变它的位置而不使用缝线、U形钉(staple)和其他附加的固定装置。

任选地，所述明胶包括发泡明胶。任选地，所述发泡明胶包括干燥或冻干的发泡明胶溶液。任选地，所述酶以酶层存在，并且其中所述明胶位于下列位置中的一个或更多个：在所述产品中，在所述酶层上，在所述酶层中，在所述增强背衬层中，在所述增强背衬层中，或者在所述酶层和所述增强背衬层之间。

任选地，所述明胶是发泡明胶，并且其中在发泡之前，明胶溶液的浓度在0.1％和30％w/w之间。任选地，在发泡之前，明胶溶液的浓度在1％和20％w/w之间。任选地，在发泡之前，明胶溶液的浓度在5％和15％w/w之间。

任选地，所述可交联蛋白存在于蛋白基质中，其中所述干基质具有在从1至100mg/cm³的范围内的密度。任选地，所述密度在从1至50mg/cm³的范围内。

任选地，所述发泡明胶是根据选自由批量混合工艺、连续混合工艺、化学发泡工艺、文丘里发泡工艺或冷冻干燥组成的组中的方法生产的。

任选地，所述蛋白包括明胶以及交联剂，例如酶，包括转谷氨酰胺酶(TG)。任选地，将明胶与所述转谷氨酰胺酶一起掺入到明胶基质中，使得下列情况中的一个或更多个出现：大部分酶活性在整个制备过程中被保持；酶遍及明胶基质表面而相等地分布；和/或酶嵌入明胶基质的深度内(梯度或相等分布)。任选地，根据在干燥所述基质之前的混合或在干燥所述基质之后的混合中的一个或更多个来将所述转谷氨酰胺酶掺入到所述明胶基质中，任选地，其中干燥所述基质以包括不超过10％的水分含量。任选地，所述干燥基质的密度在1-100mg/cm³的范围内，或者转谷氨酰胺酶以从0.05-2mg转谷氨酰胺酶/cm³明胶基质的浓度存在。优选地，转谷氨酰胺酶组合物具有大约至少1U/mg的比活性水平(酶单位/蛋白含量)。最优选地，转谷氨酰胺酶具有至少约5U/mg的比活性水平。

任选地且优选地，在明胶-转谷氨酰胺酶组合物中的转谷氨酰胺酶的活性水平为从约1至约500U/g明胶。更优选地，活性水平为从约5至约120U/g明胶。

根据本发明的一些实施方案，提供了包括可交联蛋白或多肽——条件是所述蛋白或多肽不是纤维蛋白或纤维蛋白原——和交联剂、任选地酶的组合物。

任选地且优选地，对于本文所述的任何组合物，酶包括一种或更多种转谷氨酰胺酶或多铜氧化酶。

更优选地，所述转谷氨酰胺酶包括微生物转谷氨酰胺酶。

根据本发明的一些实施方案，提供了包括可交联蛋白或多肽——条件是所述蛋白或多肽不是纤维蛋白或纤维蛋白原、诱导所述可交联蛋白的交联的酶、金属离子和变性剂的组合物。

任选地，可交联蛋白或多肽包括明胶。优选地，所述明胶为至少250bloom。

更优选地，所述金属离子包括钙作为任何在药学上相容的盐。最优选地，所述钙盐包括氯化钙或氢氧化钙中的一种或更多种。任选地且最优选地，所述钙以最多1M的量存在。

根据本发明的一些实施方案，提供了包括明胶、转谷氨酰胺酶和钙可交联藻酸盐基质的组合物。任选地，将所述组合物暴露于富含钙离子的潮湿环境使藻酸盐的交联出现。在不希望受到单一假设的限制的情况下，这种交联预期产生明胶和藻酸盐的完全互穿聚合物凝胶网络(IPN)，其中明胶和藻酸盐各自分别通过mTG和钙单独地在原位被交联。

藻酸盐优选地是藻酸的钠盐，其具有足够的古洛糖醛酸残基或G-嵌段以通过钙离子支持离子交联。海藻酸钠优选地为低粘度等级，以便于与溶液中的明胶混合。

作为海藻酸钠的替代物，可以使用已知在钙离子存在的情况下凝胶的低甲氧基果胶。

钙离子的来源作为钙盐被提供。任选地，钙盐可以是氯化钙、葡萄糖酸钙、硫酸钙或碳酸钙。氯化钙比其他钙盐更容易使藻酸盐交联，可能使它在制剂的制备期间从溶液中沉淀出来。这可通过使用缓慢溶解的葡萄糖酸钙或难溶的硫酸钙或碳酸钙来规避。硫酸钙或碳酸钙可以充当体内钙离子的释放储库。

任选地，钙盐是组合物的一部分。当暴露于水分时，钙盐溶解，且溶解的钙随后可以诱导在组合物中的藻酸盐的交联。钙盐可以与明胶、藻酸盐和mTG一起组合在发泡粘合剂层中。可选地，钙盐可以通过被添加到装置的单独部分例如背衬层或粘合层(其中它充当储库)来与藻酸盐在空间上分离。在体内应用该装置并暴露于水分后，钙盐将溶解并原理它的原始位置扩散，且当它到达含藻酸盐的层时，它将使藻酸盐交联。

任选地，在将所涂覆的网状补片粘附到组织上之前，可通过将钙盐溶液涂敷在组织上或者在面向组织的所涂覆的网状补片的粘合层上或者在背离组织的背侧上来在原位添加钙盐。涂敷钙盐溶液可以通过润湿、散布或喷洒来完成。可选地，粉末状钙盐可以如上针对钙溶液所述直接应用。

根据本发明的一些实施方案，提供了包括明胶、转谷氨酰胺酶和壳聚糖的组合物。壳聚糖是具有侧链伯胺基的脱乙酰几丁质。在不希望受到单一假设的限制的情况下，这些侧链胺基可以用作转谷氨酰胺酶的底物，且因此可以被交联到明胶基质。

可适合于组合物的其它任选组分由于它们支持基质形成的能力例如由于高分子量，而包括藻酸酯、阿拉伯树胶、高粘度羧甲基纤维素(CMC)、黄原胶、瓜尔胶、果胶和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、透明质酸或透明质酸钠、藻酸盐或果胶(没有钙)。这些聚合物可以起作用来依靠它们与彼此或与明胶的缠结来增加交联基质的内聚强度。这种现象被称为半互穿聚合物凝胶网络(半-IPN)，其中只有明胶被交联，且另外的所述聚合物没有自身交联或与明胶交联，而相反均匀地分散在交联明胶网络的全部孔中。

根据本发明的一些实施方案，提供了包括明胶、转谷氨酰胺酶和能够共价地结合到所述明胶的PEG(聚乙二醇)衍生物的组合物。任选地，所述PEG衍生物包括任何胺化PEG衍生物。优选地，所述胺化PEG衍生物包括PEG胺。

根据本发明的一些实施方案，提供了包括明胶、转谷氨酰胺酶和能够共价地结合到所述明胶的PVA(聚乙烯醇)衍生物的组合物。任选地，所述PVA衍生物包括任何胺化PVA衍生物。优选地，所述胺化PVA衍生物包括PVA胺。

根据本发明的一些实施方案，提供了包括发泡明胶和转谷氨酰胺酶的交联组合物。任选地，所述转谷氨酰胺酶以冻干形式存在。

根据一些示范性实施方案，本文描述的方法和/或装置可以包括在明胶链和组织ECM(细胞外基质)的内源性胶原蛋白之间的原位交联，例如，以为流体创建坚固的止血屏障。

在一些示范实施方案中，本文描述的方法和/或装置可以包括例如通过使明胶和TG以冻干形式被涂敷来有效地影响止血和/或流体停滞，例如其中明胶和TG可以由血液或其他身体流体重构。如本文所使用的，术语“冻干”可任选地涉及任何类型的干燥，包括但不限于真空干燥。任选地且优选地，在低于组合物的蛋白基质的溶胶-凝胶转变温度(物理凝胶点)的温度下执行干燥。

在一些示范性实施方案中，本文所述的方法和/或装置可以包括冻干形式的明胶-TG混合物，其特征在于例如具有增加的货架期。

在一些示范性实施方案中，本文描述的方法和/或装置可以包括例如分层冻干形式的明胶和TG，以提供更快速的重构，这根据一些实施方案可能对高压流体流动环境是有帮助的。

在一些示范性实施方案中，本文描述的方法和/或装置可以包括基于明胶交联技术的干组合物，该干组合物可以模仿天然凝血级联，和/或可以用于实施止血、闭合和/或密封伤口和/或切口、加强U形钉和/或缝线、支撑天然组织和/或用于任何其他合适的医疗和/或外科应用。

在一些示范性实施方案中，组合物可包括明胶或胶原蛋白基质，酶促交联剂、优选地微生物转谷氨酰胺酶例如整合到基质中。

在一些示范性实施方案中，本文描述的方法和/或装置可以包括干明胶-酶组合物，其中该组合物可以形成贴片。

在一些示范性实施方案中，本文所述的方法和/或装置可以提供一种装置，该装置包括具有明胶-TG混合物的机械背衬层，例如以例如通过减慢流体和/或允许明胶-TG有更多时间交联和/或阻止流体泄漏来增加混合物的止血和/或流体控制能力。

在一些示范性实施方案中，本文描述的方法和/或装置可包括干明胶-酶组合物，该组合物可包括整合到明胶基质中的可降解和/或不可降解装置，例如使得当组合物与流体接触时，该装置可粘附到组织表面。

在一些示范性实施方案中，本文描述的方法和/或装置可以包括干明胶-酶组合物，该组合物可以包括可降解和/或不可降解装置，其中该装置可以是例如用于受损组织的加强的外科用网状补片。

在另一个实施方案中，非交联明胶或mTG可以与部分地交联的明胶-mTG一起存在。

在另一个实施方案中，非交联明胶或mTG可以与交联明胶-mTG一起存在。

在另一个实施方案中，非交联明胶与mTG一起存在。

虽然目前在外科手术活动场所中使用许多外科粘合剂，但是在以可固定疝网状补片为特征的合适装置中没有提供现有的市售产品。此外，作为可植入医疗装置的一部分，没有现有的市售产品能够提供足够的粘附强度，以确保对组织部位的粘附，同时允许快速的组织向内生长。

根据本发明的一些实施方案，提供了一种治疗目标组织的方法，其任选地根据本文的任何实施方案包括向组织涂敷包括胶原蛋白或胶原蛋白衍生物和无毒交联剂的以贴片，任选地包括网状补片，的形式的组合物。

任选地，无毒交联剂可以包括一种或更多种酶和/或酶组合物。在一些示范性实施方案中，一种或更多种酶可以包括转谷氨酰胺酶或转谷氨酰胺酶组合物。优选地，明胶与转谷氨酰胺酶的重量比在从约50:1至约5000:1的范围内。更优选地，转谷氨酰胺酶组合物具有约至少1U/mg的比活性水平(酶单位/蛋白含量)。最优选地，转谷氨酰胺酶具有至少约5U/mg的比活性水平。

任选地，转谷氨酰胺酶组合物可以包括除了血源性因子XIII之外的植物、重组动物和/或微生物来源的转谷氨酰胺酶。任选地，胶原蛋白和/或胶原蛋白衍生物可以由动物来源、重组来源或其组合产生。优选地，动物来源选自由鱼和哺乳动物组成的组。更优选地，哺乳动物选自由猪和牛组成的组。

任选地，胶原蛋白衍生物是明胶。

任选地，明胶为A型(酸处理的)或B型(碱处理的)。更优选地，明胶包括高分子量明胶。任选地，明胶具有至少约250的bloom。

任选地，使用细菌、酵母、动物、昆虫或植物系统或任何类型的细胞培养物来产生重组明胶。

任选地，明胶被纯化以除去盐。

任选地，受伤组织选自由用外科手术切割的组织、用外科手术修补的组织和创伤组织组成的组。

任选地，该方法还可以包括减少出血和/或其他身体流体从组织泄漏。任选地，身体流体选自由脑脊液、肠液、肠气、胆汁和尿液组成的组。优选地，该方法还包括诱导止血或在组织中的其他泄漏身体流体的停滞。

任选地，伤口正在出血或泄漏另一身体流体，并且治疗受伤组织包括将组合物以例如贴片的形式涂敷到伤口部位，以促进在明胶链和组织细胞外基质的内源性胶原蛋白之间的原位交联，以创建对流体泄漏或出血的屏障。优选地，无毒交联剂包括转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶可任选地从茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)、巴氏轮枝链霉菌(Steptoverticillium Baldaccii)、吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)菌株或大肠杆菌(Escherichia Coli)中的一种或更多种中被提取。

任选地，转谷氨酰胺酶包括除了血源性因子XIII之外的植物、重组体、动物或微生物来源的转谷氨酰胺酶。优选地，组合物还包含稳定剂或填料。还优选地，组合物具有在从约5至约8的范围内的pH。

任选地，明胶由动物来源、重组来源或其组合产生。优选地，动物来源选自由鱼和哺乳动物组成的组。更优选地，哺乳动物选自由猪和牛组成的组。最优选地，明胶包括猪皮或猪骨或其组合。还最优选地，明胶为A型(酸处理的)或B型(碱处理的)。还最优选地，明胶包括高分子量明胶。

任选地，明胶具有至少约250的bloom。优选地，鱼包括冷水种的鱼。

任选地，明胶被纯化以除去盐。

任选地，明胶具有至少一个经调节的、定制的或预定的特性。

任选地，该组合物还包括额外的止血剂。优选地，额外的止血剂还包括白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、凝血酶、壳聚糖、硫酸铁或其他金属硫酸盐中的一种或更多种。

根据本发明的一些实施方案，提供了包括可交联蛋白或多肽——条件是所述蛋白或多肽不是纤维蛋白——诱导所述可交联蛋白的交联的不依赖于钙的酶、变性剂和用于逆转所述变性剂的效果、用于逆转变性剂的溶胶凝胶转变点降低效果的试剂的组合物。

任选地，所述变性剂包括尿素，并且用于逆转所述变性剂的所述效果的所述试剂包括脲酶。

任选地，如本文所述的任何组合物还可包括山梨醇。

任选地和优选地，所述山梨醇以足够的量存在以增加交联组合物的柔性和/或加快交联的速率。组合物还可任选地进一步包括乙酸酯/盐。

根据本发明的一些实施方案，本文中的任何组合物还可任选地包括增塑剂。任选地，所述增塑剂选自由阿拉伯树胶、瓜尔胶、PVA、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸烷基酯、甘油酯、邻苯二甲酸烷基酯、癸二酸烷基酯、蔗糖酯、山梨糖醇酯、乙酰化单甘油酯、甘油、脂肪酸酯、二元醇(glycols)、丙二醇、月桂酸、蔗糖、三乙酸甘油酯、泊洛沙姆、邻苯二甲酸二乙酯、食用脂肪或食用油的单甘油酯和二甘油酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、聚山梨醇酯、聚乙二醇200到12,000、Carbowax聚乙二醇组成的组。

根据本发明的一些实施方案，本文中的任何组合物可任选地还包括表面活性剂。所述表面活性剂包括聚氧乙烯-山梨糖醇酐-脂肪酸酯、聚乙二醇十二烷基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂醇醚硫酸钠、月桂基乙醚硫酸钠、泊洛沙姆、泊洛沙胺(poloxamine)、烷基聚葡萄糖苷、脂肪醇、脂肪酸盐、椰油酰胺单乙醇胺和椰油酰胺二乙醇胺。

更优选地，所述表面活性剂的浓度在所述可交联蛋白的干重的从约0.1％至约5％w/w的范围内。任选地且最优选地，所述聚氧乙烯-山梨糖醇酐-脂肪酸酯包括聚山梨醇酯20、21、0、60、61、65、80或85中的一个或更多个。

