CN116286628A - 一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用 - Google Patents
一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116286628A CN116286628A CN202310540616.7A CN202310540616A CN116286628A CN 116286628 A CN116286628 A CN 116286628A CN 202310540616 A CN202310540616 A CN 202310540616A CN 116286628 A CN116286628 A CN 116286628A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- agomir
- culture medium
- mesenchymal stem
- dental pulp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 70
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 title claims abstract description 65
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 239000000654 additive Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 46
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 44
- 108091093142 MiR-144 Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091062895 miR-144 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091031479 miR-204 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091032382 miR-204-1 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091085803 miR-204-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091089766 miR-204-3 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091073500 miR-204-4 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091053626 miR-204-5 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108091060033 miR-298 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 11
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 10
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 9
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 claims description 8
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 4
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 claims description 2
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims description 2
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 20
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 abstract description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 12
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- -1 small molecule nucleic acid Chemical class 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 3
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 3
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 210000004489 deciduous teeth Anatomy 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 1
- 210000003298 dental enamel Anatomy 0.000 description 1
- 208000007147 dental pulp necrosis Diseases 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004513 dentition Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000014684 gene silencing by miRNA Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000004283 incisor Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000036346 tooth eruption Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/65—MicroRNA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用，属于生物工程技术领域，所述添加物为miRNA激动剂，所述miRNA激动剂包括miR‑144 agomir、miR‑204 agomir、miR‑298 agomir中的一种或两种以上的组合。进一步的，本发明公开的一种牙髓间充质干细胞培养基是通过向基础培养基中添加所述miRNA激动剂制备得到。本发明提供的牙髓间充质干细胞培养基添加物可有效提高原代牙髓间充质干细胞的扩增速度，使用所述添加物制备得到的培养基可使细胞稳定传代至15代以上，获得的细胞表型稳定，保持其分化潜能。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体设计一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用。
