CN116199779A - 一种抗lilrb4单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,具体提供了一种抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,包括重链可变区和轻链可变区,单克隆抗体或其抗原结合片段选自A‑Ⅰ或B‑Ⅰ。本发明提供的抗LILRB4单克隆抗体与LILRB4抗原具有较高的结合能力,能够有效抑制LILRB4抗原与其配体复合物的结合,进而阻止下游NF‑κB信号通路的激活和ARG1的释放,促进T细胞增殖,及抑制组织浸润。本发明筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段能够用于治疗癌症,癌症包括但不限于急性髓系白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别涉及一种抗LILRB4单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是最常见的成人急性白血病,其特征是骨髓、血液和其他组织中未成熟的髓系造血细胞的异常克隆增殖,其临床表现为贫血、出血、感染和发热、脏器浸润、代谢异常等,多数病例病情急重,预后凶险,如不及时治疗常可危及生命。作为一种常见的血液恶性肿瘤,AML占全部急性白血病的70%左右,是国内十大高发恶性肿瘤之一,也是35岁以下发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。AML的发病率在国内为十万分之二左右,根据形态学分型,可以将其分为M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7型。M4和M5型AML占所有AML病人的比例大概在50%左右,并且M4和M5型AML病人存活率显著低于M0、M1、M2、M3型病人。
从上个世纪七十年代开始,“3+7”方案(阿糖胞苷和蒽环素)作为治疗AML的标准诱导治疗方案被广泛应用于儿童和成人AML患者。细胞毒性化疗的标准干预极易引起复发,在65岁或65岁以上的患者中,多达70%的患者在确诊后的一年内死于该病。虽然干细胞移植治疗可以有效降低化疗后的AML的复发率,但是干细胞移植治疗具有很高的死亡率,因此在AML缓解期进行造血干细胞移植的适应证仍有争议。除此之外,特异性靶向药物包括突变型fms样酪氨酸激酶3(FLT3)抑制剂,异柠檬酸脱氢酶1和2(IDH1和IDH2)抑制剂等能为部分AML亚型患者带来非常具有前景的治疗选择。泛靶点药物B淋巴细胞瘤-2(BCL2)抑制剂及鼠双微体2(MDM2)抑制剂等作为AML患者重要的治疗手段同样为患者提供了非常具有前景的治疗选择。但是长期使用这些药物会出现耐药现象,从而降低这些药物的治疗效果。AML患者复发和耐药的主要原因在于患者体内存在白血病干细胞,以及患者体内的免疫系统不能行使正常的免疫功能,从而导致白血病干细胞在患者体内的免疫逃逸。因此,免疫疗法通过阻断免疫抑制信号,重新激活免疫系统功能,被认为是治疗AML的基石手段。但是,免疫疗法,如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)和程序性死亡受体1(PD-1)/细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)靶向策略,并没有在AML患者中产生临床效益。虽然靶向分化簇(CD)70、CD47、CD33等靶点的单克隆抗体药物,显示出较好的抗白血病活性和耐受性,但是由脱靶效应造成的毒副作用和耐药性相关的局限性表明必须确定新的靶标及治疗手段来针对AML。
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B(LILRB)是一组I型跨膜糖蛋白,主要在髓系细胞中表达,其特征是用于配体结合的细胞外免疫球蛋白样结构域和细胞内免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。在LILRB受体结合对应的配体激活的情况下,ITIM结构域可募集酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHP-2或肌醇磷酸酶SHIP,从而调控相关信号通路抑制细胞因子,趋化因子及共刺激因子的表达,特异性抑制T细胞的激活。由于其免疫抑制功能,LILRB被认为是髓系细胞的免疫检查点蛋白。
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(LILRB4)作为LILRB家族成员,结构上包含两个细胞外免疫球蛋白样结构域及三个细胞内ITIM结构域。LILRB4在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等髓样抗原呈递细胞(APCs)中选择性表达。LILRB4特异性高表达在M4和M5型AML细胞上,并且高表达LILRB4的病人生存率显著降低。载脂蛋白E(ApoE)结合并激活LILRB4,募集SHP-2,调控核因子κB(NF-κB)信号通路,从而刺激尿激酶受体(uPAR)和精氨酸酶1(ARG1)的表达,进一步抑制T细胞增殖,促进组织浸润。抗LILRB4抗体能够阻断LILRB4与ApoE的相互作用,抑制NF-κB信号通路,降低ARG1表达,从而促进T细胞增殖并减少组织浸润。
目前,以明生物、恩格姆生物制药公司和华夏英泰(北京)生物技术有限公司均在研发靶向LILRB4的单克隆抗体药物,目前均处在临床I期阶段。抗LILRB4单克隆抗体作为首款有望用于AML的T细胞激活剂,将为全球AML和慢性粒单核细胞白血病(CMML)病患带来创新治疗方案,具有非常大的市场潜力。为此,本发明提供了一种抗LILRB4单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用。
发明内容
为了满足全球AML和慢性粒单核细胞白血病(CMML)病患的治疗需求,本发明通过对免疫文库的筛选,得到了可以与LILRB4特异性结合且具有较高生物学活性的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明具体技术方案如下:
本发明提供了一种抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区,所述轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区,所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种:
A-Ⅰ:所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示,所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示,所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示,所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示,所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示,所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示;
B-Ⅰ:所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示,所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示,所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示,所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示,所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示,所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo:12所示。
本发明通过对免疫文库的筛选得到上述2种能够与LILRB4抗原高亲和力结合的单克隆抗体分子,而且能够阻断其与配体ApoE复合物的相互作用,进而阻止下游NF-κB信号通路的激活和ARG1的释放,促进T细胞增殖,及抑制组织浸润。
