CN116194138A - 治疗性靶向癌症中经由xpr1:kidins220蛋白质复合物的磷酸盐调节异常 - Google Patents

治疗性靶向癌症中经由xpr1:kidins220蛋白质复合物的磷酸盐调节异常 Download PDF

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Abstract

本文公开的主题通常涉及抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出以治疗癌症，特别是卵巢癌和子宫癌。本文公开的主题还通常涉及通过检测SLC34A2的表达来确定癌症对磷酸盐输出的依赖性。还描述了用于抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的组合物。

Description

治疗性靶向癌症中经由XPR1:KIDINS220蛋白质复合物的磷酸 盐调节异常
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月7日提交的第63/062,890号美国临时申请的权益。上述申请的全部内容特此以引用的方式完全并入本文。
关于联邦政府赞助研究的声明
本发明是在美国国家卫生研究院授予的CA242457和CA212229号拨款的政府资助下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
对电子序列表的引用
电子序列表的内容(“BROD-5160WP_ST25.txt”；大小为18,185字节，并且其创建于2021年8月6日，其全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本文公开的主题一般涉及在癌症的治疗中抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出和通过检测SLC34A2的表达来确定癌症对磷酸盐输出的依赖性。
背景技术
卵巢癌和子宫癌是影响女性最致命的癌症，并且虽然基于铂的化疗和最近批准的PARP抑制剂对一些患者显示出功效2–4，但在过去的二十年中，对这些癌症的效果并没有得到很大的改善5,6。显然，我们需要新的治疗选择。
虽然对生物体的磷酸盐体内稳态有了很好的了解，但对磷酸盐输入、储存和外排的细胞协调却知之甚少。磷酸盐摄取受到高度调控，并且涉及SLC34和SLC20基因家族的成员7–9。在酵母和植物中，专门的液泡和代谢物协调磷酸盐储存，但这些途径在人体生物学中没有得到阐明10,11。磷酸盐外排是经由唯一注释的人体输出蛋白-异嗜性和多嗜性受体1(XPR1)实现的12。XPR1参与各种组织的磷酸盐体内稳态13–15，尽管对其调控机制和功能知之甚少16,17。
本申请中任何文献的引用或标识并非承认这样的文献可用作为本发明的现有技术。
发明内容
一方面，本发明提供治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括对受试者施用一种或多种能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂。在某些实施方案中，癌症选自由卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌和肺癌组成的组。在某些实施方案中，癌症的特征在于SLC34A2在肿瘤组织中的表达与在正常组织中的表达相比更高。在某些实施方案中，一种或多种治疗剂抑制XPR1的表达或活性，抑制KIDINS220的表达或活性，和/或破坏XPR1/KIDINS220相互作用。在某些实施方案中，一种或多种治疗剂包含来源于包膜病毒糖蛋白并且能够与XPR1膜受体相互作用的受体结合结构域(RBD)蛋白。在某些实施方案中，RBD蛋白是融合蛋白，其中所述融合蛋白包含能够使蛋白质二聚化和/或稳定化的结构域。在某些实施方案中，RBD蛋白与Fc结构域、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和/或血清白蛋白融合。在某些实施方案中，RBD蛋白来源于异嗜性或多嗜性鼠白血病逆转录病毒(X-和P-MLV)Env。在某些实施方案中，RBD融合蛋白包含氨基酸序列：MLVMEGSAFSKPLKDKINPWGPLIVMGILVRAGASVQRDSPHQIFNVTWRVTNLMTGQTANATSLLGTMTDTFPKLYFDLCDLVGDYWDDPEPDIGDGCRTPGGRRRTRLYDFYVCPGHTVPIGCGGPGEGYCGKWGCETTGQAYWKPSSSWDLISLKRGNTPKDQGPCYDSSVSSGVQGATPGGRCNPLVLEFTDAGRKASWDAPKVWGLRLYRSTGADPVTRFSLTRQVLNVGPRVPIGSVDVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:1)。在某些实施方案中，一种或多种治疗剂包含编码RBD蛋白的载体。在某些实施方案中，一种或多种治疗剂包括对XPR1特异性的抗体、对KIDINS220特异性的抗体或对XPR1/KIDINS220蛋白质复合物特异性的抗体。在某些实施方案中，抗体靶向KIDINS220的Walker A/B基序。在某些实施方案中，一种或多种治疗剂包含降解剂分子。在某些实施方案中，降解剂分子是LYTAC分子，由此细胞表面蛋白被靶向。在某些实施方案中，一种或多种治疗剂包括能够抑制XPR1或KIDINS220的表达的遗传修饰剂。在某些实施方案中，遗传修饰剂包括CRISPR-Cas系统、RNAi、锌指核酸酶、TALE系统或大范围核酸酶(meganuclease)。在某些实施方案中，CRISPR-Cas系统是CRISPR-Cas碱基编辑系统、先导编辑器(prime editor)系统或CAST系统。在某些实施方案中，方法还包括对受试者施用一种或多种能够抑制FGF23的表达或活性、能够抑制SLC34A2的阻抑或能够调节响应于XPR1抑制而上调或下调的一个或多个基因的剂。在某些实施方案中，在标准的护理治疗方案内共同施用一种或多种能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂。在某些实施方案中，标准的护理治疗方案包括手术和化疗。在某些实施方案中，标准的护理治疗方案包括施用免疫疗法、检查点阻断疗法或PARP抑制剂。
另一方面，本发明提供治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括：通过检测SLC34A2相对于对照的增加的表达来检测对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤，其中如果受试者具有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤，则包括根据本文的任何实施方案施用一种或多种能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂；如果受试者没有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤，则施用标准的护理治疗，所述标准的护理治疗不包括施用一种或多种能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂。在某些实施方案中，癌症选自由卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌和肺癌组成的组。在某些实施方案中，标准的护理治疗包括手术、化疗、免疫疗法、检查点阻断疗法或施用PARP抑制剂中的一种或多种。在某些实施方案中，方法还包括监测治疗的功效，所述监测治疗的功效包括在获自受试者的肿瘤样品中检测选自由SLC34A2、SLC20A1和FGF23组成的组的一个或多个基因的表达，其中如果SLC34A2和/或SLC20A1减少，和/或FGF23增加，则所述治疗是有效的。在某些实施方案中，方法还包括监测治疗的功效，所述监测治疗的功效包括检测获自受试者的肿瘤细胞中与磷酸盐调节异常相关的增加的形态学变化，其中如果检测到与磷酸盐调节异常相关的增加的形态学变化，则所述治疗是有效的。在某些实施方案中，与磷酸盐调节异常相关的形态学变化包括肿瘤细胞中的液泡样结构。
另一方面，本发明提供确定罹患癌症的受试者是否患有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤的方法，包括检测SLC34A2在获自受试者的肿瘤样品中的表达，其中如果SLC34A2在肿瘤样品中的表达与在正常组织中的表达相比更高，则所述肿瘤是敏感的。在某些实施方案中，方法还包括检测PAX8。在某些实施方案中，方法还包括检测与SLC34A2共变异的任何基因。在某些实施方案中，癌症选自由卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌和肺癌组成的组。
另一方面，本发明提供确定罹患癌症的受试者是否患有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤的方法，包括检测获自受试者的肿瘤样品中的XPR1拷贝数的扩增，其中如果在所述肿瘤样品中检测到XPR1拷贝数扩增，则所述肿瘤是敏感的。在某些实施方案中，通过根据在1号染色体上的XPR1基因座处的靶测序组推断来检测拷贝数。在某些实施方案中，癌症选自由卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌和肺癌组成的组。
在某些实施方案中，检测包括免疫组织化学(IHC)、原位RNA-seq、定量PCR、RNA-seq、CITE-seq、蛋白质印迹(western blot)、荧光原位杂交(FISH)、RNA-FISH、质谱法或FACS中的一种或多种。
另一方面，本发明提供确认能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的剂的方法，包括：对癌细胞或细胞群体施加候选剂；以及检测候选剂对所述细胞或细胞群体中的磷酸盐外排的调节，从而确认所述剂。
另一方面，本发明提供确认对抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出敏感的癌症的方法，包括：对癌细胞或细胞群体施加XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制剂；以及检测所述细胞或细胞群体中的磷酸盐浓度，其中如果与未用所述抑制剂处理的对照细胞或群体相比磷酸盐浓度增加，则所述癌症是敏感的。在某些实施方案中，XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制剂是根据本文的任何实施方案的一种或多种治疗剂。在某些实施方案中，癌细胞或群体获自或来源于有需要的受试者。
在考虑以下对示例实施方案的详细描述后，示例实施方案的这些及其它方面、目的、特征和优点对于本领域的普通技术人员来说将是显而易见的。
附图说明
将通过参考以下在说明性实施方案中给出的详细描述来获得对本发明的特征和优点的理解，在这些说明性实施例中可利用本发明的原理以及其附图：
图1–在SLC34A2过表达的情况下，XPR1在卵巢癌中是依赖性的。a.在733个癌细胞系(DepMap Avana 20Q1)中，测试了全部～17,000个基因的细胞系杀伤的可预测性和选择性。蓝绿色点代表卵巢癌细胞系中的依赖性。插图显示XPRR1的依赖性概况。b.在所有细胞系中的XPR1和SLC34A2表达和依赖性概况，大致按对XPR1的依赖性递减排序。c.因为磷酸盐转运的相对方向性原因，申请人假定XPR1失活由于SLC34A2-高卵巢癌中的细胞内磷酸盐积累而是毒性的。d.XPR1失活后的活力影响，与阴性和阳性对照基因相比按比例缩放。e.将与XPR1的失活组合的基因组规模CRISPR/Cas9筛选与功能筛选的基因组规模损失成对组合以发现依赖性的潜在“修饰”基因。Beta分数(通过MaGeCK MLE确定)代表每个基因从初始文库到最终时间点的表示的变化。蓝绿色点是仅当与XPR1失活组合时才显著的基因，而淡紫色点在XPR1臂和在对照臂(如肿瘤阻抑因子CDKN2A)中有显著变化。f.正常XPR1抗性(ES2)或XPR1敏感性(EMTOKA和OVISE)细胞系的SLC34A2状态通过过表达或敲除来修饰，且XPR1依赖性如图片d中所评价。
