CN116254328A - 一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法 - Google Patents

一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法 Download PDF

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CN116254328A CN202310352511.9A CN202310352511A CN116254328A CN 116254328 A CN116254328 A CN 116254328A CN 202310352511 A CN202310352511 A CN 202310352511A CN 116254328 A CN116254328 A CN 116254328A
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Abstract

本发明提供一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法，使用常规基因组DNA提取试剂盒抽取样本基因组，使用通用引物16s rRNA‑F和16s rRNA‑R扩增得到500bp左右的16srRNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小，使用HinfI和VspI两种限制性内切酶双酶切PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物片段大小。本发明提出16s rRNA引物的退火温度范围广，且在一定浓度酸碱污染情况下仍能实现有效扩增。本发明实现快速、简便、准确的鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及植鞣、铁鞣绵羊皮革，适用范围广、对设备要求低，在规范家禽皮张市场及出土皮革文物鉴定方面具有重要意义。

Description

一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法
技术领域
本发明属于家禽领域，涉及一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法，是一种基于PCR-RFLP技术和500bp左右线粒体16s rRNA片段长度多态性鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革的方法，对规范家禽皮张市场及出土皮革文物鉴定具有重要意义。
背景技术
天然皮革由动物皮张经过十分复杂的物理加工和化学处理制作而成，牢固耐用、透气性好、高雅舒适并具有良好的生态特性，可用于制作衣服、鞋子、腰带、沙发、皮包、仪表等多种生活用品，备受人们的喜爱。猪皮、牛皮和羊皮产量大且质量较好，是制革的主要原料，因而常见天然皮革主要有猪皮革、牛皮革和羊皮革。不同皮革的特性存在差异，其用途和市场价值也不相同。猪皮革透气性和耐用性较好，但弹性较差，可用于制作内衣等；黄牛皮革的弹性和耐用性较好，在市场上的重要程度较高，可用于制作服装、篮球等；水牛皮革抗张强度较高，但质地和耐磨性较差，强度较黄牛皮革低，可用于制作鞋底等；山羊皮革柔软性能好，但耐用性较差，坚牢性比牛皮革和猪皮革差，可用于制作软包等；绵羊皮革柔软性比山羊皮好，但耐用性差，强度较低，坚牢性比山羊皮革差，可用于制作软包、手套等。一直以来，鉴别皮革材质问题一直是广大消费者及质检部门关注的焦点。目前，鉴定真假皮革技术较为成熟，但鉴定皮革种类仍是有待攻克的难点。理论上，可以根据皮革表面毛孔的粗细、疏密和分布情况等粒面特征，以及革内胶原纤维的粗细等物理特征区分猪皮革、牛皮革和羊皮革，但皮革复杂的加工过程会掩盖或破坏这些物理特征，导致难以辨认皮革种类。此外，许多出土皮革文物由于长时间埋在地底下，受雨水浸泡、物理挤压、微生物腐蚀等多种因素影响，内部结构变化大，难以通过物理特征辨别其类别，对国家考古工作造成困扰。另外，借助常用仪器分析对检测人员的专业知识和经验要求高，且操作复杂，所需时间长，具有较大的局限性。因此，建立一种快速、简便、科学的鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽皮张的方法对规范皮张市场及出土皮革文物鉴定具有重要意义。
16s rRNA基因相对于线粒体其他基因来说更为保守，常用作物种鉴定的分子遗传标记。聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性(PCR-RFLP)操作简单，快捷，准确性较高，被广泛用于各物种的分子生物学鉴定。目前，基于线粒体16s rRNA片段长度多态性的PCR-RFLP技术在鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革方面的应用未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法，是一种快速、简便、准确、适用范围广、对设备要求低的鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革的方法。
本发明方法基于PCR-限制性片段长度多态性技术，同时扩增猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革线粒体16s rRNA的500bp左右片段，根据该片段的核酸位点多态性信息，选用HinfI和VspI两种限制性内切酶进行双酶切，并对酶切产物进行琼脂糖电泳分型，实现对5种家禽新鲜皮及皮革的鉴定。此外，本发明所提出16s rRNA引物的退火温度范围广，且在一定浓度酸碱污染情况下仍能实现有效扩增。本发明主要通过以下步骤实现：
(1)抽取基因组DNA：使用常规基因组DNA提取试剂盒抽取猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及植鞣、铁鞣绵羊皮革的基因组DNA，其中铁鞣绵羊皮革的酶解时间需缩短，以免过多铁离子混入基因组，从而抑制后续PCR反应，以提取的基因组DNA为模板扩增16s rRNA片段。
(2)PCR扩增：扩增体系为20μL，包括10μL 2×Rapid Taq Master Mix酶，7.8μLddH2O，0.6μL 16s rRNA-F引物，0.6μL16s rRNA-R引物，1μL基因组DNA。反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性25s，58.5℃退火25s，72℃延伸21s，循环38次；72℃延伸7min。
(3)PCR产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小。取5μL PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120V恒压电泳20min，凝胶成像系统下拍照，各样本PCR产物的条带大小约为500bp。
(4)酶切：使用HinfI/VspI双酶切PCR产物，酶切体系为20μL，包括10μL PCR产物、6μL ddH2O、2μL Tango缓冲液，以及限制酶HinfI和VspI各1μL，在37℃水浴条件下酶切1h。
(5)酶切产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物大小。取5μL酶切产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120V恒压电泳20min，凝胶成像系统下拍照。根据猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽线粒体16s rRNA扩增片段HinfI/VspI双酶切产物电泳图谱，猪皮包括95bp和405bp片段，黄牛皮包括33bp、196bp和277bp片段，水牛皮包括32bp和72bp片段，山羊皮包括95bp、184bp和227bp片段，绵羊皮包括54bp、226bp和227bp片段，其中226bp和227bp重叠在一起，误差约为10bp。