进一步的,所述单克隆抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体分子,所述鼠源抗体分子选自以下任意一种:
MA-Ⅰ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示;
MB-Ⅰ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示,所述轻链可变区包含如SEQ ID No:16所示的氨基酸序列。
本发明通过用LILRB4抗原免疫小鼠,优化免疫方法,创建噬菌体展示库,并筛选出上述亲和力较高,活性较好且较为稳定的鼠源抗体分子。通过大量的细胞水平实验验证,发现MA-Ⅰ和MB-Ⅰ具有较高的生物学活性,为此,本发明优选的选择MA-Ⅰ和MB-Ⅰ。
进一步的,所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区,所述重链恒定区选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种,所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:21所示的鼠源Ck型的恒定区;所述IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNo:17所示,所述IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:18所示,所述IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNo:19所示,所述IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:20所示。
进一步的,所述单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子,所述嵌合抗体分子包括所述鼠源抗体分子的重链可变区、所述鼠源抗体分子的轻链可变区和人源化抗体恒定区。
嵌合抗体分子包括鼠源抗体分子的可变区序列和人源抗体恒定区,嵌合抗体分子的设计用于验证本发明恒定区人源化后没有改变CDR的特异功能,为人源化抗体分子的研究提供了进一步的研发基础。
进一步的,所述单克隆抗体或其抗原结合片段为人源化抗体分子,所述人源化抗体分子选自以下任意一种:
HA-Ⅰ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:27所示;
HA-Ⅱ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:28所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29所示;
HA-Ⅲ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:30所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31所示;
HB-Ⅰ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:33所示;
HB-Ⅱ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:34所示;
HB-Ⅲ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:35所示。
本发明针对鼠源抗体分子进行人源化设计后筛选得到人源化抗体分子,通过体内外的实验验证发现本发明提供的6种人源化抗体分子中,HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的生物学活性较高,药效最为显著,所以本发明优选的人源化抗体分子为HA-Ⅰ和HB-Ⅲ。
进一步的,所述人源化抗体分子还包括人源化抗体恒定区。
进一步的,所述人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区,所述人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种,所述人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:25所示的人Ck型的恒定区;所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:22所示,所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:23所示,所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:24所示。
本发明还提供了一种多核苷酸分子,所述多核苷酸分子编码所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体,所述重组DNA表达载体包含所述的多核苷酸分子。
本发明进一步提供了一种转染所述的重组DNA表达载体的宿主细胞,所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞;
优选的,所述宿主细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症药物中的应用;
所述癌症包括急性髓系白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、母细胞性浆细胞样树状突细胞肿瘤、乳腺癌、肺癌或前列腺癌中的一种或多种。
本发明的有益效果如下:本发明提供的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段与LILRB4抗原具有较高的结合能力,能够有效抑制LILRB4抗原与其配体复合物的结合,从而阻止下游NF-κB信号通路的激活和ARG1的释放,促进T细胞增殖,及抑制组织浸润;此外,本发明筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段能够用于治疗癌症,癌症包括但不限于急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、母细胞性浆细胞样树状突细胞肿瘤(BPDCN)、乳腺癌、肺癌或前列腺癌。
附图说明
图1为本发明实施例2中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱;
图2为本发明实施例3中梯度稀释ELISA抗LILRB4噬菌体单克隆抗体相对亲和力的比较图;
图3为本发明实施例5中载体pTSE的图谱;
图4为本发明实施例5中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图;
图5为本发明实施例6中鼠源抗体与LILRB4的结合能力比较图;
图6为本发明实施例8中鼠源抗体与人单核细胞白血病细胞(THP-1)表面LILRB4的结合能力比较图;
图7本发明实施例9中鼠源抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验比较图;
图8为本发明实施例10中鼠源抗体抑制THP-1分泌ARG1实验比较图;
图9为本发明实施例12中嵌合抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图;
图10为本发明实施例15中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图;
图11为本发明实施例18中人源化抗体与LILRB4结合实验图;
图12为本发明实施例19中人源化抗体与THP-1细胞表面LILRB4的结合实验比较图;
图13为本发明实施例20中人源化抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验比较图;
图14为本发明实施例21中人源化抗体抑制THP-1分泌ARG1实验比较图;
图15为本发明实施例22中人源化抗体分子的生物学活性检测(报告基因)实验比较图。
具体实施方式
为了更加容易理解本发明,描述实施例之前,先对本发明某些技术和科学术语作以下说明:
本文所使用的术语“抗体”,包含全抗体及其任一抗原结合片段,抗体包括鼠源抗体、人源化抗体、双特异抗体或嵌合抗体,抗体也可以是Fab、F(ab)2、Fv或ScFv(单链抗体),抗体可以是天然存在的抗体也可以是通过改变(例如突变、缺失、置换等)的抗体。
