CN116240082A - 一种基于固定化酶催化的黄水利用技术 - Google Patents

一种基于固定化酶催化的黄水利用技术 Download PDF

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Abstract

本发明为一种基于固定化酶催化的黄水高附加值利用技术。该技术通过(1)固定化酶载体表面修饰及固定化酶的制备；(2)固定化酶连续催化黄水反应等步骤和反应条件；(3)基于所制备固定化酶的填充反应柱用于黄水的高效酶法转化工艺条件。将一种酸性脂肪酶固定于经过表面修饰的树脂上，以此作为催化剂催化黄水中有机酸和乙醇的反应。本发明克服了游离脂肪酶不可重复使用以及稳定性低的缺点，能够连续催化反应，成功激活脂肪酶活力，为实现黄水的连续化催化转化提供技术基础，提高了对白酒发酵副产物黄水的综合利用效率，对环境有间接的保护作用。

Description

一种基于固定化酶催化的黄水利用技术
技术领域
本发明属于固定化酶领域，特别是提出了新型的固定化酶可用于填充柱反应器连续化催化黄水酯化实现高值化利用，使得黄水降低酸浓度、增高总酯浓度，提高了黄水的综合利用。
背景技术
脂肪酶(Lipase)是一种羧基酯水解酶类，又称甘油酯水解酶。酶作为生物催化剂具有特异性和高效性，并且反应条件温和、反应副产物少。而脂肪酶作为一种特殊的工业酶制剂，可以催化水解、酯化、转酯等反应；但游离脂肪酶在工业生产的应用中，其热稳定性、酸碱稳定性、储存稳定性以及重复使用性都存在局限。因此，将游离酶进行固定化是目前解决其性质不稳定的最合适的办法。酶的固定化技术可以大大提高酶的热稳定性、储存稳定性以及各种溶剂的耐受性，同时实现了多次重复使用等。固定化酶可以通过简单的分离技术将其分离出来，比如离心、过滤等，较游离酶有明显优势。
大部分脂肪酶的活性中心被一个或数个α-螺旋结构的“盖子”所覆盖，并受其保护。“盖子”是两亲性分子结构，通过连接肽链的扭转而使酶分子的活性中心呈现“打开”或“闭合”的状态。“闭合”状态时，“盖子”覆盖在酶的活性中心上方，使得底物分子难以靠近活性中心，无法发生反应；当活性中心转变为“打开”状态时，“盖子”的疏水性残基暴露出来，在丝氨酸残基周围形成亲电子区域，“盖子”打开增加了酶与疏水性底物的亲和性，促进了反应的发生。这种结构的存在，使得脂肪酶在水/油界面微环境下通常表现出比在水相中更高的催化活性，这种现象称为界面活化作用。因此，为了保证所用脂肪酶呈现“打开”的构象，在脂肪酶的固定化方法设计过程中，应该考虑界面活化作用的重要性。
白酒产业是我国酒业的支柱产业，目前每生产1t浓香型大曲基酒会产生0.8-1t的黄水，白酒酿造副产物的综合利用成为我国白酒行业亟需解决的共性问题。黄水是一种棕褐色、粘稠、流体状液体，其中富含乙酸、乳酸和己酸等白酒重要风味物质的前体物。目前，表达一种在酸性环境下仍能展示出高效、专一催化活性的新型酯化酶成为研究热点，但其筛选方法往往是先在大曲、酒醅等中分离获得具有酯化能力的菌株，再锁定酯化酶基因，筛选过程有明显的偏好性，会导致重要菌株的遗漏；另外，有研究使用酯化剂将黄水制备成酯化液，但这类生物制剂多以复合物形式出现，反应周期长，增香效果不明显。
无论是简单的酯化处理或是串蒸工艺，其目的都是提高风味物质的浓度，从而大大提高白酒的质量。因此，利用黄水中富含的有机酸获得白酒增香所需要的风味物质是黄水资源化利用的核心问题。
本专利利用经过疏水修饰的树脂作为载体以吸附的方法固定化脂肪酶，得到的催化剂可用于催化黄水的酯化转化，进一步构筑固定化酶填充柱反应器，可以连续催化黄水和乙醇的酯化反应，提高了黄水中己酸乙酯等风味物质的含量，反应周期短，同时克服了游离酶无法重复使用的缺点，使黄水得到综合利用。
