CN116254326A - 一种生物正交氨基酸标记染色法联合荧光原位杂交技术检测活性污泥系统中活性聚磷菌的方法 - Google Patents

一种生物正交氨基酸标记染色法联合荧光原位杂交技术检测活性污泥系统中活性聚磷菌的方法 Download PDF

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Abstract

一种生物正交氨基酸标记染色法联合荧光原位杂交检测活性污泥系统中活性聚磷菌的方法，属于污水生物处理技术领域。本发明使用L‑高炔丙基甘氨酸培养活性污泥中微生物，并通过生物正交氨基酸标记染色法对利用该氨基酸合成蛋白质的微生物进行荧光染色；采用荧光原位杂交技术使探针PAO846、PAO651、PAO462与荧光染色后的样品中聚磷菌目的基因进行杂交；利用流式细胞仪检测被荧光标记的细菌，通过圈门处理识别出活性聚磷菌区域，进而计算和分析活性聚磷菌占全菌的比例。本发明提供了一种经济、简便、可靠的污水处理系统活性污泥中活性聚磷菌的定量方法，为实际污水处理厂调控生物除磷条件提供了理论依据。

Description

一种生物正交氨基酸标记染色法联合荧光原位杂交技术检测 活性污泥系统中活性聚磷菌的方法
技术领域
本发明涉及一种生物正交氨基酸标记染色法联合荧光原位杂交技术检测活性污泥中活性聚磷菌的方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中活性聚磷菌的定量分析。
背景技术
聚磷菌(Phosphorus accumulating organisms，PAOs)是增强生物除磷(Enhancedbiological phosphorus removal，EBPR)中的主要生物，用于去除磷，以避免水生系统中的富营养化。EBPR通过厌氧和有氧/缺氧条件下污泥的再循环实现高效运行。在这个过程中，PAOs在厌氧阶段吸收挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)，并合成聚羟基烷酸盐(polyhydroxyalkanoates，PHA)存储，其中胞内的聚磷酸盐水解产能作为能量来源，导致正磷酸盐的释放。这使得处于有氧阶段的普通异养生物几乎没有可用的VFA。在好氧条件下，PAOs分解PHA产生的能量被用于磷吸收以及自身生长繁殖。这些释磷和吸磷反应都需要具有活性的PAOs完成，也就是说,具有活性的PAOs决定了生物除磷系统的磷去除效率。目前常见的微生物方法如荧光原位杂交、实时定量PCR、高通量测序技术，只能检测全部PAOs(包括具有活性和被环境条件抑制丧失活性)在污泥系统中的种群丰度，无法准确定位到具有活性的PAOs的动态变化。在污水处理厂中，活性污泥中的功能微生物通过酶来促进生物代谢反应，而酶来自于氨基酸的合成。因此，在活性污泥中具有氨基酸合成蛋白质能力的微生物代表着营养物去除的功能微生物。生物正交氨基酸标记染色法是可以使特定氨基酸进入细胞胞内，进而合成蛋白质。该方法主要应用于单细胞代谢领域，在污水处理领域鲜有报道。
流式细胞仪结合荧光显微镜的优点，通过将待测颗粒维持在液流状态，依次通过激发光源，得到微生物相关信息。其检测过程快速，检测结果准确。流式细胞仪为每个可分析的颗粒提供空间分辨的定量数据，并对异质细胞群中的个体细胞进行形态学表征。流式细胞仪技术的关键在于维持单个细胞依次通过激发光源，能分析出某个群落中单个细胞的性质，对群落的分析更加具体和个性化。待检测的细胞可以依靠自身的荧光特性进行测定，也可以通过外加荧光物的特异性与细胞结合达到检测的目的。实验结果以单参数的柱状图或双参数的散点图来表示。流式细胞仪可快速分析水样的细菌总数、细胞尺寸大小及表征细胞的生理特性。其大多用在分子和细胞生物学、免疫学、干细胞生物学、微生物学、生物技术等领域，也用在海洋领域，对浮游微生物定量分析；在污水处理领域，对功能微生物的分析较少。
