CN116327782A - 一种骨靶向共递送硼替佐米和泊马度胺纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种骨靶向共递送硼替佐米和泊马度胺纳米复合物及其制备方法和应用。本发明成功制备得到一种骨靶向酸敏感纳米胶束。静脉注射后，胶束在血液循环中保持稳定，并通过纳米颗粒表面的阿仑膦酸与骨基质中的磷酸钙之间的螯合作用，靶向骨髓微环境。在肿瘤酸性环境下，纳米胶束pH敏感降解，释放游离药物硼替佐米和泊马度胺。其中，硼替佐米作用于26S蛋白酶体，扰乱错误折叠的蛋白质，导致肿瘤细胞凋亡；此外，泊马度胺抑制炎症因子，阻碍血管生成，动员免疫系统，协同抑制肿瘤的生长。同时上述胶束的使用能够显著降低上述药物引发的全身毒副作用，因此具有极佳的实际应用之价值。

Description

一种骨靶向共递送硼替佐米和泊马度胺纳米复合物及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种骨靶向共递送硼替佐米和泊马度胺纳米复合物及其制备方法和应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
多发性骨髓瘤是一种浆细胞异常增殖的B淋巴细胞恶性肿瘤，有着居高不下的复发率和死亡率，伴有典型的“蟹状特征”，即高钙血症、肾功能不全、贫血和骨病。在美国国立综合癌症网络关于多发性骨髓瘤的临床指南中，将其发病类型划分为孤立性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤和活动性多发性骨髓瘤，其中活动性多发性骨髓瘤为最主要的发病类型，并主要通过造血干细胞移植和药物疗法进行治疗。由于自体干细胞移植疗法常因人而异，药物治疗仍是大部分患者的临床治疗首选方案。
临床上有多种用于治疗多发性骨髓瘤的药物，其中免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂是最为常用的两种药物类型，且常以联合应用的形式出现。其中，蛋白酶体抑制剂主要通过特异性抑制蛋白酶体通路来诱导细胞的凋亡。泛素蛋白酶体途径是最为重要的调控细胞内蛋白降解的系统，参与如细胞周期进程，转录调控，细胞凋亡和免疫反应等过程。临床治疗多发性骨髓瘤的一线特效药物硼替佐米(bortezomib,BTZ)就是一种可逆的26S蛋白酶体抑制剂，可与蛋白酶体的催化位点结合，导致错误折叠或受损的蛋白质积聚。由于浆细胞的生存极度依赖于泛素-蛋白酶体途径的正常功能，因此体内蛋白质平衡的破坏促进了恶性浆细胞的程序性死亡。免疫调节药物则是基于沙利度胺，通过化学修饰产生的一系列衍生物，以调节免疫系统发挥抗肿瘤作用。第三代免疫调节药物泊马度胺(pomalidomide,Pom)通过增加如干扰素(IFN-γ)、减少白细胞介素(IL-6)和血管内皮生长因子(VEGF)等相关细胞因子的产生来发挥其抗骨髓瘤效应，可提高对来那度胺难治型患者的疗效。在临床上将硼替佐米和泊马度胺联合应用能够显著改善普通患者和来那度胺耐药患者的无进展生存期。
然而，临床静脉注射硼替佐米常常出现周围神经病变、血液学毒性、肝功能异常和胃肠功能紊乱等不良反应，而这些不良反应的产生主要由游离药物全身分布所导致，因此，选择一种合适的药物递送系统来减少药物在血液循环当中的泄漏，将其更多的递送到目标部位是亟待解决的。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种骨靶向共递送硼替佐米和泊马度胺纳米复合物及其制备方法和应用。具体的，本发明成功制备得到一种骨靶向酸敏感纳米胶束BV-BTZ-Pom。静脉注射后，BV-BTZ-Pom在血液循环中保持稳定，并通过纳米颗粒表面的阿仑膦酸(alendronate，Aln)与骨基质中的磷酸钙之间的螯合作用，靶向骨髓微环境。在肿瘤酸性环境下，纳米胶束pH敏感降解，释放游离药物硼替佐米和泊马度胺。硼替佐米通过作用于26S蛋白酶体，扰乱错误折叠的蛋白质，导致肿瘤细胞凋亡；泊马度胺则抑制炎症因子，阻碍血管生成，动员免疫系统，协同抑制肿瘤的生长。基于上述研究成果，从而完成本发明。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种纳米复合物，所述纳米复合物具体为骨靶向酸敏感纳米胶束BV-BTZ-Pom，其是由阿仑膦酸功能化的两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA负载硼替佐米和泊马度胺后所得；
其中，所述两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA的结构式如下所示：