背景技术
干细胞不同于成熟细胞首先是因为它能够在长时间内保持自我更新和扩增的能力，其次干细胞能够向多种细胞系分化。干细胞的这些特点使其成为良好的种子细胞来源。其中，间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
近年来，miRNA因其功能多样化而在组织工程学领域中的备受关注。miRNA通过调控靶基因而影响表观遗传的重要分子，主要通过种子序列与靶mRNA3’-端非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR)部分或完全互补结合而抑制基因表达或介导靶基因降解，实现转录后水平的广泛基因调控。miRNA介导的基因沉默效应涉及真核生物细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、免疫调节等各种发育和代谢过程。
由于miRNA动物实验的体内环境复杂，实验周期长，对miRNA的稳定性要求更高，而人工合成的miRNA激动剂（miRNA agomir）具有较好的分子稳定性和miRNA活性。在此基础上，本发明技术人员提供一种用于牙髓间充质干细胞培养基的添加物，所述添加物由3种miRNA激动剂组成，对牙髓间充质干细胞的增殖具有促进作用。并且使用所述培养基培养牙髓间充质干细胞至15代，获得的细胞表型稳定。
发明内容
本发明的目的是提供一种牙髓间充质干细胞培养基添加物，所述添加物是3种miRNA激动剂的组合。本发明提供的牙髓间充质干细胞培养基添加物可有效提高原代牙髓间充质干细胞的扩增速度，并可稳定传代至15代以上，保持其分化潜能。
第一方面，本发明提供一种牙髓间充质干细胞培养基添加物，其特征在于，所述添加物为miRNA激动剂，所述miRNA激动剂包括miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298agomir中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述miRNA激动剂由miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298 agomir组成。
更优选的，miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298 agomir的物质的量比为1:（1-2）:（1-2）。
在本发明的最优选实施方式中，miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298agomir的物质的量比为1:1:1。
miR-144 agomir是经特殊化学修饰合成的miR-144拟似物，miR-144的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。miR-144 agomir为双链结构，包含正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反义链与其互补。所述特殊化学修饰为在反义链3’端进行胆固醇分子修饰，协助核酸进入细胞，5’端两个核苷酸与3’端四个核苷酸通过硫代反应加入硫代骨架修饰，全部核苷酸分子进行甲氧基修饰，增强小分子核酸的稳定性。
miR-204 agomir是经特殊化学修饰合成的miR-204拟似物，miR-204的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。miR-204 agomir为双链结构，包含正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反义链与其互补。所述特殊化学修饰为在反义链3’端进行胆固醇分子修饰，协助核酸进入细胞，5’端两个核苷酸与3’端四个核苷酸通过硫代反应加入硫代骨架修饰，全部核苷酸分子进行甲氧基修饰，增强小分子核酸的稳定性。
miR-298 agomir是经特殊化学修饰合成的miR-298拟似物，miR-298的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。miR-298 agomir为双链结构，包含正义链和反义链，正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反义链与其互补。所述特殊化学修饰为在反义链3’端进行胆固醇分子修饰，协助核酸进入细胞，5’端两个核苷酸与3’端四个核苷酸通过硫代反应加入硫代骨架修饰，全部核苷酸分子进行甲氧基修饰，增强小分子核酸的稳定性。
第二方面，本发明提供一种牙髓间充质干细胞培养基，其特征在于，所述培养基通过向基础培养基中添加miRNA激动剂制备得到，所述miRNA激动剂包括miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298 agomir中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述miRNA激动剂由miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298 agomir组成。
具体的，在所述培养基中，miR-144 agomir的浓度为10-100nM，miR-204 agomir的浓度为10-100nM，miR-298 agomir的浓度为10-100nM。
更优选的，在所述培养基中，miR-144 agomir的浓度为30-100nM，miR-204 agomir的浓度为30-100nM，miR-298 agomir的浓度为30-100nM。
最优选的，在所述培养基中，miR-144 agomir的浓度为30nM，miR-204 agomir的浓度为30nM，miR-298 agomir的浓度为30nM。
所述基础培养基是本领域常规使用的可用于间充质干细胞培养的试剂，本领域技术人员可以根据需要自由选择。在本发明的具体实施方式中，所述基础培养基为a-MEM培养基。
进一步的，所述培养基中还包括抗生素，所述抗生素选自青霉素、链霉素、两性霉素B中的一种或两种以上的组合。
更进一步的，所述培养基中还包括10%胎牛血清，10%胎牛血清的添加量为本领域技术人员常规使用量。
