CN116287426A - 一种基于crispr技术与表面等离子共振技术的核酸检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于crispr技术与表面等离子共振技术的核酸检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学和光电子学技术领域，具体涉及一种基于CRISPR技术与表面等离子共振技术的核酸检测试剂盒及其应用。试剂盒包含：SPR生物传感器芯片、H1、H2、H3；所述H1的核苷酸序列为N1N2……NnTTATTATTN1N2……Nm；所述N为A、T、C或G；所述m、n独立选自于：10、11、12、13、14、15、16；所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补；或所述H2与所述H1的3’端反向互补，所述H3与所述H1的5’端反向互补；该试剂盒可与CRISPR‑Cas系统联用，针对不同目标核酸，设计相应的CRISPR‑Cas系统，实现目标核酸检测。

Description

一种基于CRISPR技术与表面等离子共振技术的核酸检测试剂 盒及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和光电子学技术领域，具体涉及一种基于CRISPR技术与表面等离子共振技术的核酸检测试剂盒及其应用。
背景技术
SARS-CoV-2是一种β属的新型冠状病毒，呈圆形或椭圆形，直径60-140nm，电镜下呈皇冠样形状，可感染哺乳动物和人。目前，SARS-CoV-2已出现Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron突变体。其中，Omicron变体已成为最受关注的变体。现阶段，SARS-CoV-2阳性样本仍主要通过聚合酶链式反应(PCR)进行检测，而变异体类型则依靠基因测序来确定。然而目前的PCR检测只能对SARS-CoV-2进行一般性检测，而不能对特定的毒株进行分型检测。基因测序方法虽稳定、可靠，但样本处理复杂，且对仪器要求高，耗时长。因此，新的核酸分子检测方法需要克服常规核酸检测策略的局限性，以提供低成本、高集成度、紧凑便捷的核酸诊断工具，从而扩展其临床应用。
在最近的研究中，基于常间回文重复序列丛集(CRISPR)及相关的核酸酶(Cas)的技术已经与光学检测方法结合用于常规的核酸检测。其中，CRISPR-Cas蛋白在单链引导RNA(sgRNA)分子的引导下，可以成为靶向特异性序列的强大工具。例如，“SHERLOCK”方法先通过RPA或RT-RPA技术对待测序列进行扩增，然后利用引导RNA与CRISPR相关核酸酶13(Cas13a)的复合物与待测物进行反应，若待测物中含有与目标序列一致的核酸片段，则依核酸片段浓度的不同产生荧光信号。又如“HOLMES”方法，因为使用可直接靶向DNA分子的Cas12a而无需经过“SHERLOCK”方法中DNA向RNA的转录过程。无论是“SHERLOCK”还是“HOLMES”方法，二者都可以通过单链核酸探针来对DNA分子或RNA分子进行序列特异性检测。由于CRISPR-Cas系统中的sgRNA具有极强的可设计性，因此可以通过简单更改sgRNA序列以检测不同的目标序列核酸分子。
表面等离子共振技术，英文简写SPR，是从20世纪90年代发展起来的一种高灵敏度光学检测技术，利用该技术研制出的SPR传感器是一种高分辨率光学折射率传感器，可以用于检测折射率极为微小的变化。利用SPR原理开发的生物传感器可以被视为“超微量天平”用于检测分析生物分子之间相互作用的情况，并已被广泛应用于诸如大分子检测、药物筛选、蛋白质相互作用、临床诊断、细胞膜模拟、遗传分析等多个领域。但是目前尚无将CRISPR技术和表面等离子共振技术联合用于新型冠状病毒核酸检测及分型检测。
发明内容
本发明的第一方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明的第二方面的目的，在于提供一种系统。
本发明的第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂盒和/或本发明第二方面的系统的应用。
本发明的第四方面的目的，在于提供一种方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种试剂盒，包含：SPR生物传感器芯片、H1、H2和H3；所述H1的核苷酸序列为N1 N2……NnTTATTATTNn+1Nn+2……Nn+m；所述N为A、T、C或G；所述m、n独立选自于：10、11、12、13、14、15、16；所述试剂盒用于检测核酸；
所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补；或
所述H2与所述H1的3’端反向互补，所述H3与所述H1的5’端反向互补。
优选地，所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补。
优选地，所述H2的碱基数为n～n+4；进一步为n+4。
优选地，所述H3的碱基数为m～m+4；进一步为m+4。
优选地，所述H2的碱基数为15。
优选地，所述H3的碱基数为16。
优选地，所述H1、H2、H3中至少一种修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物，即可以是：
H1、H2或H3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物；或
H1及H2、H1及H3、或H1及H3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物；或
H1、H2和H3均修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物。
优选地，所述H3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物(纳米金H3偶联物，H3@AuNPs)。
优选地，所述纳米金的直径为8～20nm；进一步为10～15nm。
优选地，所述核酸-纳米金偶联物的制备方法为本领域常规方法，具体如下：将核酸与纳米金混合，冷冻，融化，得到。
优选地，所述核酸与纳米金的摩尔比为5000：(1～25)；进一步为5000：(2～24)。
优选地，所述冷冻的条件为-20～-80℃冷冻1～4h。
优选地，所述融化的条件为恢复到室温待其融化。
优选地，所述融化后还包括如下步骤：离心、洗涤、分散。
优选地，所述离心的条件为8000～13000rpm离心10～15min。
优选地，所述H1的序列为CTTTACTCAACTTATTATTACGAACATCAGG(SEQ ID NO.1)。
优选地，所述H2的序列为ATAAGTTGAGTAAAG(SEQ ID NO.2)。
优选地，所述H3的序列为CCTGATGTTCGTAATA(SEQ ID NO.3)。
优选地，所述SPR生物传感芯片是一种基底为高透光玻璃且表面具有纳米级贵金属镀层的光学芯片。
优选地，所述贵金属包括金、银、铜中的至少一种；进一步优选地，所述贵金属包括金。
优选地，所述SPR生物传感器芯片可以通过市购得到，也可以采用本领域常规方法制备得到。
优选地，所述SPR生物传感芯片是通过物理气相沉积(PVD)法在厚度为50～300μm的高透光玻璃片表面沉积厚度为40～50nm的贵金属镀层制备而得。
优选地，SPR生物传感器芯片包括SPR裸金芯片。
优选地，所述试剂盒还包含：crRNA及Cas蛋白；所述核酸的序列包含靶核酸序列；所述crRNA包含锚定序列和向导序列，所述锚定序列与所述Cas蛋白特异性结合，所述向导序列与所述靶核酸序列相同或与所述靶核酸序列反向互补。
优选地，所述Cas蛋白包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b中的至少一种；进一步优选地，所述Cas蛋白包括Cas12a。
优选地，所述crRNA从5’端到3’端依次包含锚定序列和向导序列。
优选地，所述crRNA的长度为29～56bp。
优选地，所述crRNA的向导序列(与靶核酸序列相同或反向互补的序列)的长度为8～35bp。
优选地，所述核酸包括DNA和RNA中的至少一种。
优选地，所述DNA包括ssDNA和dsDNA中的至少一种；进一步包括dsDNA。
优选地，所述核酸来自动物、植物或微生物样品。
优选地，所述动物样品包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检、脑脊液中的至少一种。