关于催化剂催化黄水中有机酸发生酯化反应的文献报道包括：文献1：食品研究与开发,2020,41(03),40-45将一种纯脂肪酶制剂应用于黄水酯化过程，以总酯为响应值，在单因素试验基础上，进行响应面优化试验。实验结果由黄水原料液中总酯含量1.89±0.05g/L增长到黄水反应液中总酯含量5.071±0.08g/L。文献2：现代食品科技,2020,36(01),220-226通过控制酒精添加量、反应温度和南极假丝酵母展示脂肪酶B(Candidaantarctica Lipase B，CALB)添加量等，制得的黄水酯化液乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯及总酯含量大大提高，而且经过蒸馏萃取后色泽清亮、香气更加醇厚饱满。文献3：酿酒科技,2022,04,78-81将黄水、普酒、酒尾、大曲粉、窖泥、酒糟、酒头，按49∶22∶10∶9∶5∶5∶2的重量比例搅拌均匀，保持温度为32℃，并密封酯化35d，得到的酯化液中浓香型大曲酒的主要香气成分己酸乙酯含量大大提高。文献4：中国酿造,2019,38(08),6-8将复合生物制剂或酯化酶应用在黄水酯化中，结果表明所有黄水酯化后丁酸乙酯及己酸乙酯含量均大幅上升，且经过沉淀、过滤及脱色等处理后的黄水酯化液可直接用来勾兑白酒，提高酒体质量和优质品率。文献5：酿酒,2022,49(01),92-97探讨了利用黄水和酒尾添加生物酶制成调味液的可行性，得出：黄水、尾水、乙醇添加比例控制在(58～61)∶30∶(9～12)，添加0.5％复合酯化酶或高温曲,30℃培养7天以上，采用常压蒸馏，取20％综合馏出液为最佳制作调味液条件,该调味液可用于相关白酒勾调。文献6：中国专利，申请(专利)号：CN202010905296.7在原料黄水中添加20～60％V/V的食用酒精和0.1％～6％W/V的脂肪酶,混合均匀,在20～50℃反应条件下反应1～5d,经过滤/离心除去脂肪酶,得到黄水酯化液。
以上相关文献所述的黄水综合利用，皆是使用酯化剂将黄水制成酯化液，用于白酒的对勾等，目前使用较多的酯化剂为生物制剂，其中酵母菌和红曲霉菌使用最多，同时也有使用游离脂肪酶。这种生物制剂多是以菌酶复合物形式出现，存在反应周期较长，所得黄水酯化液总酯含量较低、增香效果不稳定等问题。而游离脂肪酶不能重复使用、耐酸性较弱，且成本过高，催化黄水效果同样不佳。本发明提出的使用新型固定化酶及其填充柱反应器连续催化黄水和乙醇反应的方法，脂肪酶可实现多次重复使用和连续化催化黄水酯化，提高了稳定性，而且制得的黄水酯化液中酸度降低、酯含量较高，效率高，可实现工业化连续生产。
发明内容
本发明的目的为针对现有技术中游离脂肪酶和酶制剂对黄水酯化不理想的效果，提供一种基于固定化酶催化的黄水高附加值利用技术，该技术通过固定化脂肪酶及其填充柱反应器连续催化黄水酯化反应，解决了游离脂肪酶无法重复利用和酶制剂反应周期较长的问题，大大降低成本。
本发明提供了一种基于固定化酶催化的黄水利用方法，利用脂肪酶催化黄水的反应，所述固定化酶为固定化脂肪酶，所述固定化酶的载体为经过疏水修饰的离子交换树脂，所述黄水利用方法包括固定化酶的制备和固定化酶催化黄水反应。
优选的是，所述固定化酶的制备包括以下步骤：
步骤1固定化酶载体表面修饰：将有机硅胶用正己烷溶液溶解稀释后，加入树脂添加到有机硅溶液中，超声处理后真空干燥，得到疏水修饰后的树脂，即固化酶载体；
步骤2固定化酶的制备：将步骤1得到的固化酶载体加入到柠檬酸盐缓冲液CPBS中，搅拌使其均匀分散，加入脂肪酶，搅拌回收树脂，真空干燥，得到固定化酶。
上述任一项优选的是，步骤1中，所述树脂为离子交换树脂。
上述任一项优选的是，步骤1中，所述有机硅胶为DC1-2577。
上述任一项优选的是，步骤1中，所述有机硅胶用正己烷溶液溶解稀释50-100倍；进一步优选为50、60、7、80、90、100倍。
上述任一项优选的是，步骤1中，所述树脂为LX-1000HA型离子交换树脂，得到的固定化酶载体记作SH LX-1000HA树脂；
上述任一项优选的是，步骤1中，超声处理温度22-28℃，进一步优选为22、23、24、25、26、27、28℃.
