CN116200265A - 一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片 - Google Patents

一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片 Download PDF

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Sun Yat Sen University
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Abstract

本发明公开了一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片，包括硬质基材层以及设置于所述硬质基材层上方的聚二甲基硅氧烷层；其中，所述聚二甲基硅氧烷层内部设有芯片，芯片由多个单元结构组成，每个单元结构设有两条主流体通道，主流体通道的截面为长方形，两条主流体通道中间均匀分布多个球体培养腔室；球体培养腔室的上侧开有上侧辅助通道与上侧所在的主流体通道连接，下侧开有下侧辅助通道与下侧所在的主流体通道连接；两条主流体通道的宽度尺寸大于两道辅助通道宽度尺寸；所述两条主流体通道的两端各设有首尾两个端口。所得芯片的操作简单、成本低、稳定性高和集成度高，可用于高通量肿瘤类器官球体药物筛选。

Description

一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流 控芯片
技术领域
本发明涉及微流控肿瘤芯片，特别涉及一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片。
背景技术
由于肿瘤的复杂环境和体外肿瘤模型的欠缺，癌症仍然是世界上许多国家的主要死亡原因之一。目前在癌症生物学和抗癌药物筛选方面的研究主要依赖于二维（2D）细胞培养和动物实验模型。二维细胞培养操作简单，成本低廉，可重复性高，但无法良好地重现肿瘤结构和整体微环境的特征；动物实验模型虽然可以提供体内肿瘤生长及药物反应的基本信息，但动物与人存在种的差异，使得药物疗效往往具有较大的差异。肿瘤类器官是一种三维细胞培养物，在组织学和遗传学上与患者的起源肿瘤相似，在细胞类型、空间结构及生理功能上能够模拟对应器官，从而提供一个高度生理相关的系统，且具有容易生成，长期培养和低温保存的能力，因此，可应用于药物筛选和疾病建模。微流控芯片技术作为近年来飞速发展的一门新兴技术，依靠其尺度精确微小、材料制作工艺多样、设计灵活多变和可控性高等特点，可用于概括人体器官的结构和功能的复杂性。通过将微流控芯片与类器官相结合，可以模拟肿瘤组织病理生理的动态微环境，从而有利于药物筛选、个性化药物和免疫治疗。个性化治疗的需求越来越大，如何在芯片上构建集肿瘤类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构用于个性化治疗，现有技术仍未解决。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片，旨在解决如何在芯片上构建集肿瘤类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构用于个性化治疗的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：
一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片，包括硬质基材层以及设置于所述硬质基材层上方的聚二甲基硅氧烷层（PDMS）；
其中，所述聚二甲基硅氧烷层内部设有芯片，芯片由多个单元结构组成，每个单元结构设有两条主流体通道，主流体通道的截面为长方形，两条主流体通道中间均匀分布多个球体培养腔室；球体培养腔室的上侧开有上侧辅助通道与上侧所在的主流体通道连接，下侧开有下侧辅助通道与下侧所在的主流体通道连接；两条主流体通道的宽度尺寸大于两道辅助通道宽度尺寸；所述两条主流体通道的两端各设有首尾两个端口。
作为优选的，在上述的微流控芯片中，所述硬质基材层为聚二甲基硅氧烷或有机玻璃。
作为优选的，在上述的微流控芯片中，所述球体培养腔室为Ω型，数量为4-128个，直径为0.2-0.6 mm。
作为优选的，在上述的微流控芯片中，所述上侧的辅助通道的宽度为0.12-0.52mm；所述下侧的辅助通道的宽度为0.05-0.2mm。
作为优选的，在上述的微流控芯片中，所述流体通道的深度为0.2-0.6 mm，宽度为0.2-0.6 mm。
作为优选的，在上述的微流控芯片中，所述单元结构的数量为2-8组。
