背景技术
伴随着年龄增长，人眼晶状体的可塑性和弹性逐渐变差，这导致人眼的调节幅度和能力均下降，近距离工作和阅读发生困难，这种生理老化现象称为老视。老视的治疗措施一般分为戴镜矫正治疗、手术治疗和药物治疗。治疗老视最理想的手段是恢复眼调节功能，但现阶段尚未发现能真正恢复眼调节的方法。手术方法可用于治疗老视，但针对角膜、巩膜或晶状体进行手术均为侵入式，患者难以接受。相比之下，传统治疗方法诸如戴老花镜和接触眼镜，容易损伤角膜、增加感染风险，多焦眼镜易引起视觉不适。因此，选择非侵入的方式，通过在眼表滴入药物溶液，具有毒性低、起效快、全身剂量少、方便施用的优点，相对于其他治疗手段突出了优势。
目前老视治疗药有两类：一是增强调节能力的副交感神经激动剂，如卡巴胆碱、匹罗卡品可刺激睫状肌收缩，增加睫状肌收缩力；二是降低晶状体硬度、恢复晶状体弹性的硫辛酸。
老视的发生机制与晶状体相关，随着年龄增加，晶状体形状和理化性质发生改变，晶状体囊膜弹性下降，调节变凸的能力变差。因此，恢复晶状体固有弹性成为治疗老视的新靶点。研究结果表明，晶状体内抗氧化物质谷胱甘肽的浓度随老化的发展而逐渐降低，无法还原由晶状体因氧化产生的硫化物，造成晶状体纤维紊乱、弹性降低。α硫辛酸是一种外源性抗氧化剂，可被谷胱甘肽还原酶及硫氧蛋白还原酶还原成有效的抗氧化剂——二氢硫辛酸以清除活性氧及含氮物质，减少晶状体蛋白质二硫键，降低晶状体硬度，使晶状体恢复弹性。与α硫辛酸类似，熊去氧胆酸也因为具有抗氧化能力[Ursodeoxycholic Acid ProtectsHepatocytes against Oxidative Injury via Induction of Antioxidants,Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999, 263(2), 537-542]，成为老视治疗的新候选药物。
由于人眼存在多种抵御外源性物质的机制，包括眨眼对药物滴眼液的引流、泪液稀释、眼部滞留时间短、角膜和结膜屏障，这些机制成为药物进入眼内发挥疗效的障碍。增加眼部药物吸收的常规手段，包含使用渗透促进剂增加药物跨角膜转运能力、使用增粘剂或具有粘膜粘附能力的聚合物，最大限度地减少眼表药物的流失。目前主流的策略是研发新型、有效的药物递送系统。
脂质体是一类由磷脂分子组成的双层脂质囊泡，尺寸处于10 nm至10 μm之间，这种以水性环境为核心的脂质双层结构可装载亲水或亲脂性药物：亲水性药物溶解于内水相，亲脂性药物则分布于由磷脂分子疏水链结构形成的双分子层。此外，脂质体具有耐受性良好、增加药物眼表滞留时间、给药后持续释放药物、适度增加药物渗透的能力等优点，在眼部疾病治疗方面得到了重视。根据文献报道的脂质体制备常规方法，本发明进行了前期预实验，制备了熊去氧胆酸脂质体，进行了体外抗老视研究，没有获得理想的效果。
中国专利已公开了“含有熊去氧胆酸的老视的治疗或预防剂”(CN201980081377.5)，保护了含有熊去氧胆酸的眼用制剂，但在权利要求书和所有实施例中，都使用了丙酮酸乙酯，专利并未阐明该辅料的作用机制以及安全性，仅仅用眼部刺激性实验并不能证明该辅料的全身安全性。丙酮酸乙酯（分子式为CH3COCOOC2H5）是内源性物质丙酮酸的酯化物，与丙酮酸药理作用一致，也是一种有效的活性氧 (reactive oxygenspecies，ROS) 清除剂与抗氧剂(Fink M P, Ethyl pyruvate: a novel anti-inflammatory agent. J Intern Med, 2007, 261:349-362)，具有亲脂性且性质稳定。该辅料原本作为一种工业原料以及食品添加剂而被广泛应用，而后作为丙酮酸的替代物用于动物实验。很多文献报道了丙酮酸乙酯具有多种药理活性，包括心肌缺血再灌注损伤保护、抗肿瘤、抗脓毒症、抗炎等，其核心的药理——抗氧化与抗炎作用，与熊去氧胆酸相同，通过该专利无法判定单独给予熊去氧胆酸滴眼液是否有效抑制老视的发展，此外，丙酮酸乙酯与熊去氧胆酸是否存在药理作用协同还是简单相加，还需要后续的进一步研究深入探讨。
本发明创造性的发明一种仅仅使用熊去氧胆酸或其衍生物作为活性成分的脂质组合物，发挥明显抗老视功效。本发明使用的所有辅料都是临床上成熟应用的，这有利于保障本组合物眼部应用时的安全性。
发明内容
本发明使用的材料如下：阿尔法环糊精，α-Cyclodextrin，分子式为C36H60O30，CAS号为[10016-20-3]；倍他环糊精，β-Cyclodextrin，分子式为C42H70O35，CAS号为[7585-39-9]；甲基倍他环糊精，Methyl-β-cyclodextrin，分子式为C42H70-nO35·(CH3)n（n为取代度），CAS 号为[128446-36-6]；羟丙基倍他环糊精，2-Hydropropyl-β-cyclodextrin，分子式为C42H70-nO35·(C3H7O)n（n为取代度），CAS号为[128446-35-5]；磺丁基倍他环糊精钠，Sulfobutylether β-Cyclodextrin，C42H70–nO35·(C4H8SO3Na)n（n为取代度），CAS号为[1824100-00-0]；伽马环糊精，γ-Cyclodextrin，分子式为C48H80O40，CAS号为[17465-86-0]。
本发明所述的熊去氧胆酸脂质组合物，含有熊去氧胆酸或其衍生物、环糊精、磷脂、胆固醇、注射用水和药学可接受的其他功能辅料。