上述任一项优选的是，步骤1中，超声处理时间为10-20min；进一步优选为10、15、20min。
上述任一项优选的是，真空干燥条件为：室温，12h。真空干燥条件优选为，20-30℃，10-15h。
上述任一项优选的是，步骤2中，搅拌条件为25-35℃下，3-6h；进一步优选为25、30、35℃，进一步优选为3、4、5、6h。
上述任一项优选的是，步骤2中，真空干燥条件为室温下1h；真空干燥条件优选为，20-30℃，1-2h。
上述任一项优选的是，步骤2中，所述脂肪酶为酸性脂肪酶，优选为脂肪酶AOL。
上述任一项优选的是，步骤2中，所述脂肪酶和疏水修饰后的树脂与CPBS的质量体积比为：酶：疏水修饰后的树脂：CPBS＝1：2～2.5：20～50；得到的固定化酶记作AOL@SH LX-1000HA。进一步优选的酶：疏水修饰后的树脂为1：2.0，1：2.1,1:2.2,1:2.3,1:2.4,1:2.5。进一步优选的，酶：CPBS为1：20，1：30，1：40，1：50。
上述任一项优选的是，步骤2中，柠檬酸缓冲溶液CPBS由以下步骤制得：分别配制0.1mol/L的柠檬酸溶液和0.1mol/L的柠檬酸钠溶液；按照体积比柠檬酸/柠檬酸钠为33:17的比例混合两种溶液，即可得到pH值4.0的柠檬酸缓冲溶液CPBS。
上述任一项优选的是，所述固定化酶催化黄水反应包括以下步骤：
步骤3：将黄水置于离心机中，取上清保存备用；
步骤4：取步骤3得到的黄水和95％的乙醇混合制备混合溶液，将混合溶液混合均匀后抽滤取滤液备用；
步骤5：将所述固定化酶加入到步骤4抽滤后的混合溶液滤液中，反应得到黄水酯化液。
上述任一项优选的是，步骤3中，离心条件为：8000r/min；优选的离心时间10min；优选的离心条件还可以是6000-10000r/min，优选的离心5-15min。
上述任一项优选的是，步骤4中，体积比黄水：95％乙醇＝1：0.75～1.50。进一步优选的体积比为1：0.75，1：1，1：1.2，1：1.5。
上述任一项优选的是，步骤5中，所述固定化酶与步骤4抽滤后的混合溶液滤液质量体积比固定化酶：反应体系＝1：40～55；进一步优选为1：40，1：45，1：50，1：55。所述反应体系体积为所述混合溶液滤液的总体积；
上述任一项优选的是，步骤5中，反应的条件为搅拌反应，优选的温度为40-50℃、优选的150r/min下搅拌反应，优选的反应时间为30-60min。进一步优选的温度为40、43、45、47、50℃，优选的搅拌速率100-200r/min，进一步优选的搅拌时间30、40、50、60min。
上述任一项优选的是，所述固定化酶催化黄水反应为固定化酶连续催化黄水反应，步骤5中，取步骤4抽滤后的混合溶液滤液备用，将固定化酶装填入反应柱，反应后流出酯化液。优选的，体积比固定化酶：反应柱体积＝1：(2.5-4)，进一步优选为1：2.5，1：3.0，1：3.5，1：4.0；优选的，进料体积空速控制在0.01-0.2min-1之间，进一步优选为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20min-1；优选的在46-54℃下连续反应，进一步优选为46、48、50、52、54℃；优选的反应时间为20-40min，进一步优选为20、25、30、35、40min。
上述任一项优选的是，所述反应柱为圆柱形玻璃反应器，进一步优选为直径10mm、高度150mm的反应柱。进一步优选的，反应柱带有夹套，通过恒温水循环以控制反应温度；包括进料口、内层反应柱、砂芯片、调节活塞旋钮、引流管以及外层夹套进出水口；取经过离心的黄水和95％乙醇体积比1：1混合均匀后抽滤取滤液备用；将1g固定化酶装填入所述反应柱中，进料体积空速0.01-0.2min-1之间，46-54℃下连续反应20-40min，流出酯化液，得到黄水酯化液。
在本发明一项优选的实施方式中，提供了一种基于固定化酶催化的黄水高附加值利用技术，该方法包括以下步骤：
(1)固定化酶载体表面修饰：将有机硅胶(DC1-2577)用正己烷溶液溶解稀释50-100倍，然后称取10％(W/V)的树脂添加到有机硅溶液中，在22-28℃下超声处理10-20min，室温下(优选25℃)真空干燥12h；
优选的，所述的树脂为LX-1000HA型离子交换树脂；得到的固定化酶载体，记作SHLX-1000HA树脂；
(2)固定化酶的制备：将SH LX-1000HA树脂加入到柠檬酸盐缓冲液CPBS中，搅拌使其均匀分散，加入酶液，在25-35℃下磁力搅拌吸附3-6h；然后过滤回收树脂，优选的用去离子水清洗一次；然后，室温下真空干燥1h作为固定化酶；
其中，优选的，所述的酶为脂肪酶AOL，优选的，所述脂肪酶AOL来源于米曲霉；酶和SH LX-1000HA树脂与PBS质量体积比酶：SH LX-1000HA树脂：CPBS＝1：(2-2.5)：(20-50)；得到的固定化酶记作AOL@SH LX-1000HA；
(3)固定化酶催化黄水反应：将黄水置于离心机中8000r/min离心10min，取上清保存备用；取一定体积的上述黄水和乙醇(95％)混合制备混合溶液，将混合溶液混合均匀后抽滤取滤液备用；将一定质量的固定化酶加入到上述混合溶液中，40-50℃、150r/min下磁力搅拌反应30-60min，通过GC-MS技术检测酯化液中组分，得到高附加值的黄水酯化液。