优选地，所述植物样品包括细胞、细胞提取物、组织中的至少一种。
优选地，所述微生物样品包括细菌、病毒、真菌或其提取物。
优选地，所述核酸来自病毒。
优选地，所述核酸为SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因中的至少一种。
优选地，所述SARS-Cov-2保守序列N基因的靶核酸序列为CCCCCAGCGCUUCAGCGUUC(SEQ ID NO.5)。
优选地，所述SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因的靶核酸序列为AAUGAUAUCUUUUCACGUCU(SEQ ID NO.9)。
优选地，所述SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的靶核酸序列为CAAGUGCACUUGGAAAACUU(SEQ ID NO.11)。
优选地，所述SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的靶核酸序列为CUUGUUAAACAACUUAGCUC(SEQ ID NO.13)。
优选地，所述核酸为SARS-Cov-2保守序列N基因时，所述crRNA的向导序列为CCCCCAGCGCUUCAGCGUUC(SEQ ID NO.16)。
优选地，所述核酸为SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因时，所述crRNA的向导序列为AAUGAUAUCUUUUCACGUCU(SEQ ID NO.17)。
优选地，所述核酸为SARS-Cov-2 Delta变异株S基因时，所述crRNA的向导序列为AAGUUUUCCAAGUGCACUUG(SEQ ID NO.18)。
优选地，所述核酸为SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因时，所述crRNA的向导序列为GAGCUAAGUUGUUUAACAAG(SEQ ID NO.19)。
优选地，所述Cas蛋白为Cas12a时，所述crRNA的锚定序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO.20)。
优选地，所述试剂盒还包含：用于扩增包含所述靶核酸序列的核酸分子的引物。
优选地，所述试剂盒还包含：蛋白酶K、反应buffer、PBS缓冲液中的至少一种；进一步优选的，所述试剂盒还包含：蛋白酶K、反应buffer和PBS缓冲液。
优选地，所述反应buffer包含：NaCl、Tris-HCl、MgCl2、牛血清白蛋白中的至少一种；进一步优选地，所述反应buffer包含：NaCl、Tris-HCl、MgCl2和牛血清白蛋白；更进一步优选地，所述反应buffer包含：20～100mM NaCl、5～20mM Tris-HCl、5～20mM MgCl2和0～200μg/L牛血清白蛋白。
优选地，所述反应buffer为NEBuffer2.1。
优选地，一种用于新型冠状病毒基因分型的试剂盒，包含：crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA、crRNA-N中的至少一种；和
SPR生物传感器芯片、H1、H2、H3和Cas蛋白；
所述H1的核苷酸序列为N1 N2……NnTTATTATTNn+1Nn+2……Nn+m；所述N为A、T、C或G；所述m、n独立选自于：10、11、12、13、14、15、16；所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA分别用于检测SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、SARS-Cov-2Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因；所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA均包含锚定序列和向导序列，所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA的锚定序列均与所述Cas蛋白特异性结合，所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA的向导序列分别与所述SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的靶核酸序列相同或与所述SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2Delta变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的靶核酸序列反向互补；
所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补；或
所述H2与所述H1的3’端反向互补，所述H3与所述H1的5’端反向互补。
优选地，所述试剂盒包含：crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA中的至少一种；和
SPR生物传感器芯片、H1、H2、H3、crRNA-N和Cas蛋白；
所述H1的核苷酸序列为N1 N2……NnTTATTATTN n+1N n+2……N n+m；所述N为A、T、C或G；所述m、n独立选自于：10、11、12、13、14、15、16；所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA分别用于检测SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、SARS-Cov-2Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因；所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA均包含锚定序列和向导序列，所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA的锚定序列均与所述Cas蛋白特异性结合，所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA的向导序列分别与所述SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的靶核酸序列相同或与所述SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2Delta变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的靶核酸序列反向互补；
所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补；或
所述H2与所述H1的3’端反向互补，所述H3与所述H1的5’端反向互补。
优选地，所述试剂盒包含：crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA、SPR生物传感器芯片、H1、H2、H3、CrRNA-N和Cas蛋白；
所述H1的核苷酸序列为N1 N2……NnTTATTATTNn+1Nn+2……Nn+m；所述N为A、T、C或G；所述m、n独立选自于：10、11、12、13、14、15、16；所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA分别用于检测SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、SARS-Cov-2Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因；所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA均包含锚定序列和向导序列，所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA的锚定序列均与所述Cas蛋白特异性结合，所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA的向导序列分别与所述SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的靶核酸序列相同或与所述SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2Delta变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的靶核酸序列反向互补；
