CN116251083A - 2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及2‑(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明研究发现新冠病毒(SARS‑CoV‑2)刺突蛋白可以诱导人巨噬细胞THP‑1细胞炎症反应，使NO，TNF‑α，IF‑1β，IF‑6和NF‑κB的水平显著增高；用2‑(甲氨基)苯甲酸甲酯处理THP‑1细胞可降低NO，TNF‑α，IF‑1β，IF‑6和NF‑κB的水平，能够抑制由新冠病毒SARS‑CoV‑2刺突蛋白诱导的炎症反应，为研究开发新的抗炎症药物提供了新的途径。

Description

2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎 症药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用。
背景技术
新冠病毒(SARS-CoV-2)感染可引起患者器官的炎症反应，严重者可出现多器官的炎症损伤导致患者死亡。
炎症是机体遭受各种内外刺激后的一种防御性反应，巨噬细胞是机体固有免疫的重要组成部分，同时也是产生炎症反应的重要细胞。现代研究表明，巨噬细胞在炎症性疾病的发生和炎症维持中具有关键作用。SARS-CoV-2病毒表面的刺突蛋白被认为与病毒引起炎症反应密切相关，用SARS-CoV-2刺突蛋白可以刺激巨噬细胞产生炎症反应，包括增加NO，TNF-α，IF-1β，IF-6和NF-κB的水平，通过对SARS-CoV-2病毒刺突蛋白刺激巨噬细胞炎症反应的研究寻找治疗新冠病毒炎症的有效药物是目前的一个研究热点。
然而，现阶段对新冠病毒引起的严重炎症反应尚缺乏特效的药物，现用药物中也存在毒副作用等问题，因此研发针对病毒引起炎症的新药对新冠病毒的治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的问题，提供一种2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用。
本发明是通过下述技术方案进行实现的：
第一方面，本发明提供2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用。
2-(甲氨基)苯甲酸甲酯是一种芳香化合物，从广陈皮的分离得到，是一种几乎不溶于甘油和水，微溶于丙二醇，溶于大多非挥发性油、挥发性油、矿物油、乙醇和苯甲酸苄酯的无色至淡黄色液体或白色结晶。2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的结构如式(Ⅰ)所示：
Figure SMS_1
本发明通过研究发现2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能够缓解由新冠病毒诱导的细胞炎症，可用于制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中。
作为本发明所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中应用的优选实施方式，所述细胞炎症为由新冠病毒刺突蛋白诱导的细胞炎症。
作为本发明所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中应用的优选实施方式，所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能够减少由新冠病毒SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中NO的水平。
本发明通过一氧化氮检测试剂盒研究2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中NO的水平，结果表明用2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理细胞强烈地减少了由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中NO的水平。
作为本发明所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中应用的优选实施方式，所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能够减少由新冠病毒SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中TNF-α、IF-1β和IF-6的水平。
本发明通过酶联免疫吸附试验(ELISA)研究2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中TNF-α、IF-1β和IF-6的水平，结果表明用2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理细胞强烈地减少了由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中TNF-α、IF-1β和IF-6的水平。
作为本发明所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中应用的优选实施方式，所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能够减少由新冠病毒SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中NF-κB的水平。
本发明研究通过荧光素酶检测试剂盒研究2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中NF-κB的水平，结果表明用2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理细胞强烈地减少了由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中NF-κB的水平。
本发明的实验结果表明，2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能够显著减轻SARS-CoV-2刺突蛋白产生的细胞炎症反应。
第二方面，本发明提供一种包含2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的组合物在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用。
作为本发明所述包含2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的组合物在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用的优选实施方式，所述组合物中2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的浓度为10.0μM～200.0μM。
本发明通过研究2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对THP-1细胞活性的影响发现，用10.0μM～200.0μM浓度的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理细胞，2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对THP-1细胞活性基本没有影响，即，浓度为10.0μM～200.0μM的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对THP-1细胞没有显著的毒性。本发明为有效缓解由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的炎症提供了一种毒副作用小、给药剂量低的抗炎组合物。
