CN116283995B - 一种脂酰辅酶a合成酶短链家族成员3的激动剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂及其应用。ACSS3在前列腺癌细胞中的表达下调，可能和前列腺癌的发生和发展相关。本发明公开一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂，还涉及该激动剂用于上调前列腺癌细胞ACSS3蛋白表达的应用以及用于制备治疗前列腺癌药物的应用。本发明为前列腺癌患者提供了一种潜在的上调ACSS3蛋白表达，进而抑制前列腺癌进展的药物，并能开发成有效的抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明属于脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂相关技术领域，具体涉及一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂及其应用。
背景技术
脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3(Acyl-CoA synthetase short-chain familymember 3，ACSS3)属于短链ACS，其在脂肪酸代谢中发挥着非常重要的作用。对其进行一级序列划分，ACSS3前116个氨基酸残基为N端，571之后的区域为C端，123-561区域为蛋白主体部分，其中227-230区域为辅酶A 的结合部位，425-427、446-451区域为ATP结合部位。ACSS3在前列腺癌中的表达下调，可能和前列腺癌的发生和发展相关，但目前尚无针对ACSS3的药物被报道。因此，研发一种针对ACSS3的激动药物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂及其应用。通过同源建模方法获得ACSS3的三维结构，并基于ACSS3蛋白的ATP结合口袋进行计算机虚拟筛选，确定系列候选药物，接着通过系列细胞实验证实本发明所述的激动剂具有显著上调前列腺癌细胞ACSS3蛋白表达，进而抑制前列腺癌进展的作用。
本发明提供如下技术方案：
一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂及其应用，该脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂为：
优选的，所述脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3前116个氨基酸残基为N端，571之后的区域为C端，123-561区域为蛋白主体部分，其中227-230区域为辅酶A结合部位，425-427、446-451区域为ATP结合部位。
优选的，所述脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3在前列腺癌中的表达下调。
优选的，所述的脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂用于制备上调肿瘤细胞ACSS3蛋白表达的药物的应用。
优选的，所述肿瘤细胞包括前列腺癌细胞。
优选的，所述脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂用于制备治疗前列腺癌药物的应用。
优点及效果：
本发明为前列腺癌患者提供了一种潜在的上调ACSS3蛋白表达，进而抑制前列腺癌进展的药物，并能开发成有效的抗肿瘤药物。
附图说明：
图1为人类ACSS3蛋白同源三维模型；
图2为化合物1与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图3为化合物2与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图4为化合物3与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图5为化合物4与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图6为化合物5与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图7为化合物6与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图8为化合物7与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图9为化合物8与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图10为化合物9与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图11为化合物10与靶蛋白 ACSS3 中的ATP 口袋互作叠合图；