所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补；或
所述H2与所述H1的3’端反向互补，所述H3与所述H1的5’端反向互补。
优选地，所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补。
优选地，所述H2的碱基数为n～n+4；进一步为n+4。
优选地，所述H3的碱基数为m～m+4；进一步为m+4。
优选地，所述H2的碱基数为15。
优选地，所述H3的碱基数为16。
优选地，所述H1、H2、H3中至少一种修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物，即可以是：
H1、H2或H3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物；或
H1及H2、H1及H3、或H1及H3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物；或
H1、H2和H3均修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物。
优选地，所述H3修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物(纳米金H3偶联物，H3@AuNPs)。
优选地，所述纳米金的直径为8～20nm；进一步为10～15nm。
优选地，所述核酸-纳米金偶联物的制备方法为本领域常规方法，具体如下：将核酸与纳米金混合，冷冻，融化，得到。
优选地，所述核酸与纳米金的摩尔比为5000：(1～25)；进一步为5000：(2～24)。
优选地，所述冷冻的条件为-20～-80℃冷冻1～4h。
优选地，所述融化的条件为恢复到室温待其融化。
优选地，所述融化后还包括如下步骤：离心、洗涤、分散。
优选地，所述离心的条件为8000～13000rpm离心10～15min。
优选地，所述H1的序列为CTTTACTCAACTTATTATTACGAACATCAGG(SEQ ID NO.1)。
优选地，所述H2的序列为ATAAGTTGAGTAAAG(SEQ ID NO.2)。
优选地，所述H3的序列为CCTGATGTTCGTAATA(SEQ ID NO.3)。
优选地，所述SPR生物传感芯片是一种基底为高透光玻璃且表面具有纳米级贵金属镀层的光学芯片。
优选地，所述贵金属包括金、银、铜中的至少一种；进一步优选地，所述贵金属包括金。
优选地，所述SPR生物传感器芯片可以通过市购得到，也可以采用本领域常规方法制备得到。
优选地，所述SPR生物传感芯片是通过物理气相沉积(PVD)法在厚度为50～300μm的高透光玻璃片表面沉积厚度为40～50nm的贵金属镀层制备而得。
优选地，SPR生物传感器芯片包括SPR裸金芯片。
优选地，所述Cas蛋白包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b中的至少一种；进一步优选地，所述Cas蛋白包括Cas12a。
优选地，所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA从5’端到3’端依次包含锚定序列和向导序列。
优选地，所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA的长度均为29～56bp。
优选地，所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA的向导序列(与靶核酸序列相同或反向互补的序列)的长度为8～35bp。
优选地，所述SARS-Cov-2保守序列N基因的靶核酸序列为CCCCCAGCGCUUCAGCGUUC(SEQ ID NO.5)。
优选地，所述SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因的靶核酸序列为AAUGAUAUCUUUUCACGUCU(SEQ ID NO.9)。
优选地，所述SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的靶核酸序列为CAAGUGCACUUGGAAAACUU(SEQ ID NO.11)。
优选地，所述SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的靶核酸序列为CUUGUUAAACAACUUAGCUC(SEQ ID NO.13)。
优选地，所述crRNA-N的序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述crRNA-O的序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地，所述crRNA-D的序列如SEQ ID NO.10所示。
优选地，所述crRNA-BA的序列如SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述试剂盒还包含：用于扩增所述N基因和/或S基因的引物。
优选地，所述用于扩增所述N基因的引物的序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
优选地，所述用于扩增所述S基因的引物的序列如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示。
优选地，所述试剂盒还包含：蛋白酶K、反应buffer、PBS缓冲液中的至少一种；进一步优选的，所述试剂盒还包含：蛋白酶K、反应buffer和PBS缓冲液。
优选地，所述反应buffer包含：NaCl、Tris-HCl、MgCl2、牛血清白蛋白中的至少一种；进一步优选地，所述反应buffer包含：NaCl、Tris-HCl、MgCl2和牛血清白蛋白；更进一步优选地，所述反应buffer包含：20～100mM NaCl、5～20mM Tris-HCl、5～20mM MgCl2和0～200μg/L牛血清白蛋白。
优选地，所述反应buffer为NEBuffer2.1。
本发明提供的用于新型冠状病毒基因分型的试剂盒基于光子CRISPR传感方法学(Methodologies Of Photonic CRISPR Sensing，MOPCS)，将CRISPR技术与表面等离子共振技术结合，可以实现新型冠状病毒的检测和/或分型。
本发明的第二个方面，提供一种系统，包含本发明第一个方面的试剂盒。
优选地，所述系统还包含：SPR分子相互作用仪。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的试剂盒和/或本发明第二个方面的系统在(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)非诊断目的地检测核酸；
(2)制备检测核酸的产品；
(3)非诊断目的的新型冠状病毒的检测和/或分型；
(4)制备新型冠状病毒的检测和/或分型的产品。
本发明的第四个方面，提供一种非诊断目的地检测核酸的方法，包括采用本发明的第一个方面的试剂盒和/或本发明第二个方面的系统的步骤。
优选地，所述方法包括如下步骤：
1)将SPR生物传感器芯片装载到SPR分子相互作用仪上；
2)向SPR分子相互作用仪的流通池中加入PBS缓冲液，运行3～15min，记录终点信号SPR1；
3)向流通池中加入H1，运行；
4)向流通池中加入PBS缓冲液，运行；
5)向流通池中加入H2、H3，运行；
6)向流通池中加入PBS缓冲液，运行3～30min，记录终点信号SPR5；
7)向流通池中加入CRISPR反应体系，运行20～60min；所述CRISPR反应体系包含Cas蛋白、crRNA、反应buffer和待测核酸；
8)向流通池中加入蛋白酶K，运行；
9)向流通池中加入PBS缓冲液，运行10～60min，记录终点信号SPR8；
10)计算ΔSPR＝(SPR5-SPR8)/(SPR5-SPR1)的比值。
优选地，所述方法包括如下步骤：
1)将SPR生物传感器芯片装载到SPR分子相互作用仪上；
2)向SPR分子相互作用仪的流通池中加入PBS缓冲液，运行3～15min，记录终点信号SPR1；
3)向流通池中加入H1，运行60～90min，记录终点信号SPR2；
4)向流通池中加入PBS缓冲液，运行3～20min，记录终点信号SPR3；
5)向流通池中加入H2、H3，运行45～160min，记录终点信号SPR4；
6)向流通池中加入PBS缓冲液，运行3～30min，记录终点信号SPR5；
7)向流通池中加入CRISPR反应体系，运行20～60min，记录终点信号SPR6；所述CRISPR反应体系包含Cas蛋白、crRNA、反应buffer和待测核酸；
8)向流通池中加入蛋白酶K，运行10～70min，记录终点信号SPR7；
9)向流通池中加入PBS缓冲液，运行10～60min，记录终点信号SPR8；
10)计算ΔSPR＝(SPR5-SPR8)/(SPR5-SPR1)的比值。
优选地，所述H1的工作浓度为5～15μM；进一步为8～10μM。
优选地，所述H2的工作浓度为2～10μM；进一步为3.85～9.09μM。
优选地，所述H3的工作浓度为2～7μM；进一步为2.88～5.77μM。
优选地，所述Cas蛋白的工作浓度为10～4000nM；进一步为80～400nM；更进一步为80～100nM。
优选地，所述crRNA的工作浓度为10～4000nM；进一步为80～400nM；更进一步为80～100nM。
优选地，所述蛋白酶K为500～1500倍稀释后的蛋白酶K(全式金)。
优选地，所述待测核酸包括DNA和RNA中的至少一种。
优选地，所述DNA包括ssDNA和dsDNA中的至少一种；进一步包括dsDNA。
优选地，所述待测核酸来自动物、植物或微生物样品。
优选地，所述动物样品包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检、脑脊液中的至少一种。
优选地，所述植物样品包括细胞、细胞提取物、组织中的至少一种。
优选地，所述微生物样品包括细菌、病毒、真菌或其提取物。
优选地，所述待测核酸加入CRISPR反应体系前还可以包括如下步骤：对所述待测核酸进行逆转录和/或扩增。
一种非诊断目的的新型冠状病毒的检测和/或分型的方法，包括采用本发明的第一个方面的试剂盒和/或本发明第二个方面的系统的步骤。
优选地，所述方法包括如下步骤：
1)将SPR生物传感器芯片装载到SPR分子相互作用仪上；
2)向SPR分子相互作用仪的流通池中加入PBS缓冲液，运行3～15min，记录终点信号SPR1；
3)向流通池中加入H1，运行；
4)向流通池中加入PBS缓冲液，运行；
5)向流通池中加入H2、H3，运行；
6)向流通池中加入PBS缓冲液，运行3～30min，记录终点信号SPR5；
7)向流通池中加入CRISPR反应体系，运行20～60min；所述CRISPR反应体系包含Cas蛋白、crRNA、反应buffer和待测核酸；
8)向流通池中加入蛋白酶K，运行；
9)向流通池中加入PBS缓冲液，运行10～60min，记录终点信号SPR8；
10)计算ΔSPR＝(SPR5-SPR8)/(SPR5-SPR1)的比值。
优选地，所述方法包括如下步骤：
1)将SPR生物传感器芯片装载到SPR分子相互作用仪上；
2)向SPR分子相互作用仪的流通池中加入PBS缓冲液，运行3～15min，记录终点信号SPR1；
3)向流通池中加入H1，运行60～90min，记录终点信号SPR2；
4)向流通池中加入PBS缓冲液，运行3～20min，记录终点信号SPR3；
5)向流通池中加入H2、H3，运行45～160min，记录终点信号SPR4；
6)向流通池中加入PBS缓冲液，运行3～30min，记录终点信号SPR5；
7)向流通池中加入CRISPR反应体系，运行20～60min，记录终点信号SPR6；所述CRISPR反应体系包含Cas蛋白、crRNA、反应buffer和待测核酸；
8)向流通池中加入蛋白酶K，运行10～70min，记录终点信号SPR7；
9)向流通池中加入PBS缓冲液，运行10～60min，记录终点信号SPR8；
10)计算ΔSPR＝(SPR5-SPR8)/(SPR5-SPR1)的比值。
优选地，所述H1的工作浓度为5～15μM；进一步为8～10μM。
优选地，所述H2的工作浓度为2～10μM；进一步为3.85～9.09μM。
优选地，所述H3的工作浓度为2～7μM；进一步为2.88～5.77μM。
优选地，所述Cas蛋白的工作浓度为10～4000nM；进一步为80～400nM；更进一步为80～100nM。
优选地，所述crRNA的工作浓度为10～4000nM；进一步为80～400nM；更进一步为80～100nM。
优选地，所述蛋白酶K为500～1500倍稀释后的蛋白酶K(全式金)。
优选地，步骤7)中所述CRISPR反应体系包含检测SARS-Cov-2保守序列N基因的CRISPR反应体系、检测SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因的CRISPR反应体系、检测SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的CRISPR反应体系、检测SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的CRISPR反应体系中的至少一种。
优选地，不同的CRISPR反应体系区别仅在于crRNA不同：检测SARS-Cov-2保守序列N基因的CRISPR反应体系包含crRNA-N，检测SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因的CRISPR反应体系包含crRNA-O，检测SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的CRISPR反应体系包含crRNA-D，检测SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的CRISPR反应体系包含crRNA-BA。
优选地，不同的CRISPR反应体系可以置于同一SPR分子相互作用仪中通过多通道检测，也可以依次置于同一或不同SPR分子相互作用仪依次进行检测。
优选地，所述待测核酸包括DNA和RNA中的至少一种。
优选地，所述DNA包括ssDNA和dsDNA中的至少一种；进一步包括dsDNA。
优选地，所述待测核酸来自动物、植物或微生物样品。
优选地，所述动物样品包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检、脑脊液中的至少一种。
优选地，所述植物样品包括细胞、细胞提取物、组织中的至少一种。
优选地，所述微生物样品包括细菌、病毒、真菌或其提取物。
优选地，所述待测核酸加入CRISPR反应体系前还可以包括如下步骤：对所述核酸进行逆转录和/或扩增。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种试剂盒，包含：SPR生物传感器芯片、H1、H2和H3；所述H1的核苷酸序列为N1 N2……NnTTATTATTNn+1 Nn+2……Nn+m；所述N为A、T、C或G；所述m、n独立选自于：10、11、12、13、14、15、16；所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补；或所述H2与所述H1的3’端反向互补，所述H3与所述H1的5’端反向互补；该试剂盒可以与CRISPR-Cas系统联用，针对不同的目标核酸，设计相应的CRISPR-Cas系统(crRNA及Cas蛋白)，实现目标核酸的检测，而无需更换SPR生物传感器芯片和报告探针(H1、H2和H3)，并且本发明提供的试剂盒形成的双链报告探针可以提高检测的灵敏度。
进一步地，本发明通过限定该试剂盒还包含：crRNA及Cas蛋白；得到基于光子CRISPR传感方法学(Methodologies Of Photonic CRISPR Sensing，MOPCS)的试剂盒，该试剂盒将CRISPR技术与表面等离子共振技术结合，相比诸如荧光、吸收光谱等传统光学检测手段，该试剂盒的方法具有无法比拟的超高灵敏度；相比测序或荧光显色等检测方法，该试剂盒的方法对样品处理的要求非常简单，不需要复杂的分子标记手段，从而极大简化了检测操作流程，同时降低了认为操作可能引入的检测误差的风险；并且该试剂盒的方法可以实现对检测样本进行长时间的实时监测，从而获得对检测样本各种复杂分子间相互作用的大范围动力学分析数据，进而得到分子间亲和、解离、作用力等更加全面的分析；同时，该试剂盒的方法具有极佳的兼容性，尤其是与微流控技术相结合，可以实现自动化、高通量、高灵敏度的样品检测；并且该试剂盒的方法通过CRISPR系统(Cas蛋白及crRNA)，通过crRNA的向导序列实现高特异性识别，实现目标核酸的精确识别和定量；并且相比常规核酸检测方法，该试剂盒方法灵敏度更高，检测下限最低可达0.3fM。