Figure BDA0004146905940000021
其中，x取自1-50中的任意自然数，y取自1-50中的任意自然数。
本发明的第二个方面，提供上述纳米复合物的制备方法，所述制备方法至少包括：将泊马度胺、硼替佐米和两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA溶于有机溶剂中，搅拌后将混合溶液加入缓冲溶液中进行反应经纯化后即得。
本发明的第三个方面，提供上述纳米复合物在制备抗肿瘤药物递释系统中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种抗肿瘤药物递释系统，所述抗肿瘤药物递释系统其活性成分包含上述纳米复合物。
本发明的第五个方面，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述纳米复合物或抗肿瘤药物递释系统。
此外，需要说明的是，本发明虽然以多发性骨髓瘤为例，提供一种骨靶向共递送硼替佐米和泊马度胺药物递释系统，但是基于本发明的发明构思，通过常规替换等方式，从而用于其他肿瘤的治疗，同样属于本发明的保护范围之内。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首先设计一种阿仑膦酸功能化的两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA，其端基上修饰的阿仑膦酸能够和骨基质主要无机成分磷酸钙结合，赋予聚合物靶向骨髓的能力；亲水性嵌段pDMA增加了聚合物的亲水性，确保了载药聚合物在水溶液中的稳定性；pDA段的儿茶酚结构可与硼替佐米络合连接形成疏水段，得到的两亲性聚合物可自组装成纳米粒，并在内部负载免疫调节剂泊马度胺，得到骨靶向酸敏感纳米胶束BV-BTZ-Pom。静脉注射后，BV-BTZ-Pom在血液循环中保持稳定，并通过纳米颗粒表面的阿仑膦酸螯合骨基质中的磷酸钙，靶向骨髓微环境。在肿瘤酸性环境下，纳米胶束pH敏感降解，释放游离药物硼替佐米和泊马度胺。基于上述技术方案使得硼替佐米作用于26S蛋白酶体，扰乱错误折叠的蛋白质，导致肿瘤细胞凋亡；同时，泊马度胺抑制炎症因子，阻碍血管生成，动员免疫系统，协同抑制肿瘤的生长。此外，上述技术方案的实施，能够显著降低上述药物引发的全身毒副作用，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中ADA的合成路线；
图2为本发明实施例中DA的1H NMR结果；
图3为本发明实施例中ADA的1H NMR结果；
图4为本发明实施例中Aln-pDMA-b-pDA的合成路线；
图5为本发明实施例中pDMA30的1H NMR结果；
图6为本发明实施例中pDMA30-b-pADA20的1H NMR结果；
图7为本发明实施例中Aln-pDMA30-b-pADA20的1H NMR结果；
图8为本发明实施例中Aln-pDMA30-b-pDA20的1H NMR结果；
图9为本发明实施例中Aln-pDMA30-b-pDA20的31P NMR结果；
图10为本发明实施例中纳米粒的表征。(a)V-BTZ、BV-BTZ和BV-BTZ-Pom的粒径分布。(b)V-BTZ、BV-BTZ和BV-BTZ-Pom的Zeta电位；
图11为本发明实施例中纳米粒的细胞毒性；
图12为本发明实施例中纳米粒的骨靶向能力评估。(a)小鼠静脉注射IR780、V-BTZIR780、BV-BTZIR780后，在不同时间点体内的荧光分布情况。(b)48h时解剖小鼠腿骨、脊柱和主要器官的离体荧光图像。1：心脏，2：肝，3：脾，4：肺，5：肾，6：腿骨，7：脊柱。(c)对离体器官进行感兴趣区域荧光强度分析；
图13为本发明实施例中纳米粒在斑马鱼多发性骨髓瘤模型中的抗肿瘤效果。(a)纳米粒在斑马鱼肿瘤模型中抗多发性骨髓瘤作用的定量评价。(b)不同治疗组中荷多发性骨髓瘤斑马鱼的代表性图像；
图14为本发明实施例中纳米粒调控免疫系统的评价。(a)不同治疗组斑马鱼IL-2的mRNA表达水平。(b)不同治疗组斑马鱼IL-6的mRNA表达水平。(c)不同治疗组斑马鱼IL-12的mRNA表达水平。(d)不同治疗组斑马鱼TGF-β的mRNA表达水平。(e)不同治疗组斑马鱼IFN-γ的mRNA表达水平。(f)不同治疗组斑马鱼VEGF的mRNA表达水平。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，在临床上将硼替佐米和泊马度胺联合应用能够显著改善多发性骨髓瘤普通患者和来那度胺耐药患者的无进展生存期。