图12为上述筛选的10种可能和ACSS3结合的化合物处理对前列腺癌细胞ACSS3表达的影响；
图13为化合物4，即本发明所述的一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂的化学结构式；
图14为使用化合物4处理C4-2前列腺癌细胞后的油红染色结果；
图15为使用化合物4处理C4-2前列腺癌细胞对细胞内甘油三酯、胆固醇含量的影响；
图16为使用化合物4处理后C4-2前列腺癌细胞的生长曲线；
图17为使用化合物4对C4-2前列腺癌细胞的毒性作用；
图18展示化合物4对C4-2前列腺癌细胞迁移的抑制作用；
图19为化合物4在裸鼠水平抑制前列腺癌生长的曲线；
图20为化合物4在裸鼠水平抑制前列腺癌生长的离体肿瘤图片。
具体实施方式
本发明提供了一种上调肿瘤细胞ACSS3蛋白表达的药物，旨在开发一种上调前列腺癌细胞ACSS3蛋白表达，进而抑制前列腺癌进展的药物。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体流程如下：
如图1所示，通过同源建模，构建了人类ACSS3蛋白同源三维模型，用于进行后续计算机虚拟筛选，其对接口袋为 ATP结合口袋。
虚拟筛选所用软件为Schrödinger Maestro 11.4，3D作图软件为PyMol。具体流程如下：
1. 蛋白准备：将ACSS3蛋白的同源模型导入到软件中。使用Protein PreparationWizard Panel模块对蛋白进行处理：去水、加氢、优化结构、能量最小化等（OPLS2005 力场，0.30 Å RMSD）。然后将ACSS3的ATP口袋作为对接口袋，用Receptor Grid Generation模块制作格点文件，盒子大小为 20 Å ×20 Å ×20 Å （以 ASP539/ARG554/ARG565 为中心）。
2. 化合物准备：分别将Enamine Hit Locator Library 500 （含 500K 个化合物）、MCE Bioactive Compound Library Plus（含8.3千个化合物）中化合物的2D格式通过LigPrep Module模块进行处理，输出3D结构。
3. 虚拟筛选：采用Virtual Screening Workflow模块进行虚拟筛选，将准备好的化合物导入，利用 Glide 模块进行分子对接， 即受体和配体分子之间通过几何匹配和能量匹配而互相对接。首先采用 Glide 模块中的高通量筛选（HTVS）模式将Enamine HitLocator Library中准备好的小分子化合物进行筛选，挑选打分值前 10%的小分子化合物采用标准 （SP）模式进行第二轮筛选；随后挑选打分值前 10%采用高精度（XP）模式进行第三轮筛选，获得小分子化合物的排名。采用同样的方法将 MCE Bioactive CompoundLibrary 中的化合物与靶蛋白ACSS3 进行分子对接，获得小分子化合物排名。最后进行人工挑选，即人工复核靶点与化合物结合力、化合物结构以及成药性等，优选出Enamine HitLocator Library 排名前 500名、MCE Bioactive Compound Library 排名前100名的化合物输出，作为最终结果交付。并分别将Enamine Hit Locator Library排名前5（Z223586436、 Z1444930213、 Z192646214、Z223587346、 Z1445395435）、MCE BioactiveCompound Library 排名前5（HY-N0112、HY-100456、HY-10227、HY-18085、HY-101552A）的化合物与ACSS3 蛋白的结合模式进行2D、3D作图。
前10名优选化合物与靶蛋白ACSS3中的互作叠合图如图2至图11所示，结果显示优选的前10名化合物均作用在ATP口袋位置。