根据本发明的一些实施方案，对于本文的任何组合物，任选地，所述酶包括转谷氨酰胺酶，所述组合物还包括胱胺、半胱氨酸、氰酸酯/盐(cyanate)或黑色素中的一种或更多种。

根据本发明的一些实施方案，本文中的任何组合物可任选地还包括氨清除剂、螯合剂或结合剂、氨代谢刺激剂或细胞氨摄取抑制剂。任选地，所述氨清除剂包括二糖乳果糖。还任选地，所述氨结合剂包含皂苷。优选地，所述氨清除剂包括含有苯乙酸钠和苯甲酸钠的溶液。

此外优选地，所述氨代谢刺激剂包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸盐或其组合。

此外优选地，所述细胞氨摄取抑制剂包括L-谷氨酰胺、L-谷氨酸盐或其组合。

根据本发明的一些实施方案，提供了一种具有>25酶单位/毫克的比活性、>95％的电泳纯度、<5的内毒素单位/克和<10CFU/克的微生物转谷氨酰胺酶(“mTG”)组合物。这种转谷氨酰胺酶可以任选地作为本文所述的交联剂被提供。

任选地，基于网状补片的组合物包括增强背衬层和外科用网状补片，其中所述外科用网状补片位于增强层和明胶基质之间；在明胶基质的中间；或者在明胶基质的顶部上；或者其组合。

任选地，基于网状补片的组合物包括没有背衬层的网状补片。

任选地，可交联蛋白包括多于一个(a plurality of)部分，并且其中超过50％的所述部分是非交联的。任选地，产物还包括增强背衬层，其中所述增强背衬层包括可再吸收材料。任选地，所述可再吸收材料选自由纤维素(例如羟丙基甲基纤维素＝"HPMC")、氧化纤维素、蛋白质物质(例如纤维蛋白、角蛋白、胶原蛋白和/或明胶)或碳水化合物物质(例如藻酸盐、几丁质、纤维素、蛋白聚糖(例如聚N-乙酰氨基葡萄糖)、乙醇酸聚合物、乳酸聚合物或乙醇酸/乳酸共聚物组成的组。

任选地，在贴片的制造期间，明胶/mTG溶液具有低于中性的ph值。通过降低pH值来在网状补片制备过程的整个“湿”部分中抑制mTG酶有助于防止明胶溶液的过早交联。pH值可任选地包括在3至5、优选地3.3至4.3、更优选3.6至4.0的pH值的范围内的值。

可以用加压气体创建多孔粘合层，其中例如气体与包含交联底物和交联材料例如明胶和mTG的溶液混合。然后例如可任选地将发泡溶液挤出到底物例如PEEK(聚醚醚酮)上。

另一种创建以明胶-酶的干混合物为特征的多孔海绵状结构的方法是使用冷冻-干燥方法(可选地没有额外的曝气手段)。该方法优选地例如涉及将包含交联底物和交联材料例如明胶和mTG的溶液快速冷却至接近零、零或零下温度(摄氏度)。然后降低在溶液上的压力，使得溶液的液体升华，留下冷冻干燥的材料。

根据至少一些实施方案，特定的外科用网状补片关于明胶泡沫的定位可以增加期望的特性，包括在组织整合方面的特性。令人惊讶地，发明人已经发现，在泡沫涂层内(即完全被泡沫包围)的网状补片的位置可降低在产品涂敷到组织上后的初始阶段组织对假体的响应的程度。优选地，网状补片被定位成使得网状补片的仅一部分被泡沫涂覆，而另一部分不被泡沫涂覆，允许组织对外科用网状补片的快速响应。

欧洲专利EP2219691描述了一种绷带，其中HPMC层被设计成防止粘附到内脏器官，而不是作为保护产品或防止粘合剂层粘到手套、内脏等的单独层。

美国专利申请20140271781描述了一种具有由纤维素酯组成的非粘性背衬的牙齿增白粘合剂凝胶；然而，这种组成结构对伤口治疗是明确地不相关的。

美国专利8703177描述了一种由粘合剂层和背衬层组成的粘膜粘附贴片，该背衬层是非粘性的且还可以包括至少一种水可侵蚀的成膜聚合物(例如HPMC)。再次，这样的贴片对外科治疗是明确地不相关的。

如这里使用的，“大约”意指所指示的值的大约正或负10％。

从下面的详细描述和从权利要求中，本发明的各种实施方案的其他特征和优点将是明显的。

附图说明

在本文仅以举例方式参考附图来描述本发明。现在详细地特别参考附图，强调所示的细节为举例的并且仅为了本发明的优选实施方案的说明性讨论的目的，并且为了提供被认为是本发明的原理和概念方面最有用和容易理解的描述的内容而被呈现。在这点上，没有试图比对基本理解本发明所必需的更详细地示出本发明的结构细节，使用附图来理解的描述使本发明的几种形式可如何体现在实践中变得对本领域中的技术人员明显。

在附图中：

图1示出了装置设计的俯视图，该装置设计包括粘合剂覆盖的网状补片的部分和仅围绕网状补片-粘合剂部分的粘合剂的部分。

图2A示出了装置的侧视图，该图以粘合剂在所有方向上围绕网状补片的方式描绘在粘合剂中的网状补片的任选放置，而图2B示出了层的分解图。

图3示出了用Instron测量各种背衬和组合物组合的相对粘性。

图4示出了植入体内的示例性装置。嵌入的外科疝网状补片牢固地固定到腹膜组织上。

图5示出了该组合物的制备的任选和非限制的方法。

图6示出了各种基于网状补片的组合物形状的一些任选的尺寸、最小值和最大值。对于关于给定尺寸如何与产品相关的描述，见图2A。

图7示出了通过粘度计测试的pH对mTG活性的影响。在pH 5.5(天然的)、4和3.5中的9％明胶与40u/ml酶在37℃(2:1)混合。

图8示出了曝气和混合系统的示意图；

图9示出了通过在实施例7中描述的工艺制备的明胶-mTG干泡沫物品的横截面的SEM图像；

图10示出了通过在实施例7中描述的工艺制备的明胶-mTG干泡沫物品的粘合表面的SEM图像。

图11A和11B示出了如本文所述制备的物品的SEM图像；图11A示出LM-147物品的横截面的SEM图像——网状补片嵌在泡沫的中间，而图11B示出LM-149物品的横截面的SEM图像——网状补片位于底部(表面)；

图12A和12B示出了图11A和图11B的物品的底部的SEM图像；图12A示出了LM-147物品的底面的SEM图像——外科用网状补片是不可见的，因为它被泡沫完全覆盖，而图12B示出了LM-149物品的底面的SEM图像——外科用网状补片位于表面水平处，没有完全被覆盖；

图13A和13B示出了固定在胶原蛋白上的图11A和图11B的物品的SEM图像；图13A示出了在作为组织模拟基底的胶原蛋白上固定后的LM-149的SEM图像(胶原蛋白是底层)，而图13B示出了在作为组织模拟基底的胶原蛋白上固定后的LM-147的SEM图像(胶原蛋白是顶层)；

图14示出了在固定后4分钟通过搭接剪切法测试的在胶原蛋白上的不同模型的固定强度；

图15示出了通过搭接剪切法测试的在猪腹膜组织上的不同模型的固定强度；

图16示出了7天后从猪上外植的样品的代表性组织病理学图像；

图17示出了表示在植入后14天对照网状补片(裸外科用网状补片)和基于网状补片的组合物(覆盖有粘合剂的外科用网状补片)组GF-199(交联明胶)、GF-200(HPMC)被粘合剂覆盖的表面积百分比的箱形图；

图18示出了在固定后24小时，通过搭接剪切法测试的，在胶原蛋白上的基于明胶-藻酸盐网状补片的组合物(批号GF-502)的固定强度。GF-502物品在胶原蛋白上涂敷后被浸入0.9％盐水或添加有50mM CaCl₂的0.9％盐水中24小时；

图19示出了在固定后24小时，通过搭接剪切法测试的，在胶原蛋白上的基于明胶-壳聚糖网状补片的组合物(批号GF-510、GF-511、GF-512)的固定强度。在胶原蛋白上涂敷后物品被浸入0.9％盐水中24小时。

优选实施方案的描述

本发明具有基于网状补片的组合物，所述基于网状补片的组合物包括可交联蛋白或多肽的溶液和诱导可交联蛋白的交联的试剂。

网状补片任选地且优选地包括自粘附外科用网状补片，其不需要额外的固定装置，同时最小化粘附。任选地，网状补片可以包括复合网状补片，其以例如(且没有限制地)可交联蛋白和诱导可交联材料的交联的无毒材料的发泡组合物为特征。复合网状补片可以任选地为片状形式。

根据至少一些实施方案，优选地，复合网状补片以整合的疝网状补片为特征。该结构优选地以两个部分为特征，一个部分包括被围在粘合剂组合物内的网状补片，而另一个部分只包含粘合剂组合物，而在它内没有网状补片。这种设计允许自固定粘附最小化疝网状补片装置，防止网状补片移位、迁移、卷起它的边缘，或者改变它的位置而不使用缝线、U形钉和其他附加的固定装置。

任选地和优选地，可交联蛋白包括明胶和如本文所述的任何明胶变体或变体蛋白。任选地和优选地，无毒材料包括转谷氨酰胺酶(TG)，其可以任选地包括任何类型的依赖于或不依赖于钙的转谷氨酰胺酶，其可以例如任选地是不依赖于钙的微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。在不希望以任何方式受到限制的情况下，在本发明至少一些实施方案的改进特性当中，与背景技术组合物相比，本发明的组合物提供蛋白交联的增加的速率。此外，mTG的交联反应代表优于由凝血系统的因子XIIIa催化的交联反应的显著的改进。与XIIIa因子不同，微生物酶的活性既不需要凝血酶也不需要钙。

下面在章节标题下更详细地描述本发明的各种实施方案，这些章节标题仅为了清楚起见而被提供而没有以任何方式限制的任何意图。

明胶和转谷氨酰胺酶

根据本发明的优选实施方案，提供了一种基于网状补片的组合物，其中交联材料包括转谷氨酰胺酶，且可交联蛋白包括明胶。

根据优选实施方案，转谷氨酰胺酶以至少约5U/mg的比活性水平存在。

可以通过本领域中的技术人员已知和可获得的任何方法来获得合适的明胶和转谷氨酰胺酶。明胶可以任选地包括任何类型的明胶，其包括本领域中已知的蛋白，优选地包括但不限于通过动物组织的部分水解获得的明胶和/或从动物组织获得的胶原蛋白，包括但不限于动物皮肤、结缔组织(包括但不限于韧带、软骨等)、鹿角或角等和/或骨头和/或鱼鳞和/或骨头或其他成分；和/或使用细菌、酵母、动物、昆虫或植物系统或任何类型的细胞培养物产生的重组明胶。

根据本发明的优选实施方案，来自动物来源的明胶优选地包括来自哺乳动物来源的明胶，且更优选地包括猪皮、猪肉和牛骨头、或劈开的牛皮、或任何其他猪或牛来源。更优选地，这种明胶包括猪明胶，因为它具有较低的过敏反应率。来自动物来源的明胶可以任选为A型(酸处理的)或B型(碱处理的)，尽管它优选是A型。

优选地，来自动物来源的明胶包括在第一次提取期间获得的明胶，第一次提取通常在较低温度(50-60℃，尽管这个确切的温度范围不一定是限制)执行。以这种方式产生的明胶将在250-300bloom的范围内，并且具有至少约95-100kDa的高分子量。优选地，使用275-300bloom明胶。

这种明胶的生产者的一个非限制性例子是PB明胶(比利时的Tessenderlo集团)。

根据本发明的一些实施方案，来自动物来源的明胶任选地包括来自鱼的明胶。任选地，可以使用任何类型的鱼，优选地冷水品种的鱼，例如鲤鱼、鳕鱼、梭子鱼或金枪鱼。这种明胶的pH(在10％溶液中被测量)优选地范围从4到6。

冷水鱼明胶在10℃形成在水中的溶液，且因此所有冷水鱼明胶都被认为是0bloom。对于本发明，优选地使用高分子量冷水鱼明胶，更优选地包括至少约95-100kDa的分子量。这相当于250-300bloom动物明胶的分子量。这种明胶的生产者的一个非限制性例子是Norland产品(新泽西州的克兰伯里)。

在本发明的优选实施方案中，明胶被纯化以除去盐。这可以根据前面描述的技术来实现。一种这样的技术涉及在水中形成20％w/v的明胶溶液，并在搅拌下将它加热至60℃。然后让混合物静置一整夜。所得到的凝胶被针对重复更换的去离子水透析以消除盐，将其搅拌并加热至50℃以使物理网络解聚。过滤并冷冻干燥最终溶液。(Crescenzi V,Francescangeli A,Taglienti A.(2002).Biomacromolecules.3:1384-1391)。可选地，可以通过尺寸排阻柱来使明胶脱盐。

根据本发明的一些实施方案，使用重组明胶。重组明胶目前由FibroGen(加利福尼亚州旧金山)商业生产。目前优选的方法是使用重组酵母系统(毕赤酵母(PichiaPastoris))来表达I型α1人类序列胶原蛋白的特定片段。

在本发明的任选但优选的实施方案中，重组明胶是完全合成的分子，不包含来自人或任何动物的污染成分。所谓“合成”指的是优选地根据选自化学合成、无细胞蛋白合成、细胞组织培养、任何类型的细菌、昆虫或酵母培养的方法或在植物中产生的明胶。合成明胶的使用消除了与组织来源的材料相关的许多变数和缺点，包括引起不想要的免疫反应。例如，鱼明胶展示高变应原性，且动物明胶展示低-中等变应原性，而重组明胶可以具有零变应原性。在人类安全研究中，没有发现与重组明胶相关的不利事件。

在美国专利号6,413,742和6,992,172中充分描述了创建重组明胶的方法及它们的使用的益处，这些专利如同在本文被充分阐述一样特此通过引用被并入。

重组明胶可以被生产为高度(99％)纯化的。重组明胶生产允许具有至少一个规定的和预定的特性的明胶的任选生产，所述规定的和预定的特性包括但不限于规定的分子量、pI(等电点)、被保证的批间可再现性以及使分子适合于匹配特定应用的能力。

先前已经描述了使分子适合于匹配特定应用的例子，其中明胶被创建为高度亲水的(Werten M W T等人的(2001).Protein Engineering.14(6):447-454)。任选地且优选地，根据本发明的明胶包括具有至少一个经调节的、定制的或预定的特性的明胶。

在装置中使用的明胶可以是明胶络合物或任何明胶或其衍生物或代谢物或根据单个工艺或多于一个工艺生产的明胶。例如，明胶可以任选地包括A型明胶或B型明胶或其组合。

转谷氨酰胺酶可以任选地包括优选地除了血源性因子XIII之外的任何植物、动物或微生物来源的转谷氨酰胺酶。优选地，使用源自茂原链轮丝菌的微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。

转谷氨酰胺酶可以例如任选地在包括至少一种其它物质例如稳定剂或填料的组合物中。这种材料的非限制性例子包括麦芽糊精、水解脱脂乳蛋白或任何其它蛋白物质、氯化钠、红花油、磷酸三钠、酪蛋白酸钠或乳糖或其组合。

转谷氨酰胺酶以负温度系数为特征。在转谷氨酰胺酶活性的温度范围内，在较高温度反应花费较短时间，而在较低温度开始起作用花费较长时间。下表1示出了比较与在50℃、pH 6.0下的在10分钟内出现的反应相同的反应等级的情况下，在不同温度下的不同反应时间：