本发明所述的熊去氧胆酸脂质组合物，其中熊去氧胆酸为3α-7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，其分子式为C24H40O4，其CAS号为[128-13-2]；熊去氧胆酸的衍生物为牛磺熊去氧胆酸（3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸），分子式为C26H45NO6S，CAS号为[14605-22-2]。
本发明所述的磷脂是生物膜的主要成分，其来源包含2种：一是从大豆、蛋黄中提取，也称为大豆磷脂或蛋黄磷脂，是天然来源的脂质分子；二是通过有机合成或发酵制得，也称为（人工）合成磷脂。在本发明中磷脂是脂质组合物的关键骨架分子。
本发明所述的磷脂选自饱和磷脂，是氢化大豆磷脂或合成的脂肪酰磷脂酰胆碱中的一种，具体种类为氢化大豆磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二芥酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱其中的一种。
本发明所述的环糊精为淀粉经酶解得到吡喃葡萄糖分子，再通过α-1,4-糖苷键连接成环，具有疏水空腔和亲水外壁的中空圆台状立体结构。本发明所述的环糊精，具体选自阿尔法环糊精、倍他环糊精、甲基倍他环糊精（取代度5~14）、羟丙基倍他环糊精（取代度0.4~1.8）、磺丁基倍他环糊精钠（取代度6~7）、伽马环糊精中的一种。
本发明所述的熊去氧胆酸脂质组合物中，熊去氧胆酸或其衍生物与环糊精的投料质量比为1:3-1:20，熊去氧胆酸或其衍生物与磷脂的投料质量比为1:3~1:10，磷脂与胆固醇的投料质量比为5:1-20:1。
本发明所述的熊去氧胆酸脂质组合物，还包含其他药学可接受的功能辅料，具体为渗透压调节剂、pH调节剂。
渗透压调节剂用于调节组合物的渗透压为等渗，减少因渗透压不平衡而引起的眼部不适。本发明使用的渗透压调节剂，具体选自甘露醇、蔗糖、葡萄糖、氯化钠、海藻糖、乳糖、磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐、碳酸盐其中的一种。
本发明所述的药学可接受的pH调节剂，用于调节组合物的pH值接近中性，降低pH引起眼部不适，具体选自盐酸、氢氧化钠其中的一种。
本发明所述的熊去氧胆酸脂质组合物，其制备方法如下：
称取适量熊去氧胆酸或牛磺熊去氧胆酸、环糊精，加入适量注射用水，搅拌2小时，形成包合物溶液，作为溶液I。称取适量熊去氧胆酸或牛磺熊去氧胆酸、磷脂、胆固醇，溶于适量氯仿甲醇混合溶剂，摇匀，于室温条件下，旋转蒸发2小时，除去有机溶剂，铺成均一的薄膜，加入溶液I，水化，于室温条件下振荡孵育4小时，用探头超声或高压均质工艺调整混悬体系的粒径，用微孔滤膜过滤整粒，即得脂质混悬液。测定渗透压，根据渗透压结果，加入适量的渗透压调节剂调节等渗，并用稀盐酸或稀氢氧化钠溶液调节pH值至7.0-7.5，使用微孔滤膜过滤，灌装于西林瓶中，于低温避光环境贮存。
本发明所述的熊去氧胆酸脂质组合物，使用动态光散射仪或激光粒度仪，测定平均粒径为80-600 nm。
本发明所述的熊去氧胆酸脂质组合物，用于治疗老视或者延缓老视的发展。
本发明所述的熊去氧胆酸脂质组合物，应用方法为眼部滴入，每天给药1-3次。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：将熊去氧胆酸或其衍生物分别包裹于环糊精包合物内腔和脂质双分子层内，制得脂质组合物可有效提高老年小鼠晶状体弹性；使用药学常规的注射剂辅料，具有等渗、中性特征，对眼部刺激性低，安全性良好，适合用于长期治疗。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围内。
本发明前期制备若干种包载熊去氧胆酸的脂质体配方，并进行体内外初步研究，测定结果表明，普通脂质体并不能提供显著的抗老视功效，进一步探索，发现当加入环糊精，脂质体产生明显抗老视功效。在此发现的基础上，设计一系列的实验，具体如下：
1.环糊精用量的考察
选择氢化大豆磷脂酰胆碱和胆固醇为基础脂材，筛选若干种环糊精材料，制备脂质组合物，环糊精种类具体包括阿尔法(α)环糊精、倍他(β)环糊精或其衍生物（甲基倍他环糊精、羟丙基倍他环糊精、磺丁基倍他环糊精钠）、伽马(γ)环糊精，制备熊去氧胆酸的脂质组合物。
采用薄膜水化二步法制备脂质组合物。采用老年小鼠作为老视疾病模型，滴加脂质组合物入鼠眼内，测定小鼠晶状体弹性的变化，作为抗老视功效的量化指标，根据抗老视功效结果对比，筛选出环糊精用量范围。
| 实施例1 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 注射用水 |
100份 |
| 实施例2 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 倍他环糊精 |
0.625份 |
| 注射用水 |
100份 |
| 实施例3 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 倍他环糊精 |
0.75份 |
| 注射用水 |
100份 |
| 实施例4 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 倍他环糊精 |
1.25份 |
| 注射用水 |
99份 |