在本发明的具体实施方式中，所述牙髓间充质干细胞培养基为如下组分：a-MEM培养基、10%胎牛血清、miR-144 agomir 30nM，miR-204 agomir 30nM，miR-298 agomir 30nM、青霉素 100U/mL、链霉素 100mg/mL、两性霉素B 0.25mg/ml。
第三方面，本发明提供一种牙髓间充质干细胞培养基添加物在培养牙髓间充质干细胞中的用途。
第四方面，本发明提供一种牙髓间充质干细胞培养基在制备用于培养牙髓间充质干细胞试剂中的用途。
本发明提供的牙髓间充质干细胞培养基添加物可有效提高原代牙髓间充质干细胞的扩增速度。使用所述添加物制备得到的培养基可使细胞稳定传代至15代以上，获得的细胞表型稳定，保持其分化潜能。
附图说明
图1为miRNA激动剂对牙髓间充质干细胞增殖的影响图。
图2为miRNA激动剂浓度对牙髓间充质干细胞增殖的影响图。
图3为miRNA激动剂组合形式对牙髓间充质干细胞增殖的影响图。
图4为CD105流式细胞仪检测结果图。
图5为CD73流式细胞仪检测结果图。
图6为CD90流式细胞仪检测结果图。
图7为STRO-1流式细胞仪检测结果图。
图8为CD34流式细胞仪检测结果图。
图9为CD45流式细胞仪检测结果图。
图4-9中的V1L是指荧光阈值的左边，即阴性；V1R是指荧光阈值的右边，即阳性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
牙髓间充质干细胞培养基的制备
实施例1
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基组分如下表所示：
表1 培养基组分
实施例2
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基组分与实施例1相同，区别仅在于miRNA激动剂的浓度，分别是：miR-144 agomir 30nM，miR-204 agomir 30nM，miR-298 agomir30nM。
实施例3
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基组分与实施例1相同，区别仅在于miRNA激动剂的浓度，分别是：miR-144 agomir 50nM，miR-204 agomir 50nM，miR-298 agomir50nM。
实施例4
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基组分与实施例1相同，区别仅在于miRNA激动剂的浓度，分别是：miR-144 agomir 100nM，miR-204 agomir 100nM，miR-298 agomir100nM。
实施例5
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基中基础培养基、抗生素和10%胎牛血清用量与实施例2相同，区别仅在于miRNA激动剂的组分与浓度，分别是：miR-144 agomir30nM，miR-204 agomir 0nM，miR-298 agomir 30nM。
实施例6
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基中基础培养基、抗生素和10%胎牛血清用量与实施例2相同，区别仅在于miRNA激动剂的组分与浓度，分别是：miR-144 agomir30nM，miR-204 agomir 30nM，miR-298 agomir 0nM。
实施例7
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基中基础培养基、抗生素和10%胎牛血清用量与实施例2相同，区别仅在于miRNA激动剂的组分与浓度，分别是：miR-144 agomir0nM，miR-204 agomir 30nM，miR-298 agomir 30nM。
实施例8
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基中基础培养基、抗生素和10%胎牛血清用量与实施例2相同，区别仅在于miRNA激动剂的组分与浓度，分别是：miR-144 agomir30nM，miR-204 agomir 0nM，miR-298 agomir 0nM。
实施例9
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基中基础培养基、抗生素和10%胎牛血清用量与实施例2相同，区别仅在于miRNA激动剂的组分与浓度，分别是：miR-144 agomir0nM，miR-204 agomir 30nM，miR-298 agomir 0nM。
实施例10
本实施例提供的牙髓间充质干细胞培养基中基础培养基、抗生素和10%胎牛血清用量与实施例2相同，区别仅在于miRNA激动剂的组分与浓度，分别是：miR-144 agomir0nM，miR-204 agomir 0nM，miR-298 agomir 30nM。
对比例1
通过商业途径购买到的商用牙髓间充质干细胞培养基，商品名称：LONZA DPSCGrowth Medium Bullet Kit，货号：PT-3005。
对比例2
以商用牙髓间充质干细胞培养基为基础，向其中添加miRNA激动剂，添加量为：miR-144 agomir 30nM，miR-204 agomir 30nM，miR-298 agomir 30nM。所述商用牙髓间充质干细胞培养基的来源如对比例1所示。
牙髓间充质干细胞的培养
效果例1miRNA激动剂对牙髓间充质干细胞增殖的影响
试验目的：分别以商用培养基、商用培养基+miRNA激动剂培养牙髓间充质干细胞，验证miRNA激动剂对牙髓间充质干细胞增殖的影响。
试验用培养基：实施例2、对比例1、对比例2。
试验方法：
牙髓间充质干细胞的提取：新鲜拔除的乳牙由口腔医生判断牙体和牙髓的状况，筛选无龋、无牙髓炎症和牙髓坏死等症状，并且至少剩余 1/3 牙根的乳切牙或乳尖牙。
S1：用PBS清洗牙齿，配合刀片刮掉表面异物；
S2：在牙骨质牙釉质交界进行切割，露出髓腔（用牙科高速手机）；
S3：用钩针将牙髓组织从髓腔分离出来，置于含培养基的培养皿中；
S4：用吸管将小块牙髓组织转移至装有试剂（3mg/mL Ⅰ型胶原酶 + 4mg/mL 中性蛋白酶）的15ml离心管中；
S5：37℃消化1h，用70μm细胞筛过滤，室温1200rpm离心5min；
S6：弃掉上清液，分别使用实施例2、对比例1-2制备的培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1*104/ml；
S7：单细胞悬液接种到T25培养瓶，37℃，5% CO2培养，3d后更换相应培养基，细胞融合度达到50%以上后每24h进行半换液一次；
S8：细胞融合度达到70-80%后，进行传代；
S9：分别在培养后的72h、96h、120h、144h、168h、192h使用CCK8试剂盒进行细胞增殖能力检测。