表1示出转谷氨酰胺酶的反应温度。

市售转谷氨酰胺酶产品的非限制性例子包括由Ajinomoto公司(日本川崎)生产的产品。来自该公司的这种产品的一个优选例子是Activa TG-TI(在欧洲：Activa WM)——成分：mTG和麦芽糊精；活性：81-135U/gActiva。来自该公司的合适产品的其他非限制性例子包括Activa TG-FP(成分：水解脱脂乳蛋白、mTG；活性：34-65U/g Activa TG-FP)；ActivaTG-GS(成分：氯化钠、明胶、磷酸三钠、麦芽糊精、mTG和红花油(加工助剂)；活性：47-82U/gActiva TG-GS)；Active TG-RM(在欧洲：Activa EB)——成分：酪蛋白酸钠、麦芽糊精和mTG；活性：34-65U/g Activa；Activa MP(成分：mTG、乳糖和麦芽糊精；活性：78-126U/gActiva)。

市售转谷氨酰胺酶产品的其他非限制性例子包括由Yiming BiologicalProducts公司(中国江苏)生产的那些产品。来自该公司的这种产品的一个优选例子是TG-B(成分：1％mTG、99％共蛋白(co-protein)；活性：80-130U/g)TG-B。来自该公司的合适产品的其他非限制性例子包括TG-A(成分：0.5％mTG、99.5％共蛋白；活性：40-65U/g TG-A)。

对于这两个例子，优选的转谷氨酰胺酶产品是具有最高比活性和最简单的共成分(co-ingredient)的产品，因为它们被认为(而不希望受单一假设的限制)具有在施用时的最佳反应性和对不希望有的副作用的较低可能性。

在另一个实施方案中，转谷氨酰胺酶可任选地从巴氏轮枝链霉菌或吸水链霉菌菌株提取，以产生显示在较低温度(分别约37℃和37-45℃)最佳地起作用的酶变体(NegusSS.A Novel Microbial Transglutaminase Derived from StreptoverticilliumBaldaccii.PhD Thesis.School of Biomolecular and Biomedical Science.GriffithUniversity,Queensland,Australia and Cui L et al.Purification andcharacterization of transglutaminase from a newly isolated Streptomyceshygroscopicus.2007:105(2).p.612-618)。在较低温度下的较高的比活性对于在环境条件下实现明胶的更快和更强的交联是合乎需要的。

根据一些实施方案，转谷氨酰胺酶可以以任何上述组合物——任选地包括任何包括转谷氨酰胺酶的市售混合物——的形式被使用。

在另一个实施方案中，任何上述转谷氨酰胺酶混合物可以任选地通过凝胶过滤、阳离子交换色谱法、中空纤维过滤或切向流过滤来纯化，以除去它们的载体蛋白和/或碳水化合物。这些方法中的一些已经在之前被描述(Bertoni F,Barbani N,Giusti P,Ciardelli G.Transglutaminase reactivity with gelatine:perspectiveapplications in tissue engineering.Biotechnol Lett(2006)28:697-702)(BroderickE P等人的Enzymatic Stabilization of Gelatin-Based Scaffolds J Biomed MaterRes 72B:37-42,2005)。用于过滤的过滤器孔径优选地为约10kDA。

优选地，转谷氨酰胺酶在包括阳离子交换色谱法、疏水色谱法和超滤的工艺中被纯化，如例如在2009年6月18日提交的美国专利号8367388中更充分地描述的，该专利与本申请共同被拥有，并且至少具有与本申请共同的一些发明人。

无论如何，优选地在根据本发明的组合物的使用和/或制造之前用转谷氨酰胺酶反应性测定来测量转谷氨酰胺酶的活性。这种测定可任选地包括但不限于异羟肟酸方法、奈斯勒尔测定、比色测定或转谷氨酰胺酶活性的任何其它测定(见例如Folk J E,Cole PW.Transglutaminase:mechanistic feature of the active site as determined bykinetic and inhibitor studies.Biochim Biophys Acta.1966；122:244-64；或如在下列文献中描述的奈斯勒尔测定:Bertoni F,Barbani N,Giusti P,CiardelliG.Transglutaminase reactivity with gelatine:perspective applications intissue engineering.Biotechnol Lett(2006)28:697-702)。

通常，在装置(组织粘合剂、止血或密封产品)组合物中使用的明胶和/或转谷氨酰胺酶的纯度和/或质量将具有在相关领域中的普通技术人员已知的适当纯度，以导致蛋白的功效和稳定性。

酶纯化和浓缩

根据本发明的一些实施方案，转谷氨酰胺酶溶液经历单阶段或多阶段纯化，以执行下列操作中的一个或更多个：1)从转谷氨酰胺酶混合物中去除发酵残渣；2)浓缩在转谷氨酰胺酶溶液中的活性转谷氨酰胺酶的量；3)从载体蛋白或碳水化合物中进一步纯化转谷氨酰胺酶溶液；4)降低转谷氨酰胺酶溶液的内毒素水平；和/或5)从转谷氨酰胺酶溶液中去除所有微生物，使该溶液有效地灭菌；所有这些都不希望局限于封闭列表。

根据一些实施方案，在与多肽的可交联蛋白混合之前，过滤交联材料的溶液。

在本发明的一个实施方案中，过滤工艺首先使用有时被称为澄清的粗过滤，以去除大块发酵残渣。这种粗过滤的非限制性例子以大于0.22μm的孔径为特征，例如从约0.45μm孔径过滤，任选地包括约0.65μm孔径过滤。

根据本发明的另一个实施方案，交联材料的溶液在粗过滤之后任选地且优选地二次过滤工艺中，通过小于0.22μm的孔径的过滤器，例如，以将材料的生物负载降低到每克10个菌落形成单位(CFU)以下，并使它适合于医疗用途。优选地，实际上消除了生物负载，以达到小于约10^-2且更优选小于约10^-3的无菌保证水平(SAL)，其中SAL是在微生物学中使用来描述单个单元在它经受灭菌工艺后是非-无菌的可能性。

根据本发明的另一个实施方案，在这种二次过滤阶段之后使用切向流或中空纤维超滤技术，以不仅通过除去载体碳水化合物和蛋白来纯化交联材料的溶液，而且浓缩溶液。用于供本发明使用的优选孔径是大于交联组合物的组分的尺寸的那些孔径。

在一个实施方案中，交联材料是mTG，且孔径在10-50kDa的范围内。在更优选的实施方案中，交联材料是mTG，且孔径在10-30kDa的范围内。

根据另一个实施方案，一个或更多个尺寸排阻色谱法步骤用于选择性地使交联材料与周围物质分离。

根据另一个实施方案，一个或更多个疏水或亲水相互作用色谱法步骤用于选择性地使交联材料与周围物质分离。

根据本发明的另一个实施方案，交联材料是蛋白，并且一个或更多个离子交换色谱法步骤用于优先结合交联蛋白，从而从周围材料中纯化它。

根据更优选的实施方案，交联蛋白是mTG，并且一个或更多个阳离子交换色谱法步骤用于纯化mTG。

在优选实施方案中，阳离子交换树脂是琼脂糖树脂。

根据另一个优选实施方案，纯化将交联材料的内毒素水平降低到每克<5个内毒素单位(EU)。

根据另一优选实施方案，交联材料是mTG，且纯化导致mTG组合物，其中比活性大于20酶单位/毫克，且优选地大于25酶单位/毫克。

根据另一个优选实施方案，交联材料是mTG，且纯化导致至少95％、优选地至少98％的电泳纯度。

作为非限制性例子，本文描述了一种mTG纯化方法，该方法纯化食品级mTG产品以产生具有>25酶单位/毫克的比活性、>95％的电泳纯度、<5内毒素单位/克、<10CFU/克的mTG组合物

如上所述，mTG浓度也是本发明的组合物的一些实施方案的优选参数。上述纯化工艺也可以导致更浓缩的mTG材料。除了比非浓缩的mTG溶液更快地使明胶交联之外，浓缩的mTG溶液也形成比非浓缩的对照物更有弹性、更有粘性和更透明的凝胶。

一种或更多种补充剂也可以包含在组织粘合剂、止血或密封产品中例如药物例如生长因子、多克隆抗体和单克隆抗体以及其他化合物。这种补充剂的说明性例子包括但不限于：抗生素，例如四环素和环丙沙星、阿莫西林和甲硝唑；抗凝剂，例如活化蛋白C、肝素、前列环素(PGI2)、前列腺素、白三烯、抗转谷氨酰胺酶III、ADP酶和纤溶酶原激活剂；类固醇，例如地塞米松、前列环素抑制剂、前列腺素、白三烯和/或抑制炎症的激肽；心血管药物，例如钙通道阻断剂、血管扩张剂和血管收缩剂；化学引诱剂；局部麻醉剂，例如布比卡因；和抗增殖/抗肿瘤药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇和/或泰索帝；抗病毒药，例如丙氧鸟苷、齐多夫定、金刚胺、阿糖腺苷、利巴韦林、三氟尿苷、无环鸟苷、双脱氧尿苷和针对病毒成分或基因产物的抗体；细胞因子，例如α-或β-或γ-干扰素、α-或β-肿瘤坏死因子和白细胞介素；集落刺激因子；促红细胞生成素；抗真菌药，例如大扶康、酮康唑和制霉菌素；抗寄生虫剂，例如喷他脒；抗炎剂，例如α-l-抗胰蛋白酶和α-1-抗胰凝乳蛋白酶；麻醉剂，例如布比卡因；镇痛剂；防腐剂；和激素。其他说明性补充剂包括但不限于：维生素和其他营养补充剂；糖蛋白；纤连蛋白；肽和蛋白；碳水化合物(简单的和/或复合的)；蛋白聚糖；抗血管生成素；抗原；脂质或脂质体；和寡核苷酸(有义和/或反义DNA和/或RNA)。

说明性组成

上述交联底物和交联材料可任选地与一种或更多种另外的材料组合以形成本发明的各种组合物，用于本文所述的贴片。根据一些实施方案，粘合剂材料任选地且优选地包括；(i)明胶；(ii)转谷氨酰胺酶。更优选地，明胶和转谷氨酰胺酶以足够的量被提供以作为组织粘合剂、密封剂或止血剂是有用的。

此外，一种或更多种补充剂也可以被包含在组织粘合剂、密封或止血产品中，例如药物例如生长因子、多克隆抗体和单克隆抗体以及其他化合物。这种补充剂的说明性例子包括但不限于：抗生素，例如四环素和环丙沙星、阿莫西林和甲硝唑；抗凝剂，例如活化蛋白C、肝素、前列环素(PGI2)、前列腺素、白三烯、抗转谷氨酰胺酶III、ADP酶和纤溶酶原激活剂；类固醇，例如地塞米松、前列环素抑制剂、前列腺素、白三烯和/或抑制炎症的激肽；心血管药物，例如钙通道阻断剂、血管扩张剂和血管收缩剂；化学引诱剂；局部麻醉剂，例如布比卡因；和抗增殖/抗肿瘤药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇和/或泰索帝；抗病毒药，例如丙氧鸟苷、齐多夫定、金刚胺、阿糖腺苷、利巴韦林、三氟尿苷、无环鸟苷、双脱氧尿苷和针对病毒成分或基因产物的抗体；细胞因子，例如α-或β-或γ-干扰素、α-或β-肿瘤坏死因子和白细胞介素；集落刺激因子；促红细胞生成素；抗真菌药，例如大扶康、酮康唑和制霉菌素；抗寄生虫剂，例如喷他脒；抗炎剂，例如α-l-抗胰蛋白酶和α-1-抗胰凝乳蛋白酶；麻醉剂，例如布比卡因；镇痛剂；防腐剂；和激素。其他说明性补充剂包括但不限于：维生素和其他营养补充剂；糖蛋白；纤连蛋白；肽和蛋白；碳水化合物(简单的和/或复合的)；蛋白聚糖；抗血管生成素；抗原；脂质或脂质体；和寡核苷酸(有义和/或反义DNA和/或RNA)。

基于网状补片的组合物和结构

根据至少一些实施方案，本发明具有临时可再吸收的防粘不粘背衬。它被设计为保护医疗装置不粘到手套、手术工具和内部器官上。

例子是用于止血或密封目的的衬垫、泡沫、绷带。其它例子是涂覆的外科用网状补片。这些装置中的一些包含或涂覆有粘合剂层，该粘合剂层通过将装置粘附到组织上来固定装置。如果同一种粘合剂存在于装置背离组织的一侧上，则它可能变得发粘并粘到手套、手术工具和内部器官上。此外，如果涂层本身是不发粘的，则在手术期间它们仍然可能在手套、手术工具和内部器官与腹膜液体、血液或盐水接触而变得潮湿或湿润之后粘到手套、手术工具和内部器官上。

在另一种情形下，在装置操作期间，在外科医生有机会将装置定位在期望的位置上之前，涂层可能无意地接触潮湿的组织例如肠，并粘到其上。不粘背衬被设计成防止这种事件。

装置背衬可由天然、半合成或合成性质的任何聚合材料组成，这些材料在某种程度上可溶于水，例如多糖、蛋白等。

在存在装置涂层粘到不需要的表面或组织的风险的短时间内，例如在装置的操纵期间或在手术期间，需要背衬。一旦装置被放置并固定在期望的位置处，背衬就不再是需要的，且因此被设计成快速溶解。背衬可以由纤维素醚衍生物例如HPMC(羟丙基甲基纤维素)或HPC(羟丙基纤维素)、HEC(羟乙基纤维素)或EC(乙基纤维素)制成。背衬也可以由交联明胶(酶、物理或化学交联)制成。

根据本发明的至少一些实施方案，提供了一种包括明胶层和增强背衬层的贴片，其中所述明胶层包括明胶和整合到载体中的酶，所述载体选自由下列项组成的组：HPC(羟丙基纤维素)、HPMC(羟丙基甲基纤维素)、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基纤维素、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PVA(聚乙烯醇)、PEG(聚乙二醇)、PEI(聚乙烯亚胺)、淀粉、微晶纤维素、氧化纤维素。

可以任选地选择聚合物的分子量以便确定背衬的性能。在不希望受到单一假设的限制的情况下，认为小分子量导致聚合物在潮湿/润湿条件下的更快溶解，因而导致在背衬本身中的粘性的发展。分子量越大，聚合物就越不可溶，且作为结果，粘性的趋向减小。

非粘性背衬层可以单独或组合地包括水可侵蚀的成膜性药学上可接受的聚合物，例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、胶原蛋白和衍生物、明胶、白蛋白、聚氨基酸和衍生物、聚磷腈、多糖和衍生物、几丁质和壳聚糖。取决于期望的侵蚀动力学，背衬层组分可以或可以不交联。

在一个实施方案中，优选的背衬层组分包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在羟乙基纤维素的情况下，平均分子量(从固有粘度测量估计的Mw)在2x10⁴至1.2x10⁶的范围内，且更优选地在2.5x10⁵至1x10⁶的范围内。

在另一个实施方案中，可能混合在MW上不同的两种HPMC聚合物，以便获得期望的机械特性或膜厚度。例如，使用与1-4％的HPMC(4×10^5Da)混合的0.5-2％的HPMC(1×10^6Da)被设想在本发明的至少一些实施方案内。

背衬层的侵蚀动力学可以任选地以许多不同的方式改变，以便修改停留时间。

任选地，可以用包括羟丙基甲基纤维素和烷基纤维素例如乙基纤维素的组合来执行这种改变。这种组合包括成膜量的烷基纤维素、羟丙基甲基纤维素和合适的溶剂。有利地，由凝胶形成的膜的特性可以根据羟丙基甲基纤维素与烷基纤维素之比而改变。这种可修改的特性有利地包括可侵蚀性的动力学。