图2–使用shRNA验证SLC34A2过表达卵巢癌细胞系中的XPR1依赖性。a.下图，显示SLC34A2在所有癌细胞系中的表达的泡图，对XPR1的依赖程度由点的大小和颜色编码(依赖性更大的线具有色度更深的更大的点)。要注意的是，肺癌细胞系并不显示出对XPR1的依赖性，尽管SLC34A2的表达高，并且一些高度依赖性的细胞系不表达高水平的SLC34A2。上图，在由至少10种不同细胞系代表的每一谱系内，SLC34A2 mRNA表达与XPR1依赖性之间的Pearson相关性(R2)。b.用靶向XPR1(shXPR1_2和shXPR1_4)的多西环素诱导型shRNA或具有相同种子序列但不应阻抑XPR1 mRNA的种子匹配对照shRNA(shSeed_2和shSeed_4)对三种不同的细胞系进行工程化。在诱导shRNA后三天，通过蛋白质水平分析细胞裂解物的KIDINS220(参见图11)、SLC34A2(参见图9)和XPR1。标准化为纽蛋白的蛋白质水平在每个条带下方表示。c.使用shRNA试剂阻抑XPR1的活力影响是高度渗透的。将细胞以低密度铺板，并用多西环素处理以诱导shRNA的表达。铺板后14天，将存活细胞用结晶紫染色。要注意的是，shXPR1试剂有效阻抑生长，但shSeed试剂对细胞生长没有影响。d.诱导shRNA后七天，使用Cell Titer Glo(Promega)定量测量活力。IGROV1和OVISE均表达高水平的SLC34A2，并且预计依赖于XPR1；A2780不然。
图3–基因组规模的CRISPR/Cas9筛选验证了在SLC34A2高表达的情况下XPR1依赖性之间的关系。a.基因组规模双敲除修饰剂筛选的实验方法概述。OVISE(无Cas9表达)被工程化为稳定表达靶向XPR1的sgRNA。在引入含有Cas9 ORF和第二sgRNA两者的“多合一”慢病毒后，两个基因同时被Cas9切割。申请人使用了三种sgRNA：一种靶向2号染色体上的基因沙漠(sgChr2-2)，且两种靶向XPR1(sgXPR1_1和sgXPR1_2)，并用Brunello基因组规模的sgRNA文库感染细胞。感染后15天，申请人收集细胞沉淀(由于XPR1依赖性细胞死亡，在sgXPR1臂中要小得多)，并对sgRNA进行测序。b.XPR1和SLC34A2的双敲除的蛋白质印迹(Western)确认。用表达对照、XPR1或SLC34A2靶向sgRNA的“多合一”慢病毒感染基因组规模筛选中使用的三个细胞系。要注意的是，在sgXPR1“锚”细胞系中，XPR1被对照病毒阻抑，表明第一次感染提供XPR1靶向sgRNA，且第二次感染提供Cas9蛋白。NIC代表“无感染对照”。c.基因组规模修饰剂筛选的臂水平结果。参见有关完整分析细节的方法。Beta分数代表一个基因相对于所有其它基因富集或贫乏的程度。
图4–XPR1和SLC34A2在患者样品中过表达，并且XPR1依赖性在小鼠异种移植物研究中得以保持。a.在正常(GTEx)、肿瘤(TCGA)和癌细胞系(CCLE)样品中比较SLC34A2 mRNA表达。对于CCLE细胞系，指示了XPR1依赖性状态(CERES<-0.5)。要注意的是，输卵管是许多卵巢癌/子宫癌的起源组织。b.1号染色体的～2.5Mb区域的XPR1拷贝数热图，显示了浆液性卵巢癌(TCGA OV)中的XPR1扩增。c.如在图片a中，在各指定组织中比较XPR1mRNA表达。对于TCGA样品，指示了XPR1拷贝数状态(GISTIC)。d.在卵巢癌细胞系OVISE中的CRISPR/Cas9竞争肿瘤形成测定中，对XPR1和指定基因的消耗作图。GPX4被用作代谢依赖性基因。PAX8在许多卵巢癌中是基准依赖性的。POLR2D是泛必需阳性对照。灰色框代表靶向人类基因组中非基因位点的15种不同对照sgRNA的变异性。e.与图片d相同，但为子宫癌细胞系SNGM。f.使用多西环素诱导型shXPR1_2阻抑XPR1后播散性卵巢癌症的模型的肿瘤生长。插图显示了线性标度上的完整生长曲线，而较大的图像为处理后的生长百分比。g.与f中相同，但为非靶向shSeed_2。
图5–卵巢癌中的SLC34A2和XPR1过表达可能由PAX8驱动。a.SLC34A2表达在各组织中的比较。使用如图4a和c中组合的GTEx、TCGA和CCLE数据集，比较SLC34A2在每个组织中相对于所有其它组织的差异表达。相关的妇科组织(输卵管、卵巢和子宫)以蓝绿色突出显示。b.相对于正常组织，PAX8表达在肿瘤样品中增加。以与图4a中相同的方式，在各指定组织样品中比较PAX8表达。q值表示根据Wilcoxon秩和检验，采用多重比较的Bonferroni校正，指定群体具有相同PAX8表达的可能性。c.PAX8和SLC34A2表达在输卵管、卵巢和子宫组织中高度相关。d.1号染色体的～2.5Mb区域的XPR1拷贝数热图，显示了TCGA子宫体子宫内膜癌中的XPR1扩增28。每个患者样品由水平线表示。红色表示拷贝增加，且蓝色表示拷贝丢失。垂直虚线是指定基因的位置。数据为样品的子集，其等级按最高拷贝增加排序，以指示局灶和染色体臂水平增加。
图6–XPR1依赖性不受组织培养基中磷酸盐水平的影响。a.依赖性图细胞系的生长培养基中的磷酸盐浓度并不决定XPR1依赖性的程度。磷酸盐的浓度是根据制造商配方估算的(参见方法)。b.操纵组织培养基并评估其对XPR1依赖性的影响的实验程序。将同一亲本癌细胞系工程化以表达萤火虫荧光素酶和Cas9，或仅表达海肾荧光素酶。在使细胞系在低磷酸盐RPMI 1640中生长一周后，将两种变体混合在一起，并用sgRNA编码慢病毒感染。在选择慢病毒感染的细胞系后，通过采用DualGlo测定法(Promega)测量萤火虫：海肾荧光素酶的比率来确定Cas9：亲代细胞的初始表示。在感染后一周(方案的第16天)，采用DualGlo确定遗传扰动对细胞活力的损害程度。c.XPR1依赖性在低磷酸盐培养基条件下保持。在图片b中概述的测定中对SNGM(依赖于XPR1的子宫内膜细胞系)和ES2(没有XPR1依赖性的透明细胞卵巢细胞系)进行了分析。要注意的是，在图下面显示的CERES分数代表敲除XPR1后并在指定生长培养基中生长21天的细胞系的活力缺陷。
图7–用于小鼠异种移植物中的靶标验证的体内CRISPR/Cas9竞争测定。a.体内竞争测定的实验设计。采用快速感染和选择方案，可经由慢病毒将合并的sgRNA引入到癌细胞系中，并作为皮下异种移植物接种，并且可以在比组织培养物更具有生理学相关性的环境中评价基因敲除的效果。b.在用合并的sgRNA快速感染后，将800万个SNGM细胞作为皮下异种移植物接种并使其生长。在指定的时间点收获肿瘤组织。c.与d中相同，但用于使用OVISE癌细胞系的实验。d.通过PCR和下一代测序分析评价肿瘤异种移植物中的sgRNA丰度，并将与早期时间点相比的倍数变化显示为所有阴性对照基因以及在任何筛选中丰度变化>4倍的任何基因的热图。与d中相同，但用于使用OVISE癌细胞系的实验。
图8–XPR1阻抑阻止播散性卵巢癌症的生长。a.用以评估XPR1阻抑对既定的腹膜内卵巢癌症的影响的实验设计。将以组成型方式表达荧光素酶的IGROV1工程化以可诱导地表达shXPR1_2(以阻抑XPR1)或shSeed_2(对照)。因为模型的体内生长动力学是未知的，所以在小鼠的腹膜腔中接种4种不同的细胞密度，并采用生物发光成像监测肿瘤生长。肿瘤生长三周后，给来自每个接种组的一只小鼠喂食多西环素食物以诱导shRNA的表达。处理后2-3周内，动物出现腹水，因此终止研究。b.用shXPR1_2工程化的IGROV1细胞的生长速率不依赖于接种的细胞数量。c.与图片b中相同，但为用shSeed_2工程化的IGROV1细胞。d.在处理时，肿瘤负荷在四个不同组中是相当的。e.每个处理组和shRNA组出现腹水的动物数。f.在研究终止后，在指定器官上检测以组成型方式表达荧光素酶的IGROV1细胞。在此，细胞取自来自shXPR1_2-Dox组的小鼠。
图9–转录谱分析突出了在SLC34A2过表达卵巢癌中对XPR1失活的磷酸盐体内稳态反应。a.在用多西环素处理和诱导shRNA后的不同时间点，在OVISE和IGROV1细胞系中测量细胞内磷酸盐。b.MixSeq scRNA测序结果的UMAP投影，用于比较XPR1失活后的多样癌细胞。c.中图，在使细胞周期的影响消退后，前500个差异表达的基因的对数倍数变化。左图，每个细胞系的总结注释包括XPR1依赖性(XPR1 CERES)、总体转录变化(平均LFC)和在单细胞数据中观察到的细胞周期停滞的程度(ΔG0/G1)。右图，总体转录变化的细胞系之间的相关性。d.对于左侧的高度相关的细胞系(参见图片c)和右侧的其它五个细胞系，对所测量的指定基因中的转录变化作图。e.XPR1失活后SLC34A2蛋白质水平的定量(通过简单蛋白质测量)。f.在指定基因失活后，在OVISE卵巢癌细胞系中测量放射性磷酸盐摄取。
图10–转录谱分析揭示了XPR1阻抑后的磷酸盐相关的体内稳态反应。a.与总磷酸盐平行测量细胞的活力(通过总蛋白质含量测量)。图9a中报道的总细胞内磷酸盐是指测量的总磷酸盐除以细胞活力。b.用以在许多不同癌细胞系中确定XPR1失活的转录谱的实验工作流程。将细胞系根据其倍增时间合并，并在小的库中用对照或XPR1 sgRNA以高感染复数(MOI)感染，以便最大化XPR1失活的外显率。感染后当天，用嘌呤霉素选择细胞，然后使其生长，直到感染后第四天。在此时，每次扰动对细胞进行计数和合并，并与含有RNA“哈希(Hash)标签”的细胞表面标记抗体一起孵育。然后将经过扰动的细胞合并，并进行10X基因组学单细胞RNA测序(scRNAseq)流程。每个细胞的单核苷酸多态性(SNP)谱用于将其分配给特定的细胞系，而“哈希标签”条形码用于确定细胞接受了哪种扰动。c.每个细胞系的细胞总数。差异可能是由于每个库(pool)内个别细胞系的生长或对所使用的高MOI的敏感性的差异所致。d.对每种细胞测量的独特转录物的总数，如通过独特分子标识符(UMI)所测量，所述独特分子标识符在扩增和下一代测序之前包括在文库的制备中。e.在两种条件(对照与XPR1失活)之间比较每个细胞系收集的细胞数，以确定在实验的～4天时间框架中是否观察到活力缺陷。f.在细胞周期消退后，通过基因集富集分析在依赖细胞系(IGROV1、EFE184、OVISE、RMGI、OVMANA和OVCAR4)内的XPR1失活后表达增加的基因。g.与f中相同，但为XPR1失活后减少的基因。h.在使用多西环素诱导shXPR1_2(IGROV1)或shXPR1_4(OVISE)后四天，采用ELISA在条件培养基中测量分泌的FGF23的量。要注意的是，在此时间点观察到SLC34A2阻抑。
图11–XPR1的磷酸盐外排能力是SLC34A2过表达癌细胞系中的活力所需的。a.在筛选的737个癌细胞(DepMap Avana 20Q1)中，对XPR1或KI DINS220失活的活力缺陷作图。b.在HEK-293T中表达指定的XPR1开放阅读框后，采用共免疫沉淀评价带V5标签的ORF与KIDINS220之间的相互作用。有关这些构建体的设计，参见图13a。c.在XPR1或KIDINS220的遗传失活后，采用免疫荧光法确定XPR1-V5的定位。要注意的是，sgXPR1_1使内源性XPR1和XPR1-V5 ORF均失活，因此预期不应有染色。d.在XPR1或KIDINS220的遗传失活后三天，用放射性磷酸盐加载细胞，然后测量30分钟后的外排。e.测试指定XPR1构建体拯救内源性XPR1的敲除的能力。先前已显示XPR1中的L218S突变仅具有～50％的XPR1外排能力。f.XPR1失活后4-5天的“液泡样”表型的相衬图像。箭头指示“液泡样”结构的位置。比例尺＝200um。g.在XPR1失活后五天，使用酸性染料Lysotracker将活细胞染色。h.在XPR1失活后的OVISE癌细胞中的“液泡样”结构(标记为V)或溶酶体(Lys)的透射电子显微照片。