然而，临床静脉注射硼替佐米常常出现周围神经病变、血液学毒性、肝功能异常和胃肠功能紊乱等不良反应，而这些不良反应的产生主要由游离药物全身分布所导致，因此，选择一种合适的药物递送系统来减少药物在血液循环当中的泄漏，将其更多的递送到目标部位是亟待解决的。
在众多的药物递送载体当中，聚合物载体因其能够精准调节纳米粒性质，灵活负载亲水药物和疏水药物，易于进行表面改性而广受人们关注。其中，聚合物-药物偶联体具有药物载药量高，可减少药物泄漏，能够在特定部位释放药物以及优异的生物安全性等优点，将聚合物-药物偶联体应用到药物递送载体中，能够显著降低药物的全身毒副作用。
硼替佐米结构中存在着独特的活性位点——硼酸基团，这一基团可以特异性地和儿茶酚结构中的邻二酚羟基发生偶联，得到的动态共价键在pH≥7.4时稳定存在，在酸性条件下可发生解离。而肿瘤微环境和肿瘤细胞内部存在着酸性pH、高氧化还原电势、部分酶高表达的特点，因此硼替佐米-儿茶酚偶联体在肿瘤部位的特殊环境下可以酸敏感解离，从而释放出硼替佐米游离药物，发挥抗肿瘤作用。
有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种纳米复合物，所述纳米复合物具体为骨靶向酸敏感纳米胶束BV-BTZ-Pom，其是由阿仑膦酸功能化的两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA负载硼替佐米和泊马度胺后所得；
其中，所述两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA的结构式如下所示：
Figure BDA0004146905940000061
其中，x取自1-50中的任意自然数，y取自1-50中的任意自然数，在本发明的一个具体实施方式中，所述x取自20，所述y取自30。
在本发明的一个具体实施方式中，所述BV-BTZ-Pom纳米粒粒径不大于100nm，具体的可以为91.14±8.26nm，电位为-6.81±0.08mV，适合于骨髓药物递送。
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述纳米复合物的制备方法，所述制备方法至少包括：将泊马度胺、硼替佐米和两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA溶于有机溶剂中，搅拌后将混合溶液加入缓冲溶液中进行反应经纯化后即得。
其中，所述Aln-pDMA-b-pDA、硼替佐米和泊马度胺的质量比为0.5-5：0.5-5：1；进一步为0.5-1:1:1，更进一步为0.98:1:1。
所述有机溶剂可以为二甲基亚砜，所述缓冲溶液可以为PBS缓冲溶液。
所述两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA采用如下方法制备得到：
S1、通过酰胺反应将阿仑膦酸的氨基与pDMA-b-pADA的末端羧基连接，合成Aln-pDMA-b-pADA；
S2、将所述Aln-pDMA-b-pADA溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸继续搅拌反应，旋蒸后即得Aln-pDMA-b-pDA。
其中，所述步骤S1，具体方法为：将pDMA-b-pADA溶于二甲基亚砜中，然后加入含有4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物的PBS缓冲液中进行搅拌，然后加入阿仑膦酸钠继续搅拌反应，经透析纯化后得Aln-pDMA-b-pADA。
所述pDMA-b-pADA与阿仑膦酸钠的质量比为10-50:1，优选可以为25:1。
所述透析纯化中其截留分子量(MWCO)为2-5kDa，优选可以为3.5kDa。
此外，所述pDMA-b-pADA可通过将聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)pDMA、ADA和偶氮二异丁腈基于可逆加成-断裂链转移聚合反应合成。在本发明的一个具体实施方式中，所述pDMA、ADA和偶氮二异丁腈的摩尔比为0.5-5:15-25:0.1-0.5，优选为1:20:0.2。
其中，所述pDMA可以通过市售方式购得，或者基于现有已知方法(如RAFT法)合成，在此不再赘述。
所述ADA其结构式如下：
Figure BDA0004146905940000071
其可通过如下合成路线合成：
Figure BDA0004146905940000072