进一步地，本发明提供了一种用于新型冠状病毒基因分型的试剂盒，可以实现新型冠状病毒的检测和/或分型。
附图说明
图1是采用实施例1的试剂盒检测SARS-Cov-2保守序列N基因的SPR曲线图。
图2是采用对比例1的试剂盒检测SARS-Cov-2保守序列N基因的SPR测试结果图。
图3是采用实施例1、2、3、4的试剂盒检测不同浓度的SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、Omicron BA.2变异株S基因以及荧光法检测不同浓度的SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的结果图。
图4是实施例1、2、3、4的试剂盒中的crRNA的特异性检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中采用的SPR生物传感器芯片为SPR裸金芯片，购于Affiniteinstruments。
本实施例1中的纳米金的直径为10nm，OD＝1，购于东纳生物；实施例2、3、4中的纳米金的直径为15nm，OD＝1(约为2.4nM)，购于东纳生物。
本实施例中采用的SPR分子相互作用仪购自Affinite instrument，型号为P4SPR。
本实施例中的Cas12a购自易致生物。
本实施例中的PBS缓冲液(pH7.2)购于Gibco。
实施例1一种检测SARS-Cov-2保守序列N基因的试剂盒
一种检测SARS-Cov-2保守序列N基因的试剂盒，包含：SPR生物传感器芯片、纳米金H3偶联物(H3@AuNPs，以H3计，浓度为3μM)、H2(100μM)、H1(8μM)、Cas12a(100nM)、crRNA-N(100nM)、NEBuffer2.1(1x)、蛋白酶K(全式金，采用Tris buffer进行1000倍稀释)、PBS缓冲液(pH7.2)和扩增SARS-Cov-2保守序列N基因的引物F1、R1；其中，H1的序列为CTTTACTCAACTTATTATTACGAACATCAGG(SEQ ID NO.1)；H2的序列为ATAAGTTGAGTAAAG(SEQ IDNO.2)；H3的序列为CCTGATGTTCGTAATA(SEQ ID NO.3)；crRNA-N的序列为：
Figure BDA0003735101530000131
Figure BDA0003735101530000132
(SEQ ID NO.4，其中，向导序列(单下划线部分)与SARS-Cov-2保守序列N基因中的CCCCCAGCGCUUCAGCGUUC(SEQID NO.5)相同，锚定序列(双下划线部分)与Cas12a蛋白特异性结合)；F1的序列为GGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACT(SEQ ID NO.6)；R1的序列为CGAAGGTGTGACTTCCATGCCAATG(SEQ ID NO.7)；纳米金H3偶联物(H3@AuNPs)的制备方法如下：将30μL H3(100μM)与1mL纳米金混合，-80℃冷冻1h，恢复到室温待其融化，13000rpm，15min离心洗涤3次后分散到1mLPBS缓冲液中，得到纳米金H3偶联物(H3@AuNPs)。
实施例2一种检测SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因的试剂盒
一种检测SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因的试剂盒，包含：SPR生物传感器芯片、纳米金H3偶联物(H3@AuNPs，以H3计，浓度为6μM)、H2(100μM)、H1(10μM)、Cas12a(100nM)、crRNA-O(100nM)、NEBuffer2.1(1x)、蛋白酶K(全式金，采用Tris buffer进行1000倍稀释)、PBS缓冲液(pH7.2)、扩增SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因的引物F2、R2；其中，H1的序列为CTTTACTCAACTTATTATTACGAACATCAGG(SEQ ID NO.1)；H2的序列为ATAAGTTGAGTAAAG(SEQ IDNO.2)；H3的序列为CCTGATGTTCGTAATA(SEQ ID NO.3)；crRNA-O的序列为：
Figure BDA0003735101530000141
Figure BDA0003735101530000142
(SEQ ID NO.8，其中，向导序列(单下划线部分)与SARS-Cov-2Omicron变异株S基因中的AAUGAUAUCUUUUCACGUCU(SEQ ID NO.9)相同，锚定序列(双下划线部分)与Cas12a蛋白特异性结合)；F2的序列为GTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTT(SEQ ID NO.21)；R2的序列为GCACTTCAGCCTCAACTTTGTCAAG(SEQID NO.22)；纳米金H3偶联物(H3@AuNPs)的制备方法如下：将60μL H3(100μM)与1mL纳米金混合，-20℃冷冻3h，恢复到室温待其融化，13000rpm，13min离心洗涤3次后分散到1mL PBS缓冲液中，得到纳米金H3偶联物(H3@AuNPs)。
实施例3一种检测SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的试剂盒
一种检测SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的试剂盒，包含：SPR生物传感器芯片、纳米金H3偶联物(H3@AuNPs，以H3计，浓度为5μM)、H2(100μM)、H1(10μM)、Cas12a(100nM)、crRNA-D(100nM)、NEBuffer2.1(1x)、蛋白酶K(全式金，采用Tris buffer进行1000倍稀释)、PBS缓冲液(pH7.2)、扩增SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的引物F2、R2；其中，H1的序列为CTTTACTCAACTTATTATTACGAACATCAGG(SEQ ID NO.1)；H2的序列为ATAAGTTGAGTAAAG(SEQ IDNO.2)；H3的序列为CCTGATGTTCGTAATA(SEQ ID NO.3)；crRNA-D的序列为：
Figure BDA0003735101530000143
Figure BDA0003735101530000144
(SEQ ID NO.10，其中，向导序列(单下划线部分)与SARS-Cov-2Delta变异株S基因中的CAAGUGCACUUGGAAAACUU(SEQ ID NO.11)反向互补，锚定序列(双下划线部分)与Cas12a蛋白特异性结合)；F2的序列为GTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTT(SEQ ID NO.21)；R2的序列为GCACTTCAGCCTCAACTTTGTCAAG(SEQ ID NO.22)；纳米金H3偶联物(H3@AuNPs)的制备方法如下：将50μL H3(100μM)与1mL纳米金混合，-80℃冷冻3h，恢复到室温待其融化，13000rpm，13min离心洗涤3次后分散到1mL PBS缓冲液中，得到纳米金H3偶联物(H3@AuNPs)。
实施例4一种检测Omicron BA.2变异株S基因的试剂盒
一种检测SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的试剂盒，包含：SPR生物传感器芯片、纳米金H3偶联物(H3@AuNPs，以H3计，浓度为6μM)、H2(100μM)、H1(8μM)、Cas12a(100nM)、crRNA-BA(100nM)、NEBuffer2.1(1x)、蛋白酶K(全式金，采用Tris buffer进行1000倍稀释)、PBS缓冲液(pH7.2)、扩增SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的引物F2、R2；其中，H1的序列为CTTTACTCAACTTATTATTACGAACATCAGG(SEQ ID NO.1)；H2的序列为ATAAGTTGAGTAAAG(SEQ ID NO.2)；H3的序列为CCTGATGTTCGTAATA(SEQ ID NO.3)；CrRNA-BA的序列为：