如图2分子对接结果显示，分子对接结果显示，化合物1可以与靶蛋白ACSS3形成 4个氢键作用和1个π-π 作用：其中乙酰基的羰基作为氢键受体与VAL345形成氢键作用，距离为2.2 Å；中间的酰胺键NH作为氢键供体与GLY425形成氢键作用，距离为2.2 Å；末端的酰胺键作为氢键供体与ASP446、HIS447形成两个氢键作用，距离分别为1.6 Å、 1.8 Å。此外，咪唑环可以与TRP448形成一个π-π 作用。
如图3分子对接结果显示，化合物 2可以与靶蛋白ACSS3形成5个氢键作用和1个π-π 作用：羧基作为氢键受体与TRP449、GLY425形成氢键作用，距离分别为2.5 Å、1.7 Å；中间的酰胺键羰基作为氢键受体与THR451、ARG565形成氢键作用，距离均为2.8 Å；末端环内的酰胺键羰基作为氢键受体与VAL345形成氢键作用，距离为1.9 Å；此外，与羧基相连的苯环可以与TRP448可以形成π-π 作用。
如图4分子对接结果显示，化合物 3可以与靶蛋白ACSS3形成4个氢键作用和1个π-π作用：末端的脲基可以与GLU426、HIS447、TRP449形成三个氢键作用，距离分别为2.7 Å、2.0 Å、2.1 Å；酰胺键羰基可以作为氢键受体与ARG565 形成氢键作用，距离为3.0 Å；此外，化合物还可以与TRP448形成π-π作用。
如图5分子对接结果显示，化合物4，即本发明所述的一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂，可以与靶蛋白ACSS3形成3个氢键作用和1个π-π 作用：末端酰胺键NH 作为氢键供体与ASP446、HIS447形成氢键作用，距离分别为1.6Å、1.8 Å；中间的酰胺键NH作为氢键供体与GLY425形成氢键作用，距离为2.1 Å；此外，化合物的咪唑环可以与TRP448形成π-π 作用。
如图6分子对接结果显示，化合物 5可以与靶蛋白ACSS3形成5个氢键作用和1个π-π 作用：末端的羧基与GLY425、TRP449形成3个氢键作用，距离分别为1.9 Å、2.1 Å、2.4 Å；中间的酰胺键羰基作为氢键受体与THR451形成氢键作用，距离为2.2 Å；五元环上的羰基作为氢键受体与ARG565形成氢键作用，距离为2.2 Å；此外，化合物的噻唑环可以与TRP448形成π-π作用。
如图7分子对接结果显示，化合物 6可以与靶蛋白ACSS3形成6个氢键，具体的氢键距离见3D相互作用图。此外，化合物可以与TRP448形成π-π 作用。
如图8分子对接结果显示，化合物7可以与靶蛋白ACSS3 形成5个氢键作用和1个π-π作用：羧基作为氢键受体与VAL345 形成氢键作用，距离为1.9 Å；与羧基相邻的羟基作为氢键供体与GLY563形成氢键作用，距离为1.9 Å；中间的NH作为氢键供体与GLY425 形成氢键作用，距离为2.1 Å；另一个苯环上的羟基可以与ASP539、ASN560形成两个氢键作用，距离分别为2.1 Å、2.3 Å；此外，化合物可以与TRP448形成π-π作用。
如图9分子对接结果显示，化合物 8可以与靶蛋白ACSS3形成4个氢键作用和1个π-π作用：硼酸基团可以与GLY425、TRP449形成两个氢键作用，距离分别为2.2 Å、1.9 Å；一个酰胺键NH作为氢键供体与GLY425形成氢键作用，距离为2.3 Å，另一个酰胺键羰基作为氢键受体与ARG565形成氢键作用，距离为2.0 Å；此外，吡嗪环可以与TRP344 形成π-π作用。
如图10分子对接结果显示，化合物9可以与靶蛋白ACSS3形成4个氢键作用，具体的氢键距离见3D相互作用图。此外，化合物可以与TRP448形成1个π-π作用。
如图11分子对接结果显示，化合物10可以与靶蛋白ACSS3形成7个氢键作用，具体的氢键距离见3D相互作用图。此外，化合物可以与TRP448形成1个π-π作用。
如图12所示，将上述筛选的10种可能和ACSS3结合的化合物分别处理前列腺癌细胞系C4-2和（或）DU145，然后收集细胞，提取细胞的总蛋白进行western blot检测，发现在上述筛选的10种可能和ACSS3结合的化合物中，只有化合物4处理后的前列腺癌细胞表达的ACSS3明显增加，即激动ACSS3。因此，将化合物4确定为即本发明所述的一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂。