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述纳米复合物在制备抗肿瘤药物递释系统中的应用。
其中，所述肿瘤可以为多发性骨髓瘤。
在本发明的一个具体实施方式中，提供一种抗肿瘤药物递释系统，所述抗肿瘤药物递释系统其活性成分包含上述纳米复合物。
根据本发明，所述抗肿瘤药物递释系统还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
优选的，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
优选的，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
在本发明的一个具体实施方式中，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述纳米复合物或抗肿瘤药物递释系统。
其中，所述肿瘤可以为多发性骨髓瘤。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。
此外，需要说明的是，本发明虽然以多发性骨髓瘤为例，提供一种骨靶向共递送硼替佐米和泊马度胺药物递释系统，但是基于本发明的发明构思，通过常规替换等方式，从而用于其他肿瘤的治疗，同样属于本发明的保护范围之内。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.实验方法
1.1单体的合成
1.1.1DA的合成
在氮气气氛下，将4.03g十水四硼酸钠和1.7g碳酸钠溶解于150mL双蒸水中。然后，加入1.0g多巴胺盐酸盐，室温搅拌30分钟。随后，将混合物冷却至0℃，滴加1.7mL丙烯酰氯，并加入碳酸钠使反应的pH≥9。反应12小时后，加入6mol/L的盐酸溶液将溶液酸化至pH＝1，室温搅拌1小时。随后，乙酸乙酯萃取溶液5次，0.1mol/L盐酸洗涤2次，无水硫酸钠干燥。旋蒸除去溶剂，并通过硅胶柱色谱(二氯甲烷:甲醇＝12:1)纯化，得到白色固体。
1.1.2ADA的合成
在氮气气氛下，将1.8g DA和82mg对甲苯磺酸加入含有50mL无水甲苯的圆底烧瓶中。连接索氏提取器并填充35g无水氯化钙。反应加热回流3小时，随后将反应液冷却至0℃并加入10.2mL 2,2-二甲氧基丙烷。在40℃下将混合物搅拌2小时，并在黑暗中回流2小时。反应完成后，用水洗涤溶液并用无水硫酸钠干燥。旋蒸除去溶剂，并通过硅胶柱色谱(正己烷:乙酸乙酯＝1:1)纯化，得到白色固体。
1.2聚合物Aln-pDMA-b-pDA的合成
1.2.1pDMA的合成
向Schlenk管中加入4-氰基-4-(十二烷基硫代羰基硫代)戊酸(链转移剂)、N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)和偶氮二异丁腈，将其溶解在1,4-二氧六环中，其摩尔比为1:30:0.2。在三次冷冻融化循环除去空气后，在80℃条件下反应3小时。随后，将混合物滴入正己烷和乙醚(1:1)的冷溶液中，6000rpm离心5分钟，重复3次。随后，真空干燥沉淀下来的聚合物，得到pDMA黄色粉末。1.2.2pDMA-b-pADA的合成
将在前一步骤中合成的pDMA用作链转移剂以制备pDMA-b-pADA。简言之，向Schlenk管中加入pDMA、ADA和偶氮二异丁腈，加入N,N-二甲基甲酰胺使其溶解，其摩尔比为1:20:0.2。在三次冷冻融化循环除去空气后，在70℃条件下反应12小时。随后，将混合物滴入正己烷和乙醚(1:1)的冷溶液中，6000rpm离心5分钟，重复3次。随后，真空干燥沉淀的聚合物，得到pDMA-b-pADA。
1.2.3Aln-pDMA-b-pDA的合成
通过酰胺反应连接阿仑膦酸的氨基与pDMA-b-pADA的羧基，合成Aln-pDMA-b-pADA。简而言之，将500mg pDMA-b-pADA溶解在2mL DMSO中，滴入含20mg 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物的25mL PBS缓冲液中，室温搅拌2小时。随后，加入20mg阿仑膦酸钠，继续搅拌48小时。反应完成后，用双蒸水透析(MWCO＝3.5kDa)纯化24小时，冻干除去溶剂后得到Aln-pDMA-b-pADA。将100mg Aln-pDMA-b-pADA溶解于1mL二氯甲烷中，并加入1mL三氟乙酸，搅拌过夜。随后，旋蒸除去溶剂，得到Aln-pDMA-b-pDA。
1.3BV-BTZ-Pom纳米粒的合成