(6)不同退火温度条件下PCR扩增及产物检测：
设置18个退火温度，包括46.5℃、47.5℃、48.5℃、49.5℃、50.5℃、51.5℃、52.5℃、53.5℃、54.5℃、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃、59.5℃、60.5℃、61.5℃、62.5℃、63.5℃，按照步骤(2)和(3)方法分别进行PCR扩增和凝胶电泳检测，均得到500bp左右的目的条带。
(7)不同浓度NaOH溶液污染情况下PCR扩增及产物检测：
设置0.01％、0.1％、1％和5％四个浓度的NaOH溶液，浸泡猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革6h，清水洗净后按照步骤(1)方法抽取基因组，在58.5℃的退火温度条件下进行PCR扩增，凝胶电泳检测后均得到500bp左右的目的条带。
(8)不同浓度HCl溶液污染情况下PCR扩增：
设置0.01％、0.1％、1％和5％四个浓度的HCl溶液，浸泡猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革6h，清水洗净后按照步骤(1)方法抽取基因组，在58.5℃的退火温度条件下进行PCR扩增，凝胶电泳检测后均得到500bp左右的目的条带。
本发明的另一个目的是提供所述方法在同时鉴定5种家禽新鲜皮及皮革中应用。
本发明首次提出一种能够同时扩增猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革的500bp左右线粒体16s rRNA基因的引物，建立起基于PCR-RFLP技术鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及植鞣、铁鞣绵羊皮革的方法。本发明所提出的16s rRNA引物退火温度范围广，能在一定浓度酸碱污染情况下实现PCR扩增。本发明方法实现快速、简便、准确的鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及植鞣、铁鞣绵羊皮革，适用范围广、对设备要求低的特点，对于规范皮张市场及出土皮革文物鉴定具有重要意义。
附图说明
图1：A为猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为猪的样本，泳道2为黄牛的样本，泳道3为水牛的样本，泳道4为山羊的样本，泳道5为绵羊的样本。B为猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮线粒体16s rRNA PCR扩增产物经HinfI和VspI双酶切后的电泳图谱。其中泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为猪的样本，泳道2为黄牛的样本，泳道3为水牛的样本，泳道4为山羊的样本，泳道5为绵羊的样本。
图2：A为植鞣绵羊皮革和铁鞣绵羊皮革线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为植鞣绵羊皮革的样本，泳道2为铁鞣绵羊皮革的样本。B为植鞣绵羊皮革和铁鞣绵羊皮革线粒体16s rRNA PCR扩增产物经HinfI和VspI双酶切后的电泳图谱。其中泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为植鞣绵羊皮革的样本，泳道2为铁鞣绵羊皮革的样本，有少量DNA没有酶切完全。
图3：46.5-47.5℃退火温度条件下猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为46.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道2为46.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道3为46.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道4为46.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道5为46.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道6为47.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道7为47.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道8为47.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道9为47.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道10为47.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品。
图4：48.5-51.5℃退火温度条件下猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为48.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道2为48.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道3为48.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道4为48.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道5为48.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道6为49.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道7为49.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道8为49.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道9为49.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道10为49.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道11为50.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道12为50.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道13为50.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道14为50.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道15为50.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道16为51.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道17为51.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道18为51.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道19为51.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道20为51.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品。