细胞培养和处理方法：人前列腺癌细胞系DU145和C4-2购买自ATCC。所有前列腺癌细胞放置 37℃ 5% CO2 细胞培养箱中,在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中培养。在显微镜下观察细胞生长状态。将上述筛选的10种可能和ACSS3结合的化合物按0μm、1μm、5μm、10μm的终浓度梯度加入细胞培养基中，培养细胞48h。丢弃细胞培养瓶中原有的培养基，缓慢加入2ml PBS，润洗细胞后吸取PBS，丢弃。重复2-3次后，加入1.5ml含0.5% EDTA的胰酶，显微镜下观察贴壁的细胞，细胞形态变亮变圆，细胞间隙增大，则表示贴壁细胞已经被消化成半贴壁细胞。向培养瓶中加入2ml 含10% FBS的细胞培养基，中和胰酶，并轻轻吹打细胞至单个细胞悬液。将细胞悬液转移至10ml离心管中，做好标记后密封，1000 转/min，离心5min，手机药物处理后的细胞。
western blot检测方法：①蛋白提取：取经过相应处理后的细胞经前述步骤中的
消化离心后转移至1.5ml EP管中，加入适量细胞蛋白提取液（细胞裂解液RIPA、PMSF、蛋白
酶抑制剂按 100：1：1 比例配制）。冰上裂解细胞30min，每10min在震荡器上震荡20s。超声
裂解细胞三次，每次20s。在低温高速离心机中，12000转/min，离心15min。将上清转移至新
的1.5ml EP管中，放置冰上备用。②上样蛋白的制备：预热恒温水浴锅至100℃。将上述蛋白
样品与5X蛋白上样缓冲液按1: 4比例充分混匀。将混匀的蛋白样品密封至于100℃的恒温
水浴锅中，加热10min，使蛋白样品充分变性。变性后的蛋白样品置于-20℃保存备用。③配
置SDS-PAGE凝胶：按照SDS-PAGE试剂盒说明说配制分离胶、浓缩胶，制成10%的SDS-PAGE凝
胶。蛋白上样与电泳：根据样本蛋白浓度计算30ug 总蛋白所需样品体积。按照电泳液干
粉说明书配置电泳液。将配好的SDS-PAGE凝胶放入电泳槽中，加入适量配好的电泳液。根据
设计好的点样顺序，按照先前计算的上样体积，逐孔加入蛋白样品。边缘两孔个加入4ul蛋
白marker。设定80V恒压电泳30min，待蛋白marker明显分离后，转为120V恒压电泳，直至溴
酚蓝到距分离胶底部约 0.5cm时停止电泳。转膜1小时，设定转膜电流、时间分别为 300
mA、90min，将蛋白转移至PVDF膜上。配置1* TBST缓冲液。用TBST缓冲液配置5% 脱脂奶
粉，即封闭液。转膜完成后，将膜放入封闭液中，放置在室温低速要床上孵育2h。再用1*
TBST缓冲液洗涤膜三次，每次10min。孵育一抗：按一抗说明说推荐的一抗稀释比例，用
适量的一抗稀释液稀释抗体。将清洗后的PVDF膜完全浸没在一抗中，放置在4℃摇床上，过
夜。孵育二抗：第二天，取出PVDF膜，1* TBST洗涤三次，每次10min。将山羊抗兔二抗 IgG
与TBST按1：3000配置二抗液体，将洗涤好的PVDF膜放置配好的二抗液体中，室温摇床孵育
1h。显影：取出PVDF膜，1* TBST洗涤三次，每次10min。将ECL显影液中的A液、B液混匀（现
配现用）。目的条带与ECL工作液均匀接触后，放入化学发光成像系统中，拍照保存。ACSS3、
GAPDH抗体均购自三鹰抗体。
图13为化合物4，即本发明所述的一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂的结构式。
如图14，使用化合物4处理C4-2前列腺癌细胞，再使用油红染料进行染色，发现化合物4能够显著减少细胞内的脂滴大小和数量。
油红染色方法：按上述方法培养并处理细胞，去除培养基后PBS清洗2次，4% 多聚甲醛固定10min。在60% 异丙醇中孵育30s，然后在避光油红O染色液中室温孵育10 min，PBS清洗至背景干净。显微镜下拍照，用imageJ测量100个细胞中脂滴的长度，以像素为单位测量脂滴的长度。
如图15，使用化合物4处理C4-2前列腺癌细胞，再使用脂质检测试剂盒进行检测，发现化合物4能够显著减少细胞内的甘油三酯、胆固醇的水平。
脂质检测试剂盒检测方法：按前述方法培养并药物处理后收集细胞。在细胞沉淀中加入一定量的PBS，混匀，将细胞悬浮于PBS中。用超声破裂细胞，将试剂盒中2.5ul检测试剂加入25ul标本于96孔板中，37℃避光培养5min, 510nm分光光度法测定吸光度。用BSA试剂盒检测蛋白浓度作为对照。每组细胞设置3-5个复孔，重复3次。
如图16，使用化合物4处理C4-2前列腺癌细胞，发现化合物4能够显著抑制前列腺癌细胞的生长。
