CN116267610A - 七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，属于组培技术领域，包括：植株经半洁净过渡种植，再洁净种植长出芽头；芽头先后两次经NaClO消毒无菌水清洗后，接种于培养基中培养；将得到的组培苗接种培养基离体保存。在一个实施例中，使用8％NaClO+5％NaClO，20min+10min复合消毒，污染数少，污染率低，使用1/2MS+0.1mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.5mg/L核黄素培养基离体保存，保存周期长，长势好。本发明未使用升汞消毒，对环境污染小，同时降低外植体污染率，组培离体保存未添加脱落酸、矮壮素、多效唑等生长抑制剂或延缓剂，保存便捷且周期长，长势好。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体地说，本发明涉及一种七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法。
背景技术
百合科植物七叶一枝花Paris polyphylla var.chinensis，已被列为为国家Ⅱ级珍稀濒危保护植物。此外七叶一枝花生长缓慢，繁殖率低，耗时长，开展七叶一枝花组织培养是解决当前重楼药材资源短缺和更有效地保护野生资源的有效方法。
植物组织培养技术是可实现植株快速繁育的有效途径，污染是造成组织培养失败的主要原因之一。如何降低成本是提高经济效益的首要问题，因此组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。在植物组织培养过程中一般存在两种类型的污染：一类是外植体消毒不彻底导致的污染，另一类是内源菌污染造成的污染。而外植体污染是组织培养中众多污染途径中最难解决的一个。
近年来也有研究者陆续对七叶一枝花组织培养中外植体的消毒方法进行了报导，大多使用根茎和种苗作为外植体，采用乙醇和次氯化钠或者是乙醇和升汞组合的消毒方法，但污染率都较高。如王岚等[1]采用不同浓度的乙醇和次氯化钠或者升汞比例组合的方法对梵净山的七叶一枝花的消毒方法进行了探索，结果发现在自来水冲洗2h后放入蒸馏水中浸泡，随后采用70％乙醇浸泡30～60s，取出无菌水冲洗2～3次后用0.8％的HgCl2浸泡8min的消毒效果最好，但污染率高达50％。罗晓峰等[2]以福建七叶一枝花的小苗、根、带柄叶为外植体，采用乙醇加升汞的方法杀死外植体的菌类，根部染菌率最低，为10％；小苗的染菌率25％，带柄叶染菌率最高，为50％。
而在植物种质离体保存研究中，脱落酸(ABA)、多效唑(PP333)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)以及矮壮素(CCC)等是常用于离体材料种质保存的生长调节剂，其保存效果长达12个月。但添加生长调节剂的离体保存方法大多不利于种质的恢复生长，再生后的试管苗形态纤弱，球茎和根数较少，部分会导致试管苗基部根系与球茎褐化从而加速试管苗的整体衰老枯亡。如邵玲等[3]在对濒危植物紫背天葵种质离体保存技术研究中，采用脱落酸(ABA)、多效唑(PP333)和6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)与萘乙酸(NAA)浓度组合以及不同基本培养基(MS、1/2MS、1/4MS)等多种途径对其离体保存的作用进行探索，结果发现在不添加任何生长调节剂的1/2MS的保存效果最好。目前对于七叶一枝花组织培养中外植体的离体保存方法未见有报导。
综合以上研究结果，七叶一枝花组织培养中对于外植体的消毒方法几乎都使用了HgCl2，HgCl2毒性大，含汞废弃物处理成本高，会对生态环境造成严重影响。同时对于外植体能否诱导出愈伤组织的报道不统一，而且存在污染率高等问题。目前仍没有统一的可认同的七叶一枝花的外植体无菌化处理及其离体保存方法，是限制组培规模化繁殖七叶一枝花种苗的关键因素。
文献：
[1]王岚等，梵净山七叶一枝花组织培养技术初探[J]，农技服务，2015.01:32；
[2]罗晓峰等，福建七叶一枝花组织培养及主效成分测定[J]，浙江农业科学，2021，62(7):1398-1401；
[3]邵玲等，濒危植物紫背天葵种质离体保存技术研究[J]，广东农业科学，2015，19。
发明内容
针对上述的问题，本发明的目的是提供一种七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其进行外植体消毒未使用升汞，而是通过预处理半洁净过渡种植，NaClO消毒，污染再消毒的步骤进行无菌化处理，对环境污染小，且降低外植体污染率，在组培离体保存中，未添加脱落酸(ABA)、矮壮素(CCC)、多效唑(PP333)等生长抑制剂或延缓剂，保存便捷且周期长，长势好。
为了实现本发明的这些目的，本发明提供的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，包括：
七叶一枝花植株经半洁净过渡种植预处理，再洁净种植长出芽头；所得芽头先后两次经NaClO消毒无菌水清洗后，接种于培养基中培养；将培养得到的组培苗接种于培养基中离体保存。
优选的是，所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法中，若芽头还存在污染，则再重复NaClO消毒无菌水清洗步骤；若离体保存超过12个月，则12个月后重新转接于培养基中，持续离体保存。
