CN116254235A - 一种猫细小病毒抗原试纸条检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猫细小病毒抗原试纸条检测试剂盒，属于猫细小病毒抗原检测技术领域。为了提供一种准确和有效的检测猫细小病毒抗原的方法。本发明提供一种检测猫细小病毒的抗体对，所述抗体对是单克隆抗体F‑3株和F‑6株，所述单克隆抗体F‑3是由杂交瘤细胞F‑3株分泌获得的；所述单克隆抗体F‑6株是由杂交瘤细胞F‑6株分泌获得的。可用于特异性的鉴定动物体内是否有猫细小病毒，以确定是否引发感染。

Description

一种猫细小病毒抗原试纸条检测试剂盒
技术领域
本发明属于猫细小病毒抗原检测技术领域，具体涉及一种猫细小病毒抗原试纸条检测试剂盒。
背景技术
猫泛白细胞减少症的病原是猫细小病毒(Feline Parvovirus，FPV)，在分类学上属于细小病毒科细小病毒属成员，是DNA病毒，病毒粒子为等轴对称二十面体结构，直径20-24nm，无囊膜。临床上猫细小病毒可引起猫科动物以高热、脱水、呕吐、白细胞降低及出血性，肠炎为主的症状，是高度接触性传染病，冬末春初多发，是猫科动物危害严重的病原之一。需要及时检测猫科动物的病害，现在亟需一种准确和有效的检测猫细小病毒抗原的方法。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种准确和有效的检测猫细小病毒抗原的方法。
本发明一种杂交瘤细胞对，所述杂交瘤细胞对包括第一杂交瘤细胞株F-3株和第二杂交瘤细胞株F-6株。
本发明提供一种上述杂交瘤细胞对在检测猫细小病毒抗原中的应用。
本发明提供一种检测猫细小病毒的抗体对，所述抗体对是第一抗体和第二抗体，所述第一抗体是由杂交瘤细胞F-3株分泌获得的；所述第二抗体是由杂交瘤细胞F-6株分泌获得的。
本发明提供上述抗体对在检测猫细小病毒抗原中的应用。
本发明提供一种检测猫细小病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的抗体对。
进一步地限定，还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。
本发明提供上述的试剂盒的制备方法，其特征在于，以PVC背板为支撑物，在其上分别贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水垫，其中金标垫采用聚酯膜，经含有1％BSA和1％吐温-20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记单克隆抗体F-3金标垫部分，完毕，37℃烘干2h，硝酸纤维膜上包被有两条线：分别为质控线和检测线，其中检测线包被物为单克隆抗体F-6株浓度为1.6mg/mL，质控线包被物为纯化的兔抗鼠抗体浓度为2.1mg/mL，然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上，组装好后大板用切条机切成7-8mm的裸条备用。
进一步地限定，所述胶体金标记单克隆抗体F-3混合物的终浓度为10μg/mL。
进一步地限定，所述胶体金的制备方法如下：
(1)1％的氯化金水溶液1mL，加入99mL超纯水，配置成0.01％的HAuCl4溶液，加热至沸腾；
(2)加入1.5mL 1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热沸腾2～5min，金黄色的氯金酸水溶液在2min内颜色发生迅速变化，由灰色变成黑色最后变成紫红色，继续煮沸20min得到稳定的胶体金溶液。
进一步地限定，所述抗体对与标记胶体金混合的方法如下：
(1)用0.2mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH8.0，加入单克隆抗体F-3，混合物的终浓度为10μg/mL；
(2)然后将抗体对的溶液10000rpm 4℃离心15min，弃上清，用复溶液溶解浓缩沉淀，复溶液浓缩比例为125μL/mL；
(3)将浓缩后的胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm。
有益效果：本发明提供一种检测抗原的猫细小病毒检测试纸条，拟采用双抗体夹心法，制备形成夹心配对的猫细小病毒单克隆抗体。采用体外表达抗原纯化，免疫小鼠，细胞融合，制备猫细小病毒单克隆抗体，形成夹心配对结构，用来检测猫细小病毒抗原，特异性和灵敏度高。
附图说明
图1为VP2蛋白的原核表达；注：1号条带为表达菌上清，2号条带为沉淀部分，3-4号条带为对照蛋白；
图2为＝试纸条特异性结果；1：ADV病毒、2：FPV细小病毒、3：犬瘟热病毒、4：Vero细胞、5：PBS、C：商品化对照；