将20mg硼替佐米、20mg泊马渡胺和19.6mg Aln-pDMA-b-pDA溶解在1mL DMSO中。然后，边搅拌边滴加到10mL PBS中，搅拌6小时。随后，10000rpm离心5分钟，弃去上清，并将沉淀分散在PBS中即得到BV-BTZ-Pom。
1.4BV-BTZ-Pom纳米粒的体外细胞毒性作用验证
将U266细胞接种在96孔板中，细胞密度为5×103。与不同浓度的BTZ、Pom、BTZ-Pom和BV-BTZ-Pom孵育48小时，随后加入CCK-8试剂并孵育2小时，使用微板读取器检测450nm处的吸光度。
1.5BV-BTZ-Pom纳米粒的骨靶向验证
通过小动物活体成像系统评估BV-BTZ-Pom的骨靶向能力。将BALB/c小鼠随机分为三组，分别静脉注射IR780、V-BTZIR780和BV-BTZIR780，IR780剂量为1.0mg/kg。随后，分别在注射后1小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时拍摄小鼠的荧光图像。在注射后48小时处死小鼠，并解剖腿骨、脊柱、心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行成像。使用Living Image软件分析结果。
1.6BV-BTZ-Pom纳米粒的抗多发性骨髓瘤效果
首先建立斑马鱼多发性骨髓瘤模型。将健康的雄性和雌性斑马鱼按1:2配对，在繁殖缸中产卵。第二天早上，胚胎被生产收集。斑马鱼胚胎在含0.01mM1-苯基-2-硫脲(PTU)的E3培养基中培养。将CM-Dil染料标记的U266细胞混悬在PBS中至浓度为3×107细胞/mL。在48hpf，用1mg/mL的蛋白酶E处理胚胎5～10分钟，并用0.2mg/mL三卡因-S麻醉胚胎。使用带有气动泵注射器的玻璃注射微针将CM-Dil标记的U266细胞(5-10nL/每胚胎)注射到卵黄囊内。
通过荧光显微镜挑选注射后24小时具有红色荧光的斑马鱼，移至24孔板，每孔一个胚胎，并分别用E3溶液、BTZ、Pom、BTZ-Pom和BV-BTZ-Pom处理(含PTU)。在治疗后0小时和24小时通过荧光显微镜评估肿瘤生长情况。用ImageJ软件定量，并按照公式计算相对肿瘤面积：
Figure BDA0004146905940000111
其中，S0hpt对应治疗后0h时的红色荧光肿瘤区域面积，S24hpt对应治疗后24h时的红色荧光肿瘤区域面积。
1.7BV-BTZ-Pom纳米粒调节免疫系统评价
从各实验组处理后的斑马鱼异种移植幼鱼中提取总RNA，并将其逆转录为cDNA。根据标准程序，在Bio-Rad CFX上进行定量RT-PCR。
2.结果与讨论
2.1单体的合成
单体的合成路线如图1所示。核磁结果表明单体的成功合成。
2.2聚合物Aln-pDMA-b-pDA的合成
在聚合物pDMA-b-pADA的基础上，通过酰胺反应将Aln上的氨基与pDMA-b-pADA端基上的羧基连接，脱保护后得到Aln-pDMA-b-pDA。首先，采用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)合成pDMA。随后，将pDMA作为链转移剂合成pDMA-b-pADA。通过酰胺反应合成Aln-pDMA-b-pADA后，采用三氟乙酸脱去丙酮保护后得到骨靶向聚合物Aln-pDMA-b-pDA。具体合成路线如图4所示，聚合物结构分别通过1H NMR和31P NMR表征，结果如图5-9所示。
2.3BV-BTZ-Pom纳米粒的表征
BTZ上的硼酸基团与聚合物Aln-pDMA-b-pDA的pDA段通过动态共价化学偶联，随后聚合物-药物偶联体通过自组装形成纳米粒，同时将疏水药物Pom载入纳米粒的疏水内核中，得到骨靶向纳米粒BV-BTZ-Pom。结果表明，BV-BTZ-Pom纳米粒粒径为91.14±8.26nm，电位为-6.81±0.08mV，适合于骨髓药物递送。
2.4纳米粒的细胞毒性
选用人多发性骨髓瘤细胞U266对纳米粒的体外细胞毒性进行评价。结果表明，BV-BTZ-Pom纳米粒对U266细胞有良好的细胞毒作用，且随着药物浓度的增加，细胞毒性也随之增加。
2.5纳米粒的骨靶向特性
通过小鼠活体成像系统对纳米粒的体内分布进行评估，结果表明，在静脉注射6小时后，BV-BTZIR780已经到达骨部位，而游离IR780则快速代谢。此外，V-BTZIR780由于被动靶向而部分存留在骨部位(图12a)。注射后48小时后小鼠离体腿骨、脊柱和主要器官荧光图像结果表明，BV-BTZIR780在骨质区域中充分积累(图12b)。感兴趣区域的荧光强度分析也表明了BV-BTZ的骨归巢能力(图12c)。
2.6纳米粒的抗多发性骨髓瘤效果