本发明利用生物正交氨基酸标记染色法联合荧光原位杂交技检测术污水处理系统中活性聚磷菌的种群丰度；本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下方面：
(1)现有技术对聚磷菌定量的方法，主要是荧光原位杂交技术；该方法利用涂片、探针杂交，在荧光显微镜下选取不同视野，利用图像处理软件对聚糖菌进行定量；该方法前期处理时间过长，步骤复杂；探针杂交情况、涂片效果、视野的选取及定量过程受操作者的个人经验和主观判断影响较大，可能会出现实测值与真实值相差较大的情况。而且由于探针染料的淬灭性，实验过程需要在避光情况下进行，操作不方便，并且检测结果包括了丧失活性的PAOs。而本发明只是利用荧光原位杂交技术将样品进行杂交预处理，无需涂片，然后经染色、稀释、过滤后进入流式细胞仪进行检测，不存在涂片不匀以及视野选取的问题。并且本发明首先排除不具有活性的PAOs，可准确定位活性PAOs的动态变化，从而更好地预判活性污泥系统生物除磷效率的走势。
(2)实时定量PCR方法也是目前比较流行对细菌定量的方法，该方法是前期需要提取DNA，利用特定引物及其荧光染料对特定细菌进行定量；样品的预处理，拷贝数的选择，质粒质量的好坏对实验结果影响很大。而且现在还不存在引物能对全部PAOs进行定量，并且定量出的PAOs也不能辨别是否具有活性。本发明针对的是细菌个体，不需要提取DNA，也不需要引物来扩增DNA；仅用两种染料就能对活性PAOs进行准确定量。
(3)传统的微生物方法主要是检测全部细菌，无法分辨其中具有活性和无活性细菌的具体分布；本发明以氨基酸为反应底物，检测微生物氨基酸合成蛋白质的能力，再利用探针与目标微生物特异性结合，能准确鉴定出具有活性的PAOs种群占比，从而指导污水处理厂生物除磷的合理调控。
故本发明取污水处理系统中活性污泥微生物，采用生物正交氨基酸标记染色法联合荧光原位杂交技术分析微生物群落中活性PAOs的百分含量，未见相关研究报道。
发明内容
本发明目的是提供了一种经济、简便、可靠的活性污泥系统中活性PAOs的定量方法。采用L-高炔丙基甘氨酸培养污水体系中的微生物；通过点击化学对利用该氨基酸合成蛋白质的微生物进行荧光染色；利用探针PAOmix与DNA杂交，对PAOs的DNA进行标记。标记后的样本进入流式细胞仪检测细胞在不同通道的荧光强度，对FL1和FL4通道的阳性区域进行圈门，从而分析活性PAOs的种群占比。本发明可用于快速监控污水处理系统中活性PAOs的种群丰度和代谢活性的动态变化，指导污水处理厂运行调控，具有很好的应用前景。
本发明的技术方案：
(1)取处理生活污水反应器中的泥于离心管中，加入100μL L-高炔丙基甘氨酸，最终浓度为500μM，室温，黑暗条件下培养15min；加入多聚甲醛让体系停止反应，多聚甲醛的质量终浓度为2％，在室温下固定1h；利用PBS缓冲液清洗三次，并重悬至10mL管中；
(2)使用超声破碎仪在超声功率120j下，超声1min；离心弃掉上清液，依次往离心管加入1mL体积百分数为50％，80％，99％乙醇溶液进行脱水；
(3)脱水后的样品依次加入221μL PBS缓冲液、25μL反应缓冲液和4μL染料预混物溶液；在黑暗、室温条件下，培养30min；染色完成后用PBS缓冲液和体积百分数为50％乙醇清洗；
按下表配制染料预混物溶液和反应缓冲液：
染料预混物溶液
组分 浓度(mM) 体积(μL)
硫酸铜溶液 20 1.25
三烃丙基三唑基甲胺 50 2.5
FAM吡啶甲基叠氮染料 1 0.3
配制染料预混物溶液的加药顺序是硫酸铜溶液、三烃丙基三唑基甲胺、5-羧基荧光素吡啶甲基叠氮染料，加药完毕盖盖摇匀，在室温、避光条件下反应3min。
反应缓冲液
组分 浓度(mM) 体积(μL)