优选的是，所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法中，先后两次消毒的NaClO浓度3％～10％，每次消毒时间为5～25分钟。
优选的是，所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法中，先后两次消毒方式设置为：
A：NaClO浓度相同，消毒时间递减；或B：NaClO浓度递减，消毒时间相同；或C：NaClO浓度递减，消毒时间递减。
优选的是，所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法中，两次消毒方式的浓度和时间具体为：
8％NaClO+8％NaClO，20min+10min；或
8％NaClO+8％NaClO，20min+20min；或
8％NaClO+5％NaClO，20min+10min；或
8％NaClO+5％NaClO，20min+20min；或
5％NaClO+5％NaClO，20min+10min；或
5％NaClO+5％NaClO，20min+20min。
优选的是，所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法中，芽头的培养基包括MS+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。
优选的是，所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法中，若芽头还存在污染，则消毒的浓度和时间为：8％NaClO+5％NaClO，20min+10min。
优选的是，所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法中，组培苗立体保存的培养基包括：1/2MS+0.1mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.5mg/L核黄素。
优选的是，所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法中，具体包括：
S1：8～10月份采集七叶一枝花后，洗净泥土，去掉茎叶，保留根茎，将根茎种植在河沙中15天；
S2：将S1处理后的七叶一枝花用500mg/L浓度的高锰酸钾溶液浸泡20min,再转种到经高温蒸汽灭菌法灭菌的河沙种植1个月，控制湿度在60％-80％；
S3：将经S2处理后的七叶一枝花种茎切下芽头，用8％ NaClO溶液消毒15-20min，用无菌水清洗2次后，置于无菌水中浸泡30min，再转入5％ NaClO溶液消毒8-10min，用无菌水清洗3次，接种于含MS+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA培养基中培养，pH＝5.8；
S4：3天后若在S3处理后还有污染，将其挑出再重复S3步骤；
S5：将七叶一枝花无菌化处理后获得的组培苗，接种于含1/2MS+0.1mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.5mg/L核黄素培养基中，光照1000-2000lux，12h/d，温度24-28℃，12个月后可重新转接于该培养基中，持续离体保存。
本发明至少包括以下有益效果：
1、常规的消毒方式是使用0.1％或者0.2％浓度的升汞溶液，升汞毒性大，且含汞废弃物处理成本高，会对生态环境造成严重影响。本发明的方法在无菌化处理过程中，进行外植体消毒未使用升汞，而是通过预处理半洁净过渡种植，NaClO两次消毒，污染再消毒的步骤进行无菌化处理，该处理方法处理七叶一枝花外植体不但对环境影响小，且外植体污染率低。
2、常规的离体保存方法有低温保存，添加生长抑制剂或延缓剂如脱落酸(ABA)、矮壮素(CCC)、多效唑(PP333)等。本发明的方法在组培离体保存中未使用上述生长延缓剂或抑制剂，利于七叶一枝花离体保存后复壮，且保存周期长，12个月转瓶一次，保存方法便捷，无需低温保存，可正常放置组培室中，大大减少工作量。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为实施例3中消毒芽头培养得到的组培苗；
图2为实施例3中消毒芽头培养得到的组培苗在1/2MS+0.1mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.5mg/L核黄素培养基中离体保存培养6个月的长势；
图3为实施例3中消毒芽头培养得到的组培苗在1/2MS+0.1mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.5mg/L核黄素培养基中离体保存培养12个月的长势。
图4为实施例3中消毒芽头培养得到的组培苗在1/2MS+0.1mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.5mg/L核黄素培养基中离体保存培养12个月的根部长势。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1(8％NaClO+8％NaClO，20min+10min)
七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，包括：