Figure BDA0003735101530000151
Figure BDA0003735101530000152
(SEQ IDNO.12，其中，向导序列(单下划线部分)与SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因中的CUUGUUAAACAACUUAGCUC(SEQ ID NO.13)反向互补，锚定序列(双下划线部分)与Cas12a蛋白特异性结合)；F2的序列为GTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTT(SEQ ID NO.21)；R2的序列为GCACTTCAGCCTCAACTTTGTCAAG(SEQ ID NO.22)；纳米金H3偶联物(H3@AuNPs)的制备方法如下：将60μL H3(100μM)与1mL纳米金混合，-80℃冷冻1h，恢复到室温待其融化，13000rpm，15min离心洗涤3次后分散到1mL PBS缓冲液中，得到纳米金H3偶联物(H3@AuNP s)。
对比例1一种检测SARS-Cov-2保守序列N基因的试剂盒
一种检测SARS-Cov-2保守序列N基因的试剂盒，包含：SPR生物传感器芯片、纳米金H5偶联物(H5@AuNPs，以H5计，浓度为4μM)、H4(2μM)、Cas12a(100nM)、crRNA-N(100nM)、NEBuffer2.1(1x)、蛋白酶K(全式金，采用Tris buffer进行1000倍稀释)、PBS缓冲液(pH7.2，0.1M)、Tris缓冲液(含10mM Tris,50mM NaCl,10mM MgCl2)、扩增SARS-Cov-2保守序列N基因的引物F1、R1；其中，H4的序列为CGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGACTTTACTCAACTTATTATTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCTGATGTTCGTTGTG(SEQ ID NO.14)；H5的序列为CACAACGAACATCAGGGATC(SEQ ID NO.15)；crRNA-N的序列为：
Figure BDA0003735101530000153
Figure BDA0003735101530000154
(SEQ ID NO.4，其中，向导序列(单下划线部分)与SARS-Cov-2保守序列N基因中的CCCCCAGCGCUUCAGCGUUC(SEQID NO.5)相同，锚定序列(双下划线部分)与Cas12a蛋白特异性结合)；F1的序列为GGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACT(SEQ ID NO.6)；R1的序列为CGAAGGTGTGACTTCCATGCCAATG(SEQ ID NO.7)；纳米金H5偶联物(H5@AuNPs)的制备方法如下：将40μL H3(100μM)与1mL纳米金混合，-80℃冷冻1h，恢复到室温待其融化，13000rpm，15min离心洗涤3次后分散到1mLPBS缓冲液中，得到纳米金H5偶联物(H5@AuNPs)。
效果实施例
1.不同报告基因对试剂盒的检测效果的影响
(1)采用实施例1的试剂盒检测SARS-Cov-2保守序列N基因，具体如下：
1)将SPR裸金芯片装载到SPR分子相互作用仪上；
2)向SPR分子相互作用仪的流通池中注入1mL PBS缓冲液(pH 7.2)，运行3min，记录终点信号SPR1；
3)向流通池中注入500μL H1(8μM，PBS)，运行1h，记录终点信号SPR2；
4)向流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行3min，记录终点信号SPR3；
5)向流通池中注入500μL H2与H3@AuNPs混合液(混合液由20μL H2(100μM)与500μL H3@AuNPs混合得到)，运行45min，记录终点信号SPR4；
6)向流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行3min，记录终点信号SPR5；
7)使用病毒RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP315-R)，按照试剂盒说明书提取新型冠状病毒假病毒的RNA(普通型SARS-CoV-2假病毒，购自南京金斯瑞生物科技有限公司L02087A试剂盒)。通过SuperScript III逆转录酶(18080093，赛默飞)逆转录成cDNA模板。根据试剂商说明书(TABAS03KIT，TwistDx)进行RPA扩增(引物为F1、R1)后，即得N-gene dsDNA模板。所得dsDNA模板经NanoDrop One(赛默飞)测得质量浓度后，根据分子量大小换算为摩尔浓度并稀释至1.8μM；
8)配置CRISPR反应体系500μL：Cas12a(终浓度为100nM)、crRNA-N(终浓度为100nM)、NEBuffer2.1(终浓度为1x)、N-gene dsDNA(终浓度为100pM，阳性样品)/无核酸酶水(阴性样品)(每种处理重复3次)；
9)向流通池中注入500μLCRISPR反应体系，运行20min，记录终点信号SPR6；
10)向流通池中注入500μL蛋白酶K(全式金，1/1000稀释Tris buffer)，运行10min，记录终点信号SPR7；
11)流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行10min，记录终点信号SPR8；
12)计算ΔSPR＝(SPR5-SPR8)/(SPR5-SPR1)的比值，得到阴性样品的ΔSPR＝3.1±1.1％，阳性样品的ΔSPR＝69.5±4.3％(SPR曲线如图1所示)。
(2)采用对比例1的试剂盒检测SARS-Cov-2保守序列N基因，具体如下：
1)将SPR裸金芯片装载到SPR分子相互作用仪上；
2)向SPR分子相互作用仪的流通池中注入1mL PBS缓冲液(pH 7.2)，运行3min，记录终点信号SPR1；
3)向流通池中注入500μL H4(2μM，PBS)，运行1h，记录终点信号SPR2；
4)向流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行3min，记录终点信号SPR3；
5)向流通池中注入500μL H5@AuNPs，运行45min，记录终点信号SPR4；
6)向流通池总注入1mL PBS缓冲液，运行3min，记录终点信号SPR5；
7)向流通池总注入1mL Tris缓冲液(含10mM Tris,50mM NaCl,10mM MgCl2)，运行5min，记录终点信号SPR6；
8)使用病毒RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP315-R)，按照试剂盒说明书提取新型冠状病毒假病毒的RNA(普通型SARS-CoV-2假病毒，购自南京金斯瑞生物科技有限公司L02087A试剂盒)。通过SuperScript III逆转录酶(18080093，赛默飞)逆转录成cDNA模板。根据试剂商说明书(TABAS03KIT，TwistDx)进行RPA扩增(引物为F1、R1)后，即得N-gene dsDNA模板。所得dsDNA模板经NanoDrop One(赛默飞)测得质量浓度后，根据分子量大小换算为摩尔浓度并稀释至1.8μM；
9)配置CRISPR反应体系500μL：Cas12a(终浓度为100nM)、crRNA-N(终浓度为100nM)、NEBuffer2.1(终浓度为1x)、N-gene dsDNA(终浓度为100pM，阳性样品)；
10)向流通池中注入500μLCRISPR反应体系，运行20min，记录终点信号SPR7；
11)向流通池总注入1mL Tris缓冲液(含10mM Tris,50mM NaCl,10mM MgCl2)，运行5min，记录终点信号SPR8；
12)向流通池中注入500μL蛋白酶K(全式金，1/1000稀释Tris buffer)，运行10min，记录终点信号SPR9；
13)向流通池总注入1mL Tris缓冲液(含10mM Tris,50mM NaCl,10mM MgCl2)，运行5min，记录终点信号SPR10；
14)流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行10min，记录终点信号SPR11；
