CN116286654A - 一种前列腺癌类器官、培养基及培养方法 - Google Patents
一种前列腺癌类器官、培养基及培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种前列腺癌类器官、培养基及培养方法。前列腺癌类器官培养基包括基础培养基、基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素；所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：EGF，10‑100ng/ml；Noggin，20‑500ng/ml；R‑spondin 1，20‑500ng/ml；Wnt3a，20‑500ng/ml；FGF10，1‑50ng/ml；FGF2，1‑50ng/ml；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：Protodioscin，0.1‑50nM；Dehydroepiandrosterone acetate，1‑10μM；SCF，0.5‑50ng/mL。本发明提供的前列腺癌类器官培养基可特异性地对人的前列腺癌组织进行体外培养，培养基中的各个组分协同作用，培养的前列腺癌类器官生长速度快，传代次数显著提高，多次传代后仍能维持原代组织同样的组织结构与基因组特性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种前列腺癌类器官、培养基及培养方法。
背景技术
前列腺癌(prostate cancer，PCa)是全球第二大最常见的男性癌症，在2018年全球癌症统计中报告了127万多新病例和将近36万死亡病例。目前PCa临床上的常规治疗方案是雄激素剥夺治疗法(androgen deprivationtherapy，ADT)。然而，大部分原发性PCa患者经过一段时期的ADT治疗后，会逐渐对ADT产生耐药性进而从激素依赖性前列腺癌(hormone
prostate cancer，HNPC)转化为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostate cancer，CRPC)。由于CRPC具有侵袭性和高度异质性，致使不同PCa患者对同一治疗药物常表现出不同的反应，导致前列腺癌药物临床试验的成功率大大下降。
长期以来，癌症的药物筛选常依赖于传统的二维培养及患者来源的肿瘤异种移植(patient-derived xenograft，PDX)模型。细胞系作为癌症研究中最早及最为普遍应用的模型，具有可操作性高、培养周期短及高通量的特点，然而细胞系并不能很好地模拟肿瘤的三维生长环境，也缺乏肿瘤的异质性特征。PDX模型直接来源于患者，能准确反映肿瘤的遗传异质性，可保留原始肿瘤的结构、细胞组成及分子特征，然而，PDX模型成本高、耗时长等缺点限制了其在肿瘤精准治疗中的广泛应用。
类器官(Organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细跑培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。类器官可再现肿瘤的异质性并具有与患者原发瘤对药物的反应具有较高相关性的特点，因此，类器官可用于前列腺癌患者的药敏预测，为精准医学治疗做出重要提示。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种前列腺癌类器官、培养基及培养方法。
为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种前列腺癌类器官培养基，包括基础培养基、基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：
EGF，10-100ng/ml；
Noggin，20-500ng/ml；
R-spondin 1，20-500ng/ml；
Wnt3a，20-500ng/ml；
FGF10，1-50ng/ml；
FGF2，1-50ng/ml；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
Protodioscin(原薯蓣皂苷)，0.1-50nM；
Dehydroepiandrosterone acetate(醋酸去氢表雄酮)，1-10μM；
SCF(干细胞因子)，0.5-50ng/mL。
优选的，所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：
EGF，50ng/ml；
Noggin，250ng/ml；
R-spondin 1，500ng/ml；
Wnt3a，200ng/ml；
FGF10，50ng/ml；
FGF2，20ng/ml。
优选的，所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
Protodioscin(原薯蓣皂苷)，10nM；
Dehydroepiandrosterone acetate(醋酸去氢表雄酮)，10μM；
SCF，25ng/mL。
进一步的，所述基础培养基为DMEM/F12。
进一步的，所述抑制剂包括以下终浓度的组分：
p38 MAPK抑制剂(SB202190)，100-2000nM；
A83-01，0.1-10μM；
Y-27632dihydrochloride，1-50μM。
优选的，所述抑制剂包括以下终浓度的组分：
p38 MAPK抑制剂(SB202190)，200-800nM；
A83-01，0.2-5μM；
Y-27632dihydrochloride，5-20μM。
进一步的，所述抗生素为终浓度为50-500μg/mL的原代细胞抗生素。