| 实施例5 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 倍他环糊精 |
2.5份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例6 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 倍他环糊精 |
3.75份 |
| 注射用水 |
96份 |
| 实施例7 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 倍他环糊精 |
5份 |
| 注射用水 |
95份 |
| 实施例8 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 倍他环糊精 |
5.5份 |
| 注射用水 |
95份 |
| 实施例9 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 倍他环糊精 |
5.5份 |
| 注射用水 |
95份 |
实施例1-9组合物制备方法：按上述表格处方称取适量（0.2~0.23份）熊去氧胆酸、倍他环糊精，加入适量的注射用水，搅拌2小时，形成包合物溶液I。按上述表格处方称取剩余量的熊去氧胆酸、氢化大豆磷脂酰胆碱和胆固醇，溶于适量氯仿甲醇混合溶剂形成溶液，于室温旋转蒸发2小时，除去有机溶剂，铺成均一的薄膜，加入包合物溶液I，水化，于室温条件下振荡孵育4小时，将水化后的混悬液置冰水浴环境，使用探头超声处理7分钟（功率设定为300W），用微孔滤膜过滤整粒，即得脂质混悬液测定渗透压，加入适量的甘露醇，调节等渗，并用稀盐酸/稀氢氧化钠溶液调节各实施例的pH值均为7.0-7.5，使用微孔滤膜过滤，灌装于西林瓶中，于低温避光环境贮存，备用。使用动态光散射仪测定实施例组合物的平均粒径和多分散系数。
选择老年小鼠制备老视疾病动物模型，将样品滴入眼内，测定小鼠晶状体直径变化，作为抗老视功效的指标。具体给药方法如下：
选择8个月龄的C57BL/6J小鼠，随机分为10组，包括9个脂质组合物组（实施例1-9），外加空白组（0.9%氯化钠注射液）。使用自动移液器按照2.5μL/眼的剂量，将各受试试样以每天3次的频率滴入鼠的右眼，连续给药14天。
晶状体弹性提高量的测定方法：在最后一次滴眼给药后，将小鼠安乐死，摘右眼球，用加有适量抗菌剂的Hank′s平衡盐溶液（简称HBSS溶剂）冲洗。用剃刀将视神经附近的巩膜切开，摘出晶状体浸泡于HBSS中。取出晶状体置于载玻片上，使用高分辨率取景器拍照，获取晶状体的图像（图像a）。然后，取1片盖玻片（康宁，长×宽=22×22 mm）放置在晶状体上，重复取景拍照，获取因加载了盖玻片使晶状体变厚的图像（图像b）。保存图像文件，用Photoshop软件测定图像文件中晶状体直径。由计算式1计算出晶状体直径的变化量，再由计算式2计算出与空白组比较，各受试样品的晶状体弹性提高量。
计算式1：
晶状体直径的变化量＝各受试样品的图像b的晶状体直径－各受试样品的图像a的晶状体直径
计算式2：
各试样组的晶状体弹性增加量＝各受试样品组的晶状体直径的变化量的平均值－空白组的晶状体直径变化量的平均值
测定结果如下表所示：
| 序号 |
平均粒径(nm) |
多分散系数 |
晶状体弹性增加量(μm) |
| 实施例1 |
636.7 |
0.238 |
4.9 |
| 实施例2 |
516.8 |
0.204 |
11.6 |
| 实施例3 |
383.4 |
0.171 |
15.4 |
| 实施例4 |
320.1 |
0.135 |
18.3 |
| 实施例5 |
126.2 |
0.192 |
20.6 |
| 实施例6 |
227.8 |
0.164 |
21.0 |
| 实施例7 |
339.4 |
0.181 |
28.8 |
| 实施例8 |
253.0 |
0.143 |
5.2 |
| 实施例9 |
46.5 |
0.155 |
4.5 |
熊去氧胆酸脂质组合物（实施例3-7）明显提高老年小鼠的晶状体弹性，呈现出良好的抗老视功效。相比于实施例3-7，更低的熊去氧胆酸-倍他环糊精的投料质量比1:2.5（实施例2）以及更高的投料质量比1:22（实施例8），抗老视功效均明显降低。
| 实施例10 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 甲基倍他环糊精 |
2.5份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例11 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 甲基倍他环糊精 |
3份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例12 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 甲基倍他环糊精 |
5份 |
| 注射用水 |
95份 |
| 实施例13 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 甲基倍他环糊精 |
10份 |
| 注射用水 |
90份 |
| 实施例14 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 甲基倍他环糊精 |
15份 |
| 注射用水 |
85份 |