结果如图1所示，本发明实施例2制备得到的培养基对牙髓间充质干细胞的增殖效果优于商用培养基，在商用培养基的基础上添加本发明提供的培养基添加物（miR-144agomir 30nM，miR-204 agomir 30nM，miR-298 agomir 30nM）能显著提高细胞增殖能力。
效果例2miRNA激动剂浓度对牙髓间充质干细胞增殖的影响
试验目的：在相同的基础培养基基础上添加不同浓度的miRNA激动剂得到牙髓间充质干细胞培养基，验证miRNA激动剂浓度对牙髓间充质干细胞增殖的影响。
试验用培养基：实施例1-4。
3试验方法同效果例1，试验结果如图2所示，当miRNA激动剂的浓度为10nM时，随着培养时间增长，细胞增殖效果增长较缓慢。当miRNA激动剂的浓度为30nM后，培养7d后的细胞总量与50nM、100nM组已没有统计学显著差异。所以，本发明优选miRNA激动剂的浓度为30nM。
效果例3miRNA激动剂组合形式对牙髓间充质干细胞增殖的影响
试验目的：在相同的基础培养基基础上添加不同组合的miRNA激动剂得到牙髓间充质干细胞培养基，验证miRNA激动剂组合形式对牙髓间充质干细胞增殖的影响。
试验用培养基：实施例5-10。
试验方法同效果例1，试验结果如图3所示，当miRNA激动剂是miR-144 agomir，miR-204 agomir，miR-298 agomir中的一种或两种的组合时，其制备得到的培养基对牙髓间充质干细胞的增殖促进作用均不及miRNA激动剂是miR-144 agomir，miR-204 agomir，miR-298 agomir三种的组合。
效果例4流式细胞仪鉴定牙髓间充质干细胞表面分子
按照本发明效果例2所述的方法进行牙髓间充质干细胞的培养，待细胞融合度达到85-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化约1min，培养基吹打培养瓶底收集细胞，1800 rpm离心5min，重悬细胞后传代分3-4瓶；重复以上步骤至传代到第15代后，使用流式细胞仪进行表面分子CD105、CD73、CD90、STRO-1、 CD34、CD45的鉴定。
鉴定结果如图4-9所示，使用本发明提供的培养基分离培养的牙髓间充质干细胞经流式细胞仪鉴定，CD105、CD73、CD90、STRO-1四种阳性特异性marker的阳性率均大于90％，CD34、CD45两种阴性marker的阴性率大于90％，说明培养至15代的牙髓间充质干细胞纯度依然很高，仍然保持有很好的分化活性和潜能。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种牙髓间充质干细胞培养基添加物，其特征在于，所述添加物为miRNA激动剂，所述miRNA激动剂包括miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298 agomir中的一种或两种以上的组合；
miR-144 agomir是经特殊化学修饰合成的miR-144拟似物，miR-144的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；miR-204 agomir是经特殊化学修饰合成的miR-204拟似物，miR-204的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；miR-298 agomir是经特殊化学修饰合成的miR-298拟似物，miR-298的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298 agomir为双链结构，包含正义链和反义链；所述的特殊化学修饰为在反义链3’端进行胆固醇分子修饰， 5’端两个核苷酸与3’端四个核苷酸通过硫代反应加入硫代骨架修饰，全部核苷酸分子进行甲氧基修饰。
2.根据权利要求1所述的牙髓间充质干细胞培养基添加物，其特征在于，所述miRNA激动剂由miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298 agomir组成。
3.根据权利要求2所述的牙髓间充质干细胞培养基添加物，其特征在于， miR-144agomir、miR-204 agomir、miR-298 agomir的物质的量比为1:（1-2）:（1-2）。
4.一种牙髓间充质干细胞培养基，其特征在于，所述培养基通过向基础培养基中添加miRNA激动剂制备得到，所述miRNA激动剂由miR-144 agomir、miR-204 agomir、miR-298agomir组成，在所述培养基中，miR-144 agomir的浓度为10-100nM，miR-204 agomir的浓度为10-100nM，miR-298 agomir的浓度为10-100nM。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，在所述培养基中，miR-144 agomir的浓度为30-100nM，miR-204 agomir的浓度为30-100nM，miR-298 agomir的浓度为30-100nM。
6.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还包括抗生素，所述抗生素选自青霉素、链霉素、两性霉素B中的一种或两种以上的组合。
7.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还包括10%胎牛血清。
8.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述牙髓间充质干细胞培养基为如下组分：a-MEM培养基、10%胎牛血清、miR-144 agomir 30nM，miR-204 agomir 30nM，miR-298agomir 30nM、青霉素 100U/mL、链霉素 100mg/mL、两性霉素B 0.25mg/ml。
9.一种权利要求1-3任一所述的牙髓间充质干细胞培养基添加物在培养牙髓间充质干细胞中的用途。
10.一种权利要求4-8任一所述的牙髓间充质干细胞培养基在制备用于培养牙髓间充质干细胞试剂中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310540616.7A CN116286628B (zh) | 2023-05-15 | 2023-05-15 | 一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310540616.7A CN116286628B (zh) | 2023-05-15 | 2023-05-15 | 一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116286628A true CN116286628A (zh) | 2023-06-23 |
| CN116286628B CN116286628B (zh) | 2023-07-28 |