进一步的，所述前列腺癌类器官培养基的制备方法为将基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素添加到基础培养基中混合均匀，形成液体培养基。
第二方面，本发明提供一种前列腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的手术切除标本进行预处理获取细胞团，离心去除上清备用；
2)取细胞团与Matrigel基质胶成进行混匀后铺板，凝固后倒置；
3)加入前列腺癌类器官液体培养基，培养基液面高度高于凝胶层，然后置于恒温培养箱在37℃，5％ CO2浓度下培养；
4)每隔2-3天更换一次培养基，培养4-7天。
进一步的，步骤1)中所述预处理包括洗涤、切碎、组织块消化和过滤去除杂质。
进一步的，步骤1)中细胞团的细胞数量为3～50个细胞。
进一步的，步骤2)中细胞团与基质胶的混合体积比例为1：1～1.8。
进一步的，步骤2)中凝固时间为8-10min，固定时间为20-30min。
第三方面，本发明提供使用上述前列腺癌类器官培养基或采用上述前列腺癌类器官的培养方法培养得到的前列腺癌类器官。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的前列腺癌类器官培养基可特异性地对人的前列腺癌组织进行体外培养，在培养过程中，形成从细胞构成及空间结构均近似于前列腺癌的类器官。
2、本发明提供的前列腺癌类器官培养基不需要细胞培养中最常见的组分牛血清白蛋白(FBS)，并且不需要加入激素等其他大蛋白分子，组分组成更简单，在节约成本的同时降低了FBS中带来的细胞毒性和抑制物。
3、本发明提供的前列腺癌类器官培养基中添加的特异性细胞因子有利于前列腺癌干细胞的快速扩增；添加的抑制剂全部为水溶性抑制剂，不需要DMSO溶解，减少了DMSO对体外细胞培养的毒性。
4、本发明提供的前列腺癌类器官培养基中的各个组分协同作用，培养的培前列腺癌类器官生长速度快，传代次数显著提高，多次传代后仍能维持原代组织同样的组织结构与基因组特性。
附图说明
图1为本发明实施例4培养得到的前列腺癌类器官光学显微镜图；
图2为本发明实施例5培养得到的前列腺癌类器官光学显微镜图；
图3为本发明实施例6培养得到的前列腺癌类器官光学显微镜图；
图4为本发明对比例1培养得到的前列腺癌类器官光学显微镜图；
图5为本发明对比例2培养得到的前列腺癌类器官光学显微镜图；
图6为本发明对比例3培养得到的前列腺癌类器官光学显微镜图；
图7为本发明对比例4培养得到的前列腺癌类器官光学显微镜图；
图8为本发明对比例5培养得到的前列腺癌类器官光学显微镜图；
图9为本发明对比例6培养得到的前列腺癌类器官光学显微镜图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例采用的EGF，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的Noggin，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的R-spondin 1，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的Wnt3a，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的R-spondin 1，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的FGF10，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的FGF2，购自Novoprotein；
本发明实施例采用的Y27632，购自Selleck；
本发明实施例采用的Protodioscin，购自Sigma-Aldrich；
本发明实施例采用的Dehydroepiandrosterone acetate，购自Sigma-Aldrich；
本发明实施例采用的SCF，购自Gibco；
本发明实施例采用的DMEM/F12，购自Gibco；
本发明实施例采用的原代细胞抗生素，购自InvivoGen；
本发明实施例采用的Matrigel，购自Cornin；
本发明实施例采用的p38 MAPK抑制剂(SB202190)，购自Abmole。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种前列腺癌类器官培养基，包括基础培养基、基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：
EGF，30ng/mL；
Noggin，200ng/mL；
R-spondin 1，200ng/mL；
Wnt3a，100ng/mL；
FGF10，50ng/mL；
FGF2，50ng/mL；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
Protodioscin(原薯蓣皂苷)，10nM；
Dehydroepiandrosterone acetate(醋酸去氢表雄酮)，5μM；
SCF(干细胞因子)，5ng/mL；
所述抑制剂包括以下终浓度的组分：
p38 MAPK抑制剂(SB202190)，400nM；
A83-01，2μM；
Y-27632dihydrochloride，10μM；
所述抗生素为终浓度为500μg/ml的原代细胞抗生素。
所述基础培养基为DMEM/F12。
所述前列腺癌类器官培养基的制备方法为将基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素添加到基础培养基中混合均匀，形成液体培养基。