通常，羟丙基甲基纤维素与烷基纤维素之比是形成合适的膜所必需的。该比可以根据其它组分和烷基纤维素的类型而变化。然而，如果使用乙基纤维素，则羟丙基纤维素与乙基纤维素之比通常为从约1000:1至约3:1，优选地从约200:1至约4:1，更优选从约200:1至约8:1。通常，当羟丙基纤维素与烷基纤维素之比增加时，水可侵蚀性增加，即，膜更容易被洗掉。因此，乙基纤维素是起作用来调节装置的可侵蚀性的动力学的组分。

根据另一个实施方案，背衬层被设计成在更长的持续时间例如在植入后多达1个月内保持在适当位置上，其中它可以减少网状补片或粘合剂层到内脏器官的粘附。在这种情况下，背衬层可能只非常缓慢地溶解，这可以通过交联包含背衬的聚合物来实现。

交联成膜聚合物也可任选地被执行以影响它的特性。本领域中已知的交联剂适合于在本发明中使用，且可以包括乙二醛、丙二醇、甘油、不同大小的二羟基聚乙二醇、丁二醇及其组合。所使用的交联剂的量可以根据特定的聚合物和交联剂而变化，但通常不应超过聚合物材料的5％摩尔当量，优选地包括聚合物材料的0-3％摩尔当量。

可以通过本领域中的技术人员已知的方法来交联明胶背衬，所述方法包括但不限于化学交联剂如甲醛、戊二醛和EDC、物理方法例如DHT(脱氢热)处理或酶法、例如通过任何类型的mTG(没有限制地包括哺乳动物TG或因子XIII)。

可能通过使用附带地使膜塑化的赋形剂来控制背衬层的机械特性。赋形剂或增塑剂常常改善装置的机械特性和/或修改药物释放曲线或衰变时间。修改层的侵蚀行为的合适的赋形剂或增塑剂可以包括烷基-二醇，例如丙二醇、聚乙二醇、油酸酯、癸二酸酯、硬脂酸酯或甘油酯、邻苯二甲酸酯和其它。其它合适的增塑剂包括酯，例如乙酰柠檬酸酯、油酸戊酯、肉豆蔻醇乙酸酯、油酸丁酯和硬脂酸酯、癸二酸二丁酯、邻苯二甲酸酯例如邻苯二甲酸二乙酯、二丁酯和二乙氧基乙酯等、脂肪酸例如油酸和硬脂酸、脂肪醇例如十六醇、肉豆蔻醇和硬脂醇。此外，在一些实例中，聚合物、药物或溶剂残余物可充当增塑剂。一种优选的增塑剂是PEG。MW范围为从200Pa至1000Pa。优选地，在膜中的PEG的浓度为从10％w/w至50％w/w，更优选地从25至40％。另一种优选的增塑剂是甘油，在膜中的甘油的浓度为从10％w/w至50％w/w，更优选地从25％至40％w/w。

可以通过直接涂敷或间接涂敷来将背衬层附着到粘合剂层上。

通过“直接涂敷”，可以任选地使用各种方法，包括将在明胶层上铺展或喷洒液体形式的背衬并干燥它。使用非水溶剂如乙醇防止明胶层不希望的溶解。

在直接涂敷的另一个例子中，背衬层被浇铸为膜并被干燥，然后粘合剂层被润湿地涂敷在所述膜的顶部上并经受另一轮干燥，例如冻干。

在另一个实施方案中，可以任选地如下执行直接涂敷：背衬层可以通过利用聚合物在它们用液体或蒸汽的润湿之后的固有粘性而附着到粘合剂层上。尽管粘合剂层、背衬层或者两者的聚合物是湿的和/或发粘的，但是这两层彼此附着，并且因而形成的结合是永久性的，即使在用于活化的水被消除之后。

在间接涂敷中，背衬可以任选地通过例如浇铸干燥单独地被制备为膜，且然后通过经由喷洒或铺展在膜上或在粘合剂层上涂敷粘合层而附着到粘合剂层上。然后将粘合剂层附着到背衬层上，其中粘合层将它们粘合在一起。粘合层可以在明胶层附着到背衬层之前或之后被干燥。

在另一个实施方案中，也可以任选地通过用水或其它含水液体例如盐水直接润湿粘合剂层或粘合层或者通过在高湿度环境(例如湿度室或通过蒸汽)中孵育来执行附着。

粘合层任选地由天然来源的多糖例如麦芽糖糊精、淀粉、纤维素(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或其掺和的组合物)或由合成聚合物例如PVP组成。PVP的优选MW范围是从1×10^4Da到1×10^6Da。

可以添加增塑剂来增加粘合层的水分含量并因而增加它的粘性。一种优选的增塑剂是PEG。PEG的MW范围为从200Da至1000Da。优选地，在结合层中的PEG的浓度为从10％w/w至50％w/w，更优选地从25至40％。另一种优选的增塑剂是甘油，使得任选地在粘合层中的甘油的浓度为从10％w/w至50％w/w，更优选地从25至40％。高于50％w/w增塑剂时，粘合层变得太湿且背衬层可能从明胶层滑落，并且低于10％w/w增塑剂时，它太快地变干。

任选地，该产品以网状补片为特征并适合于外科用网状补片固定，其中网状补片可以粘附到器官表面、组织表面或空腔。

任选地，所述网状补片包括任何可降解或不可降解的材料，没有限制地包括合成网状补片、生物网状补片或组合的合成-生物网状补片。

任选地，该产品适合于腹股沟、股骨、脐带或切口腹壁疝修补或其他类型的外科用网状补片重建。

任选地，该产品适合用于精简的纤维包扎或缝合程序。

任选地，该产品适合于与U形钉、大头钉(tack)或缝线中的一个或更多个一起使用来补充网状补片粘附。

任选地，该产品适合于任何大的膈疝修补、直肠固定(直肠脱垂)网状补片固定、脱垂阴道穹窿的重建或其他骨盆底网状补片加固操作(妇科手术)。

任选地，该产品还包括选自由下列项组成的组的额外剂：抗生素、抗凝剂、类固醇、心血管药物、局部麻醉剂、抗增殖/抗肿瘤药物、抗病毒药、细胞因子、集落刺激因子；促红细胞生成素；抗真菌药；抗寄生虫剂；麻醉剂，例如布比卡因；镇痛剂；防腐剂；和激素。

任选地，该产品还包括选自由下列项组成的组的额外剂：维生素和其它营养补充剂；糖蛋白；纤连蛋白；肽和蛋白；碳水化合物(简单的和/或复合的)；蛋白聚糖；抗血管生成素；抗原；脂质或脂质体；和寡核苷酸(有义和/或反义DNA和/或RNA)。

任选地，所述细胞因子选自由α-或β-或γ-干扰素、α-或β-肿瘤坏死因子和白细胞介素组成的组。

任选地，所述抗病毒药选自由丙氧鸟苷、齐多夫定、金刚胺、阿糖腺苷、利巴韦林、三氟尿苷、无环鸟苷、双脱氧尿苷和针对病毒成分或基因产物的抗体组成的组。任选地，所述抗肿瘤药物选自由5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇和/或泰索帝组成的组。

任选地，所述心血管药物选自由下列项组成的组：钙通道阻断剂、血管扩张剂和血管收缩剂；化学引诱剂。

任选地，所述类固醇选自由地塞米松、前列环素抑制剂、前列腺素、白三烯和/或抑制炎症的激肽组成的组。

任选地，所述抗凝血剂选自由活化蛋白C、肝素、前列环素(PGI2)、前列腺素、白三烯、抗转谷氨酰胺酶III、ADP酶和纤溶酶原激活剂组成的组。

任选地，所述抗生素选自由四环素、环丙沙星、阿莫西林和甲硝唑组成的组。

任选地，该产品还包括伤口愈合剂。

任选地，该产品还包括止血剂。

根据本发明的至少一些实施方案，提供了一种用于产生基于网状补片的组合物的方法，所述方法包括：产生包括可交联蛋白的可交联蛋白基质；在所述蛋白基质中沉积酶组合物，其中所述酶组合物包括能够使所述可交联蛋白交联的酶；从而产生产品。在一些实施方案中，蛋白基质被沉积在至少0.5mm的深度处。在其他实施方案中，沉积的深度可以更低。

任选地，所述酶包括转谷氨酰胺酶，并且所述转谷氨酰胺酶包括任何类型的依赖于或不依赖于钙的转谷氨酰胺酶。任选地，所述转谷氨酰胺酶包括微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。

任选地，所述可交联蛋白包括明胶溶液的形式的明胶，包括在混合器中以一速率混合所述明胶溶液以形成发泡溶液，干燥所述发泡溶液以形成干燥溶液，并将所述干燥溶液与所述酶合并。

任选地，所述混合所述明胶溶液包括在混合器中以一混合速率和气压将所述明胶溶液与加压空气混合，以使溶液发泡；其中所述方法还包括冻干发泡明胶溶液以形成明胶的冻干多孔层。

任选地，所述速率为从100RPM至10,000RPM。任选地，所述速率为从1000RPM至6000RPM。

任选地，所述速率为每体积泡沫从0.1cm³/秒至10,000cm³/秒。

任选地，所述可交联蛋白包括明胶溶液的形式的明胶，包括将所述明胶溶液与化学发泡剂混合以使溶液发泡；其中所述方法还包括将发泡明胶溶液干燥成干燥的明胶多孔层。

任选地，所述化学发泡剂包括碳酸氢钠，并且其中明胶溶液和碳酸氢钠的混合物具有低于7的pH。

任选地，所述可交联蛋白包括明胶溶液的形式的明胶，包括在一温度和压力范围内任选地使用曝气来冷冻干燥，以使溶液发泡并形成干燥的明胶多孔层。

以明胶-酶的混合物为特征的另一种创建多孔海绵状结构的方法是使用冷冻干燥方法，但任选地没有这种曝气。

在这种方法中，首先，快速冷却均匀的明胶溶液，将它转换为双相固体，该双相固体含有富含明胶的连续相和浓缩在隔离点中的冰相。其次，通过降低在冷冻干燥室中的压力，固体中的水经历升华，在冰相以前被浓缩的地方留下孔。

在不希望局限于单个范围的情况下，在冷冻干燥工艺中，示出可以用明胶与mTG酶(80u/g明胶)的相同比率获得多孔柔性干燥泡沫，但没有物理曝气。干泡沫的密度与通过物理曝气例如用N2气体制备的密度相当。因此，在体外测试的粘附力也是相当的。

任选地，该方法还包括通过将明胶溶液与所述酶混合以形成发泡明胶溶液来产生明胶层，所述酶包括转谷氨酰胺酶；其中所述方法还包括冻干发泡明胶溶液以形成冻干的发泡明胶溶液，并将所述冻干的发泡明胶溶液添加到所述产品中。

任选地，在所述混合之前或在所述混合期间，将所述转谷氨酰胺酶添加到所述明胶溶液中。任选地，在混合期间通过连续流动来将所述转谷氨酰胺酶添加到所述明胶溶液中。

任选地，该方法还包括在执行所述冻干之前冷却所述发泡明胶溶液。任选地，该方法还包括使明胶溶液发泡以形成发泡明胶溶液；干燥发泡明胶溶液以形成所述干燥的发泡明胶溶液；以及将溶液中的所述转谷氨酰胺酶添加到所述干燥的发泡明胶溶液中以形成含酶泡沫。

任选地，将所述转谷氨酰胺酶添加到所述干燥溶液中包括下列操作中的一个或更多个：将酶溶液喷洒到干明胶基质表面上；通过针或针的矩阵来将酶溶液注射到明胶基质中；将干明胶基质浸入到含酶溶剂混合物中；和/或将含酶溶剂混合物分配到干明胶基质上。

任选地，该方法还包括干燥所述含酶泡沫。

任选地，所述干燥所述含酶泡沫包括空气干燥、真空干燥、冻干和/或热干燥中的一种或更多种。

任选地，所述干燥出现在范围从-40℃至65℃的多个温度。任选地，干燥出现在高达30℃的温度。任选地，所述干燥出现在高达20℃的温度。任选地，所述干燥出现在范围从0℃至20℃的多个温度。

任选地，基于网状补片的组合物包括多个明胶层，并且其中任选地每个所述明胶层具有不同密度的明胶。任选地，至少一个明胶层包括在从约1％w/w至约15％w/w的溶液中的明胶的百分比。任选地，至少一个明胶层包括从约2.5％w/w至约10％w/w的明胶的百分比。任选地，至少一个明胶层包括至少约5％w/w的明胶的百分比。

任选地，至少一个明胶层包括润滑剂。任选地，所述润滑剂包括甘油。任选地，所述甘油以从0.1％至10％的量存在。任选地，所述甘油以从2％至6％的量存在。

根据本发明的至少一些实施方案，提供了一种基于网状补片的组合物，其包括可交联多孔蛋白基质和诱导可交联蛋白的交联的非血源性的酶，其中基质密度在5-100mg/cm³的范围内。任选地，所述密度在40-70mg/cm³的范围内。任选地，该产品具有小于30％的总水分含量、小于20％的总水分含量或小于10％的总水分含量。任选地，这种基于网状补片的组合物对多种应用是有用的，所述多种应用没有限制地包括止血敷料、组织粘合剂或伤口闭合。

任选地，酶与基质之比率为从0.05至5mg酶/cm基质。任选地，所述比率为0.5至2.5mg酶/cm基质。

任选地，通过暴露于电子束辐射，产品被灭菌至10-6的无菌保证水平。任选地，辐射剂量在10-50kGy的范围内。任选地，辐射剂量在20-40kGy的范围内。

任选地，通过暴露于环氧乙烷气体来将产品灭菌至10-6的无菌保证水平。

任选地，该产品还包括选自由抗坏血酸盐、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、氯丁醇、半胱氨酸、甘露醇、对羟基苯甲醚、烟酰胺、苯酚、丙二醇、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、水杨酸钠、硫代硫酸钠、生育酚、海藻糖组成的组的辐射防护剂。

任选地，该产品还包含任选地选自由乙酸钠、HEPES、柠檬酸钠、苯甲酸钠组成的组的缓冲液。

任选地，该产品还包括任选地选自由离子表面活性剂(即SDS)、羟丙基甲基纤维素、透明质酸、甘氨酸、葡聚糖组成的组的一种或更多种泡沫稳定剂。

任选地，多个离散的含酶蛋白基质片段一起形成单一产物。任选地，每个片段具有在0.1至10cm的范围内的直径。任选地，每个片段具有在1-5cm的范围内的直径。

表2示出了可用作上述产品的组分的合成外科用网状补片

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表3示出了生物外科用网状补片

可交联蛋白/多肽的共聚物

根据一些实施方案，也被称为聚(环氧乙烷)(PEO)或聚氧乙烯(POE)的聚乙二醇(PEG)作为共聚物被添加到蛋白/多肽或交联剂溶液中，以改善组合物的一种或更多种特性，例如(且没有限制地)增加组合物的柔性或免受身体对蛋白-交联剂组合物的免疫反应。PEG在从300Da到10MDa的宽的分子量范围内是可得到的，并且依据分子量可以是液体或低熔点固体。

取决于用于聚合工艺的引发剂的不同形式的化学改性PEG也是可得到的，其中最常见的是单官能甲基醚PEG(甲氧基聚乙二醇)。具有不同的几何结构的PEG也是可得到的。支链PEG具有从中心核心基团发出的3到10个PEG链。星形PEG具有从中心核心基团发出的10-100个PEG链。梳状PEG具有通常接枝到聚合物主链上的多个PEG链。所有这些类型的PEG应当被认为在本发明中是有用的。

PEG可以添加到蛋白-交联剂组合物的蛋白或交联剂组分中。优选地，PEG以在20:1到1:1蛋白:PEG之间的干重比被添加。PEG可以通过蛋白或交联剂的改性和/或PEG分子的改性被添加到蛋白组分或交联剂组分中。这种改性的一个例子是被称为聚乙二醇化的工艺。聚乙二醇化是将PEG结构共价地偶联到另一个更大分子上的行为。可以对蛋白或交联剂分子上执行这个工艺。

明胶聚乙二醇化实施方案在其许多优点之中不希望是限制性地具有以下优点，PEG是蛋白链的一部分，因此引起蛋白表面的特性的变化，所述特性包括但不限于电荷和亲水性；以及由于它的庞大而产生的空间效应。例如，在2009年6月18日提交的美国专利号8,367,388中描述了该实施方案，该专利与本申请共同被拥有，并且至少具有与本申请共同的一些发明人，该专利特此通过引用被并入，好像在本文充分阐述一样。结果，共价地连接的PEG可以对在蛋白链之间的分子间相互作用有深远的影响且继而对物理凝胶化和交联剂依赖性交联以及对通过这些方法制备的凝胶的机械特性有深远的影响。

在聚乙二醇化中使用的PEG分子通常被激活，意味着它们自发地与目标蛋白上的官能团起反应。聚乙二醇化的一个非限制性例子是使用PEG的NHS酯衍生物。这些活化的PEG分子与蛋白上的伯胺起反应，以形成酰胺键，释放N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)的释放。

蛋白可被改性的其他方式是通过使在赖氨酸链内和在蛋白链的氨基末端处发现的伯胺起反应。改性可以通过烷基化、琥珀酰化、氨基甲酰化或蛋白改性的任何其他方法。

在优选的实施方案中，可交联蛋白/多肽首先与活化的PEG起反应以产生聚乙二醇化的蛋白。通过方法例如但不限于透析、超滤和凝胶过滤色谱法来从过量的未反应PEG和其它反应产物中纯化聚乙二醇化的蛋白。然后聚乙二醇化的蛋白可以与交联剂起反应以形成交联凝胶。

也可任选地通过使用PEG胺作为以胺基为目标的交联剂的底物来添加PEG。交联剂使PEG分子通过它的末端胺基交联到蛋白分子上的交联剂底物，因而与蛋白上的天然胺基竞争。

PEG胺包括与胺官能团结合的PEG。这些以所有类型的PEG几何结构可商购获得。胺官能PEG产品的来源包括NOF(日本)、Nanocs(纽约)和Pierce Biotechnology(伊利诺伊州Rockford)。

在掺入PEG的所有方法中，交联可采用的天然底物的数量减少，导致减少的交联。这可能影响交联凝胶的机械特性，例如任选地允许它变得较不坚硬和更柔韧。此外且在不希望受到单一假设的限制的情况下，PEG分子本身可以充当增塑剂，并进一步有助于所得的凝胶的柔性。

根据优选的实施方案，PEG胺包含活性赖氨酸氨基酸。

根据本发明的另一个实施方案，将聚乙烯醇(PVA)作为共聚物添加到明胶或mTG溶液中，以增加蛋白-交联剂组合物的柔性或粘附性。PVA是具有高拉伸强度和柔韧性的水溶性合成聚合物。在高湿度环境中，例如在体内，PVA将吸收水。充当增塑剂的水可以接着降低PVA的拉伸强度，但增加它的伸长率。

根据一些实施方案，共聚物包括PVA-胺。当胺靶向交联剂被添加到溶液中时，蛋白和PVA-胺都将充当底物，且形成可比较的交联蛋白聚合物相比具有更好的柔韧性的蛋白-PVA共聚物。

在美国专利6107401中描述了可用于产生聚(乙烯醇)的胺官能衍生物的工艺的非限制性例子。

在美国专利4931501中描述了可用于产生PVA的胺共聚物的工艺的另一个非限制性例子，其中聚(乙烯醇)与氨基醛二烷基缩醛起反应。

先前也描述了通过两步骤工艺使用羰基二咪唑活化的二胺来合成胺改性的聚乙烯醇以产生具有不同程度的胺取代的PVA的工艺(Wittman M等人的Biophysical andTransfection Studies of an Amine-Modified Poly(vinyl alcohol)forGeneDelivery.Bioconjugate Chem.,16(6),1390-1398,2005)，作为另一个非限制性例子。

根据本发明的一些实施方式，提供了包括明胶、转谷氨酰胺酶和钙可交联藻酸盐基质的组合物。任选地，所述钙可交联藻酸盐基质以根据明胶的重量在每重量1到30％重量之间的重量比率且优选地以5到20％的比率被添加。

在示例性实施方案中使用的pH(pH 3.8)下，形成沉淀物。当形成这种沉淀物时，它可以任选地通过以合适的量添加合适的盐例如NaCl来溶解。在这个非限制性例子中且在不希望受到单一假设的限制的情况下，藻酸盐可能已经单独地沉淀，和/或明胶和藻酸盐可能已经形成从溶液沉淀的聚合电解质络合物。如前面所提到的，发现12gr/L或0.2M NaCl的添加溶解了沉淀物并使溶液澄清。

任选地，明胶、转谷氨酰胺酶、钙可交联藻酸盐基质、合适的量的合适的盐例如NaCl，任选地与额外的添加剂可以均匀溶解在溶液中。基于网状补片的组合物可以用上述相同的方法由所述溶液制备。

根据本发明的一些实施方式，提供了包括明胶、转谷氨酰胺酶和壳聚糖的组合物。

任选地，以与明胶重量比为1到100％之间的重量比率、更优选地以20到100％的比率添加所述壳聚糖。

表面活性剂

根据本发明的一些实施方案，将一种或更多种生物相容性表面活性剂添加到可交联蛋白或多肽的溶液中，例如以便降低该溶液的表面张力。

表面活性剂是润湿剂，其降低液体的表面张力，允许更容易的铺展，并降低在两种液体之间的界面张力。较低的表面张力便于更容易处理可交联肽的溶液，因为它更容易通过涂抹器，并且更容易与交联材料的溶液混合。表面活性剂还可以降低溶液的粘度。此外，当明胶溶液单独地或与mTG溶液一起被冻干时，降低明胶溶液的表面张力具有很大的效用，因为它可以防止在干燥明胶的顶层上的膜的形成。这种膜抑制冻干明胶重构为均质溶液。

在本发明的上下文中有用的生物相容性表面活性剂的非限制性例子是聚山醇酯20(Tween^TM20)、聚乙二醇十二烷基醚(Brij^TM35)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic^TMF-68)、月桂醇硫酸钠(SLS)或十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂醇醚硫酸钠或月桂基乙醚硫酸钠(SLES)、泊洛沙姆或泊洛沙胺、烷基聚葡萄糖苷、脂肪醇、脂肪酸盐、椰油酰胺单乙醇胺和椰油酰胺二乙醇胺。

表面活性剂也可用作增塑剂。例如Tween 80被示出降低几种亲水聚合物的玻璃化转变点(Tg)。在聚合物中的Tween80的较小分子的存在被认为稀释和削弱了在聚合物链之间的内聚相互作用。这通过增加在聚合物基质中的自由体积来减少摩擦和缠结(Ghebremeskel等人的2006,International Journal of Pharmaceutics 328:119-129)。

在本发明的一个优选实施方案中，一种或更多种表面活性剂用作增塑剂以改善交联组合物的弹性，特别是当它随着时间的推移而变硬时。

在另一个任选的实施方案中，一种或更多种表面活性剂与来自在上面被列出为与本发明相关的增塑剂的另一种增塑剂组合。Rodriguez等人(Food ResearchInternational 39(2006)840-6)展示了在增塑剂(甘油)和表面活性剂(Tween20、Span 80、卵磷脂)之间对增加非交联干明胶膜的弹性的协同效应。

优选地，表面活性剂以在溶液中的明胶的干重的0.1-5％的重量比率被添加明胶溶液中。可选地，将表面活性剂以大约等于溶液中的那个特定表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)的浓度添加到明胶溶液中。每种表面活性剂的CMC变化，且取决于表面活性剂溶解于的溶液的离子浓度。

冻干产品的配置

在本发明的一个实施方案中，形成干燥组合物，其中干交联剂材料完全分散贯穿可交联蛋白或多肽的冻干组合物。

在本发明的一个实施方案中，形成干燥或冷冻的组合物，其中可交联蛋白或多肽与无毒交联剂充分混合以形成均质溶液，并且溶液的温度立即降低以防止交联过程的完成。然后将混合的组合物冷冻或冷冻并干燥以形成新的均匀组合物。

在另一个实施方案中，蛋白是明胶，且在交联剂分散到整个这样的多孔泡沫中之前，未交联的明胶泡沫被冻干。

在另一个实施方案中，干交联剂材料被添加到明胶泡沫中，使得交联剂不溶解到泡沫中(即在冻干之前没有观察到交联活性)。

令人惊讶地发现，可重构泡沫可任选地由足够稳定的明胶溶液形成，以便允许以泡沫形式的明胶的冻干，而不添加任何稳定剂或交联剂。

在用于形成这种泡沫的本发明的优选例示性实施方案中，明胶溶液被制备并被保持在它处于液态形式的温度。然后，明胶溶液经受延长的且优选地连续的发泡工艺，同时它被冷却至低于它的溶胶-凝胶转变点的温度。

明胶溶液的浓度优选地在0.5％-20％w/w、更优选地5％-10％w/w的范围内。

明胶溶液的初始温度是30℃-70℃，优选地30℃-50℃，且更优选地35℃-45℃。在发泡工艺期间的环境温度是0℃-25℃，优选地15℃-25℃。发泡工艺的非限制性例子包括搅拌、混合、掺和和气体的注入。

优选地，发泡工艺包括搅拌或混合。

一种或更多种发泡技术可任选地用在发泡工艺中。可选地，一种发泡技术可任选地在不同条件下被使用多次：例如，温和搅拌以产生低水平的泡沫，后面是剧烈搅拌以在明胶泡沫中实现最大曝气。

在任选的实施方案中，在发泡完成时，明胶泡沫优选地被转移到容器中，该容器在发泡工艺完成时已经冷却到比明胶泡沫的温度低的温度。

在另一个实施方案中，明胶泡沫任选地且优选地在发泡工艺完成时立即快速冷却。快速冷却的一个非限制性例子是在发泡工艺之后立即将明胶泡沫暴露于液氮。

在一个优选的实施方案中，干明胶泡沫含有少于约15％的水分。在更优选的实施方案中，干明胶泡沫含有少于约10％的水分。

在另一个实施方案中，当发泡完成时，明胶泡沫任选地不通过冷却或其它方法来进一步稳定，使得泡沫部分地塌陷，导致在泡沫的底部上明胶泡沫的更致密层的形成。例如，任选地，一段时间例如且没有限制地高达10分钟消逝后再执行在这种稳定化被执行。如果稳定化包括冷却，任选地，在发泡后这种冷却被延迟2至10分钟。

在上面的实施方案中，更致密的层任选地包括冻干明胶组合物的厚度的小于约50％，优选地小于约35％，且更优选地小于约20％。

如在这里使用的密度指每体积冻干组合物的明胶重量的增加。这种增加可以任选地少至5％，但优选地大于约10％，且更优选地大于约20％。

在不希望局限于单一假设或封闭列表的情况下，认为明胶泡沫的这种致密层向冻干明胶组合物提供机械强度，而不影响干组合物的顶部的重构轮廓(profile)。

基于网状补片的组合物制备方法

不同的合适的制备方法可任选地用于制备基于网状补片的组合物。下面给出了各种示例性阶段，这些阶段可以任选地被不同地配置和重组。每个这样的示例性阶段可以任选地根据不同的方法来被执行，且其中每个方法可以任选地与如本文所述的任何其它制备方法组合。这些阶段以它们任选地被执行的顺序给出。

背衬(非粘性组分)涂敷可任选地包括刮刀涂布，即挤出材料的间隙控制器，因而确定所涂敷的涂层的湿厚度。此外或可选地，这种背衬涂敷可任选地包括气刀涂布、喷涂、丝网印刷或任何其它相关印刷工艺、旋涂、浸渍涂布、幕帘式涂布、溶液浇铸、用于涂覆聚合物分散体/溶液的层的任何其它合适的方法和/或熔融挤出(不涉及溶剂，仅加热聚合物)中的一种或更多种。

创建粘合剂基质的多孔结构可任选地包括(物理的)气体发泡，其涉及将加压惰性气体(例如氮气)引入到明胶溶液。此外或可选地，多孔结构的这种创建可以任选地包括(物理的)乳液冷冻干燥、(化学的)溶剂浇铸/颗粒沥滤、用超临界气体例如CO₂进行的(物理的)高压处理、(物理的和/或化学的)气体发泡/颗粒沥滤，例如用分散的碳酸氢铵盐颗粒进行、热致相分离、静电纺丝和/或快速原型制作(例如用3D打印机)中的一种或更多种。

接下来，例如在明胶溶液发泡之后，使用静态混合器执行明胶和酶的混合(混合元件通过穿过它的材料的运动而旋转)。在明胶溶液发泡后引入酶溶液。可以任选地执行各种方法，例如将明胶和酶一起混合在同一溶液中作为第一步骤，例如且没有限制地，以水包油或油包水乳液的形式混合和/或在明胶连续相中混合包封的酶微粒作为分散体。在另一个示例性方法中，在稍后的阶段中引入酶，例如且没有限制地，在预干燥的明胶基质上部署干燥的酶颗粒，和/或逐层涂敷交替的明胶和酶层。

下一个粘合剂层(明胶-酶发泡溶液)涂敷例如用刮刀涂布、即挤出材料的间隙控制器来执行，因而确定所涂敷的涂层的湿厚度。其它示例性方法没有限制地包括气刀涂布、喷涂、丝网印刷或任何其它相关印刷工艺、旋涂、浸渍涂布、幕帘式涂布、溶液浇铸、用于涂覆聚合物分散体/溶液的层的合适方法、喷射注塑和/或模塑(浇铸)。

可任选地以各种方式执行聚丙烯网状补片定位。例如且没有限制地，任选地，粘合剂层涂敷以两个步骤执行，在所述两个步骤中将聚丙烯网状补片定位在第一粘合剂层之上，然后第二粘合剂层覆盖所述网状补片。任选地，网状补片在泡沫涂敷之前或之后被定位。

可任选地通过将粘合剂发泡溶液直接涂敷在已经干燥的背衬上来执行粘合剂和背衬层的附着。此外或可选地，可以任选地通过下列操作中的一个或更多个来执行这种附着：单独干燥两个膜且然后通过合适的方法使它们附着，例如且没有限制地通过使用粘合剂(膜转移方法)或通过层压工艺。任选地，通过例如且没有限制地气刀涂布、喷涂、丝网印刷或任何其它相关印刷工艺、旋涂、幕帘式涂布、已知的用于涂覆聚合物分散体/溶液的层的任何合适方法和/或热熔融挤出。将背衬涂敷在已经干燥的粘合剂层的顶部上。

可以任选地通过在-20℃的冷干(冷冻-干燥)来执行粘合剂层的干燥。任选地也可以此外或可选地通过热风干燥、真空干燥中的一种或更多种或者通过保持产品冷冻直到涂敷来执行这种干燥。

网状补片装置尺寸

基于网状补片的组合物也可任选地被描述为具有特定尺寸的网状补片装置。这种尺寸的非限制性例子在下面和在图6中被提供。

尺寸可以任选地根据装置的形状而变化，例如作为矩形，任选地包括正方形，或者作为圆角形状，任选地包括椭圆形或圆形。直径(或者对于非圆角形状，从一个边缘到另一边缘的距离)可以任选地在从0.5cm到60cm的范围内。非限制性例子在图6中被给出为1cm和50cm。然而，任选地，这些尺寸仅涉及网状补片尺寸，而不涉及整个装置的尺寸。对于这种实施，总装置的尺寸在下面给出。