S1：8～10月份采集七叶一枝花后，洗净泥土，去掉茎叶，保留根茎，将根茎种植在河沙中15天。
S2：将S1处理后的七叶一枝花用500mg/L浓度的高锰酸钾溶液浸泡20min,再转种到经高温蒸汽灭菌法灭菌的河沙种植1个月，控制湿度在60％-80％；高压蒸汽灭菌法：103.4千帕蒸汽压温度达121.3摄氏度，维持15-20分钟。
S3：将经S2处理后的七叶一枝花种茎切下芽头，采用复合消毒方式，先用8％NaClO溶液消毒20min，用无菌水清洗2次后，置于无菌水中浸泡30min，再转入8％ NaClO溶液消毒10min，用无菌水清洗3次，接种于MS+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖中培养，pH＝5.8。
实施例2(8％NaClO+8％NaClO，20min+20min)
和实施例1的区别在于，采用的复合消毒方式为：先用8％NaClO溶液消毒20min，用无菌水清洗2次后，置于无菌水中浸泡30min，再转入8％ NaClO溶液消毒20min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
实施例3(8％NaClO+5％NaClO，20min+10min)
和实施例1的区别在于，采用的复合消毒方式为：先用8％NaClO溶液消毒20min，用无菌水清洗2次后，置于无菌水中浸泡30min，再转入5％ NaClO溶液消毒10min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
实施例4(8％NaClO+5％NaClO，20min+20min)
和实施例1的区别在于，采用的复合消毒方式为：先用8％NaClO溶液消毒20min，用无菌水清洗2次后，置于无菌水中浸泡30min，再转入5％ NaClO溶液消毒20min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
实施例5(5％NaClO+5％NaClO，20min+10min)
和实施例1的区别在于，采用的复合消毒方式为：先用5％NaClO溶液消毒20min，用无菌水清洗2次后，置于无菌水中浸泡30min，再转入5％ NaClO溶液消毒10min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
实施例6(5％NaClO+5％NaClO，20min+20min)
和实施例1的区别在于，采用的复合消毒方式为：先用5％ NaClO溶液消毒20min，用无菌水清洗2次后，置于无菌水中浸泡30min，再转入5％ NaClO溶液消毒200min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
对比例1(0.1％HgCl2，6min)
和实施例1的区别在于，采用单一消毒方式：用0.1％HgCl2消毒6min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
对比例2(0.1％HgCl2，10min)
和实施例1的区别在于，采用单一消毒方式：用0.1％HgCl2消毒10min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
对比例3(8％NaClO，10min)
和实施例1的区别在于，采用单一消毒方式：用8％NaClO消毒10min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
对比例4(8％NaClO，20min)
和实施例1的区别在于，采用单一消毒方式：用8％NaClO消毒20min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
对比例5(5％NaClO，10min)
和实施例1的区别在于，采用单一消毒方式：用5％NaClO消毒10min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
对比例6(5％NaClO，20min)
和实施例1的区别在于，采用单一消毒方式：用5％NaClO消毒20min，用无菌水清洗3次。其他步骤相同。
效果分析
实施例1～6和对比例1～6分别取10个芽头为一组进行消毒试验，消毒芽头在培养基中培养10天后统计污染情况，30天后统计长势，结果如下表1所示：
表1消毒后的污染情况和长势
从上表1可以看到，采用复合消毒方式的实施例1～6的污染数明显减少、污染率显著降低，长势也更好。其中实施例3使用8％NaClO+5％NaClO，20min+10min的复合消毒方式效果最好。
实施例7
消毒芽头在培养基中培养3天后若还有污染，将其挑出，每4个为一组，继续以实施例1～6的方式进行重新消毒，培养10天后统计污染情况，30天后统计长势，结果如下表2所示：
表2重新消毒后的污染情况和长势
从上表2可以看到，采用8％NaClO+5％NaClO，20min+10min的消毒方式进行重新消毒，污染数和污染率低，且长势最好。
实施例8
将实施例3中消毒芽头培养得到的组培苗，接种于不同的培养基中进行培养，光照1000-2000lux，12h/d，温度24-28℃，统计6个月和12个月的长势，12个月后可重新转接于该培养基中，持续离体保存。结果如下表3所示：
表3离体保存培养长势