实施例2
一种前列腺癌类器官培养基，包括基础培养基、基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：
EGF，80ng/mL；
Noggin，400ng/mL；
R-spondin 1，100ng/mL；
Wnt3a，100ng/mL；
FGF10，20ng/mL；
FGF2，10ng/mL；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
Protodioscin(原薯蓣皂苷)，40nM；
Dehydroepiandrosterone acetate(醋酸去氢表雄酮)，10μM；
SCF，40ng/mL；
所述抑制剂包括以下终浓度的组分：
p38 MAPK抑制剂(SB202190)，1500nM；
A83-01，5μM；
Y-27632dihydrochloride，20μM；
所述抗生素为终浓度为100μg/mL的原代细胞抗生素。
所述基础培养基为DMEM/F12。
所述前列腺癌类器官培养基的制备方法为将基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素添加到基础培养基中混合均匀，形成液体培养基。
实施例3
一种前列腺癌类器官培养基，包括基础培养基、基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：
EGF，50ng/mL；
Noggin，250ng/mL；
R-spondin 1，500ng/mL；
Wnt3a，200ng/mL；
FGF10，50ng/mL；
FGF2，20ng/mL；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
Protodioscin(原薯蓣皂苷)，10nM；
Dehydroepiandrosterone acetate(醋酸去氢表雄酮)，10μM；
SCF，25ng/mL；
所述抑制剂包括以下终浓度的组分：
p38 MAPK抑制剂(SB202190)，500nM；
A83-01，2.5μM；
Y-27632dihydrochloride，10μM；
所述抗生素为终浓度为200μg/mL的原代细胞抗生素。
所述基础培养基为DMEM/F12。
所述前列腺癌类器官培养基的制备方法为将基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素添加到基础培养基中混合均匀，形成液体培养基。
实施例4
一种前列腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的手术切除标本进行预处理获取细胞数量为3～50个细胞的细胞团，离心去除上清备用；所述预处理包括洗涤、切碎、组织块消化和过滤去除杂质；
2)取细胞团与Matrigel基质胶成进行混匀后铺板，细胞团与基质胶的混合比例为1:1，凝固8min后倒置20min；
3)加入实施例1前列腺癌类器官液体培养基，培养基液面高度高于凝胶层，然后置于恒温培养箱在37℃，5％ CO2浓度下培养；
4)每隔2天更换一次培养基，培养4天后得到前列腺癌类器官如图1所示。
实施例5
一种前列腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的手术切除标本进行预处理获取细胞数量为3～50个细胞的细胞团，离心去除上清备用；所述预处理包括洗涤、切碎、组织块消化和过滤去除杂质；
2)取细胞团与Matrigel基质胶成进行混匀后铺板，细胞团与基质胶的混合比例为1:1.5，凝固4min后倒置20min；
3)加入实施例2前列腺癌类器官液体培养基，培养基液面高度高于凝胶层，然后置于恒温培养箱在37℃，5％ CO2浓度下培养；
4)每隔2天更换一次培养基，培养6天后得到前列腺癌类器官如图2所示。
实施例6
一种前列腺癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
1)将新鲜的手术切除标本进行预处理获取细胞数量为3～50个细胞的细胞团，离心去除上清备用；所述预处理包括洗涤、切碎、组织块消化和过滤去除杂质；
2)取细胞团与Matrigel基质胶成进行混匀后铺板，细胞团与基质胶的混合比例为1:1.2，凝固6min后倒置20min；
3)加入实施例3前列腺癌类器官液体培养基，培养基液面高度高于凝胶层，然后置于恒温培养箱在37℃，5％ CO2浓度下培养；
4)每隔2天更换一次培养基，培养5天后得到前列腺癌类器官如图3所示，前列腺癌类器官呈圆形，直径在100μm左右。
对比例1
一种前列腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有Protodioscin，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养5天后得到前列腺癌类器官如图4所示。由图4可知，本对比例得到的前列腺癌类器官明显小于实施例6，且存在细胞逐渐凋亡情况，说明Protodioscin对前列腺癌类器官培养至关重要。
对比例2
一种前列腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有Dehydroepiandrosterone acetate，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养5天后得到前列腺癌类器官如图5所示。由图5可知，本对比例得到的前列腺癌类器官明显小于实施例6，说明Dehydroepiandrosterone acetate有助于前列腺癌类器官生长。
对比例3