图3为试纸条敏感性结果；1：对照；2:1/32病毒；3:1/16病毒；4:1/8病毒；5:1/4病毒；
6:1/2病毒；7：原倍病毒液。
图4为猫细小病毒(FPV)抗原试纸条示意图。
具体实施方式
实施例1.猫细小病毒(FPV)单克隆抗体的制备和鉴定
1.FPV VP2基因的原核表达载体pEASY-E1构建
从感染FPV的Crfk细胞中提取猫细小病毒基因组DNA作为模板，利用该模板设计PCR扩增引物，扩增FPV-VP2基因。其中，上游引物的序列为5’-GGCCATGGATTCCGTTTACCCT-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物的序列为5’-GCTCGGACCTTAATTGCCTG-3’(SEQ ID NO.2)。对PCR产物胶回收，将全部PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下切取含有目的基因的胶块，之后进行胶回收。将胶回收得到的基因以及原核表达载体pEASY-E1分别进行连接。
转入Ecoli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，之后42℃水浴热刺激90s，再迅速冰浴2min。向管中加入250μL LB液体培养基，37℃摇床中摇动培养1h，将100μL菌液涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑取单个菌落，分别接种到3mL LB(Amp+，100μg/mL)液体培养基中37℃振荡培养。将经过PCR鉴定，结果阳性的质粒送交上海英俊生物技术有限公司进行序列测定，将通过序列测定鉴定正确的重组质粒命名为pEASY-VP2。
2.猫细小病毒截短VP2蛋白的原核表达
将重组质粒pEASY-E1-VP2转化到原核表达用BL21感受态细胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，挑取LB平板培养基上的白色菌落。取1mL重组菌菌液加入到100mL的LB培养基中37℃震荡培养至OD600nm约为0.5h-1h，加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导4h。将表达产物进行SDS-PAGE电泳，通过HIS标签的亲和层析方法进行纯化。
将表达产物进行SDS-PAGE电泳，通过HIS标签的亲和层析方法进行纯化。结果如图1所示，可见在37kDa处有明显的条带，说明表达纯化成功，图2中1号条带为表达菌上清，2号条带为沉淀部分，3-4号条带为对照蛋白。
3.猫细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备
采用质控合格的VP2蛋白作为抗原免疫4只6周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)和不完全弗氏佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期1周，每次50μg免疫抗原，之后进行效价检测，采用最高效价者1周内进行腹腔冲击(无佐剂)。每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原。
末次冲击3天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5)，离心5min弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1mL的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10mL无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min弃上清后，加入10mL血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5mL混合10×HAT(Sigma公司)的小鼠胸腺细胞，混匀。将细胞悬液分配至3-5个96孔细胞板中，置于5％CO2，37℃下培养。
在杂交瘤细胞培养3天后，细胞量大约占底面积2/3，加入1％HT(Sigma公司)的完全培养基。5-7天后进行ELISA筛选，得到与免疫原间接ELISA检测OD值高于0.5的杂交瘤作为阳性克隆进行后续培养。这些阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。
4只小鼠初步筛选得到阳性杂交瘤细胞12株，而对阴性对照的结合有8株(检测纯化蛋白的His部分)，识别杂交瘤信号最高的被命名为F-3株和F-6株。VP2蛋白杂交瘤特异性检测结果如表1所示。
表1VP2蛋白杂交瘤特异性检测结果
Figure BDA0004078311060000041