建立斑马鱼异种多发性骨髓瘤移植模型，并对BV-BTZ-Pom的抗多发性骨髓瘤效果进行评价。结果表明，BV-BTZ-Pom纳米粒有着最佳的抑瘤效果，其效果优于游离BTZ和Pom联合治疗组。
2.7纳米粒调控免疫系统的评价
为了探讨联合效应的免疫机制，我们检测了药物处理后斑马鱼体内细胞因子的mRNA表达水平。结果表明，纳米粒能够上调il-2、il-12、ifn-γ和下调il-6、tgf-β、vegf表达水平，表明联合治疗具有免疫调节功能。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物具体为骨靶向酸敏感纳米胶束BV-BTZ-Pom，其是由阿仑膦酸功能化的两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA负载硼替佐米和泊马度胺后所得；
其中，所述两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA的结构式如下所示：
Figure FDA0004146905930000011
x取自1-50中的任意自然数，y取自1-50中的任意自然数。
2.如权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述x取自20，所述y取自30。
3.如权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述BV-BTZ-Pom纳米粒粒径为不大于100nm。
4.权利要求1-3任一项所述纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括：将泊马度胺、硼替佐米和两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA溶于有机溶剂中，搅拌后将混合溶液加入缓冲溶液中进行反应经纯化后即得。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述Aln-pDMA-b-pDA、硼替佐米和泊马度胺的质量比为0.5-5:0.5-5:1；
所述有机溶剂为二甲基亚砜，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液。
6.如权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述两嵌段共聚物Aln-pDMA-b-pDA采用如下方法制备得到：
S1、通过酰胺反应将阿仑膦酸的氨基与pDMA-b-pADA的末端羧基连接，合成Aln-pDMA-b-pADA；
S2、将所述Aln-pDMA-b-pADA溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸继续搅拌反应，旋蒸后即得Aln-pDMA-b-pDA。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1，具体方法为：将pDMA-b-pADA溶于二甲基亚砜中，然后加入含有4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物的PBS缓冲液中进行搅拌，然后加入阿仑膦酸钠继续搅拌反应，经透析纯化后得Aln-pDMA-b-pADA；
所述pDMA-b-pADA与阿仑膦酸钠的质量比为10-50:1；
所述透析纯化中其截留分子量为2-5kDa。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述pDMA-b-pADA通过将聚(N,N-二甲基丙烯酰胺)pDMA、ADA和偶氮二异丁腈基于可逆加成-断裂链转移聚合反应合成；
所述ADA其结构式如下：
Figure FDA0004146905930000021
9.权利要求1-3任一项所述纳米复合物在制备抗肿瘤药物递释系统中的应用；进一步的，所述肿瘤为多发性骨髓瘤。
10.一种抗肿瘤药物递释系统，其特征在于，所述抗肿瘤药物递释系统其活性成分包含权利要求1-3任一项所述纳米复合物。
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CN113908290A (zh) * 2021-10-22 2022-01-11 山东大学 一种多功能纳米复合物及其制备方法和应用
CN115120738A (zh) * 2022-07-20 2022-09-30 山东大学 一种咪喹莫特前药纳米粒及其制备方法和应用

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