| 实施例15 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 甲基倍他环糊精 |
20份 |
| 注射用水 |
80份 |
| 实施例16 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 甲基倍他环糊精 |
22份 |
| 注射用水 |
78份 |
| 实施例17 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 甲基倍他环糊精 |
22份 |
| 注射用水 |
78份 |
实施例10-17组合物制备方法：按上述表格处方称取适量（0.3~0.7份）熊去氧胆酸、甲基倍他环糊精，加入适量的注射用水，搅拌2小时，形成包合物溶液I。
按上述表格处方称取剩余量的熊去氧胆酸、氢化大豆磷脂酰胆碱和胆固醇，溶于适量氯仿甲醇混合溶剂形成溶液，于室温旋转蒸发2小时，除去有机溶剂，铺成均一的薄膜，加入包合物溶液I，水化，于室温条件下振荡孵育4小时，将水化后的混悬液置冰水浴环境，使用探头超声处理7分钟（功率设定为300W），用微孔滤膜过滤整粒，即得脂质混悬液。测定渗透压，加入适量的甘露醇，调节等渗，并用稀盐酸/稀氢氧化钠溶液调节各实施例的pH值均为7.0-7.5，使用微孔滤膜过滤，灌装于西林瓶中，于低温避光环境贮存，备用。
采用动态光散射仪测定各实施例组合物的平均粒径和多分散系数。按照上述动物实验方法测定老年小鼠的晶状体直径并计算晶状体弹性增加量。测定结果如下表所示：
| 序号 |
平均粒径(nm) |
多分散系数 |
晶状体弹性增加量(μm) |
| 实施例10 |
512.6 |
0.227 |
13.6 |
| 实施例11 |
244.0 |
0.149 |
24.5 |
| 实施例12 |
380.7 |
0.164 |
34.7 |
| 实施例13 |
524.1 |
0.215 |
29.5 |
| 实施例14 |
250.5 |
0.140 |
36.5 |
| 实施例15 |
142.0 |
0.153 |
30.3 |
| 实施例16 |
348.8 |
0.202 |
15.2 |
| 实施例17 |
56.3 |
0.190 |
16.9 |
熊去氧胆酸脂质组合物（实施例11-15）明显提高老年小鼠的晶状体弹性，呈现出良好的抗老视功效；与实施例11-15相比较，更低的熊去氧胆酸-甲基倍他环糊精的投料质量比1:2.5（实施例10），以及更高的投料质量比1:22（实施例16），抗老视功效均明显降低。
| 实施例18 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
2.5份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例19 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
3份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例20 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
5份 |
| 注射用水 |
95份 |
| 实施例21 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
10份 |
| 注射用水 |
90份 |
| 实施例22 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
15份 |
| 注射用水 |
85份 |
| 实施例23 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
20份 |
| 注射用水 |
80份 |
| 实施例24 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
22份 |
| 注射用水 |
78份 |
| 实施例25 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
22份 |
| 注射用水 |
78份 |
实施例18-25组合物制备方法：按上述表格处方称取适量（0.7~0.9份）熊去氧胆酸、氢化大豆磷脂酰胆碱和胆固醇，溶于适量氯仿甲醇混合溶剂形成溶液，于室温旋转蒸发2小时，除去有机溶剂，铺成均一的薄膜，加入注射用水，水化，将水化后的混悬液置冰水浴环境，使用探头超声处理7分钟（功率设定为300W），用微孔滤膜过滤整粒，即得脂质混悬液。按上述表格处方称取剩余量的熊去氧胆酸、羟丙基倍他环糊精，加入适量的注射用水，搅拌2小时，形成包合物溶液。
将脂质混悬液与包合物溶液混合，于室温条件下振荡孵育4小时，测定渗透压，加入适量的甘露醇，调节等渗，并用稀盐酸/稀氢氧化钠溶液调节各实施例的pH值均为7.0-7.5，使用微孔滤膜过滤，灌装于西林瓶中，于低温避光环境贮存，备用。
采用动态光散射仪测定各实施例组合物的平均粒径和多分散系数。按照上述动物实验方法测定老年小鼠的晶状体直径并计算晶状体弹性增加量。测定结果如下表所示：
| 序号 |
平均粒径(nm) |
多分散系数 |
晶状体弹性增加量(μm) |
| 实施例18 |
452.5 |
0.193 |
6.6 |
| 实施例19 |
246.3 |
0.182 |
18.5 |
| 实施例20 |
611.1 |
0.226 |
24.2 |
| 实施例21 |
199.2 |
0.170 |
26.4 |
| 实施例22 |
255.4 |
0.178 |
35.3 |
| 实施例23 |
349.7 |
0.191 |
39.7 |
| 实施例24 |
314.4 |
0.157 |
9.8 |
| 实施例25 |
74.0 |
0.212 |
11.7 |
熊去氧胆酸脂质组合物（实施例19-23）明显提高老年小鼠的晶状体弹性，呈现出良好的抗老视功效；相比于实施例19-23，更低的熊去氧胆酸-羟丙基倍他环糊精的投料质量比（实施例18）以及更高的投料质量比（实施例24），抗老视功效均明显降低。
| 实施例26 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
4份 |
| 胆固醇 |
0.2份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
2.5份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例27 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
4份 |
| 胆固醇 |
0.2份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
3份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例28 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
4份 |
| 胆固醇 |
0.2份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
5份 |
| 注射用水 |
95份 |
| 实施例29 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
4份 |
| 胆固醇 |
0.2份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
10份 |
| 注射用水 |
90份 |
| 实施例30 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
4份 |
| 胆固醇 |
0.2份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
15份 |
| 注射用水 |
85份 |
| 实施例31 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
4份 |
| 胆固醇 |
0.2份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
20份 |
| 注射用水 |
80份 |
| 实施例32 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
4份 |
| 胆固醇 |
0.2份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
22份 |
| 注射用水 |
78份 |
| 实施例33 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
22份 |
| 注射用水 |
78份 |
实施例26-33制备方法：按上述表格处方称取适量（0.2~0.8份）熊去氧胆酸、磺丁基倍他环糊精钠，加入适量的注射用水，搅拌2小时，形成包合物溶液I。 按上述表格处方称取剩余量的熊去氧胆酸、氢化大豆磷脂酰胆碱和胆固醇，溶于适量氯仿甲醇混合溶剂形成溶液，于室温旋转蒸发2小时，除去有机溶剂，铺成均一的薄膜，加入包合物溶液I，水化，于室温条件下振荡孵育4小时，将水化后的混悬液置冰水浴环境，使用探头超声处理7分钟（功率设定为300W），用微孔滤膜过滤整粒，即得脂质混悬液。测定渗透压，加入适量的甘露醇，调节等渗，并用稀盐酸/稀氢氧化钠溶液调节各实施例的pH值均为7.0-7.5，使用微孔滤膜过滤，灌装于西林瓶中，于低温避光环境贮存，备用。
采用动态光散射仪测定各实施例组合物的平均粒径和多分散系数。按照上述动物实验方法测定老年小鼠的晶状体直径并计算晶状体弹性增加量。测定结果如下表所示：
| 序号 |
平均粒径(nm) |
多分散系数 |
晶状体弹性增加量(μm) |
| 实施例26 |
550.7 |
0.243 |
8.3 |
| 实施例27 |
302.1 |
0.159 |
20.0 |
| 实施例28 |
205.3 |
0.194 |
34.9 |
| 实施例29 |
326.4 |
0.110 |
29.4 |
| 实施例30 |
304.0 |
0.208 |
31.2 |
| 实施例31 |
541.9 |
0.182 |
37.6 |
| 实施例32 |
269.8 |
0.213 |
17.1 |
| 实施例33 |
75.2 |
0.237 |
10.5 |
熊去氧胆酸脂质组合物（实施例27-31）明显提高老年小鼠的晶状体弹性，呈现出良好的抗老视功效；与实施例27-31相比，更低的熊去氧胆酸-磺丁基倍他环糊精钠的投料质量比（实施例26）以及更高的投料质量比（实施例32），抗老视功效均明显降低。
| 实施例34 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 |