作为优选的，在上述的微流控芯片中，所述球体培养腔室内采用表面活性剂进行处理；所述表面活性剂为牛血清白蛋白、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或磷脂酸。
作为优选的，在上述的微流控芯片中，所述聚二甲基硅氧烷层的厚度为2-8mm；所述端口的直径为0.8 -1.2 mm。
作为优选的，在上述的微流控芯片中，所述球体培养腔室灌注有培养基和肿瘤球体，球体培养腔室的直径大于肿瘤球体的直径，上侧辅助通道的宽度大于肿瘤球体的直径，下侧辅助通道的宽度小于肿瘤球体的直径。
作为优选的，在上述的微流控芯片中，所述培养基为肠类器官培养基IntestiCult™、脑类器官培养基STEMdiff™、呼吸道类器官培养基PneumaCult™或肝类器官培养基HepatiCult™。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的多级结构微流控芯片能够做到集捕获、培养和回收于一体，可实现肿瘤球体的收集、培养和重复收集，能够更好的用于药物筛选和多种结果表征。
2、本发明的多级结构微流控芯片的制造工艺简单，设备要求低，成本低，重复性高。
3、本发明的多级结构微流控芯片可以根据不同尺寸的肿瘤球体，使用不同尺寸的培养腔室进行收集。
4、本发明的肿瘤球体培养腔室均匀分布在两条主流通道间，每两条主通道间有多个培养腔室，且有多组平行结构，可以同时进行高通量和不同组别的药物筛选和实验研究。
5、本发明的多级结构微流控芯片可以将肿瘤球体收集并在培养腔室内培养，同时又能在药物筛选结束之后将肿瘤球体重收集，有利于更多的表征方法用于对肿瘤球体的分析。
附图说明
图1是本发明的肿瘤类器官芯片整体结构分布示意图，A为三维实体芯片外观，B为芯片内部结构图，1-上层PDMS芯片，2-下层PDMS或有机玻璃，3-芯片内部的结构单元；
图2是本发明肿瘤类器官芯片内部通道结构示意图，4-上侧首端口，5-上侧尾端口，6-下侧尾端口，7-下侧首端口，8-主流体通道，9-上侧辅助通道，10-培养腔室，11-下侧辅助通道；
图3是本发明肿瘤类器官芯片的中间培养腔室放大示意图，12-肿瘤类器官球体；
图4是本发明肿瘤类器官芯片的数据图，E为肿瘤类器官球体的灌注，F为肿瘤类器官球体的捕获和培养，G为肿瘤类器官球体的回收。
具体实施方式：
本发明提供了一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片，参见图1-2，包括硬质基材层2以及设置于所述硬质基材层上方的聚二甲基硅氧烷层1；其中，所述聚二甲基硅氧烷层1内部设有芯片，芯片由多个单元结构3组成，每个单元结构3设有两条主流体通道8，主流体通道8的截面为长方形，两条主流体通道8中间均匀分布多个球体培养腔室10；球体培养腔室10的上侧开有上侧辅助通道9与上侧所在的主流体通道连接，下侧开有下侧辅助通道11与下侧所在的主流体通道连接；两条主流体通道的宽度尺寸大于两道辅助通道宽度尺寸；所述两条主流体通道的两端各设有两个端口，分别是上侧首端口4，上侧尾端口5，下侧首端口6，下侧尾端口7。
在一些实施方式中，所述硬质基材层为聚二甲基硅氧烷或有机玻璃。
在一些实施方式中，所述球体培养腔室为Ω型，数量为4-128个，直径为0.2-0.6mm。
在一些实施方式中，所述上侧的辅助通道的宽度为0.12-0.52 mm；所述下侧的辅助通道的宽度为0.05-0.2mm。
在一些实施方式中，所述流体通道的深度为0.2-0.6 mm，宽度为0.2-0.6 mm。
在一些实施方式中，所述单元结构的数量为2-8组。
在一些实施方式中，所述球体培养腔室内采用表面活性剂进行处理；所述表面活性剂为牛血清白蛋白、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或磷脂酸。
在一些实施方式中，所述聚二甲基硅氧烷层的厚度为2-8mm；所述端口的直径为0.8 -1.2 mm。
在一些实施方式中，所述球体培养腔室灌注有培养基和肿瘤球体，球体培养腔室的直径大于肿瘤球体的直径，上侧辅助通道的宽度大于肿瘤球体的直径，下侧辅助通道的宽度小于肿瘤球体的直径。所述灌注的速度模拟人体血流速度。
在一些实施方式中，所述培养基为肠类器官培养基IntestiCult™、脑类器官培养基STEMdiff™、呼吸道类器官培养基PneumaCult™或肝类器官培养基HepatiCult™。