图12–在大规模数据集中，XPR1和KIDINS220共表达和共沉淀。a.在具有如图1d中的一系列SLC34A2表达的卵巢癌和子宫癌细胞系中进行KIDINS220依赖性的验证。b.SLC34A2表达对于KIDINS220依赖性是必要且充分的，如图1f中所表现的那样。c.XPR1和KIDINS220 mRNA水平在许多组织中是高度相关的。使用GTEx、TCGA和CCLE数据，计算Pearson相关性。d.XPR1和KIDINS220阻抑均导致细胞内磷酸盐增加，这取决于SLC34A2表达。用指定的sgRNA感染后五天，如图9a中那样测定细胞内磷酸盐。e.高通量蛋白质:蛋白质相互作用数据库表明XPR1和KIDINS220为蛋白质复合物的一部分。从BioGrid和Bioplex数据库中下载XPR1和KIDINS220的相互作用配偶体并进行比较。在多个数据集中始终存在于XPR1或KIDINS220的相互作用组中的基因被称为文本。
图13–XPR1结构域突变体在定位上和KIDINS220有所不同a.XPR1WT是指由NM_004736(唯一检测到的同种型)产生的696个氨基酸的蛋白质，而XPR1(简称)是指NM_001135669的631个氨基酸的产物。所有构建体均具有用于免疫沉淀、蛋白质印迹和免疫荧光检测的C末端V5标签。b.使用V5表位标签测试的一些XPR1突变体的免疫荧光定位。左图，WT XPR1定位于分泌途径以及细胞质内的点。中图，XPR1(简称)染色似乎要更加弥散得多。L218S突变具有与WT XPR1相同的定位模式，与适当的输运方式一致，类似于先前已经所观察到的(参见正文)。c.XPR1结构域突变体与内源性KIDINS220在293s中共免疫沉淀。这是图9b的未剪切形式，包括仅SPX结构域的构建体(泳道6-7)。右图，来自实验的全细胞提取物(WCE)，表明了KIDINS220的不同表达水平。应当注意的是，大部分背景信号归因于同一实验中内源性XPR1的免疫印迹。绿色箭头表示ORF的预期分子量，与降解产物形成对照。d.引导抗性ORF的蛋白质印迹验证。用指定的sgRNA感染OVISE.Cas9细胞(亲本，左图，或过表达WTXPR1 ORF，右图，用在图9e中)，并在感染后5天收获。XPR1 ORF包括阻断sgXPR1_2的结合、但不阻断sgXPR1_1的结合的突变(注意，用sgXPR1_1阻抑两种同种型，但用sgXPR1_2仅阻抑内源性XPR1)。
图14–常见的细胞器染色不标记“液泡”。a.用编码sgXPR1_2的慢病毒感染后6天，使用指定的染料和染色剂将OVISE.Cas9和SNGM.Cas9细胞系染色并成像。箭头通过相衬指示液泡结构的位置(图中未显示)。对于溶酶体染料LAMP1仅观察到阳性染色。b.XPR1失活后4-5天的“液泡样”表型的相衬图像。箭头指示“液泡样”结构的位置。比例尺＝200um。c.在XPR1或KIDINS220与对照sgRNA(sgChr2-2)的CRISPR失活后5天，XPR1依赖性细胞系OVISE的活细胞DIC和共聚焦免疫荧光图像。用Lysotracker(红色)检测酸性细胞器，并用DAPI(蓝色)检测DNA。箭头指示“液泡样”结构的位置。d.XPR1失活后5天的OVISE.Cas9的透射电子显微照片。图内标出了比例尺。溶酶体和“液泡样”结构分别由“Lys”和“V”表示。e.与c中相同，但为KIDINS220失活。
图15–RBD融合蛋白(51.2kDa)的示例性设计。该蛋白质包括33个残基信号序列、来自NZB株的207个残基RBD、4个残基接头(GSVD)和来自小鼠IgG1的227个残基Fc。
图16–可以感染鼠XPR1的其它病毒株的分类。
图17A-17G–XRBD是XPR1和KIDINS220蛋白质复合物的药物样抑制剂。a)XRBD蛋白抑制XPR1依赖性磷酸盐外排。通过将IGROV1卵巢癌细胞系与不含补充有32P-标记的磷酸盐的磷酸盐的RPMI一起孵育，充分洗涤细胞，然后在标准RPMI(～10mM磷酸盐)中孵育细胞，由此测量磷酸盐外排。30分钟后，收集条件培养基并洗涤细胞，然后裂解。将磷酸盐外排计算为在条件培养基中测得的32P相对于在裂解物和条件培养基中测得的总32P的百分比。在有指示的情况下，用250ng/mL多西环素将细胞预处理72小时，以经由shXPR1_2诱导XPR1阻抑。在有指示的情况下，在实验的32P摄取和外排部分期间用不同剂量的XRBD蛋白处理细胞。在有指示的情况下，在外排部分期间使用“无磷酸盐”RPMI以防止细胞输出任何32P。b)在293T细胞中稳定敲除XPR1或KIDINS220的蛋白质印迹确认。用含有靶向XPR1或KIDINS220的Cas9和sgRNA两者的“多合一”质粒瞬时转染293T细胞。通过有限稀释分离克隆群体并通过蛋白质印迹进行分析。野生型人XPR1(hXPR1)作为对照在敲除背景中再表达。c)b中分析的293T细胞的XRBD流式细胞术分析。将细胞与20nM XRBD-mFc一起在37c下孵育30分钟，接着进行充分洗涤，并与同AlexaFluor488(Invitrogen)缀合的抗小鼠二抗一起孵育。左图，来自至少10,000个单细胞的直方图。右图，在左图上所示的群体的中值荧光强度被显示为热图。d)XRBD处理导致卵巢癌细胞系中的活力缺陷。将指定的细胞系用指定浓度的XRBD蛋白处理，并在五天后通过Cell Titre Glo(CTG，Promega)评估细胞活力。右图，比较每个细胞系的XPR1失活敏感性(通过CRISPR活力测定评估)和XRBD敏感性(用相对于媒介物对照为最高剂量的XRBD处理五天后的细胞活力降低)的热图。下图，XPR1失活敏感性与XRBD处理之间的Pearson相关系数。e)肺癌细胞系小组中的蛋白质印迹分析和XRBD处理。XPR1或SLC34A2在指定细胞系中失活后5天，通过蛋白质印迹分析XPR1或SLC34A2蛋白质水平。下面，如d中那样评估细胞活力。f)有或没有KIDINS220失活的情况下，含有XPR1的天然蛋白质复合物的甘油梯度沉降分析。将在b中分析的293T细胞或稳定的KIDINS220敲除细胞系裂解，并将1mg裂解物在10-30％甘油梯度上面分层，并在4c下在SW55转子中以55,000RPM旋转3.5小时，以根据分子量分离蛋白质复合物。从每个梯度中收集24个级分，其中低分子量复合物对应于低级分数(即，1-7)，并且较大的蛋白质复合物为较大数。通过免疫印迹在级分中检测XPR1。g)FGF23的RT-PCR验证。在用多西环素诱导指定的shRNA后2或4天，从细胞中提取RNA，逆转录成cDNA，并通过基因特异性引物定量XPR1、FGF23或纽蛋白(管家对照)的水平。将所示的数据标准化为纽蛋白，并显示为相对于没有多西环素处理(Ctl)的匹配时间点的Log2倍数变化。
本文的附图仅用于说明目的，并且不一定按比例绘制。
具体实施方式
一般定义
除另有定义外，本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。分子生物学中常用的术语和技术的定义可见于：Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(1989)(Sambrook、Fritsch和Maniatis)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版(2012)(Green和Sambrook)；Current Protocols in Molecular Biology(1987)(F.M.Ausubel等人编著)；the seriesMethods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(1995)(M.J.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor编著)：Antibodies,A Laboratory Manual(1988)(Harlow和Lane编著)：Antibodies A Laboratory Manual，第2版2013(E.A.Greenfield编著)；Animal Cell Culture(1987)(R.I.Freshney编著)；BenjaminLewin，Genes IX，Jones and Bartlet出版，2008(ISBN 0763752223)；Kendrew等人(编著)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0632021829)；Robert A.Meyers(编著)，Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference，VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN9780471185710)；Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版，J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)，March，Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure第4版，John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)；以及Marten H.Hofker和Jan van Deursen，Transgenic Mouse Methods and Protocols，第2版(2011)。
如本文所用，除上下文另有明确规定外，单数形式“一个(种)”和“该(所述)”包括单数和复数指代项两者。
术语“任选的”或“任选”意指随后描述的事件、情况或取代基可能会出现或可能不会出现，并且该描述包括该事件或情况出现的情况和其不出现的情况。
通过端点表述数值范围包括归入相应范围内的所有数值和分数以及所表述的端点。
如本文所用的术语“约”或“大约”当指可测量的值如参数、量、持续时间等时意在涵盖指定值的变化和偏离指定值的变化，如指定值的和偏离指定值的+/-10％或更小、+/-5％或更小、+/-1％或更小以及+/-0.1％或更小的变化，只要这类变化在所公开的发明中进行是适当的。应当理解的是，修饰语“约”或“大约”所指的值本身也被具体且优选地公开。
如本文所用，“生物样品”可含有全细胞和/或活细胞和/或细胞碎片。生物样品可含有(或来源于)“体液”。本发明涵盖这样的实施方案，其中体液选自羊水、房水、玻璃体液、胆汁、血清、母乳、脑脊髓液、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、渗出液、粪便、女性潮射、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻引流物和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、痰液、滑液、汗液、泪液、尿液、阴道分泌物、呕吐物及其一种或多种的混合物。生物样品包括细胞培养物、体液、来自体液的细胞培养物。体液可得自哺乳动物生物体，例如通过穿刺或其它收集或取样程序。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠、类人猿、人、农场动物、竞技动物和宠物。还涵盖体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞以及它们的后代。
下文描述各种实施方案。应当注意的是，具体的实施方案并不旨在作为详尽的描述或者作为对本文所讨论的更广泛的方面的限制。结合特定实施方案描述的一个方面不一定限于该实施方案，并且可以与任何其它实施方案一起实施。在整个说明书中提到“一个实施方案”、“实施方案”、“示例实施方案”意指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书的各处出现的短语“在一个实施方案中”、“在实施方案中”或“示例实施方案”不一定指同一实施方案，但可以指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定特征、结构或特性可以按任意合适的方式组合，这将是本领域技术人员根据本公开内容显而易见的。此外，虽然本文描述的一些实施方案包括其它实施方案中包括的一些特征但不包括其它特征，但不同实施方案的特征的组合意味着在本发明的范围内。例如，在所附权利要求中，可以任意组合使用任何要求保护的实施方案。
参考Bondeson等人，“Phosphate dysregulation via the XPR1:KIDINS220protein complex is a therapeutic vulnerability in ovarian cancer”bioRxiv2020.10.16.339374；doi.org/10.1101/2020.10.16.339374(2020年10月17日发布至bioRxiv)。本文引用的所有出版物、公布的专利文件和专利申请特此以引用的方式并入，其程度如同每个单独的出版物、公布的专利文件或专利申请被具体和单独地指出是以引用的方式并入那样。
概述
利用癌症特异性代谢状态是在不伤害正常组织的同时杀伤癌细胞的一种有吸引力的策略1。无机磷酸盐是DNA的基本组分，是许多途径中的中间代谢物，并且是关键的信号传导分子，然而尚未探索将扰乱磷酸盐体内稳态作为癌症疗法。通过在许多癌细胞系中分析活力筛选的CRISPR/Cas9丢失，申请人发现作为磷酸盐输入蛋白的SLC34A2的高表达使细胞对磷酸盐输出蛋白XPR1的失活敏感。这一意外的发现表明，无机磷酸盐的积累可能对癌细胞有毒性。申请人在癌细胞系和小鼠异种移植物中广泛验证了这种合成致死性相互作用，并且发现了许多原发性卵巢癌肿瘤对磷酸盐调节异常敏感的证据。在机理上，申请人还确认了旨在恢复磷酸盐体内稳态的转录反应。申请人还确认了磷酸盐外排所需的XPR1结合配偶体(KIDINS220)。申请人还确认了申请人假定与细胞内磷酸盐的毒性积累相关的新的液泡结构。申请人还表明，病毒XPR1结合蛋白受体结合结构域(RBD)抑制XPR1依赖性磷酸盐外排，并且是XPR1的药物样抑制剂。总体而言，这些数据说明了卵巢癌细胞保持磷酸盐体内稳态的新机制，并且这些机制的扰动是卵巢癌中未被重视的治疗易感性。
本文公开的实施方案提供了基于确认肿瘤细胞(例如，过表达SLC34A2的肿瘤)中对XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的依赖性来治疗和诊断癌症的方法。在示例性实施方案中，受体结合结构域(RBD)抑制XPR1依赖性磷酸盐外排，并且是可用于治疗敏感性肿瘤的XPR1的药物样抑制剂。敏感性肿瘤表达增加的SLC34A2(一种磷酸盐输入蛋白)，并且不会响应于XPR1/磷酸盐外排抑制而充分阻抑磷酸盐输入以阻止细胞生长抑制。申请人进一步确认了与SLC34A2共变异(例如，共同变异)的基因，这些基因也可单独或组合用于检测易受XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出(例如，PAX8)的抑制影响的癌症。如本文所用，术语“共变异”是指一起上调和下调的基因。如本文所用，基因之间的“相关性”是指共变异的基因。申请人确认了响应于XPR1抑制而差异表达的基因。例如，SLC34A2和SLC20A1被阻抑，且而FGF23被上调。申请人确定肿瘤细胞改变表达，以便恢复磷酸盐体内稳态。因此，针对这些机制可进一步增加敏感性肿瘤的易感性。
如本文所用，XPR1是指异嗜性和多嗜性逆转录病毒受体1(也称为：IBGC6、SLC53A1、SYG1、X3)。示例性序列包括以下NCBI登录号：NM_004736.4、NM_001135669.2、NM_001328662.2、NP_004727.2、NP_001129141.1和NP_001315591.1。XPR1包括SPX结构域(N-末端)和EXS结构域(C-末端)，除了靶向整个蛋白质之外，它们还可以被治疗剂(例如，小分子、抗体)或用于检测表达的剂(例如，抗体)靶向。XPR1是后生动物中的磷酸盐输出蛋白，这是一种不需要SPX结构域的功能(参见例如Giovannini等人，Inorganic phosphate exportby the retrovirus receptor XPR1 in metazoans.Cell Rep.2013；3(6):1866-1873；Legati等人，Mutations in XPR1 cause primary familial brain calcificationassociated with altered phosphate export.Nat Genet.2015；47(6):579-581；Ansermet等人，Renal Fanconi Syndrome and Hypophosphatemic Rickets in theAbsence of Xenotropic and Polytropic Retroviral Receptor in the Nephron.J AmSoc Nephrol.2017；28(4):1073-1078)。
如本文所用，KIDINS220是指激酶D相互作用底物220(也称为：ARMS、SINO)。示例性序列包括以下NCBI登录号：NM_020738.4、NM_001348729.2、NM_001348731.2、NM_001348732.2、NM_001348734.2、NM_001348735.2、NM_001348736.2、NM_001348738.2、NM_001348739.2、NM_001348740.2、NM_001348741.2、NM_001348742.2、NM_001348743.2、NM_001348745.2、NP_065789.1、NP_001335658.1、NP_001335660.1、NP_001335661.1、NP_001335663.1、NP_001335664.1、NP_001335665.1、NP_001335667.1、NP_001335668.1、NP_001335669.1、NP_001335670.1、NP_001335671.1、NP_001335672.1和NP_001335674.1。KIDINS220包括可以被治疗剂(例如，小分子、抗体)或用于检测表达的剂(例如，抗体)靶向的含有锚蛋白重复序列的结构域(N-末端)和KAP家族P-环结构域。P-环结构域的特征在于两个保守基序，称为Walker A和B基序。Walker A基序也称为Walker环或P-环或磷酸盐结合环，是蛋白质中与磷酸盐结合相关的基序。Walker B基序是完全位于A-基序下游的大多数P-环蛋白中的基序。
如本文所用，SLC34A2是指溶质载剂家族34成员2(也称为：NAPI-3B、NAPI-IIb、NPTIIb、PULAM)。示例性序列包括以下NCBI登录号：NM_006424.3、NM_001177998.2、NM_001177999.1、NP_006415.3、NP_001171469.2和NP_001171470.1。已经描述了来源于针对NaPi2B转运蛋白的人源化单克隆抗体的互补决定区高变结构域氨基酸序列的合成肽，用于抑制肿瘤生长或治疗癌症(US 9,193,797 B2)。
如本文所用，SLC20A1是指溶质载剂家族20成员1(也称为：GLVR1、Glvr-1、PIT1、PiT-1)。示例性序列包括以下NCBI登录号：NM_005415.5和NP_005406.3。
如本文所用，PAX8是指配对盒8。示例性序列包括以下NCBI登录号：NM_003466.4、NM_013952.4、NM_013953.4、NM_013992.4,NP_003457.1、NP_039246.1、NP_039247.1和NP_054698.1。
如本文所用，FGF23是指成纤维细胞生长因子23(也称为：ADHR、FGFN、HFTC2、HPDR2、HYPF、PHPTC)。示例性序列包括以下NCBI登录号：NM_020638.3和NP_065689.1。
本发明可用于治疗依赖于XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的任何癌症。在其它优选的实施方案中，癌症与正常组织相比具有增加的SLC34A2表达(例如，卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌和肺癌)。在更优选的实施方案中，癌症是卵巢癌或子宫癌。本文在诊断方法部分中进一步描述SLC34A2表达的检测。
可受益于用XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的一种或多种抑制剂治疗的示例性癌症包括但不限于液体肿瘤如白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒单核细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病、非霍奇金病)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病或多发性骨髓瘤。所述癌症可包括但不限于实体肿瘤，如肉瘤和癌。实体肿瘤的实例包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、上皮癌、支气管癌、肿瘤、结肠直肠癌(例如，结肠癌、直肠癌)、肛门癌、胰腺癌(例如，胰腺腺癌、胰岛细胞癌、神经内分泌肿瘤)、乳腺癌(例如，导管癌、小叶癌、炎性乳腺癌、透明细胞癌、粘液癌)、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌或表面上皮-间质肿瘤，包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌、性索-间质肿瘤)、前列腺癌、肝癌和胆管癌(例如，肝细胞癌、胆管癌、血管瘤)、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾癌(例如，肾细胞癌、透明细胞癌、维尔姆斯瘤、肾母细胞瘤)、宫颈癌、子宫癌(例如，子宫内膜腺癌、子宫乳头状浆液性癌、子宫透明细胞癌、子宫肉瘤和平滑肌肉瘤、混合苗勒管肿瘤)、睾丸癌、生殖细胞瘤、肺癌(例如，肺腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、细支气管肺泡癌、非小细胞癌、小细胞癌、间皮瘤)、膀胱癌、印戒细胞癌、头颈癌(例如，鳞状细胞癌)、食道癌(例如，食道腺癌)、脑肿瘤(例如，神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、雪旺瘤、脑膜瘤)、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经内分泌肿瘤、黑色素瘤、胃癌(例如，胃腺癌、胃肠道间质瘤)或类癌。淋巴增殖性病症也被认为是增殖性疾病。在某些示例实施方案中，癌症是卵巢癌。在某些其它示例实施方案中，癌症是子宫癌。
另一方面，本文公开的实施方案涉及治疗癌症的方法，其基于确定受试者是否具有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤，并且如果受试者具有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤，则施用靶向XPR1:KIDINS2200介导的磷酸盐输出的一种或多种治疗剂。另一方面，本文公开的实施方案提供通过检测肿瘤样品中的SLC34A2的表达或检测肿瘤样品中的XPR1拷贝数的扩增来确定受试者是否具有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤的方法。
靶向癌症依赖性的治疗方法
治疗剂
