CN116200420A

CN116200420A - 一种高效表达眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30的串联多拷贝重组表达载体及其应用

Info

Publication number: CN116200420A
Application number: CN202211617849.4A
Authority: CN
Inventors: 喻诗; 李文辉; 钱晓明
Original assignee: Jiangsu Kangjun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Kangjun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-15
Filing date: 2022-12-15
Publication date: 2023-06-02

Abstract

本发明公开了一种高效表达眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30的串联多拷贝重组表达载体及其应用。本发明将进行过密码子偏爱性优化眼镜王蛇抗菌肽基因，并将密码子优化后的成熟肽基因插入到pPICZaA载体，通过酶切酶连串联连接连到pPIC9K载体上，转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌，制备眼镜王蛇抗菌肽。本发明采用的多拷贝串联表达技术能较为有效的提高酵母表达眼镜王蛇抗菌肽的产量，并且对眼镜王蛇抗菌肽的生物活性无显著影响，安全性极高。

Description

一种高效表达眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的串联多拷贝重组表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高效表达眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的串联多拷贝重组表达载体及其应用。

背景技术

眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30是由30个氨基酸组成的cathelicidins的截短肽，目前研究发现其对大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa ）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌效果。因此，眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30是一种非常有前景的药物候选分子，可以用来治疗各种常规抗生素耐药菌引起的感染。

目前，无论是通过化学合成或者生物合成，所获得的眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30产量都无法满足实际使用中的需求。本发明采用眼镜王蛇抗菌肽基因，将其通过酶切酶连形成多拷贝基因，构建酵母表达的重组质粒，建立酵母表达系统用于获取眼镜王蛇抗菌肽。

发明内容

本发明的目的是要提供一种高效表达眼镜王蛇抗菌肽的多拷贝重组表达载体及应用，采用基因工程技术，构建串联多拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达多拷贝串联蛋白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1）根据现有的眼镜王蛇抗菌肽氨基酸序列，按照毕赤酵母对遗传密码子的偏爱性对眼镜王蛇抗菌肽基因进行密码子优化，并将密码子优化后的成熟肽基因插入到pPICZaA载体，通过酶切酶连串联连接连到pPIC9K载体上；

2）根据pPIC9K载体的序列设计上下游两条引物，进行PCR扩增，PCR产物克隆至Pmd18T载体，通过酶切酶连获得转移载体，转移载体通过单酶切，与目的载体连接，获得多拷贝数的重组表达载体，对连接产物的鉴定；

3）重组表达载体转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌；

4）对同源重组成功的毕赤酵母进行诱导表达，从而得到分泌表达的多拷贝眼镜王蛇抗菌肽蛋白；

优选的，所述的pPIC9K表达载体构建包括以下内容：pPIC9K载体的酶切及酶切产物回收；眼镜王蛇抗菌肽序列和载体的连接；连接产物的鉴定。

优选的，所述的连接产物的鉴定包括制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。

其中，所述的眼镜王蛇抗菌肽基因的核苷酸序列可以是任何一种基因的核苷酸序列。核苷酸序列是通过酵母密码子偏爱优化后的核苷酸序列。多拷贝基因中的串联拷贝数目是3个拷贝以内。

本发明选用毕赤酵母为宿主菌。毕赤酵母具有真核生物特有的蛋白高效分泌表达，翻译后修饰，因此，近年来毕赤酵母成为表达外源目的蛋白，特别是真核来源的外源蛋白的高效表达系统。

本发明对测序鉴定后的质粒酶切线性化后电转化GS115毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于YPD平板，挑选单克隆，对克隆进行小量发酵培养，发酵液采用SDS-PAGE分离后，以获得表达眼镜王蛇抗菌肽的发酵液蛋白。发酵液蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析后，使用相应的蛋白酶进行切割，再对所得到的眼镜王蛇抗菌肽纯化。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明采用酵母表达眼镜王蛇抗菌肽时，通过串联多拷贝的方式，将眼镜王蛇抗菌肽表达产量提高多倍。

（2）本发明采用基因工程技术，构建串联多拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达多拷贝串联蛋白；本发明提供的方法具有通用性强、表达效率较高、具有生物活性、成本低、易规模化生产等优点。

（3）本发明相较于眼镜王蛇抗菌肽的单拷贝表达，使得眼镜王蛇抗菌肽的产量提高2-4倍，且并未增加生产工序，生产成本基本与单拷贝表达持平。

附图说明

图1为眼镜王蛇抗菌肽单拷贝基因全合成图；

图2为二拷贝载体的构建的方案设计图；

图3为三拷贝载体的构建的方案设计图。

图4为抑菌活性实验结果图，F为对肺炎克雷伯菌抑菌效果的抑菌圈，J为对金黄色葡萄球菌的抑菌圈，编号5、6、7代表3组发酵罐号，发酵罐号后的标记为诱导表达培养时间，例5-84h代表5号发酵罐表达84小时的上清液的抑菌实验结果。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

蛋白胨Peptone、硫酸铵、甲醇、琼脂、葡萄糖、磷酸钾缓冲液、甘油、山梨醇购于国药集团化学试剂有限公司；

YNB购于北京索莱宝科技有限公司；

酵母提取物Yeast extract购于OXOID公司；

细菌菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

除非特别指明，本发明以下实施例所用的试剂均为分析纯试剂，且可从常规渠道商购获得。

本发明中的YPDS培养基的配制: 酵母提取物Yeast extract 1%,蛋白胨Peptone2%, 葡萄糖 2%，固体培养基则添加琼脂粉 2%。

本发明中的BMMY培养基的配制：

酵母提取物Yeast extract 1%,蛋白胨Peptone 2%, 磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L, YNB 1.34%, 硫酸铵 1%，加水配置成100ml的培养基。毕赤酵母诱导表达培养基，YNB过滤除菌。摇瓶培养时每24小时之后加入0.5%的甲醇诱导，一般诱导72小时。

BMGY培养基的配制：

酵母提取物Yeast extract 1%,蛋白胨Peptone 2%, 磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L, YNB 1.34%, 硫酸铵 1%,甘油 1%，加水配置成100ml的培养基。

山梨醇培养基的配制

取18.217g山梨醇溶于100ml无菌水中配置成的1M山梨醇培养基，0.22μm滤膜过滤除菌。

实施例1

1.眼镜王蛇抗菌肽单拷贝基因的全合成

根据现有的眼镜王蛇抗菌肽氨基酸序列，按照毕赤酵母对遗传密码子的偏爱性对眼镜王蛇抗菌肽基因进行密码子优化，优化为酵母菌偏爱的密码子基因片段，全基因合成并插入到pPICZaA载体上。

GAGAAGAGAAAGTTCTTTAAGAAGTTGAAGAACTCTGTTAGAAAGAAGGCTAAGAAGTTCTTCAAGAAGCCAAGAGTTATTGGTGTTTCTATTCCATTCTAA

具体操作为pPICZaA载体的KEX2酶切位点之后到TGA之间的序列全部删除，用已经密码子偏爱性优化后的眼镜王蛇抗菌肽基因替换，末尾加TAA终止，再连接载体TGA之后的序列。眼镜王蛇抗菌肽单拷贝基因全合成图如图1所示。

实施例2

pPIC9K表达载体的构建

采用限制性内切酶Xcm I、AgeI分别双酶切pPICZaA、pPIC9K载体。pPICZaA载体切下的小片段即胶回收后的产物与双酶切的pPIC9K载体用T4 DNA连接酶连接，转入感受态E.coli DH5α。挑选单克隆，采用PCR技术及测序进行质粒阳性鉴定。

实施例3

多拷贝载体的构建

1）根据pPIC9K载体的序列设计了两条引物，

5’AOXPF: 5’CGGGATCCAACATCCAAAGACGAaaggttgaa (BamH I);

3’AOXTR: 5’GCAGATCTTAACTGTGATAAACTACC(Bgl II).

以1拷贝质粒为模板，用PfuDNA聚合酶进行PCR扩增，PCR产物克隆至pMD18T载体中测序鉴定。

2）用BglII内切酶将1拷贝质粒酶切分别回收大小7000bp和2400bp左右的片段，并使用CIAP去磷酸化，-20℃保存备用。

3）使用BamHI和Bgl II双酶切含1拷贝表达框pMD18T的质粒，回收1拷贝表达框片段，连接到Bgl II酶切并去除磷酸化的质粒2400bp左右的小片段中，转化大肠杆菌感受态，获得转移载体，BamHI内切酶和Bgl II内切酶是同尾酶。

4）转移载体使用Bgl II酶切回收与Bgl II酶切的质粒7000bp左右的大片段连接，转化大肠杆菌感受态，用Bgl II酶切鉴定，即可获得较转移载体多一拷贝数的表达载体。

实施例4

重组酵母菌的诱导表达及检测

1）将80ul酵母感受态细胞和5µg Sal I线性化后的质粒混合后转移至电转杯中，冰浴5min。电击后立刻向电转杯加入200ul山梨醇培养基，混均后，将全部菌液涂布在MD固体培养基平板上，在28℃ 培养3 d。

2）挑取含有表达质粒的毕赤酵母单菌落接入BMGY培养基，30℃，280rpm振荡培养，培养菌体浓度至

=2 ~ 6，更换培养基为BMMY培养基，每隔24h，补加终浓度为0 .5%的甲醇。发酵120h，收集的上清液，通过SDS-PAGE凝胶分析。分析结果显示酵母成功表达蛋白，且不同拷贝数间蛋白量无明显差异。

实施例5

多拷贝表达产量与单拷贝表达产量的比较

分别取不同拷贝数的眼镜王蛇抗菌肽表达菌株在相同情况下进行发酵（采用BMMY培养基进行发酵，初始

为2 ~ 6，转速280rpm，每隔24h添加培养基总量的0.5%的甲醇，共发酵120h。

取部分上清进行SDS-PAGE检测，以此衡量其蛋白产量。发酵上清经过HPLC纯化，然后经质谱鉴定，得到纯品，用微量BCA蛋白定量分析试剂盒测其浓度。不同拷贝数眼镜王蛇抗菌肽产量对比如下表1：

表1不同拷贝数眼镜王蛇抗菌肽产量对比

拷贝数	1	2	3
				产量	27 mg/L	44 mg/L	65 mg/L

实施例6

用25ml LB液体培养基培养肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌，37℃180rpm过夜培养后，再转接到25ml LB液体培养基中，同样条件培养1 .5h-2h，OD值在0 .4-0 .6之间，取30ul菌液到100mlLB冷却至不烫手的固体培养基中，混匀后倒平板；待其凝固后将牛津杯放在表面，分别加入50ul重组表达的眼镜王蛇抗菌肽样品，同时用pPIC9k空载体做空白对照组，37℃过夜培养后测定其透明圈的大小，一共做3组实验。得出重组表达的眼镜王蛇抗菌肽对金黄色葡萄球菌有明显抑制效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种高效表达眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的串联多拷贝重组表达载体及其应用，具体步骤包括：

2）根据pPIC9K载体的序列设计上下游两条引物，进行PCR扩增，PCR产物克隆至Pmd18T载体，通过酶切酶连获得转移载体，转移载体通过单酶切，与目的载体连接，获得多拷贝数的重组表达载体；

3）重组表达载体转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌；

4）对同源重组成功的毕赤酵母进行诱导表达，从而得到分泌表达的多拷贝眼镜王蛇抗菌肽蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种高效表达眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的串联多拷贝重组表达载体及其应用，其特征在于,所述的pPIC9K表达载体构建包括以下内容：pPIC9K载体的酶切及酶切产物回收；眼镜王蛇抗菌肽序列和载体的连接；连接产物的鉴定。

3.根据权利要求2所述的一种高效表达眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的串联多拷贝重组表达载体及其应用，其特征在于，所述的连接产物的鉴定包括制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。

4.根据权利要求1所述的一种高效表达眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的串联多拷贝重组表达载体及其应用，其特征在于，所述的多拷贝眼镜王蛇抗菌肽基因中的串联拷贝数目是3个拷贝以内。