4.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 伽马环糊精 |
3.75份 |
| 注射用水 |
96份 |
| 实施例35 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 |
4.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 伽马环糊精 |
4.5份 |
| 注射用水 |
95份 |
| 实施例36 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 |
4.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 伽马环糊精 |
7.5份 |
| 注射用水 |
92份 |
| 实施例37 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 |
4.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 伽马环糊精 |
15份 |
| 注射用水 |
85份 |
| 实施例38 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 |
4.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 伽马环糊精 |
22.5份 |
| 注射用水 |
77份 |
| 实施例39 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 |
4.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 伽马环糊精 |
30份 |
| 注射用水 |
70份 |
| 实施例40 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 |
4.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 伽马环糊精 |
33份 |
| 注射用水 |
67份 |
| 实施例41 |
|
| 熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 伽马环糊精 |
33份 |
| 注射用水 |
67份 |
实施例34-41组合物制备方法：按上述表格处方称取适量（1.0~1.3份）熊去氧胆酸、伽马环糊精，加入适量的注射用水，搅拌2小时，形成包合物溶液I。按上述表格处方称取剩余量的熊去氧胆酸、二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇，溶于适量氯仿甲醇混合溶剂形成溶液，于室温旋转蒸发2小时，除去有机溶剂，铺成均一的薄膜，加入包合物溶液I，水化，于室温条件下振荡孵育4小时，将水化后的混悬液置冰水浴环境，使用探头超声处理7分钟（功率设定为300W），用微孔滤膜过滤整粒，即得脂质混悬液。测定渗透压，加入适量的甘露醇，调节等渗，并用稀盐酸/稀氢氧化钠溶液调节各实施例的pH值均为7.0-7.5，使用微孔滤膜过滤，灌装于西林瓶中，于低温避光环境贮存，备用。
采用动态光散射仪测定各实施例组合物的平均粒径和多分散系数。按照上述动物实验方法测定老年小鼠的晶状体直径并计算晶状体弹性增加量。测定结果如下表所示：
| 序号 |
平均粒径(nm) |
多分散系数 |
晶状体弹性增加量(μm) |
| 实施例34 |
456.1 |
0.203 |
10.1 |
| 实施例35 |
136.8 |
0.138 |
27.8 |
| 实施例36 |
311.9 |
0.232 |
30.2 |
| 实施例37 |
209.6 |
0.142 |
33.5 |
| 实施例38 |
351.9 |
0.170 |
37.3 |
| 实施例39 |
554.0 |
0.155 |
31.7 |
| 实施例40 |
145.6 |
0.121 |
16.4 |
| 实施例41 |
80.7 |
0.246 |
11.9 |
熊去氧胆酸脂质组合物（实施例35-39）明显提高老年小鼠的晶状体弹性，呈现出良好的抗老视功效；与实施例35-39相比，更低的熊去氧胆酸-伽马环糊精的投料质量比（实施例34）以及更高的投料质量比（实施例40），抗老视功效均明显降低。
| 实施例42 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 |
2份 |
| 胆固醇 |
0.4份 |
| 阿尔法环糊精 |
1.25份 |
| 注射用水 |
99份 |
| 实施例43 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 |
2份 |
| 胆固醇 |
0.4份 |
| 阿尔法环糊精 |
1.5份 |
| 注射用水 |
98份 |
| 实施例44 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 |
2份 |
| 胆固醇 |
0.4份 |
| 阿尔法环糊精 |
2.5份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例45 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 |