图5：52.5-55.5℃退火温度条件下猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为52.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道2为52.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道3为52.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道4为52.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道5为52.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道6为53.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道7为53.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道8为53.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道9为53.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道10为53.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道11为54.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道12为54.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道13为54.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道14为54.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道15为54.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道16为55.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道17为55.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道18为55.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道19为55.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道20为55.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品。
图6：56.5-59.5℃退火温度条件下猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为56.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道2为56.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道3为56.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道4为56.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道5为56.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道6为57.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道7为57.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道8为57.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道9为57.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道10为57.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道11为58.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道12为58.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道13为58.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道14为58.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道15为58.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道16为59.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道17为59.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道18为59.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道19为59.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道20为59.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品。
图7：60.5-63.5℃退火温度条件下猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为60.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道2为60.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道3为60.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道4为60.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道5为60.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道6为61.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道7为61.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道8为61.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道9为61.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道10为61.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道11为62.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道12为62.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道13为62.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道14为62.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道15为62.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品；泳道16为63.5℃退火温度条件下新鲜猪皮的样品；泳道17为63.5℃退火温度条件下新鲜黄牛皮的样品；泳道18为63.5℃退火温度条件下新鲜水牛皮的样品；泳道19为63.5℃退火温度条件下新鲜山羊皮的样品；泳道20为63.5℃退火温度条件下新鲜绵羊皮的样品。