4.腹水单克隆抗体纯化
先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后分别将VP2单抗杂交瘤细胞株F-3株和F-6株接种到小鼠腹腔中，腹腔注入到小鼠(液体石蜡)体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。收集后的腹水经过预处理后选用Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化。用足够的起始缓冲液(8mL-10mL)平衡Protein A-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein A 1mL，PharmaciaBiotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10mg)15-25mL上柱，流速为0.5mL/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7mL-8mL、洗脱缓冲液6mL-7mL、起始缓冲液5mL洗涤，每管1mL收集洗脱液。纯度及活性鉴定纯化的单克隆抗体(McAb)用SDS-PAGE鉴定其纯度，VP2单克隆抗体经纯化去除几乎所有杂蛋白，按照2μg/m1的浓度包被病毒蛋白，100μL/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μL封闭液37℃封闭，PBS-T洗3次。将纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1:20000稀释，每孔100μL，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μL含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H2O2的柠檬酸磷酸缓冲液显色10min，加入50μl氢氟酸终止反应。用酶标仪测定波长630nm的吸光值，利用数据分析作图软件GraphPad Prism v8绘出抗体稀释浓度和OD 630对应曲线，计算亲和力。
用酶标仪测定波长630nm的吸光值，利用数据分析作图软件GraphPad Prism v8绘出抗体稀释浓度和OD630对应曲线，计算亲和力，得到F-3株和F-6株抗体亲和常数为5.78E+09和6.98E+08。
5.单克隆抗体特异性鉴定
Western blot鉴定试验：将离心收获FPV病毒上清后的细胞沉淀和Crfk细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE电泳，然后经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为18V电压30min，用5％脱脂奶粉封闭液将转印后的硝酸纤维素膜4℃封闭过夜；加入单克隆抗体上清室温孵1h，用PBST(含0.5mL/L吐温-20的pH7.4的PBS缓冲液)洗涤三次，再与4000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体室温孵育1h，PBST洗涤3次后，用DAB显色试剂盒显色，试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体F-3株和F-6株能够与FPV-VP2蛋白发生特异性反应，VP2大小约为64kDa，VP1大小约为75kDa。
实施例2.猫细小病毒(FPV)抗原试纸条的制备
以PVC背板为支撑物，在其上分别贴有样品垫1、金标垫2、硝酸纤维膜5、吸水垫6，其中金标垫采用聚酯膜，经含有1％BSA和1％吐温-20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记猫细小病毒单抗F-3按照40μL/30cm喷涂如图4所示的金标垫2部分，完毕，37℃烘干2h。硝酸纤维膜5上包被有两条线：分别为质控线4和检测线3，其中检测线包被物为猫细小病毒单抗F-6浓度为1.6mg/mL，质控线包被物为纯化的兔抗鼠抗体浓度为2.1mg/mL，然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上，组装好后大板用切条机切成7-8mm的裸条备用。
1.氯金酸、柠檬酸三钠、碳酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等均为国药集团化学试剂有限公司的产品。MEM培养基为Gibco公司的产品。胎牛血清购自长春西诺生物有限公司。
胶体金耗材：玻纤、聚酯膜、NC膜、底板、吸水垫等购自上海金标生物有限公司。喷金划膜仪、辅料切割机、切条机、压卡机等购自上海金标生物有限公司。