Family
ID=86794413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310540616.7A Active CN116286628B (zh) | 2023-05-15 | 2023-05-15 | 一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116286628B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140200261A1 (en) * | 2013-01-17 | 2014-07-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes |
| US20150024966A1 (en) * | 2012-02-22 | 2015-01-22 | Brainstem Biotec Ltd. | Mesenchymal stem cells for in vitro modeling and cell-based therapy of human diseases and banks thereof |
| US20150216892A1 (en) * | 2012-08-03 | 2015-08-06 | Aptamir Therapeutics, Inc. | Cell-specific delivery of mirna modulators for the treatment of obesity and related disorders |
| US20160076026A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-03-17 | The Hospital For Sick Children | Diagnostic and therapeutic methods relating to microrna-144 |
| KR20170132461A (ko) * | 2016-05-24 | 2017-12-04 | 한양대학교 산학협력단 | 심근경색 이후의 심근 세포 또는 심장 조직을 재생하기 위한 골수 유래 중간엽 줄기세포 및 이로부터 방출된 측분비 인자들을 포함하는 약학 조성물 |
| US20180127786A1 (en) * | 2016-09-23 | 2018-05-10 | Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership | Compositions and methods for gene editing |
| CN109381478A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-02-26 | 青岛大学附属医院 | 一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用 |
| CN112094844A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-18 | 成都仕康美生物科技有限公司 | miRNA激动剂及应用、人源间充质干细胞培养基及培养方法 |
| CN114939125A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-08-26 | 江苏省中医院 | 巨噬细胞源外泌体在制备抗腹膜纤维化药物中的应用 |
-
2023
- 2023-05-15 CN CN202310540616.7A patent/CN116286628B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150024966A1 (en) * | 2012-02-22 | 2015-01-22 | Brainstem Biotec Ltd. | Mesenchymal stem cells for in vitro modeling and cell-based therapy of human diseases and banks thereof |
| US20150216892A1 (en) * | 2012-08-03 | 2015-08-06 | Aptamir Therapeutics, Inc. | Cell-specific delivery of mirna modulators for the treatment of obesity and related disorders |
| US20140200261A1 (en) * | 2013-01-17 | 2014-07-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes |
| US20160076026A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-03-17 | The Hospital For Sick Children | Diagnostic and therapeutic methods relating to microrna-144 |
| KR20170132461A (ko) * | 2016-05-24 | 2017-12-04 | 한양대학교 산학협력단 | 심근경색 이후의 심근 세포 또는 심장 조직을 재생하기 위한 골수 유래 중간엽 줄기세포 및 이로부터 방출된 측분비 인자들을 포함하는 약학 조성물 |
| US20180127786A1 (en) * | 2016-09-23 | 2018-05-10 | Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership | Compositions and methods for gene editing |
| CN109381478A (zh) * | 2018-10-31 | 2019-02-26 | 青岛大学附属医院 | 一种miRNA在制备抑制新生血管生成和抑制VEGF-A因子表达的试剂中的应用 |
| CN112094844A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-18 | 成都仕康美生物科技有限公司 | miRNA激动剂及应用、人源间充质干细胞培养基及培养方法 |