图8：46.5-57.5℃退火温度条件下植鞣、铁鞣绵羊皮革线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为46.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道2为46.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道3为47.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道4为47.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道5为48.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道6为48.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道7为49.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道8为49.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道9为50.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道10为50.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道11为51.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道12为51.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道13为52.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道14为52.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道15为53.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道16为53.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道17为54.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道18为54.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道19为55.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道20为55.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道21为56.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道22为56.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道23为57.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道24为57.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品。
图9：58.5-63.5℃退火温度条件下植鞣、铁鞣绵羊皮革线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为58.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道2为58.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道3为59.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道4为59.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道5为60.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道6为60.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道7为61.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道8为61.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道9为62.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道10为62.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品；泳道11为63.5℃退火温度条件下植鞣绵羊皮革的样品；泳道12为63.5℃退火温度条件下铁鞣绵羊皮革的样品。
图10：不同浓度NaOH溶液处理6h后猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为0.01％NaOH溶液处理新鲜猪皮的样本；泳道2为0.01％NaOH溶液处理新鲜黄牛皮的样本；泳道3为0.01％NaOH溶液处理新鲜水牛皮的样本；泳道4为0.01％NaOH溶液处理新鲜山羊皮的样本；泳道5为0.01％NaOH溶液处理新鲜绵羊皮的样本；泳道6为0.1％NaOH溶液处理新鲜猪皮的样本；泳道7为0.1％NaOH溶液处理新鲜黄牛皮的样本；泳道8为0.1％NaOH溶液处理新鲜水牛皮的样本；泳道9为0.1％NaOH溶液处理新鲜山羊皮的样本；泳道10为0.1％NaOH溶液处理新鲜绵羊皮的样本；泳道11为1％NaOH溶液处理新鲜猪皮的样本；泳道12为1％NaOH溶液处理新鲜黄牛皮的样本；泳道13为1％NaOH溶液处理新鲜水牛皮的样本；泳道14为1％NaOH溶液处理新鲜山羊皮的样本；泳道15为1％NaOH溶液处理新鲜绵羊皮的样本；泳道16为5％NaOH溶液处理新鲜猪皮的样本；泳道17为5％NaOH溶液处理新鲜黄牛皮的样本；泳道18为5％NaOH溶液处理新鲜水牛皮的样本；泳道19为5％NaOH溶液处理新鲜山羊皮的样本；泳道20为5％NaOH溶液处理新鲜绵羊皮的样本。
图11：不同浓度NaOH溶液处理6h后植鞣、铁鞣绵羊皮革线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为0.01％NaOH溶液处理植鞣绵羊皮革的样本；泳道2为0.01％NaOH溶液处理铁鞣绵羊皮革的样本；泳道3为0.1％NaOH溶液处理植鞣绵羊皮革的样本；泳道4为0.1％NaOH溶液处理铁鞣绵羊皮革的样本；泳道5为1％NaOH溶液处理植鞣绵羊皮革的样本；泳道6为1％NaOH溶液处理铁鞣绵羊皮革的样本；泳道7为5％NaOH溶液处理植鞣绵羊皮革的样本；泳道8为5％NaOH溶液处理铁鞣绵羊皮革的样本。