本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”,即为抗体重链和轻链靠近N段的序列区为可变区(V区),靠近C段的其余氨基酸序列相对稳定,为恒定区(C区),可变区包括3个互补性决定区(CDR)和4个框架区(FR),每条轻链可变区和重链可变区均有3个CDR区和4个FR区组成,重链的3个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示,轻链的3个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。
本文所使用的术语“鼠源抗体分子”,其来源是用LILRB4抗原免疫注射小鼠后得到的抗体。
本文所使用的术语“嵌合抗体分子”,是将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区融合而成的抗体,可以减轻鼠源抗体在人体内诱发的免疫应答反应。嵌合抗体是利用DNA重组技术,将鼠源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中,这样表达的抗体分子中轻重链的可变区是鼠源的,而恒定区是人源的,整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体,减少了鼠源抗体的免疫原性,同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
本文所使用的术语“人源化抗体分子”,其是将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区,替代人源抗体CDR,使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性,同时减少其异源性。
术语“CHO细胞”为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell);术语“HEK293细胞”为人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293cell),术“NS0细胞”为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,包括重链可变区和轻链可变区,重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区,轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区,单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种。
实施例2鼠源抗体分子筛选
本发明通过用LILRB4抗原(LILRB4蛋白胞外段,后续实验所使用的LILRB4抗原、蛋白均为LILRB4胞外段)免疫小鼠,优化免疫方法,创建噬菌体展示库,具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下:
步骤一:LILRB4抗原免疫小鼠
1、实验动物:种属品系:BALB/c,雌性,小鼠;体重:18-20g;
实验动物提供商:亦康(北京)医药科技有限公司。
2、免疫:对小鼠进行免疫,免疫抗原为人LILRB4(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因,本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二:噬菌体抗体库的构建
取效价较高的小鼠脾细胞,利用Trizol试剂(购买自Ambion,货号:15596026),提取小鼠脾细胞中的总RNA,RT-PCR获得cDNA,以cDNA为模板,采用简并引物(所用简并引物参考文献:Journal of Immunological Methods233(2000)167-177)进行PCR扩增,从而获得免疫小鼠抗体重链可变区(VH)基因库及轻链可变区(VL)基因库,轻重链分别双酶切,连接至同样分步骤酶切处理过的载体上,构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库,pScFv-Disb-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造,使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体,获得其质粒图谱如图1所示,并以此载体为基础,构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三:以LILRB4为抗原包被免疫管,抗原包被量为5μg/500μL/管,4℃包被过夜,再用4%脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库,室温封闭1小时。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合,噬菌体投入量约为109~1012个,室温反应1小时后,使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体,通过0.1M pH 2.2的Glycine-HCl洗脱,最后使用1.5M pH8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH 7.0左右。
步骤四:将上述中和后的噬菌体感染10mL生长至对数期的TG1菌液,37℃培养箱中静置30分钟,取出部分菌液进行梯度稀释,涂布于2YTAG平板上,用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清,将菌体沉淀重悬于少量培养基,吸出后涂布于2YTAG大平板,为下一轮筛选做准备。
步骤五:将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下,接菌至2YTAG液体培养基,摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染,在28℃条件下,220rpm培养过夜制备噬菌体,PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选,共进行一轮噬菌体库富集筛选。
步骤六:LILRB4噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选:经过一轮筛选后,挑取分隔良好的单克隆菌落,接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板,在37℃条件下,220rpm的条件下培养至其对数生长期,每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7,在37℃的温度条件下静止感染30分钟。4000rpm,离心15分钟,弃去上清,菌体用2YTAK重悬沉淀,在28℃及220rpm的条件下培养过夜。4000rpm,4℃的条件下离心15分钟后,吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定,最终筛选得到2个亲和力较高的抗LILRB4鼠源抗体候选分子,分别命名为MA-Ⅰ和MB-Ⅰ,将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列,经过测序,上述筛选到的2个单克隆抗体序列如下:
鼠源抗体分子 | 重链可变区序列 | 轻链可变区序列 |
MA-Ⅰ | SEQ ID No:13 | SEQ ID No:14 |
MB-Ⅰ | SEQ ID No:15 | SEQ ID No:16 |
具体的,SEQ ID No:13(MA-Ⅰ的重链可变区的氨基酸序列):
EVQLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRDGYDGFDYWGQGTTLTVSS;
SEQ ID No:14(MA-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQTTLSLPVSPGDQASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTLVPTFGGGTKLEIK;
SEQ ID No:15(MB-Ⅰ的重链可变区的氨基酸序列):
QVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGQLGLREGYYAVDYWGQGTSVTVSS;
SEQ ID No:16(MB-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQSPSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKLEIK。
实施例3梯度稀释ELISA比较抗LILRB4噬菌体单克隆抗体的亲和力
将实施例2中获得的2个鼠源抗体分子(MA-Ⅰ和MB-Ⅰ)进行单克隆噬菌体的展示和纯化,然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力,具体方法如下:
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRB4抗原,100ng/孔/100μL,在4℃温度条件下包被过夜,使用PBST洗涤三次,将实施例2中筛选得到的2个噬菌体单克隆抗体分别用PBST四倍梯度稀释,每孔加入100μL稀释后的样品,在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板,将PBST稀释后的HRP-anti-M13(购买自Bio-viewshine,货号:GE27-9421-01)单克隆抗体加入ELISA板中,在室温放置1小时。TMB显色试剂盒显色,室温显色10分钟,用2M H2SO4终止后,酶标仪在450nm/630nm下读数,并计算对应的半最大效应浓度(EC50)值,具体数据如下:
克隆 | MA-Ⅰ | MB-Ⅰ |
EC50 | 1.635 | 1.936 |
通过上述数据及如图2所示,实施例2筛选出的2个不同的鼠源抗体候选分子均能够与LILRB4结合。
实施例4
本发明实施例4在实施例2的基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区,重链恒定区选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种,轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:21所示的鼠源Ck型的恒定区;IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示,IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:18所示,IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:19所示,IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQID No:20所示,具体序列如下:。
SEQ ID No:17(鼠IgG1型的重链恒定区氨基酸序列):
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG;
SEQ ID No:18(鼠IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列):
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK;
SEQ ID No:19(鼠IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列):
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK;
SEQ ID No:20(鼠IgG3型的重链恒定区氨基酸序列):
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA;
SEQ ID No:21(鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列):
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。
实施例5抗LILRB4鼠源抗体分子制备
本发明实施例5在实施例4的基础上优选的限定了鼠源抗体分子包括鼠的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:17所示)和鼠Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:21所示)。抗体制备方法具体如下:
1、在将实施例2筛选出来的2个单克隆抗体的VH和VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示),优选的重链恒定区为鼠的IgG1型重链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:17所示),轻链恒定区为鼠Ck型的轻链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:21所示),pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。
2、瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所,货号为GNHu43),进行抗体表达,使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得4个单克隆抗体,同时使用BCA试剂盒(购买自:北京汇天东方科技有限公司,货号:BCA0020)进行蛋白浓度测定,之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小,结果如图4所示,从左侧到右侧依次为非还原MA-I、还原MA-I、非还原MB-I、还原MB-I鼠源抗LILRB4单克隆抗体及蛋白质分子量Marker,每条带的分子量大小与理论一致。
实施例6鼠源抗体与LILRB4的结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRB4,100ng/孔/100μL,在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次,再加入1%BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1小时,加入不同稀释浓度的MA-I、MB-I鼠源抗体,2种抗体的起始最高浓度均是50μg/mL,分别经过5倍梯度稀释,每个抗体共稀释12个梯度,在37℃温度条件下孵育1小时。用300μL/孔PBST洗涤五次,再加入用1%BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG-HRP(购买自solarbio,货号:SE131),在37℃温度条件下孵育1小时。TMB显色试剂盒显色,100μL/孔,室温显色8分钟,然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数,并计算对应的EC50值,具体数据如下:
克隆 | MA-I | MB-I |
EC50(ng/mL) | 8.347 | 12.80 |
通过上述数据及如图5所示,筛选出的2个不同鼠源抗体MA-I和MB-I均能与LILRB4结合。
实施例7鼠源抗体与LILR家族蛋白的结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRA1,LILRA2,LILRA3,LILRA4,LILRA5,LILRA6,LILRB1,LILRB2,LILRB3,LILRB4,LILRB5,100ng/孔/100μL,在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次,再加入1%BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1小时,随后加入100μL MA-I和MB-I鼠源抗体分子,2种抗体的浓度均是50μg/mL。在37℃温度条件下孵育1小时。用300μL/孔PBST洗涤五次,再加入用1%BSA-PBST 1∶2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG-HRP(购买自solarbio,货号:SE131),在37℃温度条件下孵育1小时。TMB显色试剂盒显色,100μL/孔,室温显色8分钟,然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数,具体数据如下:
LILRA1 | LILRA2 | LILRA3 | LILRA4 | LILRA5 | LILRA6 | LILRB1 | LILRB2 | LILRB3 | LILRB4 | LILRB5 | |
MA-I | 0.12 | 0.083 | 0.068 | 0.092 | 0.077 | 0.054 | 0.064 | 0.036 | 0.072 | 2.972 | 0.197 |
MB-I | 0.022 | 0.024 | 0.056 | 0.028 | 0.045 | 0.026 | 0.038 | 0.055 | 0.022 | 2.899 | 0.016 |
通过上述数据得出,筛选出的2个不同鼠源抗体MA-I和MB-I均能与LILRB4特异性结合,且不与LILR家族其它蛋白结合。
实施例8鼠源抗体与人单核细胞白血病细胞(THP-1)表面LILRB4的结合实验
取50μL不同稀释浓度的MA-I、MB-I鼠源抗体,起始工作浓度为30μg/mL,3倍梯度稀释,共稀释1 0个梯度,加入96孔板V底板中。随后向孔中添加50μL THP-1细胞悬浮液,浓度为2×106cells/mL,混匀。4℃条件下孵育1小时。随后每孔加入100μL PBS缓冲液,3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL/孔异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗鼠IgG(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:ZF-0312)(1:100稀释)。混匀后,4℃避光孵育30分钟。每孔加入100μL PBS缓冲液,3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞,流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的EC50值,具体数据如下:
克隆 | MA-Ⅰ | MB-Ⅰ |
EC50(ng/mL) | 305.9 | 351.0 |
通过上述数据及如图6所示,筛选出的2个不同鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与THP-1细胞表面的LILRB4结合。
实施例9鼠源抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验
取THP-1细胞,浓度为2×106cells/mL,铺于V底96孔板中,每孔添加50μL细胞悬浮液。随后向孔中添加50μL不同稀释浓度的MA-Ⅰ、MB-Ⅰ鼠源抗体,起始工作浓度为400μg/mL,5倍梯度稀释,共10个梯度。另外向孔中添加100μL0.4μg/mL FITC标记的ApoE蛋白。4℃条件下避光孵育1.5小时。随后每孔加入200μL PBS缓冲液,3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞,流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | MA-Ⅰ | MB-Ⅰ |
IC50(μg/mL) | 0.2037 | 0.4399 |
通过上述数据及如图7所示,筛选出的2个不同的鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与ApoE竞争结合THP-1细胞表面的LILRB4。
实施例10鼠源抗体抑制THP-1分泌ARG1
取THP-1细胞,浓度为1×107cells/mL,铺于V底96孔板中,每孔添加50μL细胞悬浮液。先将不同浓度的MA-Ⅰ,MB-Ⅰ鼠源抗体和ApoE按照1:1比例,各50μL混合均匀。鼠源抗体起始工作浓度为400μg/mL,2倍梯度稀释,共8个梯度,ApoE工作终浓度为0.5μg/mL。随后向实验孔中添加50μL鼠源抗体与ApoE混合物。37℃条件下孵育20小时后,3000rpm离心5分钟。每孔取出40μL上清加入96孔平底板中,随后按照精氨酸酶活性检测试剂盒(购买自Sigma-Aldrich,货号:MAK112-1KT)配置并预热反应底物,每孔添加10μL反应底物混匀,37℃条件下反应1小时。每孔再次添加200μL反应终止液,并使用多功能酶标仪于450nm处读吸光度值。收集数据并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | MA-Ⅰ | MB-Ⅰ |
IC50(μg/mL) | 23.86 | 45.97 |
通过上述数据及如图8所示,筛选出的2个不同的鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能抑制THP-1细胞分泌ARG1。
实施例11
本发明实施例11进一步的限定了单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子,嵌合抗体分子包括鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区。人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区,人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种,人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:25所示的人Ck型的恒定区;IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:22所示,IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:23所示,IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:24所示。
SEQ ID No:22(人IgG1型的重链恒定区氨基酸序列):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
SEQ ID No:23(人IgG2型的重链恒定区氨基酸序列):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
SEQ ID No:24(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;
SEQ ID No:25(人的Ck链的轻链恒定区氨基酸序列):
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C。
实施例12嵌合抗体分子的制备
本发明实施例12在实施例11的基础上进一步限定了人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:22所示)和人Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:25所示)。
具体的制备方法:
将实施例2中免疫噬菌体抗体库筛选得到的抗体分子MA-Ⅰ的重链可变区VH(SEQID No:13)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:14)以及MB-Ⅰ的重链可变区VH(SEQ ID No:15)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:16)保持鼠源序列不变,分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上,重链恒定区为人IgG1型(氨基酸序列如SEQ IDNO:22所示),轻链恒定区为人Ck型(氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示)。瞬时转染HEK293细胞(购买自:中国医学科学院基础医学研究所,货号为:GNHu43),进行抗体表达,分别得到嵌合抗体CA-Ⅰ和CB-Ⅰ。嵌合抗体CA-Ⅰ和CB-Ⅰ蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果如图9所示,从左侧到右侧依次为蛋白质分子量Marker,还原CA-Ⅰ,非还原CA-Ⅰ,还原CB-Ⅰ和非还原CB-Ⅰ抗LILRB4单克隆抗体,每条带的分子量大小与理论一致。