2份 |
| 胆固醇 |
0.4份 |
| 阿尔法环糊精 |
5.0份 |
| 注射用水 |
95份 |
| 实施例46 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 |
2份 |
| 胆固醇 |
0.4份 |
| 阿尔法环糊精 |
7.5份 |
| 注射用水 |
92份 |
| 实施例47 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 |
2份 |
| 胆固醇 |
0.4份 |
| 阿尔法环糊精 |
10份 |
| 注射用水 |
90份 |
| 实施例48 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 |
2份 |
| 胆固醇 |
0.4份 |
| 阿尔法环糊精 |
11份 |
| 注射用水 |
88份 |
| 实施例49 |
|
| 熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 阿尔法环糊精 |
11份 |
| 注射用水 |
88份 |
实施例42-49组合物制备方法：按上述表格处方称取适量（0.1~0.2份）熊去氧胆酸、阿尔法环糊精，加入适量的注射用水，搅拌2小时，形成包合物溶液I。按上述表格处方称取剩余量的熊去氧胆酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱和胆固醇，溶于适量氯仿甲醇混合溶剂形成溶液，于室温旋转蒸发2小时，除去有机溶剂，铺成均一的薄膜，加入包合物溶液I，水化，于室温条件下振荡孵育4小时，将水化后的混悬液置冰水浴环境，使用探头超声处理7分钟（功率设定为300W），用微孔滤膜过滤整粒，即得脂质混悬液。测定渗透压，加入适量的甘露醇，调节等渗，并用稀盐酸/稀氢氧化钠溶液调节各实施例的pH值均为7.0-7.5，使用微孔滤膜过滤，灌装于西林瓶中，于低温避光环境贮存，备用。
采用动态光散射仪测定各实施例组合物的平均粒径和多分散系数。按照上述动物实验方法测定老年小鼠的晶状体直径并计算晶状体弹性增加量。测定结果如下表所示：
| 序号 |
平均粒径(nm) |
多分散系数 |
晶状体弹性增加量(μm) |
| 实施例42 |
373.8 |
0.199 |
13.9 |
| 实施例43 |
552.4 |
0.183 |
22.8 |
| 实施例44 |
217.9 |
0.197 |
32.1 |
| 实施例45 |
549.3 |
0.252 |
33.4 |
| 实施例46 |
157.2 |
0.106 |
28.6 |
| 实施例47 |
289.4 |
0.180 |
37.7 |
| 实施例48 |
163.0 |
0.175 |
19.5 |
| 实施例49 |
91.2 |
0.158 |
5.6 |
熊去氧胆酸脂质组合物（实施例43-47）明显提高老年小鼠的晶状体弹性，呈现出良好的抗老视功效；与实施例43-47相比，更低的熊去氧胆酸-阿尔法环糊精的投料质量比（实施例42）以及更高的投料质量比（实施例48），抗老视功效均明显降低。
总结上述实验发现，当熊去氧胆酸-环糊精的投料质量比为1:3~1:20、熊去氧胆酸-磷脂的投料质量比为1:3~1:10以及磷脂-胆固醇的投料质量比在5:1~20:1的范围内，所制得的脂质组合物明显提高了老年小鼠的晶状体弹性，且优于不含环糊精的载熊去氧胆酸脂质体，也优于不含脂质的熊去氧胆酸包合物，预示其具备良好的抗老视功效。对于超出熊去氧胆酸-环糊精投料质量比范围的组合物，上述药理作用明显变差。
2适用性考察
选择牛磺熊去氧胆酸作为活性药物，制备脂质组合物，研究各组合物的体内老年小鼠的晶状体弹性功效。
| 实施例50 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
4.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 注射用水 |
100份 |
| 实施例51 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3.0份 |
| 胆固醇 |
0.1份 |
| 倍他环糊精 |
6份 |
| 注射用水 |
94份 |
| 实施例52 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
0.25份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.5份 |
| 倍他环糊精 |
0.75份 |
| 注射用水 |
99份 |
| 实施例53 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 甲基倍他环糊精 |
3份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例54 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
5份 |
| 胆固醇 |
0.25份 |
| 甲基倍他环糊精 |
10份 |
| 注射用水 |
97份 |
| 实施例55 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