在某些实施方案中，本发明提供了靶向XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的一种或多种治疗剂。在优选的实施方案中，治疗剂是XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制剂。在某些实施方案中，治疗剂阻断或破坏XPR1:KIDINS220蛋白质复合物发挥从肿瘤细胞中输出无机磷酸盐的作用。在某些实施方案中，治疗剂阻断XPR1:KIDINS220蛋白质复合物的形成。在某些实施方案中，治疗剂靶向XPR1的细胞外结构域。在某些实施方案中，治疗剂靶向XPR1的SPX结构域或EXS结构域。在某些实施方案中，治疗剂靶向KIDIN220的含有锚蛋白重复序列的结构域或KAP家族P-环结构域(包括Walker A/B基序)。
在某些实施方案中，靶向XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出可结合当前的标准护理进行，并且可提供改善的治疗和/或更低的毒性。一种或多种治疗剂包括治疗性多肽、小分子抑制剂、小分子降解剂(例如，ATTEC、AUTAC、LYTAC或PROTAC)、抗体、抗体片段、抗体样蛋白支架、适体、遗传修饰剂(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN、锌指核酸酶、大范围核酸酶)、RNAi或其任意组合。在一个示例性实施方案中，一种或多种治疗剂包括一种或多种治疗性多肽。在另一示例实施方案中，治疗性多肽是包膜受体结合结构域(RBD)。在另一示例实施方案中，一种或多种治疗剂包括一种或多种对XPR1特异、对KIDINS220特异或对XPR1/KIDINS2200复合物特异的抗体。
术语“治疗剂(therapeutic agent)”、“能够治疗的剂”或“治疗剂(treatmentagent)”可互换使用，并且是指在对受试者施用时赋予一些有益效果的分子或化合物或分子或化合物的组合。有益效果包括允许进行诊断确定；疾病、症状、病症或病理状况的改善；减少或预防疾病、症状、病症或疾患的发作；并且通常抵消疾病、症状、病症或病理状况。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”或“减轻”或“改善”可互换使用。这些术语是指获得有益或所需结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。所谓治疗益处意指治疗中的一种或多种疾病、疾患或症状的任何治疗相关的改善或效果。对于预防益处，可以对有患特定疾病、疾患或症状的风险的受试者或对报告有疾病的一种或多种生理症状的受试者施用所述组合物，即使所述疾病、疾患或症状可能尚未显现。如本文所用，“治疗”包括改善、治愈、防止情况恶化、减缓进展速度或防止病症再次发生(即，防止复发)。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或所需结果的剂的量。治疗有效量可根据以下中的一者或多者而变化：所治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等，这些可以由本领域普通技术人员很容易地确定。该术语还适用于将提供用于通过本文所述的任何一种成像方法检测的图像的剂量。具体的剂量可根据以下中的一者或多者而变化：所选择的特定剂、要遵循的给药方案、是否与其它化合物联合施用、施用时机、要成像的组织和携带其的物理递送系统。
例如，在治疗受试者的癌症的方法中，靶向表观遗传基因的抑制剂的组合的有效量是提供抗癌作用如减少或防止癌细胞增殖或对癌细胞具有细胞毒性的任何量。在某些实施方案中，当抑制剂与一种或多种靶向表观遗传基因的另外的抑制剂同时或组合施用时，靶向表观遗传基因的抑制剂的有效量与在不存在一种或多种靶向表观遗传基因的另外的抑制剂的情况下施用时的抑制剂的有效量相比减少。在某些实施方案中，当在不存在一种或多种靶向表观遗传基因的另外的抑制剂的情况下施用时，靶向表观遗传基因的抑制剂不减少或防止癌细胞的增殖。
治疗性多肽
在一个示例实施方案中，靶向癌症磷酸盐依赖性的方法包括施用治疗性多肽。在某些实施方案中，多肽治疗剂用于抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出。治疗性多肽可通过与XPR1、KIDINS220或XPR1/KIDINS200复合物结合来抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出。在一个示例实施方案中，治疗性多肽是包膜受体结合结构域(“RBD”)。在另一示例实施方案中，治疗性多肽是抗体或其片段或变体。
包膜-受体-结合结构域(RBD)
在某些实施方案中，蛋白质治疗剂是受体结合蛋白“RBD”蛋白质，其可与XPR1:KIDINS220蛋白质复合物结合并抑制XPR1:KIDINS220蛋白质复合物。在某些示例实施方案中，RBD蛋白来源于包膜病毒糖蛋白，并且能够与XPR1膜受体相互作用。XPR1是多种鼠白血病病毒(MLV或MuLV)的异嗜性和多嗜性受体。在某些实施方案中，“RBD”是逆转录病毒如X-MLV的包膜糖蛋白的约238个残基的片段，并且片段抑制XPR1磷酸盐外排(参见例如Giovannini等人，Inorganic phosphate export by the retrovirus receptor XPR1 inmetazoans.Cell Rep.2013；3(6):1866-1873)。RBD蛋白可以如本文所述进行修饰。在某些实施方案中，RBD蛋白可以是融合蛋白。例如，RBD蛋白可以是Fc融合蛋白，以增加体内稳定性。在某些实施方案中，Fc结构域促进RBD融合蛋白的二聚化。在某些实施方案中，RBD蛋白可以是与谷胱甘肽S-转移酶(GST)和/或血清白蛋白(例如，HSA或MSA)连接的融合蛋白。在某些实施方案中，GST结构域促进RBD融合蛋白的二聚化(参见例如Tudyka和Skerra，Glutathione S-transferase Can Be Used as a C-terminal,Enzymatically ActiveDimerization Module for a Recombinant Protease Inhibitor,and FunctionallySecreted Into the Periplasm of Escherichia Coli.Protein Science(1997),6:2180-2187)。结构分析已经显示谷胱甘肽S-转移酶(GST)可形成同型二聚体(Ji等人，Biochemistry.1992年10月27日；31(42):10169-84；Reinemer等人，J Mol Biol.1992年9月5日；227(1):214-26；和Kaplan等人，Protein Sci.1997年2月；6(2):399-406)。
图15显示了示例性RBD Fc融合蛋白；MLVMEGSAFSKPLKDKINPWGPLIVMGILVRAGASVQRDSPHQIFNVTWRVTNLMTGQTANATSLLGTMTDTFPKLYFDLCDLVGDYWDDPEPDIGDGCRTPGGRRRTRLYDFYVCPGHTVPIGCGGPGEGYCGKWGCETTGQAYWKPSSSWDLISLKRGNTPKDQGPCYDSSVSSGVQGATPGGRCNPLVLEFTDAGRKASWDAPKVWGLRLYRSTGADPVTRFSLTRQVLNVGPRVPIGSVDVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:2)。在某些实施方案中，mFc标签促进RBD的二聚化。在某些实施方案中，mFc标签促进RBD融合蛋白的再循环和稳定性。Giovannini等人在2013年公开了KoRV、A-MLV、X-MLV(NZB-IU-6株)和PERV-ARBD与小鼠免疫球蛋白(Ig)G1 Fc片段C-末端融合，并在HEK293T细胞中产生。多种MULV使用具有不同物种交叉反应性的XPR1：X-MLV仅感染XPR1hum；P-MLV使用XPR1mus和XPR1hum两者。RBD蛋白可来源于异嗜性或多嗜性鼠白血病逆转录病毒(X-和P-MLV)Env。图16显示来自其它病毒株的RBD蛋白，这些病毒株可通过鼠XPR1感染，并且适用于本发明。如本文所用，得到的RBD蛋白可以是来自包膜病毒糖蛋白的RBD蛋白的任何非天然杂交体(例如，非天然杂交体X-和P-MLV)。如本文所用，“杂交蛋白”是指含有来自任何两种或更多种不同蛋白质的片段或部分的任何蛋白质(例如，含有来自X-和P-MLV两者的部分的非天然杂交体)，包括非天然存在的修饰蛋白。
RBD的基因疗法实施方案
在一个示例实施方案中，基因疗法可用于在肿瘤细胞或肿瘤微环境中表达RBD。在某些实施方案中，基因疗法用于患有过表达SLC34A2的肿瘤的受试者。如本文所用，术语“基因疗法”、“基因递送”、“基因转移”和“遗传修饰”可互换使用，是指修饰或操纵基因的表达以改变活细胞的生物学特性以用于治疗用途。
在一个示例实施方案中，用于基因疗法的载体包含编码RBD蛋白的序列，并且用于向肿瘤细胞递送所述序列。载体可还包含一个或多个调控元件以控制基因的表达。载体可还包含调控/控制元件，例如启动子、增强子、内含子、聚腺苷酸化信号、Kozak共有序列或内部核糖体进入位点(IRES)。载体可还包含靶向部分，其将载体特异性地导向肿瘤细胞或肿瘤微环境。在另一示例实施方案中，载体可包括对肿瘤具有趋向特异性的病毒载体。
一般来说，并且在整个本说明书中，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。载体包括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个自由端、无自由端(例如，环状)的核酸分子；包含DNA、RNA或这两者的核酸分子；和本领域中已知的其它种类的多核苷酸。关于可以使用的载体的类型没有限制。载体可以是克隆载体，其适合繁殖和获得结合到若干异源生物体中的多核苷酸、基因构建体或表达载体。合适的载体包括基于病毒载体(例如腺病毒、腺相关病毒以及逆转录病毒和慢病毒)的真核表达载体以及非病毒载体如质粒。
在一个示例实施方案中，载体是病毒载体，其中病毒来源的DNA或RNA序列存在于用于包装到病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)中的载体中。病毒载体还包括由病毒携带的用于转染到宿主细胞中的多核苷酸。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，游离基因型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离基因型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，从而连同宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作性连接的基因的表达。这类载体在本文中被称为“表达载体”。用于并导致在真核细胞中表达的载体在本文中可以被称为“真核表达载体”。在另一示例实施方案中，载体将基因整合到细胞基因组中或以游离基因形式维持。
在一个示例实施方案中，载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，另外的DNA区段可插入其中，如通过标准分子克隆技术。
在一个示例实施方案中，载体是mRNA载体(参见例如Sahin,U、Kariko,K和Tureci,O(2014).mRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.Nat Rev DrugDiscov 13:759–780；Weissman D、KarikóK.mRNA:Fulfilling the Promise of GeneTherapy.Mol Ther.2015；23(9):1416-1417.doi:10.1038/mt.2015.138；Kowalski PS、Rudra A、Miao L、Anderson DG.Delivering the Messenger:Advances in Technologiesfor Therapeutic mRNA Delivery.Mol Ther.2019；27(4):710-728.doi:10.1016/j.ymthe.2019.02.012；Magadum A、Kaur K、Zangi L.mRNA-Based Protein ReplacementTherapy for the Heart.Mol Ther.2019；27(4):785-793.doi:10.1016/j.ymthe.2018.11.018；Reichmuth AM、Oberli MA、Jaklenec A、Langer R、BlankschteinD.mRNA vaccine delivery using lipid nanoparticles Ther Deliv.2016；7(5):319-334.doi:10.4155/tde-2016-0006；和Khalil AS、Yu X、Umhoefer JM等人，Single-dosemRNA therapy via biomaterial-mediated sequestration of overexpressedproteins.Sci Adv.2020；6(27):eaba2422)。在示例性实施方案中，编码RBD蛋白的mRNA是使用脂质纳米颗粒递送的(参见例如Reichmuth等人，2016)，并且是直接对肿瘤施用的。在示例性实施方案中，编码RBD蛋白的mRNA是采用生物材料介导的螯合递送的(参见例如Khalil等人，2020)，并且是直接对肿瘤组织施用的。如本文进一步所述存在于mRNA分子中的序列适用于mRNA载体(例如，Kozak共有序列、miRNA靶位点和WPRE)。
调控元件
重组表达载体可包含适合在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一个或多个调控元件，其可基于要用于表达的宿主细胞进行选择，其与要表达的核酸序列可操作性连接。在重组表达载体内，“可操作性连接”旨在表示所关注的核苷酸序列以允许表达核苷酸序列(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体被引入到宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式与调控元件连接。如本文所用的术语“可操作性连接”还指启动子序列相对于所关注的多核苷酸的功能关系和位置(例如，启动子或增强子与编码序列可操作性连接，如果其影响该序列的转录的话)。通常，可操作性连接的启动子与所关注的序列邻接。然而，增强子不需要与所关注的序列邻接来控制其表达。如本文所用的术语“启动子”是指这样的核酸片段，其功能是控制一种或多种多核苷酸的转录，位于多核苷酸序列的上游，并且其通过存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点及任何其它DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点、阻遏子和激活蛋白结合位点以及本领域中已知直接或间接作用以调控来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列)在结构上被确认。“组织特异性”启动子仅在特定类型的分化细胞或组织中有活性。
在另一实施方案中，本发明的载体还包含表达控制序列，包括但不限于适当的转录序列(即，起始、终止、启动子和增强子)、有效的RNA加工信号(例如，剪接和聚腺苷酸化(聚A)信号)、稳定细胞质mRNA的序列、增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)和增强蛋白质稳定性的序列。本领域中已知大量的表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的或组织特异性的启动子，并且可以根据本发明利用。
在另一实施方案中，本发明的载体还包含转录后调控区。在优选的实施方案中，转录后调控区是土拨鼠肝炎病毒转录后区(WPRE)或其功能变体和片段以及PPT-CTS或其功能变体和片段(参见例如Zufferey R等人，J.Virol.1999；73:2886-2892；和Kappes J等人，WO2001/044481)。在特定的实施方案中，转录后调控区是WPRE。如本文所用的术语“土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件”或“WPRE”是指当被转录时产生能够增强基因的表达的三级结构的DNA序列(参见例如Lee Y等人，Exp.Physiol.2005；90(l):33-37和Donello J等人，J.Virol.1998；72(6):5085-5092)。
术语“调控元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)及其它表达控制元件(例如，转录终止信号，如聚腺苷酸化信号和聚-U序列)。这类调控元件例如描述于Goeddel，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185，AcademicPress，San Diego，Calif.(1990)中。
调控元件包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些(例如，组织特异性调控序列)。组织特异性启动子可主要在所关注的所需组织中指导表达。调控元件还可以以时间依赖性方式指导表达，如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式，这可以是或者也可以不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施方案中，载体包含一种或多种pol III启动子(例如，1、2、3、4、5种或更多种pol III启动子)、一种或多种pol II启动子(例如，1、2、3、4、5种或更多种polII启动子)、一种或多种pol I启动子(例如，1、2、3、4、5种或更多种pol I启动子)或其组合。术语“调控元件”还涵盖增强子元件。本领域技术人员将了解的是，表达载体的设计可取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、所需的表达水平等因素。可将载体引入到宿主细胞中，从而产生由如本文所述的核酸(例如，RBD)编码的转录物、蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。
在一个实施方案中，载体含有在非肿瘤组织中表达的至少一种miRNA的至少一个靶序列。如本文所用的术语“微RNA”或“miRNA”是以转录后水平参与RNA介导的基因沉默的小(～22-nt)进化保守的调控RNA(参见例如，Barrel DP.Cell 2004；116:281-297)。通过与互补区(最常见的是在细胞信使RNA(mRNA)的3’非翻译区(3’UTR)中)的碱基配对，miRNA可起到阻抑mRNA翻译的作用，或者在高序列同源性时导致mRNA的催化降解。由于许多miRNA的组织表达具有高度差异，因此可以利用细胞miRNA来介导基因疗法载体的组织特异性靶向。通过工程化与组织特异性miRNA(miRT)完全互补的靶元件的串联拷贝。
抗体
在某些实施方案中，一种或多种剂是抗体。在某些实施方案中，抗体阻断或破坏XPR1:KIDINS220蛋白质复合物发挥从肿瘤细胞中输出无机磷酸盐的作用。在示例实施方案中，抗体对XPR1、KIDINS220或XPR1/KIDINS220蛋白质复合物具有特异性。在某些实施方案中，抗体阻断XPR1:KIDINS220蛋白质复合物的形成。在某些实施方案中，抗体靶向XPR1(参见例如，WO2020153467A1)。在某些实施方案中，抗体靶向XPR1的细胞外结构域。在某些实施方案中，抗体靶向XPR1的SPX结构域或EXS结构域。在某些实施方案中，XPR1抗体靶向跨越蛋白质的氨基酸529至末端的区域，该区域通常可自不同供应商获得。在某些实施方案中，抗体靶向KIDINS220的Walker A/B基序。在某些实施方案中，抗体靶向KIDINS220的Walker A/B基序或KAP家族P-环结构域以阻断磷酸盐结合。
识别XPR1或KIDINS220的抗体已经产生，并且可通过商业途径获得(参见例如，ThermoFisher网站：目录号21856-1-AP、目录号PA5-116475、目录号PA5-100152、目录号PA5-97897、目录号PA5-22116、目录号MA5-32869、目录号PA5-82511、目录号PA5-111894、目录号66748-1-IG、目录号A303-002A、目录号A303-003A、目录号MA1-90667、目录号PA1-4229、目录号BS-7041R、目录号A303-002A-M、目录号RA19019、目录号RA19020；和目录号PA5-82552、目录号PA5-21908、目录号PA5-34338、目录号14174-1-AP、目录号PA5-34337、目录号PA1-23547)。本领域技术人员可以很容易地产生用以阻断XPR1或KIDINS220的治疗性抗体以抑制磷酸盐外排(参见例如Lu,RM.、Hwang,YC.、Liu,IJ.等人，Development oftherapeutic antibodies for the treatment of diseases.J Biomed Sci 27,1(2020))。
术语“抗体”在本文中可与术语“免疫球蛋白”互换使用，并且包括完整抗体、抗体的片段，例如Fab、F(ab')2片段，以及已经在其恒定区和/或可变区中突变的完整抗体和片段(例如，突变产生嵌合、部分人源化或完全人源化的抗体，以及产生具有所需特质(例如，增强的结合和/或降低的FcR结合)的抗体)。术语“片段”是指抗体或抗体链的一部分，其包含比完整或完全抗体或抗体链更少的氨基酸残基。可经由完整或完全抗体或抗体链的化学或酶促处理获得片段。也可通过重组方式获得片段。示例性片段包括纳米抗体、Fab、Fab′、(Fab′)2、Fv、scFv、双抗体、三抗体、四抗体、双-scFv、微型抗体、Fab2或Fab3片段、Fabc、Fd、dAb、VHH和ScFv和/或Fv片段。
如本文所用，非抗体蛋白(在本文中也被称为“污染蛋白”)或化学前体少于约50％的抗体蛋白的制剂被认为是“基本上不含”40％、30％、20％、10％且更优选5％(以干重计)的非抗体蛋白或化学前体被认为是基本上不含的。当抗体蛋白或其生物活性部分是重组产生时，其还优选基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积或质量的不到约30％，优选不到约20％，更优选不到约10％，且最优选不到约5％。
术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其结合抗原或与完整抗体(即，与得到它们的完整抗体)竞争抗原结合(即，特异性结合)。因此，这些抗体或其片段包括在本发明的范围内，条件是所述抗体或片段与靶分子特异性结合。
术语“抗体”旨在涵盖得自任何来源(例如，人和非人灵长类动物以及啮齿类动物、兔类动物、山羊、牛、马、绵羊等)的任何Ig类别或任何Ig亚类(例如IgG的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)。
如本文所用的术语“Ig类别”或“免疫球蛋白类别”是指已在人和高等哺乳动物中确认的五类免疫球蛋白，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。术语“Ig亚类”是指已在人和高等哺乳动物中确认的IgM的两个亚类(H和L)、IgA的三个亚类(IgA1、IgA2和分泌型IgA)以及IgG的四个亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体可以以单体或聚合体形式存在；例如，IgM抗体以五聚体形式存在，且IgA抗体以单体、二聚体或多聚体形式存在。
术语“IgG亚类”是指已分别通过免疫球蛋白的重链V1-γ4在人和高等哺乳动物中确认的免疫球蛋白类别IgG的四个亚类-IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中可互换使用)是指具有由重链和轻链组成的双多肽链结构的蛋白质，所述链例如通过具有特异性结合抗原的能力的链间肽接头稳定。术语“结构域”是指重链或轻链多肽的球状区，其包含例如通过β折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3至4个肽环)。结构域在本文中被进一步称为“恒定的”或“可变的”，这是基于在“恒定”结构域的情况下各种类别成员的结构域内序列变异的相对缺乏，或者在“可变”结构域的情况下各种类别成员的结构域内的显著变异。抗体或多肽“结构域”在本领域中通常可互换地称为抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域可互换地称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可互换地称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变”结构域可互换地称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域可互换地称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“VH”区或“VH”结构域。
术语“区”还可以指抗体链或抗体链结构域的一部分(例如，重链或轻链的一部分或恒定结构域或可变结构域的一部分，如本文所定义)，以及所述链或结构域的更离散的部分。例如，如本文所定义，轻链和重链或轻链和重链可变结构域包括散布在“框架区”或“FR”当中的“互补决定区”或“CDR”。
术语“构象”是指蛋白质或多肽(例如，抗体、抗体链、结构域或其区)的三级结构。例如，短语“轻(或重)链构象”是指轻(或重)链可变区的三级结构，且短语“抗体构象”或“抗体片段构象”是指抗体或其片段的三级结构。
术语“抗体样蛋白质支架”或“工程化蛋白质支架”广义上涵盖蛋白质类非免疫球蛋白特异性结合剂，其通常是通过组合工程化(如定点随机诱变与噬菌体展示或其它分子选择技术相组合)获得。通常，这类支架来源于稳健且小的可溶性单体蛋白(如Kunitz抑制剂或脂质运载蛋白)，或来源于细胞表面受体的稳定折叠的膜外结构域(如蛋白A、纤连蛋白或锚蛋白重复序列)。
这类支架已经在以下文献中有广泛的综述：Binz等人，(Engineering novelbinding proteins from nonimmunoglobulin domains.Nat Biotechnol 2005,23:1257-1268)；Gebauer和Skerra(Engineered protein scaffolds as next-generationantibody therapeutics.Curr Opin Chem Biol.2009,13:245-55)；Gill和Damle(Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds.Curr OpinBiotechnol 2006,17:653-658)；Skerra(Engineered protein scaffolds for molecularrecognition.J Mol Recognit 2000,13:167-187)；和Skerra(Alternative non-antibodyscaffolds for molecular recognition.Curr Opin Biotechnol 2007,18:295-304)，并且包括但不限于基于葡萄球菌蛋白A的Z-结构域的亲和体，其是58个残基的三螺旋束，在其α-螺旋中的两者上提供了界面(Nygren,Alternative binding proteins:Affibodybinding proteins developed from a small three-helix bundle scaffold.FEBS J2008,275:2668-2676)；基于小(大约58个残基)且稳健的二硫化物交联的丝氨酸蛋白酶抑制剂的工程化Kunitz结构域，其通常来源于人(例如，LACI-D1)，可以针对不同的蛋白酶特异性进行工程化(Nixon和Wood，Engineered protein inhibitors of proteases.CurrOpin Drug Discov Dev 2006,9:261-268)；基于人纤连蛋白III的第10个细胞外结构域(10Fn3)的单抗体或粘连蛋白(adnectin)，其采用具有2-3个暴露环的Ig样β-三明治折叠(94个残基)，但缺少中心二硫化物桥(Koide和Koide，Monobodies:antibody mimics basedon the scaffold of the fibronectin type III domain.Methods Mol Biol 2007,352:95-109)；来源于脂质运载蛋白的抗运载蛋白(anticalin)，其是多样化的八链β-桶蛋白家族(大约180个残基)，它们借助于在开放端的四个结构上可变的环天然形成小配体的结合位点，在人、昆虫及许多其它生物体中是丰富的(Skerra,Alternative binding proteins:Anticalins—harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligandpocket to engineer novel binding activities.FEBS J 2008,275:2677-2683)；DARPin，其是设计的锚蛋白重复序列结构域(166个残基)，提供由通常三个重复的β-转角产生的刚性界面(Stumpp等人，DARPins:a new generation of protein therapeutics.DrugDiscov Today 2008,13:695-701)；高亲和性多聚体(avimer)(多聚化LDLR-A模块)(Silverman等人，Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of afamily of human receptor domains.Nat Biotechnol 2005,23:1556-1561)；和富半胱氨酸的结蛋白肽(Kolmar，Alternative binding proteins:biological activity andtherapeutic potential of cystine-knot miniproteins.FEBS J 2008,275:2684-2690)。
抗体的“特异性结合”意指抗体对特定抗原或表位表现出明显的亲和力，并且通常不表现出显著的交叉反应性。“明显的”结合包括具有至少25μM的亲和力的结合。亲和力大于1x107M-1(或解离系数为1μM或更小，或解离系数为1nm或更小)的抗体通常以相应更高的特异性结合。在本文所列出的那些值中间的值也旨在处于本发明的范围内，并且本发明的抗体以一定范围的亲和力结合，例如100nM或更小、75nM或更小、50nM或更小、25nM或更小，例如10nM或更小、5nM或更小、1nM或更小，或者在多个实施方案中为500pM或更小、100pM或更小、50pM或更小或25pM或更小。“不表现出显著交叉反应性”的抗体是不会与其靶标以外的实体(例如，不同的表位或不同的分子)明显结合的抗体。例如，与靶分子特异性结合的抗体将明显结合该靶分子，但不会与非靶分子或肽发生显著反应。例如对特定表位具有特异性的抗体不会与同一种蛋白质或肽上的远端表位发生显著的交叉反应。特异性结合可根据任何本领域中公认用于确定这种结合的方式来确定。优选地，根据Scatchard分析和/或竞争性结合测定来确定特异性结合。
如本文所用，术语“亲和力”是指单个抗原结合位点与抗原决定簇结合的强度。亲和力取决于抗体结合位点与抗原决定簇之间的立体化学匹配的接近程度、它们之间接触面积的大小、带电和疏水基团的分布等。可通过平衡透析或通过动力学BIACORETM方法测量抗体亲和力。解离常数Kd和缔合常数Ka是亲和力的定量度量。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指来源于产生抗体的细胞(例如，B淋巴细胞或B细胞)的克隆群体的抗体，其在结构和抗原特异性上是同质的。术语“多克隆抗体”是指来源于产生抗体的细胞的不同克隆群体的多种抗体，它们在结构和表位特异性上是异质的，但识别共同的抗原。单克隆抗体和多克隆抗体可作为粗制剂存在于体液内，或者可以如本文所述进行纯化。
术语抗体的“结合部分”(或“抗体部分”)包括一个或多个完整结构域，例如一对完整结构域，以及抗体的保留与靶分子特异性结合能力的片段。已表明抗体的结合功能可通过全长抗体的片段来执行。结合片段通过重组DNA技术或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fd、dAb、Fv、单链、单链抗体，例如scFv和单结构域抗体。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的高变区的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含不见于受者抗体或供体抗体中的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般来说，人源化抗体将包含基本上所有或至少一个且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的那些高变区，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分。
本发明定义所涵盖的抗体或表位结合蛋白的部分的实例包括：(i)具有VL、CL、VH和CH1结构域的Fab片段；(ii)Fab’片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1结构域以及在CHI结构域的C-末端的一个或多个半胱氨酸残基的Fd’片段；(v)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(vi)由结合抗原的VH结构域或VL结构域组成的dAb片段(Ward等人，341Nature544(1989))；(vii)分离的CDR区或功能框架中存在的分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，其为二价片段，包括在铰链区通过二硫化物桥连接的两个Fab’片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)(Bird等人，242Science 423(1988)；和Huston等人，85PNAS 5879(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，其包含在同一多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(参见例如，EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，90PNAS 6444(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联Fd区段(VH-Ch1-VH-Ch1)，它们与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-62(1995)；和美国专利第5,641,870号)。