实施例13鼠源抗体分子MA-Ⅰ和MB-Ⅰ进行人源化
首先将实施例2中鼠源抗体分子MA-Ⅰ和MB-Ⅰ的序列和人抗体种系数据库(v-base)进行比较,寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列,然后将鼠源抗体分子MA-Ⅰ和MB-Ⅰ的CDR序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基,从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗体的轻、重链可变区分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成,然后再连接到瞬时表达载体上,对人源化得到的轻重链组合分析,得到如下人源化抗体分子:HA-Ⅰ,HA-Ⅱ,HA-Ⅲ,HB-Ⅰ,HB-Ⅱ,HB-Ⅲ,上述筛选到的6个单克隆抗体序列如下:
单克隆抗体 | 重链可变区 | 轻链可变区 |
HA-Ⅰ | SEQ ID No:26 | SEQ ID No:27 |
HA-Ⅱ | SEQ ID No:28 | SEQ ID No:29 |
HA-Ⅲ | SEQ ID No:30 | SEQ ID No:31 |
HB-Ⅰ | SEQ ID No:32 | SEQ ID No:33 |
HB-Ⅱ | SEQ ID No:32 | SEQ ID No:34 |
HB-Ⅲ | SEQ ID No:32 | SEQ ID No:35 |
具体的,SEQ ID No:26(HA-Ⅰ重链可变区的氨基酸序列):
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDGFDYWGQGTTVTVSS;
SEQ ID No:27(HA-Ⅰ轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPTFGGGTKVEIK;
SEQ ID No:28(HA-Ⅱ重链可变区的氨基酸序列):
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDGFD YWGQGTTVTVSS;
SEQ ID No:29(HA-Ⅱ轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPTFGGGTK VEIK;
SEQ ID No:30(HA-Ⅲ重链可变区的氨基酸序列):
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATI SSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDGYDGFD YWGQGTTVTVSS;
SEQ ID No:31(HA-Ⅲ轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPTFGGGTK VEIK;
SEQ ID No:32(HB-Ⅰ,HB-Ⅱ,HB-Ⅲ重链可变区的氨基酸序列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIG EINPSNGRTNYNEKFKTRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWGQLGL REGYYAVDYWGQGTLVTVSS;
SEQ ID No:33(HB-Ⅰ轻链可变区的氨基酸序列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPPTFGGGTKVEIK;
SEQ ID No:34(HB-Ⅱ轻链可变区的氨基酸序列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGAVKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKVEIK;
SEQ ID No:35(HB-Ⅲ轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGAVKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKVEIK。
实施例14
本发明实施例14在实施例13的基础上进一步的限定了人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区,人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种,人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:25所示的人Ck型的恒定区;IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:22所示,IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:23所示,IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:24所示。
上述人源抗体恒定区具体序列与实施例11相同。
实施例15人源化抗体分子的制备
本发明实施例15在实施例14的基础上进一步的限定了人源抗体恒定区包括人IgG1型重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:22所示)和人Ck型轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:25所示)。
将上述实施例13人源化得到的6个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示),重链恒定区为人IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示),轻链恒定区为Ck链(氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示)。
将人源化抗体分子HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅰ、HB-Ⅱ、HB-Ⅲ分别瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所,货号为GNHu43),进行抗体表达,使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得单克隆抗体,同时使用BCA试剂盒(购买自:北京汇天东方科技有限公司,货号:BCA0020)进行蛋白浓度测定,之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小,结果如图10所示,从左侧到右侧依次为非还原HA-Ⅰ,还原HA-Ⅰ,非还原HA-Ⅱ,还原HA-Ⅱ,非还原HA-Ⅲ,还原HA-Ⅲ,蛋白质分子量Marker,非还原HB-Ⅰ,非还原HB-Ⅰ,非还原HB-Ⅱ,非还原HB-Ⅱ,非还原HB-Ⅲ和非还原HB-Ⅲ抗LILRB4单克隆抗体,每条带的分子量大小与理论一致。
实施例16
本发明实施例16在上述实施例的基础上进一步的限定了人源化抗体分子为全长抗体或抗体片段,人源化抗体分子包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
实施例17
本发明实施例17在上述实施例的基础上进一步的限定了如下方案:
进一步的,本发明还提供了一种蛋白,其包含上述任意一个实施例限定的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种多核苷酸分子,多核苷酸分子编码上述任意一个实施例限定的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体,重组DNA表达载体包含上述限定的多核苷酸分子。
本发明还提供了一种转染上述限定的重组DNA表达载体的宿主细胞,宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞;
优选的,宿主细胞为哺乳动物细胞,哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物,药物包含上述任意一个实施例限定的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症药物中的应用;