1份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
3份 |
| 注射用水 |
96份 |
| 实施例56 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
0.8份 |
| 氢化大豆磷脂酰胆碱 |
2.4份 |
| 胆固醇 |
0.12份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
16份 |
| 注射用水 |
83份 |
| 实施例57 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
1份 |
| 二油酰磷脂酰胆碱 |
2.5份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
2.5份 |
| 注射用水 |
77份 |
| 实施例58 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
1份 |
| 二油酰磷脂酰胆碱 |
3份 |
| 胆固醇 |
0.6份 |
| 磺丁基倍他环糊精钠 |
3份 |
| 注射用水 |
96份 |
| 实施例59 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 |
4.5份 |
| 胆固醇 |
0.9份 |
| 伽马环糊精 |
4.5份 |
| 注射用水 |
95份 |
| 实施例60 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
0.6份 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 |
6份 |
| 胆固醇 |
0.3份 |
| 伽马环糊精 |
12份 |
| 注射用水 |
88份 |
| 实施例61 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 |
1.5份 |
| 胆固醇 |
0.3份 |
| 阿尔法环糊精 |
1.5份 |
| 注射用水 |
98份 |
| 实施例62 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
0.5份 |
| 二棕榈酰磷脂酰胆碱 |
5份 |
| 胆固醇 |
0.25份 |
| 阿尔法环糊精 |
10份 |
| 注射用水 |
89份 |
| 实施例63 |
|
| 牛磺熊去氧胆酸 |
1.5份 |
| 羟丙基倍他环糊精 |
30份 |
| 注射用水 |
70份 |
实施例50-63组合物制备方法：按上述表格处方称取适量（占表格中总投料份数的15~75%）牛磺熊去氧胆酸、环糊精，加入适量的注射用水，搅拌2小时，形成包合物溶液I（对于实施例63，该包合物溶液直接用于后续的研究）。 按上述表格处方称取适量牛磺熊去氧胆酸、磷脂和胆固醇，溶于适量氯仿甲醇混合溶剂形成溶液，于室温旋转蒸发2小时，除去有机溶剂，铺成均一的薄膜，加入包合物溶液I（对于实施例50，加100份注射用水），水化，于室温条件下振荡孵育4小时，将水化后的混悬液置冰水浴环境，使用探头超声处理7分钟（功率设定为300W），用微孔滤膜过滤整粒，即得脂质混悬液。测定渗透压，加入适量的甘露醇，调节等渗，并用稀盐酸/稀氢氧化钠溶液调节各实施例的pH值均为7.0-7.5，使用微孔滤膜过滤，灌装于西林瓶中，于低温避光环境贮存，备用。
采用动态光散射仪测定各实施例组合物的平均粒径和多分散系数。按照上述动物实验方法测定老年小鼠的晶状体直径并计算晶状体弹性增加量。测定结果如下表所示：
| 序号 |
平均粒径(nm) |
多分散系数 |
晶状体弹性增加量(μm) |
| 实施例50 |
235.0 |
0.111 |
10.9 |
| 实施例51 |
111.8 |
0.239 |
8.8 |
| 实施例52 |
582.6 |
0.252 |
22.2 |
| 实施例53 |
147.5 |
0.170 |
32.6 |
| 实施例54 |
315.0 |
0.238 |
35.4 |
| 实施例55 |
213.7 |
0.167 |
36.1 |
| 实施例56 |
279.8 |
0.228 |
40.8 |
| 实施例57 |
466.1 |
0.209 |
17.2 |
| 实施例58 |
607.4 |
0.184 |
33.3 |
| 实施例59 |
263.7 |
0.166 |
47.5 |
| 实施例60 |
341.8 |
0.211 |
50.6 |
| 实施例61 |
411.4 |
0.215 |
34.1 |
| 实施例62 |
272.9 |
0.191 |
39.8 |
| 实施例63 |
161.5 |
0.244 |
6.9 |
与对照制剂相比（实施例50和实施例63），牛磺熊去氧胆酸脂质组合物（52-56、58-63）明显提高老年小鼠的晶状体弹性，呈现出良好的抗老视功效，在这些实施例中，牛磺熊去氧胆酸与环糊精的投料质量比在1:3~1:20范围内，牛磺熊去氧胆酸与磷脂的投料质量比在1:3~1:10范围内，磷脂与胆固醇的投料质量比在5:1~20:1的范围内，超出该范围的组合物（实施例51、实施例57）对晶状体弹性的影响明显弱于其他实施例。实验结果说明，本发明筛选出熊去氧胆酸与环糊精的投料质量比范围同样适用于牛磺熊去氧胆酸。