在一些实施方式中，参加图3，为本发明实施例肿瘤类器官芯片的中间培养腔室放大示意图，附图标记12所指的黑圆点为肿瘤类器官球体；图4是本发明肿瘤类器官芯片的数据图，E为肿瘤类器官球体的灌注，F为肿瘤类器官球体的捕获和培养，G为肿瘤类器官球体的回收。可见，采用本发明的芯片培养出的肿瘤类器官球体较为接近真实状况。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅在于说明本发明而决不限制本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
（A）微流体芯片材料及结构组成：微流体芯片共有两层，上层为聚二甲基硅氧烷，下层为聚二甲基硅氧烷。芯片由4组平行的结构组成，主流体通道设有两条截面为长方形的流体通道作为主通道，深度为0.4 mm；宽度为0.4 mm。在芯片两条主流体通道两端各设有两个直径为0.8 mm的端口。
（B）微流控芯片球体培养腔体设计：在芯片两条主流体通道中央均匀分布16个球体培养腔室，培养腔室为Ω型，直径为0.4 mm；上侧开有宽度为0.32 mm的辅助通道与上侧主通道连接，下侧开有0.1mm的辅助通道与下侧主通道连接。
（C）微流控芯片表面处理：为了使通道壁降低细胞粘附，将5%（w/v）牛血清白蛋白引入芯片培养腔体，孵育8小时后吸出，自然风干。
（D）微流控芯片肿瘤球体收集：从端口4向经步骤（C）表面处理的微流体芯片灌注培养基，待培养基充满芯片之后，关闭端口6和端口7，从端口4灌注肿瘤球体，使球体在上侧主通道均匀分布，之后将芯片垂直转动并关闭端口4和端口5，使得球体在重力的作用下均匀的沉降到培养腔室中，最后再水平放置芯片，打开端口4和端口5，从端口4将残留在上侧主通道的球体从端口5冲洗，即得多级结构微流控肿瘤球体培养芯片；
（E）微流控芯片肿瘤球体培养：经步骤（D）处理后，以0.2 mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在芯片内进行14天的培养。
（F）微流控芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以0.2 mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在24h内观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
（G）微流控芯片肿瘤球体重收集：将经步骤（F）处理后的芯片端口5和端口6关闭，打开端口4和端口7，从端口7灌注培养基，并将肿瘤球体从端口4重收集。肿瘤球体通过逆流从培养腔室回收。
实施例2
一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
（A）微流体芯片材料及结构组成：微流体芯片共有两层，上层为聚二甲基硅氧烷，下层为有机玻璃。芯片由8组平行的结构组成，主流体通道设有两条截面为长方形的流体通道作为主通道，深度为0.6 mm；宽度为0.6 mm。在芯片两条主流体通道两端各设有两个直径为1.2 mm的端口。
（B）微流控芯片球体培养腔体设计：在芯片两条主流体通道中央均匀分布64个球体培养腔室，培养腔室为Ω型，直径为0.6 mm；上侧开有宽度为0.52 mm的辅助通道与上侧主通道连接，下侧开有0.2mm的辅助通道与下侧主通道连接。
（C）微流控芯片表面处理：为了使通道壁降低细胞粘附，将3%（w/v）聚乙二醇辛基苯基醚引入芯片培养腔体，孵育12小时后吸出，自然风干。
（D）微流控芯片肿瘤球体收集：从端口4向经步骤（C）表面处理的微流体芯片灌注培养基，待培养基充满芯片之后，关闭端口6和端口7，从端口4灌注肿瘤球体，使球体在上侧主通道均匀分布，之后将芯片垂直转动并关闭端口4和端口5，使得球体在重力的作用下均匀的沉降到培养腔室中，最后再水平放置芯片，打开端口4和端口5，从端口4将残留在上侧主通道的球体从端口5冲洗，即得多级结构微流控肿瘤球体培养芯片；
（E）微流控芯片肿瘤球体培养：经步骤（D）处理后，以0.5 mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在芯片内进行20天的培养。
（F）微流控芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以0.5mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在48h内观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
（G）微流控芯片肿瘤球体重收集：将经步骤（F）处理后的芯片端口5和端口6关闭，打开端口4和端口7，从端口7灌注培养基，并将肿瘤球体从端口4重收集。肿瘤球体通过逆流从培养腔室回收。
实施例3
一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