抗坏血酸钠 100 12.5
氨基胍HCl 100 12.5
(4)染色后的细胞加入含有PAOmix探针的杂交混合液，放入46℃恒温杂交箱杂交2h 25min；PAOmix探针由Cy5标记的PAO846、PAO651、PAO462探针按等体积比组成，杂交混合液按杂交缓冲液与探针的体积比8:1配制；杂交后的细胞利用杂交清洗液清洗两遍，并用10μm尼龙滤膜过滤；
按下表配制杂交缓冲液和杂交清洗液：
杂交缓冲液
组分 体积(mL)
甲酰胺 0.4
4.5M NaCl 0.4
100mM Tris/HCl 0.4
1.0％SDS 0.02
无菌蒸馏水 0.78
杂交清洗液
组分 体积或质量
NaCl 0.116g
100mM Tris/HCl 10mL
1.0％SDS 0.5mL
无菌蒸馏水 39.5mL
(5)染色后的样品被PBS缓冲液稀释100倍，然后开启流式细胞仪，对样品进行检测；
(6)在流式细胞仪设置大小阈值为FSC＝8000，收集60000个颗粒，圈出FL1通道中5-羧基荧光素吡啶甲基叠氮染料阳性群中的主要细胞群；圈门FL4通道中Cy5标记的PAOmix显阳性的聚磷菌细胞群，得出活性聚磷菌在全菌中的数量百分比；
本发明的有益效果：
从控制点源污染入手，严格限制排放到地表水体的污水中的氮、磷浓度是减轻水体富营养化的根本措施。EBPR工艺被认为是一种潜在的经济和高效工艺，但EBPR系统的除磷效果由于活性聚磷菌的种群占比难以检测而无法维持稳定。本发明提供经济、简便、省时的检测污水处理系统中活性聚磷菌的方法，可快速检测污水中活性聚磷菌的种群丰度，及时有效地调控使聚磷菌活性变差的条件，保持生物除磷系统稳定和高效地运行。
本发明采用特定氨基酸培养污水体系中的微生物。通过荧光性较强的5-羧基荧光素吡啶基叠氮染料对可利用该氨基酸合成蛋白质的微生物进行荧光染色；利用Cy5标记的PAO846、PAO651、PAO462探针与聚磷菌的功能基因进行杂交，对聚磷菌的DNA进行标记。标记后的样本进入流式细胞仪检测细胞在不同通道的荧光强度，对FL1和FL4通道的阳性区域进行圈门，从而分析活性PAOs的种群占比。在本发明中，5-羧基荧光素吡啶基叠氮染料和Cy5染料的最大发射波长相差较远，因此双标记的聚磷菌能很容易被识别出来。此外，样品由流式细胞仪检测，实验操作简单，省时，经济，结果可靠，具有很好的推广前景。
本发明的创新点：
(1)本发明针对污水处理系统复杂的微生物环境，采用生物正交氨基酸标记染色法识别具有活性的细菌，再利用荧光原位杂交标记聚磷菌功能基因，在不提取DNA的情况下，检测环境样本中的活性聚磷菌，操作简单，结果准确，通用性好，检测成本低。
(2)本发明利用了流式细胞仪检测方法的灵敏性与准确性，5-羧基荧光素吡啶基叠氮染料和Cy5染料的最大发射波长相差较远，因此双标记的聚磷菌易被识别出来，从而计算出活性聚磷菌的种群占比；实验结果可靠、稳定性好，减少了人为操作所带来的误差。
(3)本发明利用生物正交氨基酸标记染色法标记活性聚磷菌，可以通过对比合成蛋白质的能力来比较同一污泥系统中聚磷菌活性的变化，从而选择适应聚磷菌发挥作用的最佳条件或者表达聚磷菌受到外界干扰时的活性变化。
附图说明
图1活性聚磷菌流式细胞仪阴性样本圈门点图；
图1a和图1b分别是样本在未被染料染色下，活性细菌的FL1-SSC点图和活性聚磷菌的FL4-SSC点图；
图2活性聚磷菌流式细胞仪单染色圈门点图；
图2a是经5-羧基荧光素吡啶基叠氮染料染色后的活性细菌荧光点图，其中P1代表FAM吡啶基叠氮染料显阳性区域；图2b是5-羧基荧光素吡啶基叠氮染料显阳性区域中，未进行荧光原位杂交的荧光点图，其中P2代表Cy5染料显阳性区域；
图3活性聚磷菌流式细胞仪双染色圈门点图；
