CN116287246A - Trappc1基因在制备肿瘤诊断和/或预后的试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TRAPPC1基因在制备肿瘤诊断和/或预后的试剂中的应用、和TRAPPC1基因抑制剂或含TRAPPC1基因抑制剂的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。由TRAPPC1基因制备的所述试剂具有高灵敏度和高精确度的特点，检测结果可靠；所述治疗肿瘤的药物可显著抑制肿瘤细胞的增殖，具有优异的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及TRAPPC1基因在制备胶质母细胞瘤诊断和/或预后的试剂中的应用。
背景技术
脑胶质瘤人中枢神经系统中常见的原发性肿瘤，其中以胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)恶性程度最高，是中枢神经系统最具侵袭性和致命性的原发性恶性肿瘤，以发病率高、死亡率高、侵袭性强、预后差为主要特点。新诊断的GBM患者平均总生存时间仍<14.6个月，复发的GBM患者平均总生存时间则为6.9个月。早期GBM的治疗方式是根治性手术，但由于早期GBM多无明显症状，且缺乏特异性的诊断指标，导致多数患者发现时已是中晚期GBM。因此，寻找可用于GBM早期精准诊断与靶标治疗的关键分子，是目前GBM患者所亟需的，这对于GBM的机制研究以及临床上的诊断和治疗具有重要意义。
TRAPPC1(Ensembl数据库编号为ENSG00000170043)，隶属于蛋白编码基因。其主要参与胞内蛋白从内质网到高尔基体的囊泡运输过程，维持细胞内环境稳定。在目前的研究中，仅在黑色素瘤中发现TRAPPC1可能发挥一定作用(PMID：10582700)。
发明内容
为解决现有技术中对早期黑色素瘤的诊断精确度不高的难题，本发明提供了一种生物标志物在制备肿瘤诊断和/或预后的试剂中的应用。
在一些实施方案中，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
本发明进一步提供了一种试剂组在制备肿瘤诊断和/或预后的试剂盒中的应用，所述试剂组包括TRAPPC1基因和/或检测TRAPPC1基因的试剂，所述TRAPPC1基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
在一些实施方案中，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
在一些实施方案中，所述试剂组还包括检测TRAPPC1基因的引物对；和/或，
所述试剂组包括检测内标的引物对。
在一些具体的实施方案中，所述内标为GAPDH基因。
在一些实施方案中，所述检测TRAPPC1基因的引物对包括TRAPPC1基因上游引物和TRAPPC1基因下游引物；和/或，所述检测内标的引物对包括GAPDH基因上游引物和GAPDH基因下游引物。
在一些具体的实施方案中，所述TRAPPC1基因上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，所述TRAPPC1基因下游引物序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些具体的实施方案中，所述GAPDH基因上游引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述GAPDH基因下游引物如SEQ ID NO：5所示。
在一些实施方案中，其中诊断和/或预后的样品选自细胞、血清或血浆中的一种或多种。
本发明进一步还提供了一种TRAPPC1基因抑制剂，所述TRAPPC1基因的序列如SEQID NO：1所示。
在一些实施方案中，所述TRAPPC1基因抑制剂为siRNA。
在一些具体的实施方案中，所述siRNA序列为SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7。
本发明进一步还提供了一种药物组合物，其包括所述的TRAPPC1基因抑制剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明还提供了所述的TRAPPC1基因抑制剂或所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
在一些实施方案中，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明公开了TRAPPC1基因在制备肿瘤诊断和/或预后的试剂中的应用、和TRAPPC1基因抑制剂或含TRAPPC1基因抑制剂的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。由TRAPPC1基因制备的所述试剂具有高灵敏度和高精确度的特点，检测结果可靠；所述治疗肿瘤的药物可显著抑制肿瘤细胞的增殖，具有优异的临床应用价值。
附图说明
图1为TRAPPC1在GBM患者样本及正常对照样本的差异表达情况。
图2为在GBM患者样本中TRAPPC1检测结果的ROC曲线。
图3为TRAPPC1与GBM患者预后相关性分析。
图4为TRAPPC1在正常对照细胞与GBM细胞株中的差异表达情况。
图5为TRAPPC1在健康对照与GBM患者血液样本中的差异表达情况。
图6为采用qPCR检测TRAPPC1基因siRNA在GBM细胞中转染效率结果。
图7为采用CCK8方法检测抑制TRAPPC1基因表达对GBM细胞增殖影响。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1TRAPPC1基因在GBM组织、正常对照组织中的差异表达及预后相关性分析
本发明所述的TRAPPC1其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
利用TCGA数据库，分析156例GBM患者样本及5例正常对照样本高通量测序结果，得到GBM差异基因表达谱，其中所述基因TRAPPC1在GBM患者组显著高表达(如图1所示)，ROC曲线下面积(the area under the ROC curve，AUC)等于0.888(如图2所示)。
本领域技术人员所熟知的是，ROC曲线下面积在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性，该值大于0.7即表示检测靶点能够作为该种检测的特异性标示物。
针对TCGA数据库156例GBM样本TRAPPC1表达水平与患者预后进行相关性分析，其中高于表达中位数即为高表达，低于表达中位数即为低表达。以TRAPPC1表达量对156例GBM患者进行分组，发现低表达TRAPPC1组GBM患者总生存期显著长于高表达TRAPPC1组，TRAPPC1与GBM预后显著负向相关(如图3所示)。