从上表3可以看出，采用1/2MS+KT0.1mg/L+NAA0.1mg/L+核黄素0.5mg/L的培养基进行离体保存效果最佳。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。
Claims (9)
1.七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其特征在于，包括：
七叶一枝花植株经半洁净过渡种植预处理，再洁净种植长出芽头；所得芽头先后两次经NaClO消毒无菌水清洗后，接种于培养基中培养；将培养得到的组培苗接种于培养基中离体保存。
2.如权利要求1所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其特征在于，若芽头还存在污染，则再重复NaClO消毒无菌水清洗步骤；若离体保存超过12个月，则12个月后重新转接于培养基中，持续离体保存。
3.如权利要求1所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其特征在于，先后两次消毒的NaClO浓度3％～10％，每次消毒时间为5～25分钟。
4.如权利要求3所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其特征在于，先后两次消毒方式设置为：
A：NaClO浓度相同，消毒时间递减；或B：NaClO浓度递减，消毒时间相同；或C：NaClO浓度递减，消毒时间递减。
5.如权利要求4所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其特征在于，两次消毒方式的浓度和时间具体为：
8％NaClO+8％NaClO，20min+10min；或
8％NaClO+8％NaClO，20min+20min；或
8％NaClO+5％NaClO，20min+10min；或
8％NaClO+5％NaClO，20min+20min；或
5％NaClO+5％NaClO，20min+10min；或
5％NaClO+5％NaClO，20min+20min。
6.如权利要求4所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其特征在于，芽头的培养基包括MS+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。
7.如权利要求2所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其特征在于，若芽头还存在污染，则消毒的浓度和时间为：8％NaClO+5％NaClO，20min+10min。
8.如权利要求1所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其特征在于，组培苗立体保存的培养基包括：1/2MS+0.1mg/L KT+0.1mg/L NAA+0.5mg/L核黄素。
9.如权利要求1所述的七叶一枝花外植体的无菌化处理及离体保存方法，其特征在于，具体包括：
S1：8～10月份采集七叶一枝花后，洗净泥土，去掉茎叶，保留根茎，将根茎种植在河沙中15天；
S2：将S1处理后的七叶一枝花用500mg/L浓度的高锰酸钾溶液浸泡20min,再转种到经高压蒸汽灭菌法灭菌的河沙种植1个月，控制湿度在60％-80％；
S3：将经S2处理后的七叶一枝花种茎切下芽头，用8％NaClO溶液消毒15-20min，用无菌水清洗2次后，置于无菌水中浸泡30min，再转入5％NaClO溶液消毒8-10min，用无菌水清洗3次，接种于含MS+0.1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA培养基中培养，pH＝5.8；
S4：3天后若在S3处理后还有污染，将其挑出再重复S3步骤；
S5：将七叶一枝花无菌化处理后获得的组培苗，接种于含1/2MS+0.1mg/L KT+0.1mg/LNAA+0.5mg/L核黄素培养基中，光照1000-2000lux，12h/d，温度24-28℃，12个月后可重新转接于该培养基中，持续离体保存。
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| CN102144553A (zh) * | 2011-01-25 | 2011-08-10 | 唐忠海 | 七叶一枝花的快速繁殖方法 |
| CN108719067A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-02 | 楚雄师范学院 | 一种滇重楼的组培快繁方法 |
| CN113951140A (zh) * | 2021-11-11 | 2022-01-21 | 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所 | 一种促进华重楼幼嫩植株快速繁殖种苗的方法 |
-
2023
- 2023-03-14 CN CN202310239375.2A patent/CN116267610B/zh active Active
Patent Citations (3)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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