图3a是经5-羧基荧光素吡啶基叠氮染料染色后的活性细菌荧光点图，其中P1代表FAM吡啶基叠氮染料显阳性区域；图3b是在5-羧基荧光素吡啶基叠氮染料显阳性区域中，活性聚磷菌的荧光点图，其中P2代表被Cy5耦联的PAOmix探针荧光杂交的区域；
图4同一污泥系统中不同光照操作条件下活性聚磷菌活性荧光直方图。
具体实施方式
(1)污泥微生物培养及固定
a.取泥样1mL于2mL离心管中，加入100μL 100mmol/L L-高炔丙基甘氨酸浓缩液；
b.室温下，在振荡器中培养15min；
c.在离心管中加入1ml的质量百分比浓度为4％多聚甲醛，在室温下固定1h；
d.固定结束后，在12000r/min转速下离心2min30s，去除上清液；往离心管中加入1.5mL的1×PBS磷酸缓冲液，离心去除上清液；重复该步骤两次；
(2)超声分散及乙醇脱水
a.利用超声破碎仪，超声功率120j，每超声3s后停2s，共超声1min；
b.在12000r/min转速下离心2min30s去除上清液，依次往离心管加入体积百分数为50％，80％，99％乙醇溶液，每次脱水3min共9min，每次加乙醇1mL；在12000r/min转速下离心2min30s去除上清液；
(3)染料染色
a.往离心管中加入221μL 1×PBS磷酸缓冲液；
b.配制反应缓冲液和5-羧基荧光素吡啶甲基叠氮染料预混物溶液；
按下表配制染料预混物溶液：
Figure BDA0004095658510000061
Figure BDA0004095658510000071
配制染料预混物溶液的加药顺序是硫酸铜溶液、三烃丙基三唑基甲胺、5-羧基荧光素吡啶甲基叠氮染料，加药完毕盖盖摇匀，在室温、避光条件下反应3min。按下表配制反应缓冲液：
组分 浓度(mM) 体积(μL)
抗坏血酸钠 100 12.5
氨基胍HCl 100 12.5
c.加入25μL反应缓冲液，离心管缓慢倒转两次，反应1min；
d.加入4μL染料预混物溶液，离心管缓慢倒转一次，在室温、避光条件下，培养30min；
e.用1×PBS磷酸缓冲液清洗三次，用体积百分比50％乙醇清洗两次；
f.在12000r/min转速下，离心2min30s去除上清液。
(4)杂交与洗脱探针
a.配制杂交缓冲液；
按下表配制杂交缓冲液：
组分 体积(mL)
甲酰胺 0.4
4.5M NaCl 0.4
100mM Tris/HCl 0.4
1.0％SDS 0.02
无菌蒸馏水 0.78
配制杂交缓冲液的加药顺序是甲酰胺、NaCl、Tris/HCl、SDS、无菌双蒸水，加药完毕盖盖摇匀；
b.PAOmix探针由Cy5标记的PAO846、PAO651、PAO462探针按等体积比配制，杂交混合液按杂交缓冲液与探针的体积比8∶1配制；使用涡旋仪混合均匀，然后加入300μL到样品中，缓慢倒转离心管两次；放入46℃恒温杂交箱中杂交2h 25min；
c.杂交后的样本在12000r/min转速下，离心2min30s去除上清液，加入1mL杂交清洗液，清洗两次；在12000r/min转速下离心2min30s，去除上清液；加入1mL 1×PBS磷酸缓冲液重悬样品，经过10μm滤膜过滤；
按下表配置杂交清洗液：
组分 体积或质量
NaCl 0.116g
100mM Tris/HCl 10mL
1.0％SDS 0.5mL
无菌蒸馏水 39.5mL
(5)上机检测
a.样品被1×PBS磷酸缓冲液稀释100倍，进行流式细胞仪检测；
b.设置FSC通道阈值为8000，开始进样，收集60000个颗粒；
(6)流式细胞仪上机分析
图1未与染料预混物溶液反应和未与探针杂交的样本的荧光点图；P1区域代表5-羧基荧光素吡啶甲基叠氮染料显阳性区域和P2区域代表Cy5染料显阳性区域。从图1可以看出，阴性样本的P1和P2区域几乎为0，代表未经染色样本无法检测出活性聚磷菌的种群丰度。