作为本发明所述包含2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的组合物在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用的优选实施方式，所述组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供了2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用，尤其是用于制备治疗由新冠病毒SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症药物的新应用，2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能改善由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症，可较大程度抑制由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中NO、TNF-α、IF-1β、IF-6和NF-κB的水平，对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症具有良好的保护效果。且2-(甲氨基)苯甲酸甲酯是一种天然药物成分，天然存在于广陈皮中，作为由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症的保护剂对细胞的活性几乎没影响，无毒性。此外，本发明所提供的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症有明显的抑制作用，可以减少其它有毒副作用的抗炎药物的使用。
(2)本发明提供的一种包含2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的组合物在制备治疗细胞炎症药物中的应用，该组合物为研究天然药物抑制由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症的作用机制奠定理论基础。且该组合物价格相对便宜，可以减轻患者的经济负担。
附图说明
图1为实施例1中，不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理对THP-1细胞活性影响的趋势图；
图2为实施例2中，不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作用24h对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞的NO水平影响的趋势图；
图3为实施例3中，不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作用24h对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞的TNF-α水平影响的趋势图；
图4为实施例4中，不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作用24h对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞的IF-1β水平影响的趋势图；
图5为实施例5中，不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作用24h对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞的IF-6水平影响的趋势图；
图6为本发明实施例6中，不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作用24h对由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞的NF-κB水平影响的趋势图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
THP-1细胞是人巨噬细胞，且具有来源简单，易培养，稳定性好，增殖能力强的特点，本发明选用体外培养的THP-1细胞为代表，以2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作为预保护剂，再用SARS-CoV-2刺突蛋白诱导其炎症损害，通过评估2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对THP-1细胞的NO、TNF-α、IF-1β、IF-6和NF-κB水平的影响，以探讨2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的细胞炎症中的作用。
实施例1
用CCK-8法测定不同浓度的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对THP-1细胞活性的影响
1、实验方法
用胰蛋白酶将THP-1细胞从培养瓶中消化下来，离心3min，加入含有10％FBS和1％抗生素的DMEM培养基中制成细胞悬浮液，以接种浓度5×104个/mL的浓度接种于96孔板(100μL/孔)，置于5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。设置2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的浓度为10μM、20μM、50μM、100μM、200μM，每个浓度设置5个复孔。5％CO2，37℃培养72h后小心吸出培养液，每孔加入100μL无血清培养基配制的10％的CCK-8溶液，继续培养4h后，用酶标仪测量450nm处各孔的吸光值。
2、实验结果
如图1所示，当浓度达到200μM时，2-(甲氨基)苯甲酸甲酯不会显著改变细胞活力。方差分析的统计分析表明，对照组和不同浓度的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的细胞存活率差异无统计学意义(p>0.05)。
因此实验结果表明，在10μM～200μM的浓度范围内，2-(甲氨基)苯甲酸甲酯对HaCaT细胞无毒性。所有随后的实验都是在这些无毒浓度下进行的。
实施例2
不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理对SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞中NO水平影响
1、实验方法
将THP-1细胞以5×105个/mL的浓度接种于24孔板(1mL/孔)，置于5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。用SARS-CoV-2刺突蛋白(100ng/mL)刺激THP-1细胞，同时设置2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的浓度为0μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM，处理细胞24h。吸取50μL的上清液于96孔板中，加入等体积的Griess试剂，孵育10min。用酶标仪测量540nm处各孔的吸光值。
2、实验结果
如图2所示，20μM、50μM、100μM和200μM的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯降低了NO的水平，分别具有统计学意义p<0.05、p<0.01、p<0.001和p<0.001。
如图2所示，与对照组相比，用SARS-CoV-2刺突蛋白处理THP-1细胞显著增加了NO的水平，表明SARS-CoV-2刺突蛋白可诱导人巨噬细胞THP-1细胞炎症反应。用2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理THP-1细胞降低了NO的水平，表明2-(甲氨基)苯甲酸甲酯这种天然存在的化合物能够抑制由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的炎症反应。
实施例3
不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理对SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞中TNF-α水平影响
1、实验方法
将THP-1细胞以2×105个/mL的浓度接种于35mm培养皿中(1mL/皿)，置于5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。用SARS-CoV-2刺突蛋白(100ng/mL)刺激THP-1细胞，同时设置2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的浓度为0μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM，处理细胞24h。按照酶联免疫试剂盒的说明书进行操作，用其测定培养上清液中TNF-α的水平。
2、实验结果