图12：不同浓度HCl溶液处理6h后猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为0.01％HCl溶液处理新鲜猪皮的样本；泳道2为0.01％HCl溶液处理新鲜黄牛皮的样本；泳道3为0.01％HCl溶液处理新鲜水牛皮的样本；泳道4为0.01％HCl溶液处理新鲜山羊皮的样本；泳道5为0.01％HCl溶液处理新鲜绵羊皮的样本；泳道6为0.1％HCl溶液处理新鲜猪皮的样本；泳道7为0.1％HCl溶液处理新鲜黄牛皮的样本；泳道8为0.1％HCl溶液处理新鲜水牛皮的样本；泳道9为0.1％HCl溶液处理新鲜山羊皮的样本；泳道10为0.1％HCl溶液处理新鲜绵羊皮的样本；泳道11为1％HCl溶液处理新鲜猪皮的样本；泳道12为1％HCl溶液处理新鲜黄牛皮的样本；泳道13为1％HCl溶液处理新鲜水牛皮的样本；泳道14为1％HCl溶液处理新鲜山羊皮的样本；泳道15为1％HCl溶液处理新鲜绵羊皮的样本；泳道16为5％HCl溶液处理新鲜猪皮的样本；泳道17为5％HCl溶液处理新鲜黄牛皮的样本；泳道18为5％HCl溶液处理新鲜水牛皮的样本；泳道19为5％HCl溶液处理新鲜山羊皮的样本；泳道20为5％HCl溶液处理新鲜绵羊皮的样本。
图13：不同浓度HCl溶液处理6h后植鞣、铁鞣绵羊皮革线粒体16s rRNA基因PCR扩增产物的电泳图谱。其中，泳道M为2000bp的核酸分子量标准；泳道1为0.01％HCl溶液处理植鞣绵羊皮革的样本；泳道2为0.01％HCl溶液处理铁鞣绵羊皮革的样本；泳道3为0.1％HCl溶液处理植鞣绵羊皮革的样本；泳道4为0.1％HCl溶液处理铁鞣绵羊皮革的样本；泳道5为1％HCl溶液处理植鞣绵羊皮革的样本；泳道6为1％HCl溶液处理铁鞣绵羊皮革的样本；泳道7为5％HCl溶液处理植鞣绵羊皮革的样本；泳道8为5％HCl溶液处理铁鞣绵羊皮革的样本。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例做进一步的说明。
实施例1鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮
1、遗传标记选择及引物设计
通过查阅文献，选定16s rRNA作为鉴定猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮的遗传标记。从NCBI下载猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽的16s rRNA序列，并通过Primer-BLAST设计通用引物。通用引物序列：16s rRNA-F：GAGCCTGGTGATAGCTGGTT；16srRNA-R：TTTTGGTAAACAGGCGGGGT，由杭州擎科生物技术有限公司合成。预测扩增产物大小：猪皮为500bp，黄牛皮为506bp，水牛皮为504bp，山羊皮为506bp，绵羊皮为507bp。
2、限制性内切酶设计
从NCBI下载猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽的16s rRNA序列，通过限制性酶切位点统计工具(网址：http://www.detaibio.com/sms2/rest_summary.html)搜索限制性内切酶酶切位点，在最终选定HinfI和VspI两种限制性内切酶进行后续PCR-RFLP分析。HinfI和VspI购自赛默飞世尔科技公司。
3、样本采集
从市场上采集标记为猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽的新鲜皮。
4、抽取5种家禽新鲜皮基因组
使用常规试剂盒抽取新鲜皮基因组DNA，以此为PCR反应模板扩增16s rRNA片段。
5、5种家禽新鲜皮16s rRNA基因的PCR扩增
PCR反应总体系为20μL，包括10μL2×Rapid Taq Master Mix酶，7.8μL ddH2O，0.6μL 16s rRNA-F引物，0.6μL16s rRNA-R引物，1μL基因组DNA。采用ABVeriti96孔热循环仪进行扩增，反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性25s，58.5℃退火25s，72℃延伸21s，循环38次；72℃延伸7min。
6、PCR产物琼脂糖电泳检测
通过琼脂糖电泳检测PCR产物大小：取5μL PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120V恒压电泳20min，凝胶成像系统下拍照(图1A)，猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮PCR产物的条带大小约为500bp。
7、HinfI/VspI双酶切PCR产物
酶切体系为20μL，依次加入10μL PCR产物、6μL ddH2O、2μL Tango缓冲液，以及限制酶HinfI和VspI各1μL，混匀，在37℃水浴条件下酶切1h。
8、酶切产物检测
通过琼脂糖电泳检测酶切产物大小：取5μL酶切产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120V恒压电泳20min，凝胶成像系统下拍照(图1B)。
9、酶切片段长度多态性(RFLP)带型
图1B为猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽线粒体16s rRNA扩增片段HinfI/VspI双酶切产物电泳图谱，其中泳道1为猪的样本(95bp和405bp)，泳道2为黄牛的样本(33bp、196bp和277bp)，泳道3为水牛的样本(32bp和72bp)，泳道4为山羊的样本(95bp、184bp和227bp)，泳道5为绵羊的样本(54bp、226bp和227bp，其中226bp和227bp重叠表现为一个条带)，误差约为10bp。
实施例2鉴定植鞣绵羊皮革和铁鞣绵羊皮革
具体步骤与实施案例1相似，不同之处如下：
1、样本采集
植鞣、铁鞣绵羊皮革由四川大学提供。
2、抽取基因组
植鞣绵羊皮革基因组抽取方法与实施案例1相似，但铁鞣绵羊皮革富含铁离子，铁离子会抑制PCR扩增，应缩短其酶解时间至10分钟，以免过多的铁离子混入基因组，从而影响后续PCR扩增。
3、PCR产物琼脂糖电泳检测
与实施案例1的步骤6相似，不同之处在于本实施案例凝胶成像系统下拍照结果见图2A。
4、酶切片段长度多态性(RFLP)带型及比对
图2B为植鞣绵羊皮革和铁鞣绵羊皮革线粒体16s rRNA扩增片段HinfI/VspI双酶切产物电泳图谱。其中，泳道1为植鞣绵羊皮革的样本(54bp、226bp和227bp，其中226bp和227bp重叠表现为一个条带)，泳道2为铁鞣绵羊皮革的样本(54bp、226bp和227bp，其中226bp和227bp重叠表现为一个条带，存在少量PCR产物未被酶切完全)。
实施例3不同退火温度条件下扩增家禽新鲜皮及皮革的16s rRNA基因
1、遗传标记选择及引物设计
与实施例1的步骤1相似，不同之处在于本实施案例的研究对象包括猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽的新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革。
2、样本采集
猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮样本采集与实施案例1的步骤3一致，铁鞣、植鞣绵羊皮革样本采集与实施案例2的步骤1一致。
3、抽取基因组
猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮的基因组抽取与实施案例1的步骤4一致，铁鞣、植鞣绵羊皮革的基因组抽取与实施案例2的步骤2一致。