其中，优选的，体积比黄水：乙醇(95％)＝1：(0.75-1.50)；固化酶与反应体系的质量体积比为固定化酶：反应体系＝1：(40-55)；
(4)固定化酶连续催化黄水反应：取一定体积的上述经过离心的黄水和乙醇(95％)混合制备混合溶液，将混合溶液混合均匀后抽滤取滤液备用；将一定质量的固定化酶填充入圆柱形玻璃反应器(直径10mm，高度150mm)中，进料体积空速控制在0.01-0.2min-1之间，46-54℃下连续反应20-40min，流出酯化液，通过GC-MS技术检测酯化液中组分，得到高附加值的黄水酯化液。
其中，优选的，体积比黄水：乙醇(95％)＝1：(0.75-1.50)；体积比固定化酶：反应柱体积＝1：(2.5-4)；体积空速(min-1)：单位时间里通过单位体积催化剂的反应物的体积。体积空速(min-1)＝原料体积流量(cm32 min-1)/催化剂体积(cm3)。
优选的，所述的柠檬酸缓冲溶液(CPBS)由以下步骤制得：分别配制0.1mol/L的柠檬酸溶液和0.1mol/L的柠檬酸钠溶液；按照体积比柠檬酸/柠檬酸钠为33:17的比例混合两种溶液，即可得到pH值4.0的柠檬酸缓冲溶液(CPBS)。
优选的，固定化酶连续催化黄水反应：圆柱形玻璃反应器(直径10mm，高度150mm)，反应柱带有夹套，通过恒温水循环以控制反应温度；包括进料口、内层反应柱、砂芯片、调节活塞旋钮、引流管以及外层夹套进出水口；取经过离心的黄水和乙醇(95％)体积比1：1混合均匀后抽滤取滤液备用；将1g权利要求1中得到的固定化酶装填入上述反应柱中，进料体积空速0.01-0.2min-1之间，46-54℃下连续反应20-40min，流出酯化液，连续化催化黄水酯化实现高值化利用，得到高附加值的黄水酯化液。
所述的GC-MS检测酯化液组分前处理方法为顶空固相微萃取：取20mL顶空瓶放入转子，加入5mL样品溶液，盖紧瓶塞，55℃水浴磁力搅拌预热15min；将固相微萃取头插入气相色谱质谱联用仪进样口老化15min，老化温度250℃；将经过老化的萃取头插入顶空瓶距离液面1.5cm处，55℃水浴磁力搅拌吸附40min，进样口脱附15min，进样口温度250℃。进行色谱分离、质谱检测。
本发明所述质量体积比“W/V”或“m/V”表示每单位体积中质量，所述质量体积比的单位为g/mL。
本发明的实质性特点为：
该技术将脂肪酶AOL成功固定在树脂上，解决了脂肪酶AOL无法重复使用的问题，提高了脂肪酶AOL的储存稳定性，赋予其在提高黄水附加值的工业生产中更好的潜力。同时，树脂经过疏水修饰，再以此为载体固定脂肪酶AOL，使得脂肪酶发挥了界面活化作用，得到的固定化酶的酶活力是游离酶的3倍左右，成功激活了脂肪酶的活力。经过固定化脂肪酶AOL催化的黄水酯化液中有机酸消耗在70％左右，己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯的总酯浓度能够达到3.976g/L，是黄水原液中己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯的总酯浓度1.293g/L的3倍。此外，固定化酶的制备条件温和，固定化酶用于填充柱反应器连续化催化黄水酯化实现高值化利用，且反应周期短、酯产率高，非常适合应用于工业生产。
本发明的有益效果是：
1.本发明所用的载体经过疏水修饰，使脂肪酶很好的发挥了界面活化作用，疏水性载体的接触角在120°左右(见附图1)，未经疏水修饰的树脂接触角<90°。
2.本发明所得固定化酶制备条件温和，便于操作。
3.发明所得的固定化酶对高温有很好的耐受性。固定化酶在70℃高温下孵育90min后，仍能保持初始酶活的14.41％，而游离酶在70℃高温下浸泡30min后，活性仅为初始活性的1.30％。
4.发明所得的固定化酶有较好的耐酸稳定性。固定化酶在pH＝2.5的环境下孵育5h后，仍能保持初始酶活的38.87％，而游离酶在pH＝2.5的环境下孵育3h后，活性仅为初始活性的24.66％。
5.本发明得到的固定化重复使用稳定性较高，在重复催化反应10次后仍能保持40％左右的初始酶活，本发明制备的固定化酶增加了其工业应用价值，降低了平均批次成本投入。
6.本发明得到的固定化酶贮藏稳定性较好，在4℃下储存28天以后活性仍然能保持在初始酶活的62.17％。
7.本发明得到的固定化酶填充入反应柱后，连续催化黄水中有机酸和乙醇酯化反应48h，反应器仍能保留60％的催化酯化反应活性。
8.本发明反应主要涉及水相，安全无污染，可实现连续反应，反应周期短，酯得率高(见附图3)，可应用于工业生产。
附图说明
图1为实施例1中未经DC1-2577涂覆LX-1000HA树脂和制得的SH LX-1000HA树脂接触角照片。
图2为实施例1中对固定化酶进行的荧光显微镜和热重表征图。
图3为实施例4中GC-MS检测色谱图。
图4为实施例2中所得固定化脂肪酶AOL的条件优化图。
图5为实施例4中所得酯化液的条件优化图。
图6为实施例6中所得酯化液的条件优化图。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
本发明所用的脂肪酶AOL购自于默克生命科学Sigma Aldrich。
本发明所用的LX-1000HA型树脂购自于西安蓝晓科技新材料股份有限公司。
本发明所用的有机硅胶DC1-2577购自于东莞市松克新材料科技有限公司。
本发明所用的无水乙醇购自于上海吉至生化科技有限公司。
本发明所用的黄水为某浓香型白酒酿造黄水；其他试剂均为分析纯。
本发明所述柠檬酸盐盐缓冲溶液(CPBS)：0.1moL/L柠檬酸溶液和0.1moL/L柠檬酸钠溶液按照体积比33:17混合而成；
本发明所用的电子天平购自于北京赛多利斯科学仪器有限公司。
本发明所用的超声清洗仪购自于湖北鼎泰恒胜科技设备有限公司。
本发明所用的真空干燥箱购自于上海一恒科学仪器有限公司。
本发明所用的磁力加热搅拌器购自于江苏金怡仪器科技有限公司。
本发明所用的高速冷冻离心机购自于长沙市高新技术开发区湘仪离心机仪器有限公司。
本发明所用的气相色谱质谱联用仪购自于美国赛默飞世尔科技。
实施例1
将10g LX-1000HA型树脂加入到50mL磷酸缓冲溶液(PB)中，容器为100mL烧杯，25℃下磁力搅拌活化1h，过滤并用去离子水清洗3次，回收树脂。将100μL的DC1-2577和4900μL的正己烷按照体积比(V/V)1：49的比例混溶，即将DC1-2577稀释50倍。将500mg经过活化的LX-1000HA型树脂按照质量体积比(m/V)1：10加入到5mL上述的有机硅溶液中，超声处理10min，过滤回收树脂，并置于真空干燥箱中真空干燥12h，以上操作均在室温下进行。以此得到固定化酶载体，记作SH LX-1000HA树脂。将未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂和制得的SH LX-1000HA树脂进行接触角测定，结果见附图1，可以看到：未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂接触角<90°，而SH LX-1000HA树脂接触角>90°，疏水修饰效果比较显著，符合脂肪酶表现界面活化作用的条件。(图1中，图1(a)为LX-1000HA树脂接触角，图1(b)为经DC1-2577涂覆的SH LX-1000HA树脂接触角)
称取50mg SH LX-1000HA树脂按照质量体积比(m/V)1：20加入到1mL柠檬酸盐缓冲液(CPBS)中，搅拌使其均匀分散，然后加入20-35μL脂肪酶AOL酶液，25℃下磁力搅拌4h，抽滤回收树脂，去离子水清洗一次，真空干燥1h。所得产品即为固定化脂肪酶AOL，记作AOL@SHLX-1000HA，于4℃下保存待用。
对得到的固定化酶进行表征分析，包括荧光显微镜和热重分析仪，见附图2(其中，图2(a)为AOL/SH LX-1000HA荧光显微镜图，左上角为SH LX-1000HA荧光显微镜图，图2(b)为SH LX-1000HA和AOL/SH LX-1000HA的热重失重图)。可以看到：固定化酶上有被过异硫氰酸荧光素(FITC)标记过的脂肪酶AOL显示的绿色荧光，直接证明其被成功固定在SH LX-1000HA树脂表面；热重失重图显示在200-350℃区间内有明显的失重，这是由于酶蛋白的热分解造成的，也间接证明脂肪酶AOL成功被固定在SH LX-1000HA树脂表面。
将其运用于三油酸甘油酯水解产生油酸的反应中(三油酸甘油酯水解产生油酸的测定方法：配制0.5％的吐温-80正己烷溶液，取2mL，加入800uL三油酸甘油酯，37℃预热5min；加入一定量的固定化酶，记1号，加入等量的树脂记2号，37℃搅拌反应5min；分别取0.5mL反应液于2.5mL苯内，并加入1mL5％(w/v)且用吡啶调节pH＝6的醋酸铜溶液，萃取5min；取上层有机相在715nm下测定吸光值。根据油酸浓度标准曲线计算生成油酸的量，表示酶活力)。
通过分光光度计测量反应前后体系吸光值变化进一步根据标准曲线计算油酸的浓度变化，以此来表示固定化脂肪酶的活力。在此条件下制得的固定化脂肪酶重复使用十次之后活性保持初始活性的32.75％，具有良好的重复使用稳定性，克服了游离脂肪酶无法重复使用的缺点，可以大幅度降低工业应用成本。
实施例2
将10g LX-1000HA型树脂加入到50mL磷酸缓冲溶液(PB)中，容器为100mL烧杯，25℃下磁力搅拌活化1h，过滤并用去离子水清洗3次，回收树脂。将100μL的DC1-2577和4900μL的正己烷按照体积比(V/V)1：49的比例混溶，即将DC1-2577稀释50倍。将500mg经过活化的LX-1000HA型树脂按照质量体积比(m/V)1：10加入到5mL上述的有机硅溶液中，超声处理10min，过滤回收树脂，并置于真空干燥箱中真空干燥12h，以上操作均在室温下进行。以此得到固定化酶载体，记作SH LX-1000HA树脂。将未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂和制得的SH LX-1000HA树脂进行接触角测定，可以看到：未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂接触角<90°，而SH LX-1000HA树脂接触角>90°，疏水修饰效果比较显著，符合脂肪酶表现界面活化作用的条件。
称取50mg SH LX-1000HA树脂按照质量体积比(m/V)1：20加入到1mL柠檬酸盐缓冲液(CPBS)中，搅拌使其均匀分散，然后加入30μL脂肪酶AOL酶液，25-40℃下磁力搅拌5h，抽滤回收树脂，去离子水清洗一次，真空干燥1h。所得产品即为固定化脂肪酶AOL，记作AOL@SHLX-1000HA，于4℃下保存待用。(表征方法同实施例1)
将所得的催化剂用于实例1相同反应，固定化脂肪酶的初始活力是实例1的127.51％，固定化脂肪酶重复使用十次之后活性保持初始活性的40.51％，具有良好的重复使用稳定性，克服了游离脂肪酶无法重复使用的缺点，可以大幅度降低工业应用成本。且无论是初始活力还是重复使用稳定性都较实施例1有所提升。
图4为实施例2中所得固定化脂肪酶AOL的条件优化图，其为最优条件下制备的固定化酶；其中图4(a)为固定化时间对合成AOL@SH LX-1000HA活力的影响，图4(b)为反应体系大小对合成AOL@SH LX-1000HA活力的影响，图4(c)为固定化温度对合成AOL@SH LX-1000HA活力的影响，图4(d)为脂肪酶AOL添加量对合成AOL@SH LX-1000HA活力的影响，图4(f)为固定化pH对合成AOL@SH LX-1000HA活力的影响，图4(e)为游离AOL和AOL@SH LX-1000HA的酶活力比较。
实施例3
将10g LX-1000HA型树脂加入到50mL磷酸缓冲溶液(PB)中，容器为100mL烧杯，25℃下磁力搅拌活化1h，过滤并用去离子水清洗3次，回收树脂。将100μL的DC1-2577和4900μL的正己烷按照体积比(V/V)1：49的比例混溶，即将DC1-2577稀释50倍。将500mg经过活化的LX-1000HA型树脂按照质量体积比(m/V)1：10加入到5mL上述的有机硅溶液中，超声处理10min，过滤回收树脂，并置于真空干燥箱中真空干燥12h，以上操作均在室温下进行。以此得到固定化酶载体，记作SH LX-1000HA树脂。将未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂和制得的SH LX-1000HA树脂进行接触角测定，可以看到：未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂接触角<90°，而SH LX-1000HA树脂接触角>90°，疏水修饰效果比较显著，符合脂肪酶表现界面活化作用的条件。
称取50mg SH LX-1000HA树脂按照质量体积比(m/V)1：20加入到1mL柠檬酸盐缓冲液(CPBS)中，搅拌使其均匀分散，然后加入30μL脂肪酶AOL酶液，30℃下磁力搅拌5h，抽滤回收树脂，去离子水清洗一次，真空干燥1h。所得产品即为固定化脂肪酶AOL，记作AOL@SH LX-1000HA，于4℃下保存待用。
(表征方法同实施例1)
黄水前处理方法：将黄水置于离心机中8000r/min离心10min，取上清保存备用。将所得催化剂用于催化黄水中有机酸和乙醇的反应：按照体积比黄水：乙醇(95％)＝1：0.75-1.50得到黄水和乙醇的混合液，抽滤取滤液作为底物备用，45℃下水浴预热5min，按照质量体积比(m/V)1：40称取50mg所得催化剂加入到2mL上述预热好的上清混合液中，45℃下150r/min水浴磁力搅拌30min得到黄水酯化液。
使用乙醇和硝酸铈铵(CAN)反应显色的原理检测酯化液中乙醇浓度变化(称取20gCAN溶于100mL4moL/L的HNO3溶液，室温避光保存，以此作为显色剂；取一定体积的酯化液，加入0.4mL显色剂，涡旋20s，静置1min，在480nm下测定吸光值，根据乙醇浓度标准曲线计算乙醇消耗量，以此来表示酯化液酯化效果)。
实施例4
将10g LX-1000HA型树脂加入到50mL磷酸缓冲溶液(PB)中，容器为100mL烧杯，25℃下磁力搅拌活化1h，过滤并用去离子水清洗3次，回收树脂。将100μL的DC1-2577和4900μL的正己烷按照体积比(V/V)1：49的比例混溶，即将DC1-2577稀释50倍。将500mg经过活化的LX-1000HA型树脂按照质量体积比(m/V)1：10加入到5mL上述的有机硅溶液中，超声处理10min，过滤回收树脂，并置于真空干燥箱中真空干燥12h，以上操作均在室温下进行。以此得到固定化酶载体，记作SH LX-1000HA树脂。将未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂和制得的SH LX-1000HA树脂进行接触角测定(附图1)，可以看到：未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂接触角<90°，而SH LX-1000HA树脂接触角>90°，疏水修饰效果比较显著，符合脂肪酶表现界面活化作用的条件。
称取50mg SH LX-1000HA树脂按照质量体积比(m/V)1：20加入到1mL柠檬酸盐缓冲液(CPBS)中，搅拌使其均匀分散，然后加入30μL脂肪酶AOL酶液，30℃下磁力搅拌5h，抽滤回收树脂，去离子水清洗一次，真空干燥1h。所得产品即为固定化脂肪酶AOL，记作AOL@SH LX-1000HA，于4℃下保存待用。
(表征方法同实施例1)
黄水前处理方法：将黄水置于离心机中8000r/min离心10min，取上清保存备用。将所得催化剂用于催化黄水中有机酸和乙醇的反应：按照体积比黄水：乙醇(95％)＝1：1得到黄水和乙醇的混合液，抽滤取滤液作为底物备用，45-55℃下水浴预热5min，按照质量体积比(m/V)1：40称取50mg所得催化剂加入到2mL上述预热好的上清混合液中，45-55℃下150r/min水浴磁力搅拌20-50min得到黄水酯化液，记作1号酯化液。