（A）微流体芯片材料及结构组成：微流体芯片共有两层，上层为聚二甲基硅氧烷（PDMS），下层为聚二甲基硅氧烷。芯片由2组平行的结构组成，主流体通道设有两条截面为长方形的流体通道作为主通道，深度为0.2mm；宽度为0.2 mm。在芯片两条主流体通道两端各设有两个直径为0.8 mm的端口，记为端口4，端口5，端口6，端口7。
（B）微流控芯片球体培养腔体设计：在芯片两条主流体通道中央均匀分布4个球体培养腔室，培养腔室为Ω型，直径为0.2 mm；上侧开有宽度为0.12 mm的辅助通道与上侧主通道连接，下侧开有0.05mm的辅助通道与下侧主通道连接。
（C）微流控芯片表面处理：为了使通道壁降低细胞粘附，将1%（w/v）磷脂酸溶液引入芯片培养腔体，孵育6小时后吸出，自然风干。
（D）微流控芯片肿瘤球体收集：从端口4向经步骤（C）表面处理的微流体芯片灌注培养基，待培养基充满芯片之后，关闭端口6和端口7，从端口4灌注肿瘤球体，使球体在上侧主通道均匀分布，之后将芯片垂直转动并关闭端口4和端口5，使得球体在重力的作用下均匀的沉降到培养腔室中，最后再水平放置芯片，打开端口4和端口5，从端口4将残留在上侧主通道的球体从端口5冲洗，即得多级结构微流控肿瘤球体培养芯片；
（E）微流控芯片肿瘤球体培养：经步骤（D）处理后，以0.05 mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在芯片内进行3天的培养。
（F）微流控芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以0.05mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在24h内观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
（G）微流控芯片肿瘤球体重收集：将经步骤（F）处理后的芯片端口5和端口6关闭，打开端口4和端口7，从端口7灌注培养基，并将肿瘤球体从端口4重收集。肿瘤球体通过逆流从培养腔室回收。
实施例4
一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
（A）微流体芯片材料及结构组成：微流体芯片共有两层，上层为聚二甲基硅氧烷（PDMS），下层为聚二甲基硅氧烷。芯片由4组平行的结构组成，主流体通道设有两条截面为长方形的流体通道作为主通道，深度为0.3 mm；宽度为0.3 mm。在芯片两条主流体通道两端各设有两个直径为0.8mm的端口，记为端口4，端口5，端口6，端口7。
（B）微流控芯片球体培养腔体设计：在芯片两条主流体通道中央均匀分布128个球体培养腔室，培养腔室为Ω型，直径为0.3 mm；上侧开有宽度为0.22 mm的辅助通道与上侧主通道连接，下侧开有0.1mm的辅助通道与下侧主通道连接。
（C）微流控芯片表面处理：为了使通道壁降低细胞粘附，将3%（w/v）牛血清白蛋白引入芯片培养腔体，孵育8小时后吸出，自然风干。
（D）微流控芯片肿瘤球体收集：从端口4向经步骤（C）表面处理的微流体芯片灌注培养基，待培养基充满芯片之后，关闭端口6和端口7，从端口4灌注肿瘤球体，使球体在上侧主通道均匀分布，之后将芯片垂直转动并关闭端口4和端口5，使得球体在重力的作用下均匀的沉降到培养腔室中，最后再水平放置芯片，打开端口4和端口5，从端口4将残留在上侧主通道的球体从端口5冲洗，即得多级结构微流控肿瘤球体培养芯片；
（E）微流控芯片肿瘤球体培养：经步骤（D）处理后，以0.1 mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在芯片内进行10天的培养。
（F）微流控芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以0.1mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在36h内观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
（G）微流控芯片肿瘤球体重收集：将经步骤（F）处理后的芯片端口5和端口6关闭，打开端口4和端口7，从端口7灌注培养基，并将肿瘤球体从端口4重收集。肿瘤球体通过逆流从培养腔室回收。
实施例5
一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
（A）微流体芯片材料及结构组成：微流体芯片共有两层，上层为聚二甲基硅氧烷（PDMS），下层为有机玻璃。芯片由6组平行的结构组成，主流体通道设有两条截面为长方形的流体通道作为主通道，深度为05 mm；宽度为0.5 mm。在芯片两条主流体通道两端各设有两个直径为1.2 mm的端口，记为端口4，端口5，端口6，端口7。