| CN114939125A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-08-26 | 江苏省中医院 | 巨噬细胞源外泌体在制备抗腹膜纤维化药物中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CONG HUANG等: "MiR-144-3p regulates osteogenic differentiation and proliferation of murine mesenchymal stem cells by specifically targeting Smad4", FEBS LETTERS, pages 795 - 807 * |
| SHANSHAN CHEN等: "MiR-144 Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis and Autophagy in Lung Cancer Cells by Targeting TIGAR", CELLULAR PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY, vol. 35, no. 3, pages 999 * |
| 丁香通: "miRNA antagomir / miRNA Agomir（8折促销中）", 丁香通, pages 2 * |
| 黄聪: "miR-144-3p在间充质干细胞增殖、分化、凋亡过程中调控作用研究", 中国博士学位论文全文数据库, pages 98 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116286628B (zh) | 2023-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lizier et al. | Scaling-up of dental pulp stem cells isolated from multiple niches | |
| Hakki et al. | Comparison of mesenchymal stem cells isolated from pulp and periodontal ligament | |
| Tran et al. | Various methods for isolation of multipotent human periodontal ligament cells for regenerative medicine | |
| JP2017513477A5 (zh) | ||
| Zhang et al. | Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from whole human umbilical cord applying a single enzyme approach | |
| EP3828263A1 (en) | Method and kit for preparing clinical-grade mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells | |
| TW490487B (en) | A cell line derived from Penaeus monodon and a method of growing virus using the same | |
| CN111454953B (zh) | 一种骨髓间充质干细胞成脂转化促进剂 | |
| CN112111448B (zh) | 改良的间充质干细胞培养基、骨髓间充质干细胞及其培养方法和应用 | |
| JP5878650B2 (ja) | 間充織幹細胞を大規模で迅速に高純度で誘導して造血幹細胞に転換する方法 | |
| El-Sayed et al. | Isolation and characterization of multipotent postnatal stem/progenitor cells from human alveolar bone proper | |
| Arpornmaeklong et al. | Allogenic human serum, a clinical grade serum supplement for promoting human periodontal ligament stem cell expansion | |
| CN111500578A (zh) | 调控ADSCs成骨分化及组织再生Circ RNA-FTO及其应用 | |
| CN104830758A (zh) | 一种间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法 | |
| Moreira et al. | Successful use of human AB serum to support the expansion of adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cell in a microcarrier-based platform | |
| CN110106150B (zh) | 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R的制备方法及应用 | |
| WO2020251348A1 (en) | Production of mesenchymal stem cells with therapeutic potential | |
| CN116286628B (zh) | 一种牙髓间充质干细胞培养基添加物、培养基及其应用 | |
| CN111849878A (zh) | 一种提高间充质干细胞成骨能力的方法 | |
| CN112251411A (zh) | 一种miR-17-92修饰的间充质干细胞、外泌体及其制备方法和应用 | |
| CN112941106B (zh) | 一种通过foxp1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法 | |
| BAGHABAN et al. | Mesenchymal stem cells derived from rat epicardial versus epididymal adipose tissue | |
| CN110172448B (zh) | 一种滑膜肉瘤细胞系hSS-005R及其子代细胞系 | |
| US11248210B2 (en) | Method for isolation of stem cells from bone marrow using subfractionation culturing method and proliferation thereof | |
| CN111944751B (zh) | 一种与干细胞增殖相关的Abca4基因及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |