CN116218830A

CN116218830A - 一株高产葡萄糖异构酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN116218830A
Application number: CN202210894326.8A
Authority: CN
Inventors: 汪小杰; 冯娟; 张艺达
Original assignee: Shanghai Jikaixing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Jikaixing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-07-27
Filing date: 2022-07-27
Publication date: 2023-06-06

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种蛋白的生产方法，以及高效表达葡萄糖异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株。申请人首先将人工合成的葡萄糖异构酶基因在枯草芽孢杆菌宿主中过表达，构建得到重组表达菌株；然后以该菌株为出发菌进行紫外诱变，筛选获得一株能大幅度提高葡萄糖异构酶表达量的突变菌枯草芽孢杆菌JKX204，保藏编号为CCTCC NO:M20221172，其发酵酶活高达925.3 U/ml，比出发菌提高了约58.52%。所述突变菌株可以广泛应用于葡萄糖异构酶的生产，有利于降低该酶的生产成本，加快葡萄糖异构酶的推广应用。

Description

一株高产葡萄糖异构酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产葡萄糖异构酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

葡萄糖异构酶（Glucose isomerase, GI）也叫木糖异构酶（EC5.3.1.5），其能催化葡萄糖异构化为果糖，同时也能催化木糖异构化为木酮糖。由于果糖是饮料和食品的主要增甜剂，因此葡萄糖异构酶是最重要的工业酶之一。除此之外，戊糖和已糖也是葡萄糖异构酶良好的底物，包括D-核糖, L-阿拉伯糖, L-鼠李糖和 D-阿洛糖。GI也用于生产一些稀有糖类，这些稀有糖类在药物方面有重要应用，例如GI 能高效的催化L-阿拉伯糖变成 L-核糖, L-核糖是核苷类、糖基复合物和寡核苷类抗病毒和抗癌药物的重要组成部分。

在工业方面，GI最重要的用途是利用其催化葡萄糖变为果糖的活性，用于生产高果糖浆（HFCS）。果糖是一种天然的己酮糖,并且是已知的甜度最高的单糖，其富含于蜂蜜和水果中。果糖被预测为21世纪全球代替蔗糖、葡萄糖的新型功能性糖源。果糖可绕过糖酵解中的限速酶(磷酸果糖激酶)，在肝脏中果糖的分解速度快于葡萄糖。果糖代谢强度取决于果糖浓度，不受胰岛素的影响。因此人体摄入果糖不会引起摄入葡萄糖和蔗糖所容易引起的严重的饭后血糖高峰和低血糖等症状，消除了诱发糖尿病的潜在因素。因而是糖尿病人可以食用的健康糖。由于果糖具有低热值、保水特性、抗冻性、防腐特性、风味增强性和亲和性等特性，许多国家利用果糖来制造低能量食品、婴儿食品、病弱者食品等营养食品和疗效食品。欧美国家在糖果与饮料中基本不用蔗糖而用果糖。如加拿大法律规定，所有饮料必须使用高果糖浆作为增甜剂。据统计，2013年高果糖浆消耗量为107吨/年，是工业酶生产最多的产品，因此葡萄糖异构酶的用量也是巨大的。

目前全球的葡萄糖异构酶的生产主要由两家公司所垄断，为美国的杜邦公司和丹麦的诺维信公司。生产菌株大多数为锈棕色链霉菌（Streptomyces rubiginosus）和凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。

葡萄糖异构酶基因在原核生物中是普遍存在的，在大肠杆菌、链霉菌、乳酸菌等众多的微生物中均发现了葡萄糖异构酶基因。前期为了提高葡萄糖异构酶的表达，主要使用优化培养基的方法。前人发现在发酵培养基中加入D-木糖能提高葡萄糖异构酶的表达，但是D-木糖的添加提高了工业生产成本，后来发现添加淀粉、葡萄糖、山梨醇、甘油等能达到添加D-木糖的75%的效果。后来Bejar S等人研究发现强启动子能提高葡萄糖异构酶的表达水平，将强启动子（P1）替换葡萄糖异构酶基因原来的启动子，发现该菌株与木糖诱导的野生菌相比，葡萄糖异构酶的表达水平提高了7倍。但是葡萄糖异构酶的表达水平依然较低，不能满足工业生产的需求。因此构建具有自主知识产权的葡萄糖异构酶高产菌株，减低生产成本，实现工业化生产，迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产葡萄糖异构酶的枯草芽孢杆菌菌株，并提供了其在葡萄糖异构酶生产中的应用。申请人首先构建得到重组表达葡萄糖异构酶基因的枯草芽孢杆菌菌株，然后进一步对其进行紫外诱变，筛选获得葡萄糖异构酶产量显著提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进葡萄糖异构酶的广泛应用。

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其携带有表达葡萄糖异构酶的重组质粒。

所述葡萄糖异构酶基因序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面提供了一种突变菌株枯草芽孢杆菌JKX204（Bacillus subtilis JKX204），已于2022年7月25日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M20221172。

本发明一方面提供了所述枯草芽孢杆菌在生产葡萄糖异构酶中的应用。

本发明还提供了一种生产葡萄糖异构酶的方法，是以所述枯草芽孢杆菌为发酵菌株。

本发明还提供了一种葡萄糖异构酶，是由所述枯草芽孢杆菌发酵获得的。

有益效果

本发明首先将葡萄糖异构酶基因在枯草芽孢杆菌宿主中表达，构建得到重组表达该酶的工程菌株枯草芽孢杆菌JKX203。该菌株摇瓶发酵和15L罐发酵上清液中葡萄糖异构酶活分别达到70.2 U/mL和672.8 U/mL。

为了提高葡萄糖异构酶的产量，申请人以枯草芽孢杆菌JKX203为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌枯草芽孢杆菌JKX204。该突变菌株摇瓶发酵上清液中葡萄糖异构酶活高达110.6 U/mL，比出发菌提高的57.54%；其15 L罐发酵粗酶液中葡萄糖异构酶酶活高达1020.5U/mL，比出发菌提高了51.68%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于葡萄糖异构酶的生产，有利于降低葡萄糖异构酶的生产成本，促进该酶的应用。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌JKX203发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图。

生物材料保藏信息

突变菌株枯草芽孢杆菌JKX204（Bacillus subtilis JKX204），保藏编号为CCTCCNO: M20221172，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏时间为2022年7月25日。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

本发明实施例中所涉及的培养基的配方如下：

GM I配制方法为：1×最低盐溶液96 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母粉汁1 mL；其中1×最低盐溶液的配制方法为：K₂HPO₄ 14 g/L，KH₂PO₄ 6 g/L，(NH₄)₂SO₄ 2 g/L，柠檬酸三钠1 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.2 g/L，在蒸馏水中依次溶解；

GM II配制方法为：1×最低盐溶液97 mL，20%葡萄糖2.5 mL，5%水解酪蛋白0.08mL，10%酵母粉汁0.04 mL，1 M MgCl₂ 0.25 mL，1 M CaCl₂ 0.05 mL；

LB平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，琼脂粉1.5%；

脱脂奶粉平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，脱脂奶粉1%，琼脂粉1.5%；

种子培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K₂HPO₄ 1.8%，氯霉素5 μg/mL；

发酵培养基：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl₂0.1~0.5%，MgSO₄ 0.1~0.5%，K₂HPO₄ 0.5~2%。

实施例1 葡萄糖异构酶整合表达质粒pBE2R-GI和表达

葡萄糖异构酶的氨基酸序列为SEQID NO:2。根据SEQID NO:2的氨基酸序列，获得其优化后的核酸序列SEQID NO:1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成SEQID NO:1。使用Gibson Assembly的方法将SEQID NO:1连接到pBE2R载体上，用热激法转入大肠杆菌DH5α，提质粒进行测序确定，获得葡萄糖异构酶重组质粒pBE2R-gi。

将测序正确的重组质粒pBE2R-GI转入感受态细胞WB600中，具体转化过程如下：用枪头挑取在LB平板上生长的WB600单菌落于2 mL GMⅠ中，培养12 h；将过夜培养的菌液加到98mLGMⅠ中，37℃，200rpm培养约4 h；取10 mL菌液加入90 mLGMII中，37℃，200 rpm培养约1.5 h；菌体冰水浴30 min，4000 rpm，4℃离心30 min，去上清；加10 mL GMⅢ，混匀，即为感受态细胞WB600。然后在500 μL感受态细胞中加入5μL pBE2R-GI质粒，直接将感受态细胞置于37 ℃，200 rpm摇床培养1.5 h，低速离心3 min，弃部分上清，均匀涂布于含40 μg/mL卡那霉素的脱脂奶粉培养基平板上，37 ℃恒温培养箱培养12 h。次日平板上的单菌落即为含葡萄糖异构酶基因的重组菌株WB600/pBE2R-GI。葡萄糖异构酶枯草杆菌重组工程菌接种于5mL LB液体培养基（蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母粉0.5%）中，37℃，200 rpm振荡培养12 h，将菌液按2%的接菌量分别转接于发酵产酶培养基中，37℃，200 rpm振荡培养72 h。4000 rpm离心10 min取上清液；采用中华人民共和国国家标准葡萄糖异构酶活力的测定方法（GB23533-2009）分别测定上述菌株发酵上清液的葡萄糖异构酶酶活。

结果显示：重组菌发酵上清液中葡萄糖异构酶酶活高达10618 U/mL。申请人将该菌株命名为枯草芽孢杆菌JKX203（Bacillus subtilis JKX203）。将该菌株发酵上清液进行SDS-PAGE电泳分析。结果如图1所示，可以看到明显的葡萄糖异构酶表达条带。