以平方厘米为单位的网状补片的面积任选地范围从0.5cm²到3600cm²。对于1平方厘米的装置，如果是圆角的网状补片的面积的非限制性例子被给出为0.8厘米，或如果不是圆角的网状补片的面积的非限制性例子则被给出为1厘米。根据其中装置的上述尺寸不包括例如边缘和/或以其他方式与装置的总尺寸无关的那些实施，网状补片的面积不一定是装置的总面积。

边缘尺寸是装置的延伸到网状补片之外的部分，其可以任选地包括例如粘合剂。边缘尺寸任选地在从0.01至10cm的范围内。非限制性例子在图6中被给出为0.1cm和5cm。边缘尺寸作为直径或边缘到边缘距离的百分比任选地范围从0.1％到10％。

边缘的面积任选地从0.0001cm²到1200cm²，但是对于圆角形装置优选地从0.1cm²到900cm²，对于方形装置优选地从0.1cm²到1100cm²。

当与上面给出的尺寸不同时，总装置的面积任选地对于圆角形装置范围从0.5cm²到3000cm²，而对于方形装置范围从0.5cm²到4000cm²。

边缘面积作为网状补片面积的百分比任选地范围从0.1cm²至14,000cm²。边缘面积作为总装置面积的百分比任选地范围从0.1％至100％。

根据在图2A中给出的符号，装置的不同参数的厚度的尺寸任选地对于d1(从装置边缘到网状补片的粘合剂层厚度)(μm)范围从0到10000；对于d2(从网状补片到粘合层的粘合剂层厚度)(μm)范围从0到10000；对于d3(被围在网状补片内的泡沫的厚度)(μm)范围从100到2500；对于d4(背衬的厚度)(μm)范围从1到2000；以及对于d5(粘合层的厚度)(μm)范围从1到100。总厚度(μm)范围从101到24600。

装置的不同参数的厚度的尺寸的比率(作为百分比)任选地对于背衬厚度占泡沫厚度的百分比范围从0.004到2000.000；以及对于背衬占总厚度的百分比范围从0.004到1980.198。

泡沫密度(g/ml)任选地范围从0.001至0.1。

任选地，本文所述的所有尺寸、百分比和其他参数值可以增加或减少10％，并且仍然被认为在如本文所述的本发明的范围内。

实施例

现在对下面的实施例进行参考，实施例与上述描述一起以非限制性方式示出本发明的一些实施方案。

实施例1：

如本文所示的，以基于网状补片的组合物为特征的结构的各种示例性实施是可能的，并且被认为落在本发明的范围内。

图1示出了装置设计的俯视图，该装置设计包括粘合剂覆盖的网状补片的部分和围绕网状补片-粘合剂部分的仅粘合剂的部分。

图2A示出了装置的侧视图，该图以粘合剂在所有方向上围绕网状补片的方式描绘在粘合剂中的网状补片的可选放置。图2B示出了层的分解图。

下面在表4中提供网状补片材料和相关组合物的非限制性例子。

表4

粘合剂可任选地如在美国专利号号8,961,544B2中所描述的那样被组成，该专利好像在本文被充分阐述一样特此通过引入被并入，与本申请共同被拥有，并且至少具有与本申请共同的一些发明人。如上面给出的其它材料和参数仅仅是例子，而没有任何限制的意图。

实施例2：

使用垂直机电测试系统(英国Instron)来测试各种底物对湿乳胶手套的粘性。使用两种类型的背衬：交联(CL)明胶和HPMC。背衬覆盖一层未交联的发泡明胶。扁平的附件连接到Instron头上，乳胶手套紧紧地附着到该Instron头。在附着到Instron之前，将乳胶手套浸入0.9％盐水中。用双面胶带将发泡粘合剂和背衬的样品连接到底部平板上。垂直地压缩Instron头，直到获得0.3-0.9N的力为止。保持该力一秒钟，并执行伸长，同时通过50N称重传感器测量伸长负载。

数据清楚地表明，背衬降低发泡明胶层的粘性，并且与在乳胶手套自身之间的粘性没有区别。结果显示在图3中，图3示出了各种背衬和组合物组合的相对粘性的测量。

实施例3：

背衬通过浇铸被制备为膜，且在干燥后被切成1cm宽的条并放置到垂直机电测试系统(英国Instron)的保持架中。薄膜长度为5厘米。在底部和上部保持架上设置背衬，其中底部保持架是固定的，以及上部保持架连接到50N称重传感器。在此之后，执行样品的拉伸伸长。伸长速率被设定为0.5毫米/秒，同时测量拉伸应力和应变。

数据显示，当添加增塑剂时HPMC背衬变得更有弹性，并且这种效应是浓度相关的。当比较相同的量时，PEG400是比山梨醇更好的增塑剂。结果在下面的表5中示出。

表5-增塑剂对弹性的影响

背衬组合物	％增塑剂	％伸长
			1％HPMC	0	1.11
1％HPMC+0.1％PEG400	9.1	3.49
			1％HPMC+0.3％PEG400	23	9.74
1％HPMC+0.1％山梨醇	9.1	1.87
			1％HPMC+0.3％山梨醇	23	4.57

实施例4：

这个实施例涉及周围的粘合剂边缘部分(图1中的A)及其在体内的性能；图4示出了使用明胶-mTG粘合剂基质固定到体内的腹膜组织上的轻质网状补片。这个图像示出了通过腹腔镜插入到适当的位置内并施加到猪腹膜的基于网状补片的装置。所施加的网状补片的尺寸为15x 15cm的外科用网状补片，其被粘合剂包围并被背衬层((HPMC(k100)+HPMC(k4))和由Plasdone C17组成的粘合层加上在外围上的1cm边缘覆盖，边缘仅包括粘合剂和背衬(与粘合层连接)而没有网状补片。在图像中可以看到这些边缘具有与装置的中心和在手术部位周围的组织稍微不同的颜色。在这种植入中，由于粘合剂层和背衬而成功地粘附到组织上的网状补片防止对手术工具的任何粘性。

实施例5：

该实施例涉及基于网状补片的组合物的制备的非限制性示例性方法。

如在图5的左手分支上用蓝色所示的，粘合剂组合物任选地如下被制备。明胶溶液任选地首先用气体——优选地惰性气体例如氮气——发泡。接下来，发泡溶液与酶溶液混合。然后，该粘合剂组合物任选地通过将粘合剂层涂敷在非粘合剂层上并然后嵌入网状补片来与非粘性组分如HPMC组合。然后该网状补片-组合物组合任选地首先在-70℃至-80℃被冷冻，且然后在-20℃至15℃被冷冻干燥。

表6涉及在工艺的各阶段制备的各种任选的和非限制性的方法。

表6-工艺备选方案

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图6提供了根据上述工艺制备的贴片的各种贴片形状的一些可选尺寸、最小值和最大值。图1示出了给定的尺寸如何与产品相关。特别是，字母“A”示出粘合剂存在的部分，而字母“M”指示网状补片和粘合剂都存在。下面的尺寸在图6中给出，并在下面被解释：

d1-从装置的底部到外科用网状补片的粘合剂的厚度

d2-从外科用网状补片到粘合层的粘合剂的厚度

d3-外科用网状补片的厚度

d4-背衬的厚度

d5-粘合层的厚度

实施例6-使用乙酸来抑制过程中的mTG酶

通过降低pH值在网状补片制备工艺的整个“湿”部分中抑制mTG酶有助于防止明胶溶液的过早交联。

方法：

明胶溶液的制备-9％w/w(例如pH 3.8)：

将12285克纯净水预热至40-45℃。将1350g明胶逐渐添加到容器，同时用锥形顶置式搅拌器搅拌。

在明胶的完全溶解后，将1365克3M乙酸(与1640克PW混合的360克100％冰乙酸(J.T Baker))添加到容器，同时搅拌5分钟。用pH计测试pH为3.8±0.5。

以相同的方式，制备具有5.5、4.0和3.5的pH的明胶溶液。添加包含柠檬酸钠缓冲液50u/ml的纯mTG酶溶液(下面所述制备)以包含40u/g明胶。

图7通示出了过粘度计测试的pH对mTG活性的影响。在pH 5.5(天然的)、4和3.5中的9％明胶与40u/ml酶溶液在37℃(2:1)混合。对于pH 3.5(用*指示)，测试在15分钟后停止，因为粘度没有上升到0.1％以上。

实施例7-用于创建多孔粘合层的方法

使用加压气体的物理曝气

图8示出了以料斗为特征的曝气和混合系统的示意图，凝胶溶液被放置在料斗内用于曝气。曝气出现在混合头处，后面是通过温控管道的移动。在mTG溶液的注入后，静态混合出现。材料然后通过流动歧管流出。

方法：

明胶溶液的制备-9％w/w，pH＝3.8,15kg；将12285克纯净水预热至40-45℃。将1350g明胶逐渐添加到容器，同时用锥形顶置式搅拌器搅拌。在明胶的完全溶解后，将1365克3M乙酸添加到容器，同时搅拌5分钟。用pH计测试pH为3.8±0.5。

微生物转谷氨酰胺酶溶液的制备

将56.5克浓缩的纯mTG溶液(885U/ml)与943.5克20mM柠檬酸钠溶液混合，以产生稀释的mTG溶液(50u/ml)。

酸化的明胶溶液被泵送到曝气机，其中加压氮气被引入到压力室，以达到0.28g/ml±0.02的湿泡沫密度。

在整个系统中的泡沫流量保持6Kg/hr的流速，并且它的温度通过双护套管被调节，以保持明胶溶液高于它的转变温度，防止它冷冻。

在整个流线的中途，在室温的酶溶液以15ml/min的速率通过管线中的阀被引入。

在管(～2m长)内的静态混合元件允许mTG溶液和明胶溶液泡沫的充分混合。

混合的明胶-mTG泡沫在用作模具的PEEK(聚醚醚酮)平板的顶部上的管线的末端处被喷射。SurgicalMesh(SurgicalMesh,USA)外科用网状补片假体被预先固定到PEEK模具上，使得在模具的顶部上涂覆的泡沫完全覆盖它。

然后用刮刀涂布机将泡沫挤出至期望厚度(在1000和1500微米之间)。

将带有泡沫涂覆的网状补片的PEEK模具插入到-80C冰箱用于冷冻。

在1.5小时后，将模具转移到冻干机(Virtis Genesis EL,SP Scientific)用于冷冻-干燥工艺(见表7)。

表7-冷冻干燥程序

在冷冻-干燥后，通过容易地将泡沫层从PEEK模具剥离来获得由含有明胶和mTG的干混合物的1.0-1.5mm泡沫涂覆的网状补片物品。

结果

图9示出了通过在实施例7中描述的方法制备的明胶-mTG干泡沫物品的横截面的SEM图像；

图10示出了通过在实施例7中描述的方法制备的明胶-mTG干泡沫物品的粘合表面的SEM图像。

实施例8-在水溶液中的非共晶明胶的冷冻-干燥

方法：

通过在50℃将Bloom 275明胶颗粒(美国Gelita)在DW中混合1小时来制备在水中的不同浓度的明胶的溶液。

通过乙酸6M(BioLab)的滴定来将溶液酸化至pH＝3.8。

在最终混合阶段中，将50U/ml的浓度的纯mTG储备溶液以80U/g明胶的比率添加到溶液中。溶液充分混合1分钟。在添加所有材料后，溶液包含水中的2.5％和1.5％的明胶(w/w)。

溶液冷却下来并保持24.5℃一整夜，略高于明胶溶液的冷冻-融化转变点。

Vitamesh Blue(爱尔兰Proxy)疝假体15cm圆形物品固定在用作模具的PEEK平板上，该PEEK平板被预先冷却至5℃。使用刮刀涂布机来将酸化明胶-酶混合物以1-1.5mm层涂敷在PEEK平板上，覆盖Vitamesh Blue物品。

将所涂覆的板插入到-80℃的冰箱1.5小时且在冷冻后插入到冻干机(VirtisGenesis EL,SP Scientific)用于与在上面的表7中所述的相同的冷冻干燥工艺。

在检查前，将干燥的泡沫涂覆的物品从PEEK板剥离。

在胶原蛋白上的搭接剪切力方法中的固定强度：

将被切割成6×7cm(W×L)大小的胶原蛋白片浸泡在0.9％盐水中直到水合为止，且然后加热至36-37℃。通过将整个基于网状补片的组合物物品切割成5×7cm(W×L)的块并用胶带覆盖7cm中的2cm以便用试验机夹住来制备样品。将基于网状补片的组合物样品施加到预热的胶原蛋白片上，并允许在37℃培养箱中固化4分钟。

对于在时间零处的测试：在4分钟固化后，立即使用3433型Instron万能试验机用搭接剪切法来测试样品。

对于在盐水中浸泡24小时之后的测试；将样品放置在填充有盐水的培养皿中，然后留在37℃培养箱中24小时。在24小时后，使用3433型Instron万能试验机用搭接剪切法来测试样品。

结果

表8示出了测试的结果。如所示，理想的明胶含量为至少2％，且优选地至少2.5％。

*为了测量起见，将约50微米厚的交联明胶背衬层附着在样品的背面。

实施例9-网状补片的精确定位

根据至少一些实施方案，特定外科用网状补片关于明胶泡沫的定位可以增加期望的特性，包括在组织包埋方面的特性。令人惊讶的是，发明人已经发现，不希望受到单一假设的限制，在泡沫涂层内的网状补片的位置可以降低在组织上的产品应用的初始阶段组织对假体的反应程度。

方法：

在下面的实施例中，没有使用粘合层，因为粘合剂层直接涂覆在预固化的背衬层上，当粘合剂层干燥时将它们粘合在一起。

通过涂覆PEEK平板来制备背衬层：

背衬溶液：1％HPMC K100(Ashland)、1.7％HPMC K4(Ashland)、0.9％PEG 400(Merck)

背衬浇铸：将背衬溶液倒在PEEK衬里上，并使用刮刀涂布器(刮片)，以便调整它的高度(1100μm)。

溶液在室温干燥至少24小时。

如上所述，在使用加压气体的物理曝气下制备明胶-mTG泡沫(在水和乙酸中的9％w/w明胶，pH＝3.8，mTG浓度-80U/g明胶)。

为了将Vitamesh Blue外科用网状补片放置在表9中所示的不同位置的粘合剂层中，实施下面的工艺修改。

表9-测试网状补片关于粘合剂层的放置的修改

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*对应于上面的图2A

**设计意图为是中间和表面交替的部分，使得网状补片暴露在浅部分中。实际上，在这些部分中，网状补片完全被泡沫覆盖。

结果：

图11A示出LM-147物品的横截面的SEM图像——网状补片嵌在泡沫的中间中。图11B示出LM-149物品的横截面的SEM图像——网状补片位于底部(表面)处。图12A示出了LM-147物品的底面的SEM图像——外科用网状补片是不可见的，因为它被泡沫完全覆盖。图12B示出了LM-149物品的底面的SEM图像——外科用网状补片位于表面水平处，没有完全被覆盖。图13A示出了在作为组织模拟基底的胶原蛋白上固定后的LM-149的SEM图像(胶原蛋白是底层)。图13B示出了在作为组织模拟基底的胶原蛋白上固定后的LM-147的SEM图像(胶原蛋白是顶层)。

图14示出了在固定后4分钟通过搭接剪切法测试的在胶原蛋白上的不同模型的固定强度。测试方法如在关于在水溶液中非共晶明胶的冷冻-干燥的章节中所述的被执行。

图15示出了在植入后的不同的日子通过搭接剪切法测试的在猪腹膜组织上的不同模型的固定强度(研究AT-05-55)。对组织的固定在体外测试。在0、3和7天时间点的测试方法：将基于外植网状补片的组合物样品切割成样品4×7cm(W×L)，将1cm的网状补片从在7cm边缘上的组织分离用于夹持，留下4×6cm的有效测试区域。使用Instron万能试验机用搭接剪切法来测试样品，同时在一侧上只有组织被夹持，而在另一侧上只有网状补片被夹持。第1天通过打开腹壁、分离用于夹持的基于网状补片的组合物(留下4×6cm测试面积)和使用测力仪用搭接剪切力拉来测试样品。