使用乙醇和硝酸铈铵(CAN)反应显色的原理检测酯化液中乙醇浓度变化(称取20gCAN溶于100mL4moL/L的HNO3溶液，室温避光保存，以此作为显色剂；取一定体积的酯化液，加入0.4mL显色剂，涡旋20s，静置1min，在480nm下测定吸光值，根据乙醇浓度标准曲线计算乙醇消耗量，以此来表示酯化液酯化效果)。
将黄水原料液和1号酯化液进行GC-MS检测得色谱图(附图3，，其中图3(a)为黄水原液色谱图，图3(b)为黄水酯化液色谱图；1-8分别乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸乙酯、己酸、己酸乙酯、辛酸乙酯和庚酸乙酯)，通过内标法计算各成分浓度(附表1)，可以看到：己酸和丁酸浓度大大降低，乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯含量有所提高，己酸乙酯浓度大大提高，乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯的总酯浓度由黄水原液的1.293g/L增长到黄水酯化液的3.976g/L，酯得率较实施例3有所提高。
图5为实施例4中所得酯化液的条件优化图，其为最优条件下制备的酯化液；其中图5(a)为催化时间对黄水中总有机酸转化的影响，图5(b)为催化温度对黄水中总有机酸转化的影响，图5(c)为游离AOL和AOL@SH LX-1000HA的添加量对黄水中总有机酸转化的影响，图5(d)为底物体积比对黄水中总有机酸转化的影响。
实施例5
将10g LX-1000HA型树脂加入到50mL磷酸缓冲溶液(PB)中，容器为100mL烧杯，25℃下磁力搅拌活化1h，过滤并用去离子水清洗3次，回收树脂。将100μL的DC1-2577和4900μL的正己烷按照体积比(V/V)1：49的比例混溶，即将DC1-2577稀释50倍。将500mg经过活化的LX-1000HA型树脂按照质量体积比(m/V)1：10加入到5mL上述的有机硅溶液中，超声处理10min，过滤回收树脂，并置于真空干燥箱中真空干燥12h，以上操作均在室温下进行。以此得到固定化酶载体，记作SH LX-1000HA树脂。将未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂和制得的SH LX-1000HA树脂进行接触角测定，可以看到：未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂接触角<90°，而SH LX-1000HA树脂接触角>90°，疏水修饰效果比较显著，符合脂肪酶表现界面活化作用的条件。
称取50mg SH LX-1000HA树脂按照质量体积比(m/V)1：20加入到1mL柠檬酸盐缓冲液(CPBS)中，搅拌使其均匀分散，然后加入30μL脂肪酶AOL酶液，30℃下磁力搅拌5h，抽滤回收树脂，去离子水清洗一次，真空干燥1h。所得产品即为固定化脂肪酶AOL，记作AOL@SH LX-1000HA，于4℃下保存待用。
(表征方法同实施例1)
黄水前处理方法：将黄水置于离心机中8000r/min离心10min，取上清保存备用。将所得催化剂用于连续催化黄水中有机酸和乙醇的反应：按照体积比黄水：乙醇(95％)＝1：1得到黄水和乙醇的混合液，抽滤取滤液作为底物备用；称取1g所得催化剂填充入圆柱形玻璃反应器(直径10mm，高度150mm)中，将上述底物缓慢进料至反应柱中，50℃下预热5min；进料体积空速为0.2min-1，46-54℃下连续反应20-40min，流出酯化液，通过GC-MS技术检测酯化液中组分，得到高附加值的黄水酯化液。通过硝酸铈铵显色法检测酯化液，黄水中总有机酸消耗达到56.42％。
实施例6
将10g LX-1000HA型树脂加入到50mL磷酸缓冲溶液(PB)中，容器为100mL烧杯，25℃下磁力搅拌活化1h，过滤并用去离子水清洗3次，回收树脂。将100μL的DC1-2577和4900μL的正己烷按照体积比(V/V)1：49的比例混溶，即将DC1-2577稀释50倍。将500mg经过活化的LX-1000HA型树脂按照质量体积比(m/V)1：10加入到5mL上述的有机硅溶液中，超声处理10min，过滤回收树脂，并置于真空干燥箱中真空干燥12h，以上操作均在室温下进行。以此得到固定化酶载体，记作SH LX-1000HA树脂。将未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂和制得的SH LX-1000HA树脂进行接触角测定，可以看到：未经DC1-2577涂覆的LX-1000HA树脂接触角<90°，而SH LX-1000HA树脂接触角>90°，疏水修饰效果比较显著，符合脂肪酶表现界面活化作用的条件。
称取50mg SH LX-1000HA树脂按照质量体积比(m/V)1：20加入到1mL柠檬酸盐缓冲液(CPBS)中，搅拌使其均匀分散，然后加入30μL脂肪酶AOL酶液，30℃下磁力搅拌5h，抽滤回收树脂，去离子水清洗一次，真空干燥1h。所得产品即为固定化脂肪酶AOL，记作AOL@SH LX-1000HA，于4℃下保存待用。
(表征方法同实施例1)