实施例2 枯草芽孢杆菌JKX203 15L罐发酵验证

将枯草芽孢杆菌JKX203接种于含500mL种子培养基中，37℃、220 rpm振荡培养约12h。

将种子液全部转入15 L发酵罐（发酵罐培养基成分：玉米淀粉3%，葡萄糖1%，豆饼粉3%，麸皮3%，Na₂HPO₄ 0.78%，KH₂PO₄ 0.05%，发酵罐消后体积8 L）；温度控制37℃，发酵初始pH 7.2，发酵过程中氨水控制pH不低于7.0；风量1~1.5 vvm，转速300~1000 rpm，控制发酵过程中DO不低于10%；3~4 h后开始流加50%葡萄糖，流加速度3 g/L·h；发酵25~30 h，DO、pH均回升后停止培养。收集发酵液上清，采用中华人民共和国国家标准葡萄糖异构酶活力的测定方法（GB 1886.174-2016）测定发酵上清液的葡萄糖异构酶酶活。

结果显示，枯草芽孢杆菌JKX203菌株发酵上清液酶活高达96882 U/mL。从而说明本发明构建的重组工程菌株枯草芽孢杆菌JKX203能高效表达外源葡萄糖异构酶基因gi。

实施例3 葡萄糖异构酶高产菌株的诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以实施例1构建得到的枯草芽孢杆菌JKX203为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其葡萄糖异构酶的产量。

4.1菌悬液制备

将出发菌枯草芽孢杆菌JKX203在LB斜面上划线接种，37 ℃培养24 h；加入5 mL0.85%的无菌生理盐水，将斜面上的菌体全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中，涡旋震荡10 min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15 mL离心管，6000 rpm离心3min收集菌体，取上清，用10 mL生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至10⁸个/mL。

4.2 紫外诱变处理及诱变剂量确定

打开9 W紫外灯开关，预热约30 min；取直径9 cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为10⁸个/mL的菌悬液10 mL，加入一根无菌磁力搅拌转子，打开磁力搅拌器，打开皿盖，在垂直距离为15 cm处，分别搅拌照射0.5 min、1 min、1.5 min、2 min、2.5 min、3 min；盖上平皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30 min。

将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水梯度稀释至10^-1~10^-6；取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬液各100 μL，涂布LB平板，每个稀释度涂布三个平板；以同样的操作，取未经紫外线照射处理的菌液稀释涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置于37℃过夜培养。

统计不同照射时间下每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下长出的单菌落数在30~300个之间，则认为改稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：

菌悬液浓度（CFU/mL）=某个稀释度下的菌落平均数×稀释倍数×10

按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：

致死率（%）=（1－某剂量处理后的菌悬液浓度/处理前菌悬液浓度）×100%

经计算，不同紫外诱变剂量下枯草芽孢杆菌JKX203的致死率如表1所示。

表1 枯草芽孢杆菌JKX203紫外诱变致死率

时间/min	0.5	1	1.5	2	2.5	3
							致死率/%	85.3	95.7	98.6	99.8	99.9	99.9

从表1可以看出，菌悬液经紫外照射1 min后致死率达到95%以上，因此确定最终诱变时间为1 min。

4.3 摇瓶初筛

将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水10倍稀释法梯度稀释成10^-1~10^-6；取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬液各100 μL，涂布牛肉膏蛋白胨平板，每个稀释度涂布三个平板，用无菌玻璃棒均匀涂满整个平板表面。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置37℃过夜培养。

挑取平板上长出的单菌落，在含50 μg/mL氯霉素的牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；挑取单菌落，划线接种于含50 μg/mL氯霉素的牛肉膏蛋白胨斜面保种；共富集筛选到50株突变菌株，分别命名为GI-1、GI2、GI-3……GI-50。

将上述筛选得到的50株突变菌分别接种于50 mL摇瓶发酵培养基中，37℃，220rpm发酵培养72 h后，离心取上清液，分别测定发酵上清液中的葡萄糖异构酶酶活，同时以出发菌株作为对照，选择摇瓶发酵酶活较出发菌株提高15%以上的突变株进行第二轮紫外诱变筛选。

申请人按照上述方法继续进行了8轮紫外诱变筛选，最终获得1株葡萄糖异构酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为枯草芽孢杆菌JKX204（Bacillus subtilisJKX204）。该菌株在50 mL摇瓶发酵培养基中，37℃，220 rpm发酵培养72 h后，离心取上清液，上清液葡萄糖异构酶酶活高达110.6 U/mL，比出发菌提高的57.54%；15 L罐发酵粗酶液中葡萄糖异构酶酶活高达1020.5 U/mL，比出发菌提高了51.68%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2022年7月25日将所述突变菌株枯草芽孢杆菌JKX204（Bacillus subtilis JKX204）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M20221172。

Claims

1.一种葡萄糖异构酶，其特征在于，所述葡萄糖异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体携带有编码序列为SEQ ID NO：2的葡萄糖异构酶基因。

3.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包含权利要求1或2所述的重组表达载体。

4.一种枯草芽孢杆菌突变菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌突变菌是以权利要求3所述的枯草芽孢杆菌工程菌为出发菌，通过紫外诱变获得的。

5.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌突变菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌突变菌的保藏编号为CCTCC NO: M20221172。

6.权利要求4或5所述的枯草芽孢杆菌突变菌在生产果葡糖浆中的应用。