实验方法：按前述方法培养前列腺癌细胞后制备细胞浓度为 1×105个/ml的细胞悬液。将细胞接种于 96 孔板中，每孔约3000个细胞，每组设置3-5个复孔。将 96 孔板置于37℃ 5% CO2培养箱中继续培养过夜。第二天，化合物4按5.00μm浓度处理C4-2前列腺癌细胞，根据CCK8试剂盒说明书行后续操作。在酶标仪450nm波长的下测定每孔的OD值。连续检测5天，尽量每天在同一时间段内检测。绘制细胞生长曲线。
如图17，使用化合物4处理C4-2前列腺癌细胞，发现化合物4能够显著对前列腺癌细胞具有明显毒性作用。
实验方法：按前述方法培养前列腺癌细胞后制备细胞浓度为 1×105个/ml的细胞悬液。将细胞接种于 96 孔板中，每孔约3000个细胞，每组设置3-5个复孔。将 96 孔板置于37℃ 5% CO2培养箱中继续培养过夜。第二天，化合物4按不同浓度（0μm、0.05μm、0.10μm、0.50μm、1.00μm、2.00μm、3.00μm、4.00μm、5.00μm、7.50μm、10.00μm、20.00μm、50.00μm）处理C4-2前列腺癌细胞。48h后，根据CCK8试剂盒说明书行后续操作。在酶标仪450nm波长的下测定每孔的OD值。绘制药物毒性曲线。
如图18，使用化合物4处理C4-2前列腺癌细胞，发现化合物4能够显著抑制前列腺癌细胞的迁移。
实验方法：按前述方法培养并化合物4按5.00μm浓度处理C4-2前列腺癌细胞后收集细胞。换用无血清培养基饥饿细胞12h后，消化细胞，计数。用无血清的1640 培养基调节细胞浓度,分别制备细胞浓度为 1×105个/ml的细胞悬液。准备一个24 孔板，每孔加入750ul含10% FBS的细胞培养基，小心放入Transwell小室。向小室内缓慢加入200ul上述细胞悬液。将24孔板置于37℃ 5% CO2培养箱中继续培养48h后，弃去培养基，上室加入200ul甲醇，下室加入750ul甲醇，于冰上固定15-20min。PBS清洗小室2-3遍后，上、下室各加入200ul、750ul 5% 结晶紫，常温染色15min。PBS漂洗结晶紫3-5次后，用棉签小心擦去上室内为穿透的细胞。将小室和24孔培养板放在通风橱内风干，在显微镜下观察下室细胞数量，随机选取5个视野拍照。
图19为化合物4在裸鼠水平抑制前列腺癌生长的曲线。具体实验方法：于裸鼠右侧腋窝皮下注射500万C4-2细胞，待肿瘤自然生长1周左右，裸鼠右侧腋窝局部可触及皮下肿瘤如绿豆大小，将裸鼠随机分成两组，分别腹腔注射给予生理盐水或者化合物4，一周给药两次。期间每间隔3天测量裸鼠皮下肿瘤大小一次，并绘制皮下肿瘤生长曲线，结果提示腹腔注射化合物4，即本发明所述的ACSS3激动剂，能够显著抑制前列腺癌的生长。3周后处死裸鼠，取出裸鼠皮下肿瘤进行拍照，如图20所示，腹腔注射化合物4，即本发明所述的ACSS3激动剂，裸鼠皮下的前列腺癌明显比对照组更小，说明本发明所述的ACSS3激动剂能够显著抑制前列腺癌的进展。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂的应用，其特征在于：该脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂为：
所述脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂用于制备上调肿瘤细胞ACSS3蛋白表达的药物的应用。
2.根据权利要求1所述的一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂的应用，其特征在于：所述脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3前116个氨基酸残基为N端，571之后的区域为C端，123-561区域为蛋白主体部分，其中227-230区域为辅酶A结合部位，425-427、446-451区域为ATP结合部位。
3.根据权利要求1所述的一种脂酰辅酶A合成酶短链家族成员3的激动剂的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞包括前列腺癌细胞。
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| GR01 | Patent grant | ||
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