如图3所示，20μM、50μM、100μM和200μM的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯降低了TNF-α的水平，分别具有统计学意义p<0.05、p<0.01、p<0.001和p<0.001。
如图3所示，与对照组相比，用SARS-CoV-2刺突蛋白处理THP-1细胞显著增加了TNF-α的水平，表明SARS-CoV-2刺突蛋白可诱导人巨噬细胞THP-1细胞炎症反应。用2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理THP-1细胞降低了TNF-α的水平，表明2-(甲氨基)苯甲酸甲酯这种天然存在的化合物能够抑制由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的炎症反应。
实施例4
不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理对SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞中IF-1β水平影响
1、实验方法
将THP-1细胞以2×105个/mL的浓度接种于35mm培养皿中(1mL/皿)，置于5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。用SARS-CoV-2刺突蛋白(100ng/mL)刺激THP-1细胞，同时设置2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的浓度为0μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM，处理细胞24h。按照酶联免疫试剂盒的说明书进行操作，用其测定培养上清液中IF-1β的水平。
2、实验结果
如图4所示，20μM、50μM、100μM和200μM的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯降低了IF-1β的水平，分别具有统计学意义p<0.05、p<0.001、p<0.001和p<0.001。
如图4所示，与对照组相比，用SARS-CoV-2刺突蛋白处理THP-1细胞显著增加了IF-1β的水平，表明SARS-CoV-2刺突蛋白可诱导人巨噬细胞THP-1细胞炎症反应。用2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理THP-1细胞降低了IF-1β的水平，表明2-(甲氨基)苯甲酸甲酯这种天然存在的化合物能够抑制由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的炎症反应。
实施例5
不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理对SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞中IF-6水平影响
1、实验方法
将THP-1细胞以2×105个/mL的浓度接种于35mm培养皿中(1mL/皿)，置于5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。用SARS-CoV-2刺突蛋白(100ng/mL)刺激THP-1细胞，同时设置2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的浓度为0μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM，处理细胞24h。按照酶联免疫试剂盒的说明书进行操作，用其测定培养上清液中IF-6的水平。
2、实验结果
如图5所示，20μM、50μM、100μM和200μM的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯降低了IF-1β的水平，分别具有统计学意义p<0.05、p<0.01、p<0.001和p<0.001。
如图5所示，与对照组相比，用SARS-CoV-2刺突蛋白处理THP-1细胞显著增加了IF-6的水平，表明SARS-CoV-2刺突蛋白可诱导人巨噬细胞THP-1细胞炎症反应。用2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理THP-1细胞降低了IF-6的水平，表明2-(甲氨基)苯甲酸甲酯这种天然存在的化合物能够抑制由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的炎症反应。
实施例6
不同浓度2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理对SARS-CoV-2刺突蛋白诱导人巨噬细胞THP-1细胞中NF-κB水平影响
1、实验方法
将NF-κB荧光素酶基因转染进THP-1细胞，并以4×104个/mL的浓度接种于12孔板中(1mL/孔)，置于5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。用SARS-CoV-2刺突蛋白(100ng/mL)刺激THP-1细胞，同时设置2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的浓度为0μM、10μM、20μM、50μM、100μM、200μM，处理细胞24h。按照荧光素酶检测试剂盒的说明书进行操作，用其测定培养上清液中NF-κB的水平。
2、实验结果
如图6所示，20μM、50μM、100μM和200μM的2-(甲氨基)苯甲酸甲酯降低了NF-κB的水平，分别具有统计学意义p<0.01、p<0.001、p<0.001和p<0.001。
如图6所示，与对照组相比，用SARS-CoV-2刺突蛋白处理THP-1细胞显著增加了NF-κB的水平，表明SARS-CoV-2刺突蛋白可诱导人巨噬细胞THP-1细胞炎症反应。用2-(甲氨基)苯甲酸甲酯处理THP-1细胞降低了NF-κB的水平，表明2-(甲氨基)苯甲酸甲酯这种天然存在的化合物能够抑制由SARS-CoV-2刺突蛋白诱导的炎症反应。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用，其特征在于，所述细胞炎症为由新冠病毒刺突蛋白诱导的细胞炎症。
3.根据权利要求2所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用，其特征在于，所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能够减少由新冠病毒刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中NO的水平。
4.根据权利要求2所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用，其特征在于，所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能够减少由新冠病毒刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中TNF-α、IF-1β和IF-6的水平。
5.根据权利要求2所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯在制备治疗细胞炎症药物中的应用，其特征在于，所述2-(甲氨基)苯甲酸甲酯能够减少由新冠病毒刺突蛋白诱导的细胞炎症中THP-1细胞中NF-κB的水平。
6.一种包含2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的组合物在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用。
7.根据权利要求6所述包含2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的组合物在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用，其特征在于，所述组合物中2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的浓度为10.0μM～200.0μM。
8.根据权利要求6所述包含2-(甲氨基)苯甲酸甲酯的组合物在制备治疗由新冠病毒诱导的细胞炎症药物中的应用，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的载体。
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