优选的,所述癌症包括急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、母细胞性浆细胞样树状突细胞肿瘤(BPDCN)、乳腺癌、肺癌或前列腺癌。
实施例18人源化抗体与LILRB4结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRB4,100ng/孔/100μL,在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次,再加入1%BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1小时,加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅰ、HB-Ⅱ、HB-Ⅲ和实施例12中制备的嵌合抗体CA-Ⅰ和CB-Ⅰ,8个抗体的起始最高浓度均是50μg/mL,分别经过5倍稀释后每个抗体均稀释12个梯度,在37℃温度条件下孵育1小时。用300μL/孔PBST洗涤五次,再加入用1%BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:ZB-2304),在37℃温度条件下孵育1小时。TMB显色试剂盒显色,100μL/孔,室温显色5分钟,然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数,并计算对应的EC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HB-Ⅰ | HB-Ⅱ | HB-Ⅲ | CA-Ⅰ | CB-Ⅰ |
EC50(ng/mL) | 17.37 | 15.36 | 14.01 | 342.8 | 917.8 | 74.32 | 17.83 | 65.46 |
通过上述数据及实验结果如图11所示,6个不同的人源化抗体分子均能与LILRB4进行结合。其中HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ三个人源化单克隆抗体的亲和力比较接近。HB-Ⅰ、HB-Ⅱ、HB-Ⅲ三个人源化单克隆抗体中HB-Ⅲ的EC50值最低,说明其与LILRB4结合能力最好,亲和力最高。同时HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ的EC50值与嵌合抗体CA-Ⅰ相似,HB-Ⅲ的EC50值与嵌合抗体CB-Ⅰ相似,说明人源化后的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ以及HB-Ⅲ保留了鼠源亲本抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ与LILRB4的高亲和力。
实施例19人源化抗体与THP-1细胞表面LILRB4的结合实验
取50μL不同稀释浓度的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ、CA-Ⅰ及CB-Ⅰ抗体,起始工作浓度为32μg/mL,2倍梯度稀释,共稀释12个梯度,加入96孔板V底板中。随后向孔中添加50μLTHP-1细胞悬浮液,浓度为2×106cells/mL,混匀。4℃条件下孵育1小时。随后每孔加入100μL PBS缓冲液,3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL/孔FITC标记山羊抗鼠IgG(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:ZF-0312)(1:100稀释)。混匀后,4℃避光孵育30分钟。每孔加入100μL PBS缓冲液,3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞,流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的EC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HB-Ⅲ | CA-Ⅰ | CB-Ⅰ |
EC50(ng/mL) | 181.5 | 178.7 | 185.7 | 385.9 | 200.3 | 445.3 |
通过上述数据及如图12所示,筛选出的4个人源化抗体均能与THP-1细胞表面的LILRB4结合。此外,这4个人源化抗体分子的EC50值与对应的嵌合抗体类似,说明人源化后的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ以及HB-Ⅲ保留了鼠源亲本抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ与LILRB4的高亲和力。
实施例20人源化抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验
取THP-1细胞,浓度为2×106cells/mL,铺于V底96孔板中,每孔添加50μL细胞悬浮液。随后向孔中添加50μL不同稀释浓度的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ人源化抗体,起始工作浓度为400μg/mL,5倍梯度稀释,共12个梯度。另外向孔中添加100μL 0.4μg/mL FITC标记的ApoE蛋白,4℃条件下避光孵育1.5小时。随后每孔加入200μL PBS缓冲液,3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞,流式细胞仪上机检测,收集数据并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HB-Ⅲ |
IC50(μg/mL) | 0.4797 | 2.752 | 2.559 | 0.4265 |
通过上述数据及如图13所示,筛选出的4个人源化抗体均能与ApoE竞争结合THP-1细胞表面的LILRB4。此外,HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的IC50值最低,说明其能够有效的抑制ApoE与LILRB4的结合。
实施例21人源化抗体抑制THP-1分泌ARG1
取THP-1细胞,浓度为1×107cells/mL,铺于V底96孔板中,每孔添加50μL细胞悬浮液,先将不同浓度的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ人源化抗体和ApoE按照1:1比例,各50μL混合均匀。人源化抗体的起始工作浓度为400μg/mL,2倍梯度稀释,共稀释8个梯度。ApoE的工作浓度为0.5μg/mL。随后向孔中添加50μL人源化抗体与ApoE混合物。37℃条件下孵育20小时后,3000rpm离心5分钟。每孔取出40μL上清加入96孔平底板中,随后按照精氨酸酶活性检测试剂盒(购买自Sigma-Aldrich,货号:MAK112-1KT)配置并预热反应底物,每孔添加10μL反应底物混匀,37℃条件下反应1小时。每孔再次添加200μL反应终止液,并使用多功能酶标仪于450nm处读吸光度值。收集数据并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HB-Ⅲ |
IC50(μg/mL) | 31.20 | 249.5 | 98.54 | 30.57 |
通过上述数据及如图14所示,筛选出的4个不同的人源化均能抑制THP-1细胞分泌ARG1。此外,本发明提供的4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的IC50值最低,说明其能够有效的抑制ARG1分泌。
实施例22人源化抗体分子的生物学活性检测(报告基因)
取THP-1-NF-κB-Luc工程细胞,浓度为2×106cells/mL,铺于V底96孔板中,每孔添加50μL细胞悬浮液。随后向孔中添加100μL不同稀释浓度的4种人源化抗体分子HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ,抗体起始工作浓度为200μg/mL,5倍梯度稀释,共计8个梯度。37℃条件下孵育2小时后,添加20μg/mL ApoE蛋白,50μL每孔。轻轻混匀细胞培养板,置于37℃条件箱孵育5小时。1000rpm离心5分钟,弃上清后,按照说明书每孔加入50μL Lysis Buffer(购买自Promega,货号:E2661),室温作用10分钟充分裂解。每孔吸取10μL转移至384孔板中,每孔再加入等体积荧光底物(购买自Promega,货号:E2610),室温反应5分钟,在酶标仪下读荧光数值,并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HB-Ⅲ |