15)计算ΔSPR＝(SPR5-SPR11)/(SPR5-SPR1)的比值，得到阳性样品的ΔSPR＝28.3％(SPR测试结果如图2所示)。
可见，对比例1的试剂盒中的报告探针(H4、H5@AuNPs)上升微弱，切割信号弱，不及实施例1的试剂盒中的报告探针(H1、H2、H3@AuNPs)；并且实施例1的试剂盒可以检测出SARS-Cov-2保守序列N基因。
2.采用实施例2的试剂盒检测SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因，具体如下：
1)将SPR裸金芯片装载到SPR分子相互作用仪上；
2)向SPR分子相互作用仪的流通池中注入1mL PBS缓冲液(pH 7.2)，运行15min，记录终点信号SPR1；
3)向流通池中注入500μL H1(10μM，PBS)，运行80min，记录终点信号SPR2；
4)向流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行20min，记录终点信号SPR3；
5)向流通池中注入500μL H2与H3@AuNPs混合液(混合液由50μL H2(100μM)与500μL H3@AuNPs混合得到)，运行160min，记录终点信号SPR4；
6)向流通池总注入1mL PBS缓冲液，运行30min，记录终点信号SPR5；
7)使用病毒RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP315-R)，按照试剂盒说明书提取SARS-Cov-2 Omicron变异株假病毒的RNA(SARS-Cov-2 Omicron变异株假病毒，购自南京金斯瑞生物科技有限公司L02087-027试剂盒)。通过SuperScript III逆转录酶(18080093，赛默飞)逆转录成cDNA模板。根据试剂商说明书(TABAS03KIT，TwistDx)进行RPA扩增(引物为F2、R2)后，即得S-gene dsDNA模板。所得dsDNA模板经NanoD rop One(赛默飞)测得质量浓度后，根据分子量大小换算为摩尔浓度1.8μM；
8)配置CRISPR反应体系500μL：Cas12a(终浓度为100nM)、crRNA-O(终浓度为100nM)、NEBuffer2.1(终浓度为1x)、S-gene dsDNA(终浓度为100pM，阳性样品)/无核酸酶水(阴性样品)(每种处理重复3次)；
9)向流通池中注入500μLCRISPR反应体系，运行60min，记录终点信号SPR6；
10)向流通池中注入500μL蛋白酶K(全式金，1/1000稀释Tris buffer)，运行70min，记录终点信号SPR7；
11)流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行60min，记录终点信号SPR8；
12)计算ΔSPR＝(SPR5-SPR8)/(SPR5-SPR1)的比值，得到阴性样品的ΔSPR＝4.4±0.9％，阳性样品的ΔSPR＝68.4±5.2％。可见，实施例2的试剂盒可以检测出SARS-Cov-2Omicron变异株S基因。
3.采用实施例4的试剂盒检测SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因，具体如下：
1)将SPR裸金芯片装载到SPR分子相互作用仪上；
2)向SPR分子相互作用仪的流通池中注入1mL PBS缓冲液(pH 7.2)，运行3min，记录终点信号SPR1；
3)向流通池中注入800μL H1(8μM，PBS)，运行1h，记录终点信号SPR2；
4)向流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行3min，记录终点信号SPR3；
5)向流通池中注入800μL H2与H3@AuNPs混合液(混合液由32μL H2(100μM)与800μL H3@AuNPs混合得到)，运行45min，记录终点信号SPR4；
6)向流通池总注入1mL PBS缓冲液，运行3min，记录终点信号SPR5；
7)使用病毒RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP315-R)，按照试剂盒说明书提取SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株假病毒的RNA(SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株假病毒，购自南京金斯瑞生物科技有限公司L02087-029试剂盒)。通过SuperScriptIII逆转录酶(18080093，赛默飞)逆转录成cDNA模板。根据试剂商说明书(TABAS03KIT，TwistDx)进行RPA扩增(引物为F2、R2)后，即得S-gene dsDNA模板。所得dsDNA模板经NanoDrop One(赛默飞)测得质量浓度后，根据分子量大小换算为摩尔浓度1.8μM；
8)配置CRISPR反应体系600μL：Cas12a(终浓度为100nM)、crRNA-BA(crRNA-B,终浓度为100nM)、NEBuffer2.1(终浓度为1x)、S-gene dsDNA(终浓度为100pM，阳性样品)/无核酸酶水(阴性样品)(每种处理重复3次)；
9)向流通池中注入600μLCRISPR反应体系，运行20min，记录终点信号SPR6；
10)向流通池中注入800μL蛋白酶K(全式金，1/1000稀释Tris buffer)，运行10min，记录终点信号SPR7；
11)流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行10min，记录终点信号SPR8；
12)计算ΔSPR＝(SPR5-SPR8)/(SPR5-SPR1)的比值，得到阴性样品的ΔSPR＝0.7±1.2％，阳性样品的ΔSPR＝63.9±4.2％。可见，实施例4的试剂盒可以检测出SARS-Cov-2Omicron BA.2变异株S基因。
4.分别采用实施例3的试剂盒以及荧光法检测SARS-Cov-2 Delta变异株S基因
(1)采用实施例3的试剂盒检测SARS-Cov-2 Delta变异株S基因，具体如下：
1)将SPR裸金芯片装载到SPR分子相互作用仪上；
2)向SPR分子相互作用仪的流通池中注入1mL PBS缓冲液(pH 7.2)，运行5min，记录终点信号SPR1；
3)向流通池中注入500μL H1(10μM，PBS)，运行90min，记录终点信号SPR2；
4)向流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行5min，记录终点信号SPR3；
5)向流通池中注入500μL H2与H3@AuNPs混合液(混合液由40μL H2(100μM)与500μL H3@AuNPs混合得到)，运行90min，记录终点信号SPR4；
6)向流通池总注入1mL PBS缓冲液，运行3min，记录终点信号SPR5；
7)使用病毒RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP315-R)，按照试剂盒说明书提取SARS-Cov-2 Delta变异株假病毒的RNA(SARS-Cov-2 Delta变异株假病毒，购自南京金斯瑞生物科技有限公司L02087X试剂盒)。通过SuperScript III逆转录酶(18080093，赛默飞)逆转录成cDNA模板。根据试剂商说明书(TABAS03KIT，TwistDx)进行RPA扩增(引物为F2、R2)后，即得S-gene dsDNA模板。所得dsDNA模板经NanoDrop One(赛默飞)测得质量浓度后，根据分子量大小换算为摩尔浓度1.8μM；
8)配置CRISPR反应体系500μL：Cas12a(终浓度为100nM)、crRNA-O(终浓度为100nM)、NEBuffer2.1(终浓度为1x)、S-gene dsDNA(终浓度为100pM，阳性样品)/无核酸酶水(阴性样品)(每种处理重复3次)；
9)向流通池中注入500μLCRISPR反应体系，运行30min，记录终点信号SPR6；
10)向流通池中注入500μL蛋白酶K(全式金，1/1000稀释Tris buffer)，运行15min，记录终点信号SPR7；
11)流通池中注入1mL PBS缓冲液，运行10min，记录终点信号SPR8；
12)计算ΔSPR＝(SPR5-SPR8)/(SPR5-SPR1)的比值，得到阴性样品的ΔSPR＝3.2±1.4％，阳性样品的ΔSPR＝64.1±5.3％。可见，实施例3的试剂盒可以检测出SARS-Cov-2Delta变异株S基因。