一种前列腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中不含有SCF，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养5天后得到前列腺癌类器官如图6所示。由图6可知，本对比例得到的前列腺癌类器官明显小于实施例6，且存在细胞逐渐凋亡情况，说明SCF对前列腺癌类器官培养至关重要。
对比例4
一种前列腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中Protodioscin的终浓度为0.05nM，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养5天后得到前列腺癌类器官如图7所示。由图7可知，本对比例得到的前列腺癌类器官明显小于实施例6，说明Protodioscin浓度偏低时，培养的前列腺癌类器官效果较差。
对比例5
一种前列腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于特异性添加因子中Protodioscin的终浓度为70nM，其余均相同。采用实施例6的培养方法培养5天后得到前列腺癌类器官如图8所示。由图8可知，本对比例得到的前列腺癌类器官明显小于实施例6，说明Protodioscin浓度过高时，培养的前列腺癌类器官效果较差。
对比例6
一种前列腺癌类器官培养基，与实施例3的区别在于抑制剂不含有p38MAPK抑制剂(SB202190)：其余均相同。采用实施例6的培养方法培养5天后得到前列腺癌类器官如图9所示。由图9可知，本对比例得到的前列腺癌类器官逐渐凋亡，说明p38 MAPK抑制剂(SB202190)对前列腺癌类器官培养至关重要。
传代测试：
采用实施例5的培养方法，分别使用实施例1～3的液体培养基进行培养，得到的前列腺癌类器官、采用实施例5的培养方法，分别使用对比例1～6的培养基进行培养得到的前列腺癌类器官分别进行传代测试。经测试，采用实施例1～3的液体培养基可以传至5-10代，类器官仍能生长良好；而对比例1～6的培养基在传至3代内就凋亡，培养失败。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种前列腺癌类器官培养基，其特征在于，包括基础培养基、基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素；
所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：
EGF，10-100ng/mL；
Noggin，20-500ng/mL；
R-spondin 1，20-500ng/mL；
Wnt3a，20-500ng/mL；
FGF10，1-50ng/mL；
FGF2，1-50ng/mL；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
Protodioscin，0.1-50nM；
Dehydroepiandrosterone acetate，1-10μM；
SCF，0.5-50ng/mL。
2.根据权利要求1所述前列腺癌类器官培养基，其特征在于，所述基础细胞因子包括以下终浓度的组分：
EGF，50ng/mL；
Noggin，250ng/mL；
R-spondin 1，500ng/mL；
Wnt3a，200ng/mL；
FGF10，50ng/mL；
FGF2，20ng/mL；
所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：
Protodioscin，10nM；
Dehydroepiandrosterone acetate，10μM；
SCF，25ng/mL。
3.根据权利要求1所述的前列腺癌类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12。
4.根据权利要求1所述的前列腺癌类器官培养基，其特征在于，所述抑制剂包括以下终浓度的组分：
p38 MAPK抑制剂，100-2000nM；
A83-01，0.1-10μM；
Y-27632dihydrochloride，1-50μM。
5.根据权利要求4所述的前列腺癌类器官培养基，其特征在于，所述抑制剂包括以下终浓度的组分：
p38 MAPK抑制剂，200-800nM；
A83-01，0.2-5μM；
Y-27632dihydrochloride，5-20μM。
6.根据权利要求1所述的前列腺癌类器官培养基，其特征在于，所述抗生素为终浓度为50-500μg/ml的原代细胞抗生素。
7.权利要求1所述的前列腺癌类器官培养基，其特征在于，其制备方法为将基础细胞因子、特异性添加因子、抑制剂和抗生素添加到基础培养基中混合均匀，形成液体培养基。
8.一种前列腺癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将新鲜的手术切除标本进行预处理获取细胞团，离心去除上清备用；
2)取细胞团与Matrigel基质胶成进行混匀后铺板，凝固后倒置；
3)加入权利要求1～7任意一项所述的前列腺癌类器官培养基，培养基液面高度高于凝胶层，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养；
4)每隔2-3天更换一次培养基，培养4-7天。
9.根据权利要求8所述的前列腺癌类器官的培养方法，其特征在于，步骤2)中细胞团与基质胶的混合体积比例为1：1～1.8。
10.一种前列腺癌类器官，其特征在于，采用权利要求1～5任意一项所述前列腺癌类器官培养基或使用权利要求9所述前列腺癌类器官的培养方法培养获得。
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