4、PCR扩增16s rRNA基因
与实施例1的步骤5相似，不同之处在于本实施案例共设置18个退火温度，包括46.5℃、47.5℃、48.5℃、49.5℃、50.5℃、51.5℃、52.5℃、53.5℃、54.5℃、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃、59.5℃、60.5℃、61.5℃、62.5℃、63.5℃，分别进行PCR扩增。
5、PCR产物琼脂糖电泳检测
与实施案例1的步骤6相似，不同之处在于本实施案例凝胶成像系统拍照结果如图3-9。
实施例4PCR扩增不同浓度NaOH溶液处理后样本的16s rRNA基因
步骤与实施例3基本相似，不同之处在于：
1、样品处理
共设置0.01％、0.1％、1％和5％四个浓度的NaOH溶液，浸泡猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及铁鞣、植鞣绵羊皮革6h，清水浸洗3次，各10min。
2、抽取基因组
抽取NaOH溶液处理后样品的基因组。
3、PCR扩增16s rRNA基因
退火温度为58.5℃。
4、PCR产物凝胶电泳检测
凝胶成像拍照结果见图10和图11。
实施例5PCR扩增不同浓度HCl处理后的样本16s rRNA基因
步骤与实施案例4相似，不同之处在于：
1、样品处理
分别用0.01％、0.1％、1％和5％四个浓度的HCl溶液浸泡样品。
2、抽取基因组
抽取HCl溶液处理后样品的基因组。
3、PCR产物凝胶电泳检测
凝胶成像拍照结果见图12和图13。

Claims (10)

1.一种快速鉴定5种家禽新鲜皮及皮革的方法，其特征在于，基于PCR-限制性片段长度多态性技术，同时扩增猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及皮革线粒体16s rRNA的500bp左右片段，根据该片段的核酸位点多态性信息，选用HinfI和VspI两种限制性内切酶进行双酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分型，实现对5种家禽新鲜皮及皮革的鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体通过以下步骤实现：
(1)抽取基因组DNA：使用常规基因组DNA提取试剂盒抽取猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮及植鞣、铁鞣绵羊皮革基因组DNA，其中铁鞣绵羊皮革的酶解时间为10分钟，以免过多铁离子混入基因组，从而抑制后续PCR反应，以提取的基因组DNA为模板扩增16srRNA片段；
(2)PCR扩增：扩增体系为20μL，包括10μL 2×Rapid Taq Master Mix酶，7.8μL ddH2O，0.6μL 16s rRNA-F引物，0.6μL16s rRNA-R引物，1μL基因组DNA，反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性25s，58.5℃退火25s，72℃延伸21s，循环38次；72℃延伸7min，得到16s rRNA片段；
(3)PCR产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小，凝胶成像系统下拍照，猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革PCR产物的条带大小约为500bp；
(4)酶切：使用HinfI/VspI双酶切PCR产物，酶切体系为20μL，包括10μL PCR产物、6μLddH2O、2μL Tango缓冲液，以及限制酶HinfI和VspI各1μL，在37℃水浴条件下酶切1h；
(5)酶切产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物大小，凝胶成像系统下拍照，得到猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽线粒体16s rRNA扩增片段HinfI/VspI双酶切产物电泳图谱；
(6)不同退火温度条件下PCR扩增及产物检测：
设置退火温度，按照步骤(2)方法分别进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，均得到500bp左右的目的条带；
(7)不同浓度NaOH溶液污染情况下PCR扩增及产物检测：
设置不同浓度的NaOH溶液污染样品后，浸泡猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革，清水洗净后抽取基因组，进行PCR扩增，凝胶电泳检测后均得到500bp左右的目的条带；
设置0.01％、0.1％、1％和5％四个浓度的NaOH溶液，
(8)不同浓度HCl溶液污染情况下PCR扩增及产物检测：
设置不同浓度的HCl溶液浸泡污染猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊5种家禽新鲜皮以及植鞣、铁鞣绵羊皮革6h，清水洗净后按照步骤(1)方法抽取基因组，进行PCR扩增，凝胶电泳检测后均得到500bp左右的目的条带。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物通过如下方法进行：取5μL PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120V恒压电泳20min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物大小通过如下方法进行：取5μL酶切产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120V恒压电泳20min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增所用的16s rRNA通用引物序列为：F：GAGCCTGGTGATAGCTGGTT，R：TTTTGGTAAACAGGCGGGGT。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中5种家禽线粒体双酶切产物电泳图谱选择：猪皮包括95bp和405bp片段，黄牛皮包括33bp、196bp和277bp片段，水牛皮包括32bp和72bp片段，山羊皮包括95bp、184bp和227bp片段，绵羊皮包括54bp、226bp和227bp片段，其中226bp和227bp重叠在一起，误差为10bp。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中退火温度选择：包括46.5℃、47.5℃、48.5℃、49.5℃、50.5℃、51.5℃、52.5℃、53.5℃、54.5℃、55.5℃、56.5℃、57.5℃、58.5℃、59.5℃、60.5℃、61.5℃、62.5℃、63.5℃共18个退火温度。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中设置0.01％、0.1％、1％和5％四个浓度的NaOH溶液浸泡污染样品6h，在58.5℃的退火温度条件下进行PCR扩增。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中不同浓度HCl溶液污染样品后进行PCR扩增：0.01％、0.1％、1％和5％四个浓度的HCl溶液浸泡处理样品6h，清水洗净后抽取基因组，进行PCR扩增。
10.权利要求1所述的方法在同时鉴定5种家禽新鲜皮及皮革中应用。
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