图2为与染料预混物溶液反应，但未与探针杂交的单阳对照的点图；在图2a中，P1区域表示5-羧基荧光素吡啶甲基叠氮染料显阳性区域，其中收集的颗粒中有61.9％为阳性，即代表具有功能活性的群落。图2b为P1区域的FL4-SSC图，其中P2区域代表Cy5显阳性的区域，所显示此区域Cy5阳性菌群的占比几乎为0，即未经过探针标记的样本，在P2区域显示不出来。
图3为与染料预混物溶液反应，并经探针杂交标记后的阳性样本荧光点图；图3a中，P1区域表示5-羧基荧光素吡啶甲基叠氮染料显阳性区域的荧光点图，其中收集的颗粒中有62.4％左右的颗粒为阳性，即是具有翻译活性的细菌，视其为功能活性细菌；图3b为P1区域的FL4-SSC图，其中P2区域代表Cy5显阳性的区域，所显示此区域Cy5阳性菌群的占比为41.3％，即具有活性的聚磷菌的种群占比。
(7)同一污泥系统中活性聚磷菌活性对比
a.选取同一系统中不同操作条件下的污泥进行步骤(1)-(6)，得到在该活性污泥系统中不同操作条件下活性聚磷菌的活性荧光图；
b.在Flowjo V10软件进行分析比对，从而判断该系统生物除磷的最佳运行条件。
图4为根据该方法检测无光照和光照条件下厌氧-好氧-缺氧系统中活性聚磷菌的具体活性比较。A1代表无光照下的活性聚磷菌的活性直方图，A2代表适当光照下活性聚磷菌的活性直方图。从图4中可以看出，光照条件下的活性聚磷菌的功能活性明显比无光照条件下的活性聚磷菌高，这说明光照能提升磷去除性能。

Claims (1)

1.一种生物正交氨基酸标记染色法联合荧光原位杂交技术检测活性污泥系统中活性聚磷菌的方法，其特征在于：
(1)取处理生活污水反应器中的泥于离心管中，加入100μL L-高炔丙基甘氨酸，最终浓度为500μM，室温，黑暗条件下培养15min；加入多聚甲醛让体系停止反应，多聚甲醛的质量终浓度为2％，在室温下固定1h；利用PBS缓冲液清洗三次，并重悬至10mL管中；
(2)使用超声破碎仪在超声功率120j下，超声1min；离心弃掉上清液，依次往离心管加入1mL体积百分数为50％，80％，99％乙醇溶液进行脱水；
(3)脱水后的样品依次加入221μL PBS缓冲液、25μL反应缓冲液和4μL染料预混物溶液；反应缓冲液由12.5μL 100mM抗坏血酸钠和12.5μL 100mM氨基胍HCl配制；染料预混物由1.25μL 20mM硫酸铜溶液、2.5μL 50mM三烃丙基三唑基甲胺、0.3μL 1mM 5-羧基荧光素吡啶甲基叠氮染料配制，在加药完毕之后盖盖摇匀，染料预混物在室温、避光条件下反应3min之后方可使用；
(4)在黑暗、室温条件下，培养30min；染色完成后用PBS缓冲液和体积百分数为50％乙醇清洗；
(5)染色后的细胞加入含有PAOmix探针的杂交混合液，放入46℃恒温杂交箱杂交2h25min；PAOmix探针由Cy5标记的PAO846、PAO651、PAO462探针按等体积比配制，杂交混合液按杂交缓冲液与探针的体积比8:1配制，其中杂交缓冲液由0.4mL甲酰胺、0.4mL 4.5MNaCl、0.4mL 100mM Tris/HCl、0.02mL质量百分数1.0％SDS和0.78mL无菌蒸馏水配制；
(6)杂交后的细胞利用杂交清洗液清洗两遍，并用10μm尼龙滤膜过滤；杂交清洗液由0.116g NaCl、10mL 100mM Tris/HCl、0.5mL质量百分数1.0％SDS和39.5mL无菌蒸馏水配制；
(7)染色后的样品被PBS缓冲液稀释100倍，然后开启流式细胞仪，对样品进行检测；
(8)在流式细胞仪设置大小阈值为FSC＝8000，收集60000个颗粒，圈出FL1通道中5-羧基荧光素吡啶甲基叠氮染料阳性群中的主要细胞群；圈门FL4通道中Cy5标记的PAOmix显阳性的聚磷菌细胞群，得出活性聚磷菌在全菌中的数量百分比。
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