毒株来源及背景：猫细小病毒FPV-B株质控毒株，由中国农业学院特产研究所制备、保存和提供。其他质控毒株采购自背景清晰的疫苗产品和自我分离的病毒株，包括犬瘟热病毒(CDV)等。
2.方法：
2.1胶体金的制备
取1％的氯化金水溶液1mL，加入99mL超纯水，配置成0.01％的HAuCl4溶液，并置于三角烧瓶中，烧瓶口覆上保鲜膜，用电炉加热至沸腾，迅速加入1.5mL 1％柠檬酸三钠水溶液。继续搅拌加热沸腾2～5min，金黄色的氯金酸水溶液在2min内颜色发生迅速变化，由灰色变成黑色最后变成紫红色，继续煮沸20min得到稳定的胶体金溶液。待胶体金溶液冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积，在2～8℃保存。
2.2FPV单抗的制备
FPV单抗制备和纯化，获得FPV多抗血清，其对流免疫电泳效价≥1：8。
2.3免疫胶体金的制备
此实验主要目的为合成报告抗体，放置结合垫上，作为检测时在检测线与控制线显色使用。
以0.1M HCl及0.1M K2CO3调整抗体IgG pH值至9。取出胶体金溶液1ml于tube内。将第一抗体缓慢加入胶体金溶液中均匀混合，置于4℃冰箱内反应2hr。低温离心机设定在4℃，将反应胶体金抗体溶液放入，于12000rpm下离心20分钟。待离心完毕，移除上层澄清液，加入Tris buffer(0.01M,pH 8.6)再次离心20min。结束后，移除上层澄清液，加入复溶液存放在4℃环境。复溶液浓缩比例为125μL/mL。用喷金划膜一体机将浓缩后的胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm，自然干燥。
2.4NC膜包被
在硝酸纤维素膜表面用喷金划膜一体机喷涂检测线(T)和质控线(C)，检测线为针对猫细小病毒的纯化多抗，质控线为羊抗小鼠IgG抗体；两者划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离0.5cm。
2.5试纸条的组装
(1)金标结合垫组装：揭开PVC底板金标垫结合部位的双面胶覆盖纸，取出5mm宽的金标结合垫，将金标线平行贴于不干胶上，其上端覆盖住NC膜的下端1～2mm。
(2)样品垫组装：揭开PVC底板样品垫部位的双面胶覆盖纸，取出10mm宽的样品垫，样品垫的下端对齐大卡的下端进行粘贴，粘贴完毕后用手将样品垫压实。
(3)吸水纸组装：揭开PVC底板上端吸水纸部分的双面胶盖纸，取出切割好的25mm宽的吸水纸，吸水纸的一端对齐底板的上端进行粘贴，粘贴完毕后用手将吸水纸压实。
(4)切条及质检：调整切割机的参数(条宽4mm、切割速度200条/min)，之后开始切割。将切割好的试纸条按先后顺序、同一方向摆放，检查试纸条的切割质量，包括：切割尺寸、试纸条破损情况、NC膜破损及划痕问题，对不符合要求的试纸条集中起来做统一报废处理。
2.6试纸条用法与判定
(1)样本处理：组织样本的处理方法组织样本与PBS按照1:1的比例研磨后离心取上清直接用于检测。血液检测样本的处理方法直接用于检测。
(2)操作步骤：取适量的检测样品(30～40μl，滴管1滴)，缓慢滴加到样品孔中，然后滴加2滴样品缓冲液。加样完成后将试纸条平放在桌面上，5～10分钟内观察结果。
(3)判定：在试纸条上出现两条条带(T：检测线，C：质控线)，判为阳性。在试纸条上仅出现一条蓝色条带(C：质控线)，判为阴性。在试纸条质控线处不出现条带，判为无效。
(4)试纸条使用注意事项
包装破损、过有效期的，请勿使用。试纸条贮藏与运输过程中不可冷冻，避免阳光直晒。试验时，请勿饮食和吸烟。处理疑似被感染物时，应带上手套，并在处理后将手洗净。试验完毕后，试纸条和其他物品与检测样品一起进行无害化处理。试纸条贮藏与有效期2～30℃阴凉干燥处保存，有效期为6个月。
2.7试胶体金免疫层析试纸条性能的测试
胶体金免疫层析试纸条特异性试验：猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒CDV、细胞对照、PBS和水貂阿留申病毒(ADV)对试纸条进行特异性检测。
胶体金免疫层析试纸条敏感性试验：取背景清晰、效价明确的猫细小病毒阳性质控病毒抗原，分别用样品稀释液作1:2倍比稀释后检测。
胶体金免疫层析试纸条重复性实验：使用不同批次的试纸条对猫细小病毒阳性抗原和阴性抗原同时检测进行批次间重复检测。使用同一批次的试纸条对猫细小病毒阳性抗原和对照抗原在不同的时间点进行批次内重复检测。
3 结果
3.1 胶体金溶液的制备
对所制备的胶体金溶液的粒径、吸光度、外观颜色、漂浮物、沉淀、澄清度进行评价。结果，其吸收峰为531nm，色泽呈葡萄酒红色，无漂浮物，无沉淀，澄清，粒径30nm。
3.2抗体接金结果