（B）微流控芯片球体培养腔体设计：在芯片两条主流体通道中央均匀分布32个球体培养腔室，培养腔室为Ω型，直径为0.5 mm；上侧开有宽度为0.42 mm的辅助通道与上侧主通道连接，下侧开有0.15mm的辅助通道与下侧主通道连接。
（C）微流控芯片表面处理：为了使通道壁降低细胞粘附，将3%（w/v）十二烷基硫酸钠溶液引入芯片培养腔体，孵育10小时后吸出，自然风干。
（D）微流控芯片肿瘤球体收集：从端口4向经步骤（C）表面处理的微流体芯片灌注培养基，待培养基充满芯片之后，关闭端口6和端口7，从端口4灌注肿瘤球体，使球体在上侧主通道均匀分布，之后将芯片垂直转动并关闭端口4和端口5，使得球体在重力的作用下均匀的沉降到培养腔室中，最后再水平放置芯片，打开端口4和端口5，从端口4将残留在上侧主通道的球体从端口5冲洗，即得多级结构微流控肿瘤球体培养芯片；
（E）微流控芯片肿瘤球体培养：经步骤（D）处理后，以0.4 mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在芯片内进行15天的培养。
（F）微流控芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以0.4 mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，在42h内观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
（G）微流控芯片肿瘤球体重收集：将经步骤（F）处理后的芯片端口5和端口6关闭，打开端口4和端口7，从端口7灌注培养基，并将肿瘤球体从端口4重收集。肿瘤球体通过逆流从培养腔室回收。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种集类器官球体捕获、培养和回收于一体的多级结构微流控芯片，其特征在于包括硬质基材层以及设置于所述硬质基材层上方的聚二甲基硅氧烷层；
其中，所述聚二甲基硅氧烷层内部设有芯片，芯片由多个单元结构组成，每个单元结构设有两条主流体通道，主流体通道的截面为长方形，两条主流体通道中间均匀分布多个球体培养腔室；球体培养腔室的上侧开有上侧辅助通道与上侧所在的主流体通道连接，下侧开有下侧辅助通道与下侧所在的主流体通道连接；两条主流体通道的宽度尺寸大于两道辅助通道宽度尺寸；所述两条主流体通道的两端各设有首尾两个端口。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述硬质基材层为聚二甲基硅氧烷或有机玻璃。
3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述球体培养腔室为Ω型，数量为4-128个，直径为0.2-0.6 mm。
4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述上侧的辅助通道的宽度为0.12-0.52 mm；所述下侧的辅助通道的宽度为0.05-0.2 mm。
5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述流体通道的深度为0.2-0.6 mm，宽度为0.2-0.6 mm。
6.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述单元结构的数量为2-8组。
7.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述球体培养腔室内采用表面活性剂进行处理；所述表面活性剂为牛血清白蛋白、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或磷脂酸。
8.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述聚二甲基硅氧烷层的厚度为2-8mm；所述端口的直径为0.8 -1.2 mm。
9.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述球体培养腔室灌注有培养基和肿瘤球体，球体培养腔室的直径大于肿瘤球体的直径，上侧辅助通道的宽度大于肿瘤球体的直径，下侧辅助通道的宽度小于肿瘤球体的直径。
10.如权利要求9所述的微流控芯片，其特征在于所述培养基为肠类器官培养基、脑类器官培养基、呼吸道类器官培养基或肝类器官培养基。
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