图16示出了7天后从猪外植的样品的代表性组织病理学图像。左-LM-147，右-LM-149。在泡沫中的网状补片的原始位置影响在网状补片周围的向内生长的新组织量(相对于LM-147，在LM-149中更高)。

实施例10-粘合层-泡沫面密度

假设泡沫的多孔明胶结构对于在外科用网状补片内的快速组织整合很重要。这是因为泡沫的高有效表面积增加了在身体内的酶分解的可用性，使交联明胶的快速降解(在几天内)成为可能。当交联明胶降解时，它为新组织的渗透和增殖留出空间，包封外科用网状补片纤维封，并将它牢固地固定到位。另一方面，增加每面积的泡沫负载可有助于对交联明胶凝胶基质的强度，交联明胶凝胶基质是在植入后几天内的主要承载固定元件。因此，寻求在快速组织整合和凝胶基质的初始固定强度之间的最佳关系。

方法：

注意-在下面的例子中，没有使用粘合层，因为粘合剂层直接涂覆在预固化的背衬层上，当粘合剂层干燥时将它们粘合在一起。

明胶-mTG泡沫(在水和乙酸中的9％w/w明胶，pH＝3.8，mTG浓度-80U/g明胶)如在上面关于关于用气体发泡的章节中描述的制备。

如表10所示，实施下面的工艺修改。

表10-工艺修改

*对应于上面的图2A

结果

表11示出了不同泡沫深度涂敷的结果，在左列中深度较大(2000微米)且在右列中的深度较低(1400微米)。

表11-泡沫深度的影响

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实施例11-交联明胶的背衬替代物和粘附屏障特性

该产品包含嵌在水活化的粘合剂涂层中的外科用网状补片。如在临时申请中所述的，它还包含背衬层，该背衬层防止产品粘到它的背面(即到外科医生使用来应用产品的手套、手术工具等)。

在腹膜内网状补片植入中所需的另一个重要特征是防止植入物粘附到内脏器官，例如肠、肝、脾和膀胱。这种特性通常被称为“粘附屏障”，并且在现有技术中是已知的。

在整个开发中检查两种非粘性背衬形式：

第一种背衬形式是基于HPMC的(羟丙基甲基纤维素K4M 22.3％wt，羟丙基甲基纤维素K100M 44.6％wt，PEG 400 33％wt)。HPMC背衬仅用于防止产品粘附到手术工具和湿手套的目的。它是水溶性的，因此它在植入后几小时内溶解在腹腔内存在的液体中。粘附屏障特性来自剩余的明胶层，其完全覆盖外科用网状补片并且已经完全被交联，同时基于HPMC的背衬被溶解掉。

第二种背衬形式是基于交联明胶的(明胶70％，mTG-5U/g明胶，PEG 400 30％wt)。交联明胶背衬与原位交联粘合剂明胶-mTG层融合，以成为连续的交联明胶基质。在涂敷在组织上期间，它是非粘性的，因为它已经被交联，因此防止粘在它的背面中，并且它还用作对粘合剂的额外增强，增加了总凝胶质量。由于它是非粘性的，也是对内脏器官的粘附屏障。

方法

HPMC背衬(GF-199)：

溶液：1％HPMC K100(Ashland)，0.3％PEG400(Aldrich)，高压灭菌的。

工艺：特氟隆涂覆的托盘(12cm×17cm和9.5cm×9.5cm)分别填充有60ml和26ml溶液，并被允许在室温干燥

热交联明胶背衬(GF-200)：

溶液：1％明胶225A型(Gelita)，通过0.2μm过滤器过滤。

工艺：将约60ml溶液倒入9.5cm×9.5cm涂有特氟隆的托盘中。允许溶液在室温干燥，然后在烘箱中在160℃孵育2-4小时。

酶交联明胶背衬(LM-274)：

溶液：5％明胶(Gelita)、2.1％PEG 400(Merck)+5u纯mTG酶(TP1701)/g明胶(在溶胶中的总量)。

工艺：在没有酶的情况下制备溶液。在将溶液涂敷在衬里上之前，添加酶、混合，且然后使用间隙控制器(刮刀)涂敷溶液并设定为1000μm高度。允许背衬在室温干燥(同时通过酶来交联)。

结果

对于两种模型：LM-274(基于交联明胶的背衬层)和LM-216(基于HPMC的背衬层)，在0.9％盐水溶液中浸泡24小时后测试对胶原蛋白的固定强度。结果如下被显示在表12中。

表12-交联明胶与HPMC背衬的影响

图17示出了表示在植入后14天对照网状补片(裸外科用网状补片)和基于网状补片的组合物^TM(覆盖有粘合剂的外科用网状补片)组GF-199(交联明胶)、GF-200(HPMC)被粘合剂覆盖的表面积百分比的箱形图。使用物品在猪内的腹膜内植入来执行这项研究。该实施例展示HPMC或交联明胶中的任何一种可任选地用作背衬。

实施例12-基于明胶-藻酸盐网状补片的组合物

明胶/藻酸盐溶液的制备

将300g纯净水加热至约40℃。将8.35g明胶粉末(Gelita，A型明胶，Bloom 275)被添加到加热的水中并用磁力搅拌器混合，直到均匀为止。

将98.35g纯净水加热至约40℃。将1.68g低粘度海藻酸钠(Sigma Aldrich，目录号A0682)添加到加热的水中并用磁力搅拌器混合，直到均匀为止。

将藻酸盐溶液添加到明胶溶液中并混合。当藻酸盐和明胶溶液混合时出现相分离时，添加3.4ml 6M乙酸(BioLab，以色列)和5.7g NaCl(Merck)，直到混合物pH值为3.8的下且溶液是清澈的为止。

添加74.72g纯净水以达到490.5g的重量。

明胶/藻酸盐涂覆的外科用网状补片的制备(批次#GF-502)

将50U/ml的浓度的纯mTG酶储备溶液以80U/g明胶的比率添加到酸化明胶-藻酸盐溶液中。将溶液彻底地混合1分钟。

将Vitamesh Blue(Proxy，爱尔兰)疝假体15cm圆形物品固定在用作模具的PEEK平板，该PEEK平板被预先冷却至5℃。使用刮刀涂布机将酸化明胶-藻酸盐-酶混合物以1-1.5mm层涂敷在PEEK平板上，覆盖Vitamesh Blue物品。

在检查前，将干燥的泡沫涂覆的物品从PEEK板剥离。

用钙源测试明胶/藻酸盐LifeMesh(GF-502)应用后1天的固定强度。

将LifeMesh切割成样品5×7cm(W×L)，并用胶带覆盖2cm的长度，以允许有个空间来用试验机夹住样品。将胶原蛋白片切成6×7cm(W×L)的块，并预热到36-37℃，同时用盐水浸泡过的纱布覆盖。LifeMesh样品被施加到胶原蛋白，并被允许在37℃培养箱中固化4分钟。在固化后，将样品浸入0.9％盐水/含有钙源(CaCl₂)的0.9％盐水中。将样品保持在37℃下24小时，然后使用3433型Instron万能试验机用搭接剪切法测试。

图18示出了在固定后24小时，通过搭接剪切法测试的，在胶原蛋白上的基于明胶-藻酸盐网状补片的组合物(批号GF-502)的固定强度。GF-502物品在胶原蛋白上施加后被浸入0.9％盐水或添加50mM CaC12的0.9％盐水中24小时。

实施例13-基于明胶-壳聚糖网状补片的组合物

制备明胶(Gelita，A型明胶，Bloom 275)和低MW壳聚糖(Aldrich目录号448869)的三种混合物(见表13)，每种混合物具有2％w/w的总固体含量和300g的总重量。

用乙酸将混合物调到pH 3.8，以便允许壳聚糖的溶解。添加mTG到每克明胶80U的最终比率。

表13-基于明胶-壳聚糖网状补片的组合物：

批号	％壳聚糖	壳聚糖(gr)	明胶(gr)	乙酸(ml)
					GF512	5	0.3	5.7	5.4
GF511	10	0.6	5.4	5.7
					GF510	20	1.2	4.8	9

将溶液冷却至16℃，使用刮片以250μm的层厚度浇铸在PEEK板上。将外科用网状补片被放置在液体层上且将组合物在4℃下冷却下来。使用刮片将另一层以1700μm的厚度放置在外科用网状补片的顶部上。然后将涂覆的网状补片在-80℃冷冻并冻干。

如在实施例12中所述的，测试所得的干的涂覆的网状补片对胶原蛋白的固定强度。

图19示出了在固定后24小时过搭接剪切法测试的在胶原蛋白上的基于明胶-壳聚糖网状补片的组合物(批号GF-510、GF-511、GF-512)的固定强度。在胶原蛋白上施加后物品被浸没在0.9％盐水中24小时。

应认识到，为了清楚而在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合地被提供。相反，为了简洁而在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征还可以单独地或以任何合适的子组合被提供。

尽管本发明已经结合其特定的实施方案被描述，但显然许多备选方案、修改和变形将对本领域中的技术人员是明显的。相应地，意图是包括落在所附权利要求的精神和宽范围内的所有这样的备选方案、修改和变形。在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在好像每个单独的出版物、专利或专利申请特定地且单独地被指示为通过引用并入本文的相同程度上，通过引用被全部并入本说明书中。此外，在本申请中的任何参考文献的引用或识别不应被解释为承认这样的参考文献作为本发明的现有技术是可获得的。

本申请还涉及以下内容：

1)一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及一种或更多种交联材料，其中所述网状补片的至少一部分被所述涂层涂覆，并且其中所涂覆的网状补片组合物包括不需要额外固定并且能够在施用时最小化组织粘附的自粘附外科用网状补片。

2)根据1)所述的组合物，其中所述网状补片包括复合网状补片，所述复合网状补片包括所述一种或更多种可交联蛋白和所述一种或更多种交联材料的发泡组合物。

3)根据2)所述的组合物，其中所述复合网状补片是片状形式。

4)根据1)-3)中的任一项所述的组合物，其中所述可交联蛋白或多肽包括明胶。

5)根据4)所述的组合物，其中所述明胶是发泡的。

6)根据5)所述的组合物，其中明胶泡沫在1到100mg/cm³的密度范围内，且优选地在1到50mg/cm³的范围内。

7)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述发泡明胶包括干燥或冻干的发泡明胶。

8)根据7)所述的组合物，其中在发泡之前，明胶溶液的浓度在0.1％和30％w/w之间

9)根据8)所述的组合物，其中在发泡之前，所述明胶溶液的浓度在1％和20％w/w之间。

10)根据9)所述的组合物，其中在发泡之前，所述明胶溶液的浓度在5％和15％w/w之间。

11)根据4)-10)中的任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种交联材料包括转谷氨酰胺酶。

12)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述复合网状补片以整合的外科用网状补片为特征。

13)根据上述项中的任一项所述的组合物，包括两个部分，其中一部分包括被围在粘合剂组合物内的网状补片，而另一部分仅包含所述粘合剂组合物，而在它内没有网状补片。

14)根据上述项中的任一项所述的组合物，还包括非粘性的保护性背衬。

15)根据14)所述的组合物，其中所述背衬包括一种或更多种纤维素醚衍生物和/或交联明胶。

16)根据15)所述的组合物，其中所述背衬包括HPMC(羟丙基甲基纤维素)、HPC(羟丙基纤维素)、HEC(羟乙基纤维素)或EC(乙基纤维素)。

17)根据上述项中的任一项所述的组合物，包括非粘性背衬层，所述背衬层单独地或组合地包括水可侵蚀的成膜性药学上可接受的聚合物，例如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、胶原蛋白和衍生物、明胶、白蛋白、聚氨基酸和衍生物、聚磷腈、多糖和衍生物、几丁质和壳聚糖。

18)根据14)-17)中的任一项所述的组合物，其中所述背衬层在植入后保留多达1个月。

19)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种可交联蛋白包括明胶，并且还包括选自由胺化PEG、胺化PVA、藻酸盐和壳聚糖组成的组的可交联材料。

20)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中只有所述网状补片在植入后一个月之后被保留。

21)根据1)所述的组合物，其中所述网状补片包括复合网状补片，所述复合网状补片包括所述一种或更多种可交联蛋白和所述一种或更多种交联材料的非发泡组合物。

22)一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及一种或更多种交联材料，其中所述网状补片的至少一部分被所述涂层涂覆，并且其中所述涂层包括所述一种或更多种可交联蛋白和所述一种或更多种交联材料的发泡组合物。

23)一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及能够交联所述一种或更多种可交联蛋白或多肽的酶，其中所述网状补片的至少一部分被所述涂层覆盖，并且其中所述涂层包括所述一种或更多种可交联蛋白和所述酶的发泡组合物，条件是所述蛋白或多肽不是纤维蛋白或纤维蛋白原，其中所述酶包括转谷氨酰胺酶或多铜氧化酶中的一种或更多种。

24)一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及一种或更多种交联材料，其中所述网状补片的第一部分被围在所述涂层内，并且其中所述涂层包括所述一种或更多种可交联蛋白和所述一种或更多种交联材料的发泡组合物，并且其中所述网状补片的第二部分没有被围在所述涂层内。

25)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述蛋白包括明胶，所述涂层包括所述发泡组合物，并且其中所述发泡组合物具有在1至100mg/cm³的密度范围内的密度。

26)根据25)所述的组合物，其中所述密度在1至50mg/cm³的范围内。

27)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中在发泡之前，明胶溶液的浓度在0.1％和30％w/w之间。

28)根据27)所述的组合物，其中在发泡之前，所述明胶溶液的浓度在1％和20％w/w之间。

29)根据28)所述的组合物，其中在发泡之前，所述明胶溶液的浓度在5％和15％w/w之间。

30)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述发泡明胶包括干燥的或冻干的发泡明胶。

31)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述涂层包括所述发泡组合物，并且其中所述发泡组合物根据选自由批量混合工艺、连续混合工艺、化学发泡工艺、文丘里发泡工艺和冷冻干燥组成的组中的工艺而发泡。

32)根据31)所述的组合物，其中所述涂层包括所述发泡组合物，并且其中所述发泡组合物用气体发泡。

33)根据上述项中的任一项所述的组合物，还包括壳聚糖。

34)根据上述项中的任一项所述的组合物，还包括钙和钙可交联藻酸盐基质。

35)一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括钙、明胶、转谷氨酰胺酶和钙可交联藻酸盐基质。

36)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述网状补片包括外科用网状补片。

37)根据36)所述的组合物，其中所述外科用网状补片包括疝网状补片。

38)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述网状补片的第一部分被围在所述涂层内，并且其中所述网状补片的第二部分没有被围在所述涂层内。

39)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述涂层组合物延伸到所述网状补片之外，使得所述装置的总面积大于所述网状补片的总面积。

40)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种交联材料包括转谷氨酰胺酶，其中所述转谷氨酰胺酶的活性水平为从约1至约500U/g明胶。

41)根据40)所述的组合物，其中所述活性水平为从约5至约120U/g明胶。

42)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种交联材料包括转谷氨酰胺酶，并且所述一种或更多种可交联蛋白或多肽包括明胶，其中明胶与转谷氨酰胺酶的重量比在从约50:1至约5000:1的范围内。

43)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种交联材料包括转谷氨酰胺酶，并且其中所述转谷氨酰胺酶包括植物、重组动物和/或除了血源性因子XIII以外的微生物来源的转谷氨酰胺酶。