实施例2TRAPPC1基因在正常对照细胞与GBM细胞株中的差异表达
细胞培养：人正常星形胶质细胞(NHA)、人GBM细胞株(A172，TG-905，U251)，使用含10％胎牛血清和1％双抗的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养，2-3天换液1次。
RNA提取：收集培养的细胞，按照总RNA提取试剂盒(购自上海飞捷生物技术有限公司)说明书指示操作，进行细胞总RNA提取。
逆转录：按照HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒(购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司)说明书指示操作，进行反转录合成cDNA。
定量PCR扩增检验，反应体系为：
反应程序为：95℃预变性10min，然后以95℃变性15s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共进行38个循环。
ABI 7500荧光定量PCR仪器选定熔解曲线程序，在爬坡过程中连续收集样品荧光信号以获得熔解曲线。Real-Time PCR采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。TRAPPC1及GAPDH引物序列如表1所示：
表1.特异性扩增引物序列及相关信息
图4示出了TRAPPC1在正常对照细胞与GBM细胞株中的差异表达。如图6所示，与人正常星形胶质细胞(NHA)相比，TRAPPC1基因在人GBM细胞系(A172，TG-905，U251)中表达上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
实施例3TRAPPC1基因在健康对照与GBM患者血液样本中的差异表达
样本收集与处理：收取GBM患者和健康对照血液样本各10例，将待检血液样本常温离心，获取血浆。
样本总RNA提取：应用艾美捷血浆RNA提取试剂盒进行样本总RNA提取，按照试剂盒说明书操作。
同实施例2，进行逆转录与定量PCR扩增检验。
图5示出了TRAPPC1在健康对照与GBM患者血液样本中的差异表达。如图7所示，与健康对照血液样本相比，TRAPPC1基因在GBM患者血液样本中表达上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
实施例4TRAPPC1基因的表达抑制
细胞培养，具体步骤同实施例2。
siRNA的设计，采用在线siRNA设计工具设计TRAPPC1的siRNA两条：
siRNA#1：TTCCAAACTAGCCGTTACAAACT(SEQ ID NO.6)；
siRNA#2：AGCACAGAATAAACTTTTTGTCA(SEQ ID NO.7)。
转染，将GBM细胞A172分为三组，分别为空白对照组(转染无意义siRNA)，siRNA组#1(转染siRNA#1)和siRNA组#2(转染siRNA#2)。siRNA浓度为50nM，转染6小时后换液。
总RNA提取及TRAPPCI的表达检测与分析，48小时后收取细胞样品，后续具体步骤同实施例2。
结果如图6所示，与对照组相比，转染特异性siRNA组的TRAPPC1显著下调，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。
实施例5下调TRAPPC1表达可显著抑制GBM细胞增殖能力
采用CCK-8(Dojindo，cat#CK04-11)的方法检测TRAPPC1对GBM细胞增殖能力的影响，步骤如下：
1、细胞培养与转染步骤同实施例4。
2、各组细胞经胰酶消化重悬、计数后调整细胞浓度，以3000个/孔的浓度接种于96孔板中，每组设3个副孔。
3、待细胞到达相应时间点(24h，48h，72h，96h)后，按照说明书建议方法处理细胞后用酶标仪在450nm波长测定其吸光度值。
4、结果
结果如图7所示，与对照组相比，siRNA组GBM细胞的增殖能力受到显著抑制。
Claims (10)
1.TRAPPC1基因在制备肿瘤诊断和/或预后的试剂中的应用，其特征在于，所述TRAPPC1基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其中所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
3.一种试剂组在制备肿瘤诊断和/或预后的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂组包括TRAPPC1基因和/或检测TRAPPC1基因的试剂，所述TRAPPC1基因的序列如SEQ ID NO：1所示。
4.如权利要求3所述的应用，其中所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
5.如权利要求3或4所述的应用，其中所述试剂组还包括检测TRAPPC1基因的引物对；和/或，
所述试剂组包括检测内标的引物对；较佳地，所述内标为GAPDH基因。
6.如权利要求5所述的应用，所述检测TRAPPC1基因的引物对包括TRAPPC1基因上游引物和TRAPPC1基因下游引物，较佳地，所述TRAPPC1基因上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，所述TRAPPC1基因下游引物序列如SEQ ID NO：3所示；和/或，
所述检测内标的引物对包括GAPDH基因上游引物和GAPDH基因下游引物，较佳地，所述GAPDH基因上游引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述GAPDH基因下游引物如SEQ ID NO：5所示。
7.如权利要求1-6任一项所述的应用，其中诊断和/或预后的样品选自细胞、血清或血浆中的一种或多种。
8.一种TRAPPC1基因抑制剂，其特征在于，所述TRAPPC1基因的序列如SEQ ID NO：1所示；
较佳地，所述TRAPPC1基因抑制剂为siRNA，
更佳地，所述siRNA序列为SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7。
9.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求8所述的TRAPPC1基因抑制剂；优选地还包括药学上可接受的载体。
10.一种如权利要求8所述的TRAPPC1基因抑制剂或如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用；
较佳地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
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