IC50(μg/mL) | 0.7557 | 2.678 | 3.437 | 0.8302 |
通过上述数据及图15所示,筛选出的4个人源化抗体分子均能阻断ApoE与LILRB4的结合,进而抑制下游NF-κB信号通路的传导。此外,本发明提供的4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的IC50值最低,说明其能够有效的抑制下游信号通路传导。
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区,所述轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区,所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种:
A-Ⅰ:所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示,所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示,所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQID No:3所示,所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示,所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示,所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示;
B-Ⅰ:所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示,所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示,所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQID No:9所示,所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示,所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示,所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示。
2.如权利要求1所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述单克隆抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体分子,所述鼠源抗体分子选自以下任意一种:
MA-Ⅰ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示;
MB-Ⅰ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示,所述轻链可变区包含如SEQID No:16所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区,所述重链恒定区选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种,所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:21所示的鼠源Ck型的恒定区;所述IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示,所述IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:18所示,所述IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQID No:19所示,所述IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:20所示。
4.如权利要求2所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子,所述嵌合抗体分子包括所述鼠源抗体分子的重链可变区、所述鼠源抗体分子的轻链可变区和人源化抗体恒定区。
5.如权利要求1所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述单克隆抗体或其抗原结合片段为人源化抗体分子,所述人源化抗体分子选自以下任意一种:
HA-Ⅰ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:27所示;
HA-Ⅱ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:28所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29所示;
HA-Ⅲ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:30所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31所示;
HB-Ⅰ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:33所示;
HB-Ⅱ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:34所示;
HB-Ⅲ:所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:35所示。
6.如权利要求5所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述人源化抗体分子还包括人源化抗体恒定区。
7.如权利要求4或6所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区,所述人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种,所述人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:25所示的人Ck型的恒定区;所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:22所示,所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:23所示,所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:24所示。
8.一种多核苷酸分子,其特征在于,所述多核苷酸分子编码权利要求1-6任一项所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段。
9.一种重组DNA表达载体,其特征在于,所述重组DNA表达载体包含权利要求8所述的多核苷酸分子。
10.一种转染如权利要求9所述的重组DNA表达载体的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞;
优选的,所述宿主细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
11.权利要求1-6任一项所述的抗LILRB4单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症药物中的应用;
所述癌症包括急性髓系白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、母细胞性浆细胞样树状突细胞肿瘤、乳腺癌、肺癌或前列腺癌中的一种或多种。
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