通过将逐级稀释后的水貂阿留申病毒单抗依次分别标记胶体金，然后分别加入10％的氯化钠溶液检测胶体金的包被量是否达到饱和，试验结果显示，结果只有控制组与5μg/ml产生沉淀现象，而10μg/ml颜色也产生些许变化，因此选择最佳的抗体混合浓度为15μg/ml以上为佳。
3.4试纸条特异性检验
结果如图2所示，用猫细小细小病毒、犬瘟热病毒、水貂阿留申病毒、阴性样本对试纸条进行特异性检测，结果只有猫细小病毒显示阳性反应，而不与对照病毒发生反应。
结果如图3所示，对猫细小病毒质控抗原(病毒含量)进行倍比稀释，后使用试纸条进行测试其敏感性，即最低检测检测值为1:4病毒原液。
3.6试纸条重复性实验
从FPV试纸条中各随机取15个试纸条，对水貂阿留申病毒(ADV)阳性样品，猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒各1份进行检测。结果如表2所示，批内检测结果一致。
表2水貂阿留申病毒胶体金检测试纸条批内重复性检测结果
Figure BDA0004078311060000081
3.6批间试纸条重复性实验
三批试纸条各取3个试纸条，对水貂阿留申病毒(ADV)、猫细小病毒(FPV)、犬瘟热病毒各1份进行检测。结果显示批间检测结果依然一致(表3)，表明该试纸条能进行较好的批间重复试验。
表3个不同批次的试纸条批间重复性试验结果
编号 样品信息 PCR检测结果 第一批 第二批 第三批
1 ADV病毒 - - - -
2 犬瘟热病毒 - - - -
3 猫细小样品 + + + +
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞对，其特征在于，所述杂交瘤细胞对包括第一杂交瘤细胞株F-3株和第二杂交瘤细胞株F-6株。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞对在检测猫细小病毒抗原中的应用。
3.一种检测猫细小病毒的抗体对，其特征在于，所述抗体对是单克隆抗体F-3株和F-6株，所述单克隆抗体F-3是由杂交瘤细胞F-3株分泌获得的；所述单克隆抗体F-6株是由杂交瘤细胞F-6株分泌获得的。
4.权利要求3所述抗体对在检测猫细小病毒抗原中的应用。
5.一种检测猫细小病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的抗体对。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括PVC底板、金标垫、样品垫和吸水垫。
7.权利要求6所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，以PVC背板为支撑物，在其上分别贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水垫，其中金标垫采用聚酯膜，经含有1％BSA和1％吐温-20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记单克隆抗体F-3金标垫部分，完毕，37℃烘干2h，硝酸纤维膜上包被有两条线：分别为质控线和检测线，其中检测线包被物为单克隆抗体F-6株浓度为1.6mg/mL，质控线包被物为纯化的兔抗鼠抗体浓度为2.1mg/mL，然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上，组装好后大板用切条机切成7-8mm的裸条备用。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述胶体金标记单克隆抗体F-3混合物的终浓度为10μg/mL。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金的制备方法如下：
(1)1％的氯化金水溶液1mL，加入99mL超纯水，配置成0.01％的HAuCl4溶液，加热至沸腾；
(2)加入1.5mL 1％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热沸腾2～5min，金黄色的氯金酸水溶液在2min内颜色发生迅速变化，由灰色变成黑色最后变成紫红色，继续煮沸20min得到稳定的胶体金溶液。
10.根据权利要求9所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗体对与标记胶体金混合的方法如下：
(1)用0.2mol/L K2CO3溶液调节胶体金溶液至pH8.0，加入单克隆抗体F-3，混合物的终浓度为10μg/mL；
(2)然后将抗体对的溶液10000rpm 4℃离心15min，弃上清，用复溶液溶解浓缩沉淀，复溶液浓缩比例为125μL/mL；
(3)将浓缩后的胶体金复合物喷涂于胶体金垫内，喷涂量为15μL/cm。
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