黄水前处理方法：将黄水置于离心机中8000r/min离心10min，取上清保存备用。将所得催化剂用于连续催化黄水中有机酸和乙醇的反应：按照体积比黄水：乙醇(95％)＝1：1得到黄水和乙醇的混合液，抽滤取滤液作为底物备用；称取1g所得催化剂填充入圆柱形玻璃反应器(直径10mm，高度150mm)中，将上述底物缓慢进料至反应柱中，50℃下预热5min；进料体积空速控制在0.01-0.2min-1之间，50℃下连续反应20-40min，流出酯化液，通过GC-MS技术检测酯化液中组分，得到高附加值的黄水酯化液，记作2号酯化液。
将黄水原料液和2号酯化液进行GC-MS检测得色谱图，通过内标法计算各成分浓度(附表1)，可以看到：己酸和丁酸浓度大大降低，乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯含量有所提高，己酸乙酯浓度大大提高，乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯的总酯浓度由黄水原液的1.293g/L增长到黄水酯化液的3.369g/L，酸消耗率和酯得率较实施例5有所提高。
图6为实施例6中所得酯化液的条件优化图，其为最优条件下制备的酯化液；其中图6(a)为进料体积空速对黄水中总有机酸转化的影响，图6(b)为连续催化温度对黄水中总有机酸转化的影响，图6(c)为底物体积比对黄水中总有机酸转化的影响，图6(d)为连续催化时间对黄水中总有机酸转化的影响。
表1黄水原料液和酯化液各组分占比及浓度
Figure SMS_1
本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (10)

1.一种基于固定化酶催化的黄水利用方法，利用脂肪酶催化黄水的反应，其特征在于，所述固定化酶为固定化脂肪酶，所述固定化酶的载体为经过疏水修饰的离子交换树脂，所述黄水利用方法包括固定化酶的制备和固定化酶催化黄水反应。
2.如权利要求1所述的黄水利用方法，其特征在于，所述固定化酶的制备包括以下步骤：
步骤1：固定化酶载体表面修饰：将有机硅胶用正己烷溶液溶解稀释后，加入树脂添加到有机硅溶液中，超声处理后真空干燥，得到疏水修饰后的树脂，即固化酶载体；
步骤2：固定化酶的制备：将步骤1得到的固化酶载体加入到柠檬酸盐缓冲液CPBS中，搅拌使其均匀分散，加入脂肪酶，搅拌回收树脂，真空干燥，得到固定化酶。
3.如权利要求2所述的黄水利用方法，其特征在于，步骤1中，所述树脂为离子交换树脂。
4.如权利要求3所述的黄水利用方法，其特征在于，步骤1中，所述有机硅胶为DC1-2577；所述有机硅胶用正己烷溶液溶解稀释50-100倍；所述树脂为LX-1000HA型离子交换树脂，得到的固定化酶载体记作SH LX-1000HA树脂；超声处理条件为：22-28℃，10-20min；真空干燥条件为：室温，12h。
5.如权利要求2所述的黄水利用方法，其特征在于，步骤2中，搅拌条件为25-35℃下，3-6h；真空干燥条件为室温下1h；所述脂肪酶为脂肪酶AOL，脂肪酶和疏水修饰后的树脂与CPBS的质量体积比为：酶：疏水修饰后的树脂：CPBS＝1：2～2.5：20～50；得到的固定化酶记作AOL@SH LX-1000HA。
6.如权利要求2所述的黄水利用方法，其特征在于，步骤2中，柠檬酸缓冲溶液CPBS由以下步骤制得：分别配制0.1mol/L的柠檬酸溶液和0.1mol/L的柠檬酸钠溶液；按照体积比柠檬酸/柠檬酸钠为33:17的比例混合两种溶液，即可得到pH值4.0的柠檬酸缓冲溶液CPBS。
7.如权利要求1-6任一项所述的黄水利用方法，其特征在于，所述固定化酶催化黄水反应包括以下步骤：
步骤3：将黄水置于离心机中，取上清保存备用；
步骤4：取步骤3得到的黄水和95％的乙醇混合制备混合溶液，将混合溶液混合均匀后抽滤取滤液备用；
步骤5：将所述固定化酶加入到步骤4抽滤后的混合溶液滤液中，反应得到黄水酯化液。
8.如权利要求7所述的黄水利用方法，其特征在于，
步骤3中，离心条件为：8000r/min离心10min；
步骤4中，体积比黄水：95％乙醇＝1：0.75～1.50；
步骤5中，所述固定化酶与步骤4抽滤后的混合溶液滤液质量体积比固定化酶：反应体系＝1：40～55；
所述反应体系体积为所述混合溶液滤液的总体积；
步骤5中，反应的条件为40-50℃、150r/min下搅拌反应30-60min。
9.如权利要求7所述的黄水利用方法，其特征在于，所述固定化酶催化黄水反应为固定化酶连续催化黄水反应，步骤5中，取步骤4抽滤后的混合溶液滤液备用，将固定化酶装填入反应柱，体积比固定化酶：反应柱体积＝1：2.5-4，进料体积空速控制在0.01-0.2min-1之间，46-54℃下连续反应20-40min，流出酯化液。
10.如权利要求9所述的黄水利用方法，其特征在于，所述反应柱为圆柱形玻璃反应器，直径10mm、高度150mm，反应柱带有夹套，通过恒温水循环以控制反应温度；包括进料口、内层反应柱、砂芯片、调节活塞旋钮、引流管以及外层夹套进出水口；取经过离心的黄水和95％乙醇体积比1：1混合均匀后抽滤取滤液备用；将1g固定化酶装填入所述反应柱中，进料体积空速0.01-0.2min-1之间，46-54℃下连续反应20-40min，流出酯化液，得到黄水酯化液。
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