44)根据43)所述的组合物，其中所述转谷氨酰胺酶包括微生物转谷氨酰胺酶。

45)根据44)所述的组合物，其中所述微生物转谷氨酰胺酶从选自由茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)、巴氏轮枝链霉菌(SteptoverticilliumBaldaccii)、吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)菌株或大肠杆菌(EscherichiaColi)中的一种或更多种组成的组的微生物产生。

46)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述明胶由动物来源、重组来源或其组合产生。

47)根据46)所述的组合物，其中所述动物来源选自由鱼和哺乳动物组成的组。

48)根据47)所述的组合物，其中所述哺乳动物选自由猪和牛组成的组。

49)根据48)所述的组合物，其中所述明胶为A型(酸处理的)或B型(碱处理的)。

50)根据49)所述的组合物，其中所述明胶包括高分子量明胶。

51)根据50)所述的组合物，其中所述明胶具有至少约250的bloom。

52)根据46)所述的组合物，其中使用细菌、酵母、动物、昆虫或植物系统或任何类型的细胞培养物来产生所述重组明胶。

53)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述明胶被纯化以除去盐。

54)根据上述项中的任一项所述的组合物，还包括额外的止血剂。

55)根据54)所述的组合物，其中所述额外的止血剂包括白蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白、凝血酶、壳聚糖、硫酸铁或其他金属硫酸盐中的一种或更多种。

56)根据上述项中的任一项所述的组合物，还包括增塑剂。

57)根据56)所述的组合物，其中所述增塑剂选自由阿拉伯树胶、瓜尔胶、PVA、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸烷基酯、甘油酯、邻苯二甲酸烷基酯、癸二酸烷基酯、蔗糖酯、山梨糖醇酯、乙酰化单甘油酯、甘油、脂肪酸酯、二元醇、丙二醇、月桂酸、蔗糖、三乙酸甘油酯、泊洛沙姆、邻苯二甲酸二乙酯、食用脂肪或食用油的单甘油酯和二甘油酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、聚山梨醇酯、聚乙二醇200到12,000、Carbowax聚乙二醇组成的组。

58)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述基于网状补片的组合物不以背衬层为特征。

59)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述基于网状补片的组合物以包括可再吸收材料的背衬层为特征。

60)根据59)所述的组合物，其中所述可再吸收材料选自由纤维素、氧化纤维素、蛋白质物质或碳水化合物物质组成的组。

61)根据60)所述的组合物，其中所述可再吸收材料选自由羟丙基甲基纤维素、纤维蛋白、角蛋白、胶原蛋白、明胶、藻酸盐、几丁质、纤维素、蛋白聚糖、乙醇酸聚合物、乳酸聚合物或乙醇酸/乳酸共聚物组成的组。

62)根据上述项中的任一项所述的组合物，还包括藻酸酯、阿拉伯树胶、高粘度羧甲基纤维素(CMC)、黄原胶、瓜尔胶、果胶和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。

63)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述可交联材料包括明胶，还包括能够共价结合到所述明胶的PEG(聚乙二醇)衍生物。

64)根据63)所述的组合物，其中所述PEG衍生物包括胺化PEG衍生物。

65)根据64)所述的组合物，其中所述胺化PEG衍生物包括PEG胺。

66)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述可交联材料包括明胶，还包括能够共价结合到所述明胶的PVA(聚乙烯醇)衍生物。

67)根据66)所述的组合物，其中所述PVA衍生物包括胺化PVA衍生物。

68)根据67)所述的组合物，其中所述胺化PVA衍生物包括PVA胺。

69)根据上述项中的任一项所述的组合物，其中所述网状补片是合成的或生物的。

70)根据69)所述的组合物，其中所述网状补片是可降解的。

71)根据69)所述的组合物，其中所述网状补片是不可降解的。

72)一种包括任何上述项的所述组合物的装置，被构造为矩形或圆角形状。

73)根据72)所述的装置，其中所述矩形包括正方形。

74)根据72)所述的装置，其中所述圆角形状包括椭圆形或圆形。

75)根据72)-74)中的任一项所述的装置，其中直径或从一个边缘到另一边缘的距离在从0.5cm至60cm的范围内。

76)根据75)所述的装置，其中以平方厘米为单位的所述网状补片的面积范围从0.5cm²至3600cm²。

77)根据75)或76)所述的装置，其中边缘尺寸在从0.01至10cm的范围内。

78)根据77)所述的装置，其中作为直径或边缘到边缘距离的百分比的边缘尺寸范围从0.1％至10％。

79)根据72)-78)中的任一项所述的装置，其中所述边缘的面积是从0.0001cm²至1200cm²。

80)根据79)所述的装置，其中所述边缘的面积对于圆角形装置是从0.1cm²到900cm²，且对于方形装置是从0.1cm²到1100cm²。

81)根据72)-80)中的任一项所述的装置，其中总装置的面积对于圆角形装置范围从0.5cm²至3000cm²，而对于方形装置范围从0.5cm²至4000cm²。

82)根据72)-81)中的任一项所述的装置，其中作为网状补片面积的百分比的边缘面积任选地范围从0.1％至14,000％。

83)根据82)所述的装置，其中作为所述总装置的面积的百分比的所述边缘面积范围从0.1％至100％。

84)根据72)-83)中的任一项所述的装置，其中根据在图2A中给出的符号，所述装置的不同参数的厚度的尺寸对于d1(从装置的边缘到网状补片的粘合剂层厚度)(μm)范围从0到10000。

85)根据84)所述的装置，其中所述尺寸对于d2(从网状补片到粘合层的粘合剂层厚度)(μm)范围从0到10000。

86)根据85)所述的装置，其中所述尺寸对于d3(网状补片的厚度)(μm)范围从100到2500。

87)根据86)所述的装置，其中所述尺寸对于d4(背衬的厚度)(μm)范围从1到2000。

88)根据87)所述的装置，其中所述尺寸对于d5(粘合层的厚度)(μm)范围从1至100。

89)根据84)-88)中的任一项所述的装置，其中所述尺寸对于总厚度(μm)范围从101到24600。

90)根据72)-89)中的任一项所述的装置，其中所述装置的不同参数的厚度的尺寸的比率(作为百分比)对于背衬厚度占泡沫厚度的百分比范围从0.004到2000.000。

91)根据90)所述的装置，其中所述比率对于背衬占总厚度的百分比范围从0.004至1980.198。

92)根据72)-91)中的任一项所述的装置，其中泡沫密度(g/ml)任选地范围从0.001至0.1。

93)一种用于制备根据上述项中的任一项所述的装置的方法，包括涂敷非粘性背衬(非粘性组分)，创建明胶的多孔结构，混合明胶和酶，将所述明胶和酶的所述混合物涂敷到所述非粘性背衬上，以及关于所述明胶和酶的所述混合物定位所述网状补片。

94)根据93)所述的方法，其中涂覆所述非粘性背衬包括刮刀涂布。

95)根据93)所述的方法，其中所述涂敷所述非粘性背衬包括气刀涂布、喷涂、丝网印刷或任何其它相关印刷工艺、旋涂、浸渍涂布、幕帘式涂布、溶液浇铸、用于涂覆聚合物分散体/溶液的层的任何其它合适的方法和/或熔融挤出(不涉及溶剂，仅加热聚合物)中的一种或更多种。

96)根据93)-95)中的任一项所述的方法，其中创建粘合剂基质的多孔结构包括所述明胶溶液的(物理的)气体发泡。

97)根据93)-95)中的任一项所述的方法，其中所述粘合剂基质包括明胶，并且其中所述创建粘合剂基质的多孔结构包括(物理的)乳液冷冻干燥、(化学的)溶剂浇铸/颗粒沥滤、用超临界气体例如CO2进行的(物理)高压处理、(物理的和/或化学的)气体发泡/颗粒沥滤，例如用分散的碳酸氢铵盐颗粒进行、热致相分离、静电纺丝和/或快速原型制作(例如用3D打印机)中的一种或更多种。

98)根据93)-97)中的任一项所述的方法，其中所述混合明胶和酶包括通过根据穿过混合元件的材料的运动旋转混合元件来应用静态混合器。

99)根据98)所述的方法，还包括下列操作中的一个或更多个：以水包油或油包水乳液的形式混合和/或在明胶连续相中混合包封的酶微粒作为分散体。

100)根据93)-99)中的任一项所述的方法，其中所述将明胶和酶的所述混合物涂敷到所述非粘性背衬上包括刮刀涂布。

101)根据93)-99)中的任一项所述的方法，其中所述将明胶和酶的所述混合物涂敷到所述非粘性背衬上包括气刀涂布、喷涂、丝网印刷或任何其它相关印刷工艺、旋涂、浸渍涂布、幕帘式涂布、溶液浇铸、用于涂覆聚合物分散体/溶液的层的合适方法、喷射注塑和/或模塑(浇铸)中的一种或更多种。

102)根据93)-101)中的任一项所述的方法，其中所述定位所述网状补片以两个步骤执行，在所述两个步骤中将所述网状补片定位在第一粘合剂层上，然后第二粘合剂层覆盖所述网状补片。

103)根据93)-102)中的任一项所述的方法，包括通过将粘合剂发泡溶液直接涂敷在已经干燥的背衬上来附着粘合剂层和背衬层。

104)根据93)-102)中的任一项所述的方法，包括通过单独地干燥两个膜并然后附着它们来附着粘合剂层和背衬层。

105)根据104)所述的方法，其中通过使用粘合层或通过层压工艺来执行所述附着。

106)根据105)所述的方法，其中所述粘合层包括天然来源的多糖或合成聚合物。

107)根据106)所述的方法，其中所述粘合层包括一种或更多种麦芽糊精、淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或PVP。

108)根据107)所述的方法，其中所述粘合层包括增塑剂。

109)根据108)所述的方法，其中所述增塑剂包括甘油或PEG中的一种或更多种。

110)根据104)所述的方法，其中根据气刀涂布、喷涂、丝网印刷或任何其它相关印刷工艺、旋涂、幕帘式涂布、已知的用于涂覆聚合物分散体/溶液的层的任何其它方法和/或热熔融挤出中的一种或更多种，将所述背衬涂敷在已经干燥的粘合剂层的顶部上。

111)根据101)-110)中的任一项所述的方法，其中通过在-20℃冻干(冷冻-干燥)来执行所述粘合剂层的干燥。

112)根据101)-110)中的任一项所述的方法，其中通过热风干燥、真空干燥中的一种或更多种来执行所述粘合剂层的干燥。

113)一种用于在根据上述项中的任一项所述的方法混合所述转谷氨酰胺酶和所述明胶之前制备转谷氨酰胺酶溶液的方法，包括纯化所述转谷氨酰胺酶。

114)根据113)所述的方法，包括下列操作中的一个或更多个：从转谷氨酰胺酶混合物中去除发酵残渣；浓缩在转谷氨酰胺酶溶液中的活性转谷氨酰胺酶的量；去除载体蛋白或碳水化合物；降低所述转谷氨酰胺酶溶液的内毒素水平；和/或从所述转谷氨酰胺酶溶液中去除所有微生物，将所述溶液有效地灭菌。

115)根据113)或114)所述的方法，其中所述纯化包括过滤所述转谷氨酰胺酶溶液。

116)根据115)所述的方法，其中所述过滤包括有时被称为澄清的粗过滤，以去除大块发酵残渣。

117)根据116)所述的方法，其中所述粗过滤以大于0.22μm的孔径为特征。

118)根据117)所述的方法，还包括在二次过滤工艺中使所述转谷氨酰胺酶溶液通过小于0.22μm的孔径的过滤器。

119)根据118)所述的方法，其中所述二次过滤阶段包括切向流或中空纤维超滤技术。

120)根据119)所述的方法，其中孔径在10-50kDa的范围内。

Claims

1.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，其中所述基于网状补片的组合物是可植入的外科用网状补片，其中所述涂层是包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及一种或更多种交联材料的发泡组合物，其中所述网状补片的至少一部分被所述涂层涂覆使得所述基于网状补片的组合物包含以下两个部分：网状补片-粘合剂部分，其由被围在所述涂层内的网状补片组成；和仅涂层部分，其仅含有所述涂层，而在它内没有网状补片，其中所述仅涂层部分围绕所述网状补片-粘合剂部分，并且其中所述被涂覆的网状补片是自粘附的、不需要额外固定并且能够在施用时最小化组织粘附。

2.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，

其中所述基于网状补片的组合物是可植入的外科用网状补片，

其中所述涂层是包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及一种或更多种交联材料的发泡组合物，

其中所述网状补片的至少一部分被所述涂层涂覆使得所述基于网状补片的组合物包含以下两个部分：网状补片-粘合剂部分，其由被围在所述涂层内的网状补片组成；和仅涂层部分，其仅含有所述涂层，而在它内没有网状补片，

其中所述仅涂层部分围绕所述网状补片-粘合剂部分，

其中所述被涂覆的网状补片是自粘附的、不需要额外固定并且能够在施用时最小化组织粘附，

其中所述仅粘合剂部分采取边缘的形式，并且

其中所述边缘构成0.1％和10％之间的所述组合物的直径。

3.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，

其中所述仅涂层部分围绕所述网状补片-粘合剂部分，

其中所述仅粘合剂部分采取边缘的形式，并且

其中所述边缘构成0.1％和10％之间的所述组合物的面积。

4.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，

其中所述仅涂层部分围绕所述网状补片-粘合剂部分，

其中所述一种或更多种交联材料包括转谷氨酰胺酶，并且

其中所述转谷氨酰胺酶遍及所述发泡的明胶表面相等地分布。

5.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及一种或更多种交联材料，其中所述网状补片的至少一部分被所述涂层涂覆以形成被涂覆的网状补片的组合物，所述被涂覆的网状补片组合物是自粘附的、不需要额外固定并且能够在施用时最小化组织粘附，并且其中所述涂层延伸到所述网状补片之外，使得所述涂层在平面方向的总面积大于所述网状补片的总面积。

6.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及一种或更多种交联材料，其中所述网状补片的至少一部分被所述涂层涂覆以形成被涂覆的网状补片的组合物，所述被涂覆的网状补片组合物是自粘附的，并且其中所述涂层包括所述可交联蛋白或多肽以及所述一种或更多种交联材料的发泡组合物，并且其中所述涂层延伸到所述网状补片之外，使得所述涂层在平面方向的总面积大于所述网状补片的总面积。

7.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及能够交联所述一种或更多种可交联蛋白或多肽的酶，其中所述网状补片的至少一部分被所述涂层涂覆以形成被涂覆的网状补片的组合物，所述被涂覆的网状补片组合物是自粘附的，并且其中所述涂层包括所述可交联蛋白或多肽以及所述酶的发泡组合物，条件是所述蛋白或多肽不是纤维蛋白或纤维蛋白原，其中所述酶包括转谷氨酰胺酶或多铜氧化酶中的一种或更多种，并且其中所述涂层延伸到所述网状补片之外，使得所述涂层在平面方向的总面积大于所述网状补片的总面积。

8.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及一种或更多种交联材料，其中所述网状补片的第一部分被围在所述涂层内并且其中所述涂层包括所述可交联蛋白或多肽以及所述一种或更多种交联材料的发泡组合物，并且其中所述网状补片的第二部分不被围在所述涂层内。

9.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括一种或更多种可交联蛋白或多肽以及能够交联所述一种或更多种可交联蛋白或多肽的酶，其中所述网状补片的至少一部分被所述涂层覆盖，并且其中所述涂层包括所述可交联蛋白或多肽和所述酶的发泡组合物，条件是所述蛋白或多肽不是纤维蛋白或纤维蛋白原，其中所述酶包括转谷氨酰胺酶或多铜氧化酶中的一种或更多种。

10.一种基于网状补片的组合物，包括网状补片和涂层，所述涂层包括钙、明胶、转谷氨酰胺酶和钙可交联藻酸盐基质。