(2)分别采用实施例1、2、3、4的试剂盒检测不同浓度的SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、Omicron BA.2变异株S基因以及荧光法检测不同浓度的SARS-Cov-2 Delta变异株S基因
1)采用实施例1、2、3、4的试剂盒检测不同浓度的SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、Omicron BA.2变异株S基因，方法与(1)相同，区别仅在于：步骤8)中S-gene dsDNA/N-gene dsDNA的终浓度分别为100pM、20pM、4pM、800fM、160fM、32fM、6.4fM、128aM、25.6aM、5.12aM。
2)采用荧光法检测SARS-Cov-2 Delta变异株S基因：配置CRISPR反应体系20μL，Cas12a(终浓度为100nM),crRNA-D(终浓度为100nM),NEBuffer2.1(终浓度为(1x))，报告探针(FAM-5'TTATTATT3'-BHQ1，终浓度为200nM)，S-gene dsDNA(终浓度为5225pM、2090pM、836pM、334.4pM、133.7pM、53.5pM、21.4pM、8.56pM、3.424pM、1.37pM)。37℃孵育30min后，用多功能酶标仪(型号Synergy H1MF,BIOTECK公司)检测荧光强度。
采用实施例1、2、3、4的试剂盒检测不同浓度的SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、Omicron BA.2变异株S基因以及荧光法检测不同浓度的SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的结果如图3所示：采用荧光法检测SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的检测限约为100pM；而采用实施例1、2、3、4的试剂盒检测不同浓度的SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、Omicron BA.2变异株S基因的检测限为0.3fM(因本方法根据病毒RNA提取试剂盒上的说明，一般用500μL的样本提取纯化至干燥的RNA样本，并以10μL灭菌纯净水重新溶解RNA，此步骤可把病毒初始样本浓缩50倍；因此计算原始样本检测下限时把50倍初始浓度浓缩计入，检测下限为0.3fM)。
5.分别采用实施例1、2、3、4的试剂盒检测实施例1、2、3得到的dsDNA(分别为SARS-Cov-2保守序列N基因dsDNA模板、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因dsDNA模板、SARS-Cov-2Omicron BA.2变异株S基因dsDNA模板、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因dsDNA模板，即分别为dsDNA-N、dsDNA-O、dsDNA-BA(dsDNA-B)、dsDNA-D)，方法与1中步骤1)～6)、8)～12)相同，结果如图4所示：实施例1、2、3、4的试剂盒分别检测dsDNA-N、dsDNA-O、dsDNA-BA(dsDNA-B)、dsDNA-D的结果优于其他dsDNA；可见，实施例1、2、3、4的试剂盒中的crRNA具有较佳的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种试剂盒，包含：SPR生物传感器芯片、H1、H2和H3；所述H1的核苷酸序列为N1N2……NnTTATTATTNn+1Nn+2……Nn+m；所述N为A、T、C或G；所述m、n独立选自于：10、11、12、13、14、15、16；
所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补；或
所述H2与所述H1的3’端反向互补，所述H3与所述H1的5’端反向互补；
所述试剂盒用于检测核酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述H2与所述H1的5’端反向互补，所述H3与所述H1的3’端反向互补；
优选地，所述H2的碱基数为n～n+4；
优选地，所述H3的碱基数为m～m+4；
优选地，所述H1、H2、H3中至少一种修饰有纳米金形成核酸-纳米金偶联物。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包含：crRNA及Cas蛋白；所述核酸的序列包含靶核酸序列；所述crRNA包含锚定序列和向导序列，所述锚定序列与所述Cas蛋白特异性结合，所述向导序列与所述靶核酸序列相同或与所述靶核酸序列反向互补。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：
所述Cas蛋白包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b中的至少一种；
优选地，所述核酸包括DNA和RNA中的至少一种；
优选地，所述核酸来自动物、植物或微生物样品。
5.权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：
所述核酸为SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因中的至少一种；
优选地，所述SARS-Cov-2保守序列N基因的靶核酸序列为CCCCCAGCGCUUCAGCGUUC(SEQID NO.5)；
优选地，所述SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因的靶核酸序列为AAUGAUAUCUUUUCACGUCU(SEQ ID NO.9)；
优选地，所述SARS-Cov-2 Delta变异株S基因的靶核酸序列为CAAGUGCACUUGGAAAACUU(SEQ ID NO.11)；
优选地，所述SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因的靶核酸序列为CUUGUUAAACAACUUAGCUC(SEQ ID NO.13)；
优选地，所述Cas蛋白为Cas12a时，所述crRNA的锚定序列为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO.20)。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述crRNA包含crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA、crRNA-N中的至少一种；所述crRNA-N、crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA分别用于检测SARS-Cov-2保守序列N基因、SARS-Cov-2 Delta变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron变异株S基因、SARS-Cov-2 Omicron BA.2变异株S基因；
优选地，所述crRNA包含crRNA-D、crRNA-O、crRNA-BA中的至少一种和crRNA-N；
优选地，所述试剂盒还包含：用于扩增包含所述靶核酸序列的核酸分子的引物；
优选地，所述试剂盒还包含：蛋白酶K、反应buffer、PBS缓冲液中的至少一种。
7.一种系统，包含权利要求1～6中任一项所述的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：
所述系统还包含：SPR分子相互作用仪。
9.权利要求1～6中任一项所述的试剂盒和/或权利要求7～8中任一项所述的系统在(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)非诊断目的地检测核酸；
(2)制备检测核酸的产品；
(3)非诊断目的的新型冠状病毒的检测和/或分型；
(4)制备新型冠状病毒的检测和/或分型的产品。
10.一种方法，包括采用1～6中任一项所述的试剂盒和/或权利要求7～8中任一项所述的系统的步骤；
所述方法为(a1)或(a2)；
(a1)非诊断目的地检测核酸；
(a2)非诊断目的的新型冠状病毒的检测和/或分型。
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