如本文所用，“阻断”抗体或抗体“拮抗剂”是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。在某些实施方案中，本文所述的阻断抗体或拮抗剂抗体或其部分完全抑制抗原的生物活性。
抗体可作为识别的多肽的激动剂或拮抗剂。例如，本发明包括部分或完全破坏受体/配体相互作用的抗体。本发明以受体特异性抗体和配体特异性抗体两者为特征。本发明还以不阻止配体结合但阻止受体激活的受体特异性抗体为特征。受体激活(即，信号传导)可通过本文所述或本领域中另外已知的技术来确定。例如，可通过如下方式确定受体激活：通过免疫沉淀检测受体或其下游底物之一的磷酸化(例如，酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸)，接着进行蛋白质印迹分析。在具体的实施方案中，提供的抗体对配体活性或受体活性的抑制达在不存在所述抗体情况下的活性的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。
本发明还以既阻止配体结合又阻止受体激活的受体特异性抗体以及识别受体-配体复合物的抗体为特征。同样，本发明涵盖结合配体并阻止配体与受体结合的中和抗体，以及结合配体、从而阻止受体激活但不阻止配体结合受体的抗体。本发明还包括激活受体的抗体。这些抗体可作为受体激动剂，即增强或激活配体介导的受体激活的所有或一部分生物活性，例如通过诱导受体的二聚化。抗体可以被指定为生物活性的激动剂、拮抗剂或反向激动剂，所述生物活性包括本文公开的肽的特异性生物活性。可采用本领域中已知的方法制备抗体激动剂和拮抗剂。参见例如，PCT公布WO 96/40281；美国专利第5,811,097号；Deng等人，Blood 92(6):1981-1988(1998)；Chen等人，Cancer Res.58(16):3668-3678(1998)；Harrop等人，J.Immunol.161(4):1786-1794(1998)；Zhu等人，Cancer Res.58(15):3209-3214(1998)；Yoon等人，J.Immunol.160(7):3170-3179(1998)；Prat等人，J.Cell.Sci.III(Pt2):237-247(1998)；Pitard等人，J.Immunol.Methods 205(2):177-190(1997)；Liautard等人，Cytokine 9(4):233-241(1997)；Carlson等人，J.Biol.Chem.272(17):11295-11301(1997)；Taryman等人，Neuron 14(4):755-762(1995)；Muller等人，Structure6(9):1153-1167(1998)；Bartunek等人，Cytokine8(1):14-20(1996)。
如本发明所定义的抗体包括被修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与抗体共价连接，使得共价连接不阻止抗体产生抗独特型反应。例如但不限于，抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质连接等。可以通过已知技术进行任何的多种化学修饰，包括但不限于衣霉素的特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、代谢合成等。另外，衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。
简单的结合测定可用于筛选或检测与靶蛋白结合或破坏蛋白质(例如，受体与配体)之间的相互作用的剂。因为本发明的某些靶标是跨膜蛋白，所以在一些实施方案中可以采用使用这些蛋白质的可溶形式而不是全长蛋白的测定。可溶形式包括例如缺少跨膜结构域的那些和/或包含IgV结构域或其片段的那些，它们保留了结合其同源结合配偶体的能力。进一步地，用于本文所述的组合物和方法中抑制或增强蛋白质相互作用的剂可包括重组拟肽。
可用于筛选测定的检测方法包括基于抗体的方法、报告子部分的检测、如本文所述的细胞因子的检测和如本文所述的基因标记的检测。
确定受体蛋白与配体蛋白结合的另一种测定变化形式是通过采用亲和生物传感器方法。这类方法可基于压电效应、电化学或光学方法，如椭圆光度法、光波导向和表面等离子体共振(SPR)。
治疗性多肽修饰
在某些示例实施方案中，可以修饰本发明的治疗性多肽，使得它们获得用于治疗用途的有利特性(例如，稳定性和特异性)，但保持它们的生物活性。可以修饰治疗性蛋白质以增加稳定性或当对受试者体内施用时提供改善蛋白质功效的特征。如本文关于治疗性蛋白质所用，术语“修饰的”、“修饰”等是指增强治疗性蛋白质的所需特性的一种或多种改变，其中所述改变不改变治疗性蛋白质的一级氨基酸序列。“修饰”包括共价化学修饰，其不改变治疗性蛋白质本身的一级氨基酸序列。这类所需特性包括例如延长体内半衰期、增加稳定性、降低清除率、改变免疫原性或变应原性、能够刺激特定抗体或细胞靶向。可以对治疗性蛋白质进行的改变包括但不限于与载剂蛋白的缀合、与配体的缀合、与抗体的缀合、PEG化、聚唾液酸化、HES化、重组PEG模拟物、Fc融合、白蛋白融合、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性物质、添加氨基酸模拟物或添加非天然氨基酸。修饰的治疗性蛋白质还包括类似物。所谓“类似物”意指不相同但具有类似功能或结构特征的分子。例如，治疗性蛋白质类似物保留了相应的天然存在的多肽的生物活性，同时具有某些生物化学修饰，这些修饰相对于天然存在的多肽增强了类似物的功能。这类生物化学修饰可增加类似物的蛋白酶抗性、膜渗透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可包括非天然氨基酸。
在本文变量的任何定义中对化学基团列表的叙述包括该变量作为任何单个基团或所列基团的组合的定义。对本文变量或方面的实施方案的叙述包括该实施方案作为任何单个实施方案或与任何其它实施方案或其部分的组合。
修饰的蛋白质可包括间隔子或接头。如提到融合蛋白时使用的术语“间隔子”或“接头”是指连接包含融合蛋白的蛋白质的肽。一般地，除了连接或保持蛋白质之间的某个最小距离或其它空间关系之外，间隔子没有特定的生物活性。然而，在某些实施方案中，可选择间隔子的组成氨基酸以影响分子的某种特性，如分子的折叠、净电荷或疏水性。
用于本发明的实施方案的合适接头是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。接头用于将两个肽分开足够的距离，以确保在优选的实施方案中，每个肽正确折叠。优选的肽接头序列采取柔性延伸的构象，并且不表现出形成有序二级结构的倾向。柔性蛋白区中的典型氨基酸包括Gly、Asn和Ser。实际上，预期含有Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的任何排列都将满足接头序列的上述标准。其它近中性氨基酸如Thr和Ala也可用于接头序列中。还有其它氨基酸序列可用作接头，它们公开于Maratea等人，(1985),Gene 40:39-46；Murphy等人，(1986)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 83:8258-62；美国专利第4,935,233号；和美国专利第4,751,180号中。
蛋白质治疗剂的临床有效性通常受短血浆半衰期和对蛋白酶降解的敏感性的限制。对各种治疗性蛋白质(例如，非格司亭)的研究显示，这类困难可以通过各种修饰来克服，包括使多肽序列与多种非蛋白质类聚合物中的任一者(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)缀合或连接(参见例如，通常经由与蛋白质和非蛋白质类聚合物(例如PEG)两者共价结合的连接部分)。
众所周知的是，某些蛋白质的特性可通过连接聚乙二醇(PEG)聚合物来调节，这增加了蛋白质的流体力学体积，从而减缓其通过肾脏过滤的清除。(参见例如，Clark等人，J.Biol.Chem.271:21969-21977(1996))。已显示这类PEG缀合的生物分子具有临床上有用的特性，包括更好的物理和热稳定性、防止对酶促降解的敏感性、增加的溶解度、更长的体内循环半衰期和减少的清除率、降低的免疫原性和抗原性以及降低的毒性。因此，预期某些剂可以被PEG化(例如，在肽残基上)以提供增强的治疗益处，举例如通过延长体内半衰期而增加功效。在某些实施方案中，剂的PEG化可用于延长剂的血清半衰期，并允许特定的剂能够穿过血脑屏障。因此，在一个实施方案中，PEG化XPR1:KIDINS220拮抗剂改善了拮抗剂的药代动力学和药效动力学。
关于肽PEG化方法，参考Lu等人，Int.J.Pept.Protein Res.43:127-38(1994)；Lu等人，Pept.Res.6:140-6(1993)；Felix等人，Int.J.Pept.Protein Res.46:253-64(1995)；Gaertner等人，Bioconjug.Chem.7:38-44(1996)；Tsutsumi等人，Thromb.Haemost.77:168-73(1997)；Francis等人，hit.J.Hematol.68:1-18(1998)；Roberts等人，J.Pharm.Sci.87:1440-45(1998)；和Tan等人，Protein Expr.Purif.12:45-52(1998)。聚乙二醇或PEG意在涵盖已用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，包括但不限于单-(C1-10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇。合适的PEG部分包括例如40kDa甲氧基聚(乙二醇)丙醛(Dow，Midland，Mich.)；60kDa甲氧基聚(乙二醇)丙醛(Dow，Midland，Mich.)；40kDa甲氧基聚(乙二醇)马来酰亚胺基-丙酰胺(Dow，Midland，Mich.)；31kDaα-甲基-w-(3-氧代丙氧基)聚氧乙烯(NOFCorporation，Tokyo)；mPEG2-NHS-40k(Nektar)；mPEG2-MAL-40k(Nektar)、SUNBRIGHT GL2-400MA((PEG)240kDa)(NOF Corporation，Tokyo)、SUNBRIGHT ME-200MA(PEG20kDa)(NOFCorporation，Tokyo)。PEG基团通常经由通过PEG部分上的反应性基团(例如，马来酰亚胺、醛、氨基、硫醇或酯基团)与肽上的反应性基团(例如，醛、氨基、硫醇、马来酰亚胺或酯基团)的酰化或烷基化而与肽(例如，RBD)连接。
PEG分子可与肽中任何位置的任何Lys、Cys或K(CO(CH2)2SH)残基共价连接。在某些实施方案中，本文所述的RBD蛋白可通过N-末端氨基直接PEG化至N-末端的任何氨基酸。可以将“接头臂”添加到肽中以促进PEG化。半胱氨酸的硫醇侧链处的PEG化已被广泛报道(参见例如，Caliceti和Veronese，Adv.Drug Deliv.Rev.55:1261-77(2003))。如果肽中没有半胱氨酸残基，则可以通过取代或通过将半胱氨酸添加至N-末端氨基酸来引入半胱氨酸残基。在某些实施方案中，通过添加至N-末端氨基酸的半胱氨酸残基的侧链将蛋白质PEG化。
在示例实施方案中，PEG分子可以与肽的C-末端中(如RBD蛋白中)的酰胺基团共价连接。在某些实施方案中，用于修饰本发明的剂的PEG分子是支链的，而在其它实施方案中，PEG分子可以是直链的。在特定方面，PEG分子的分子量在1kDa与100kDa之间。在进一步的方面，PEG分子选自10、20、30、40、50、60和80kDa。在进一步的方面，其选自20、40或60kDa。在有两个PEG分子与本发明的剂共价连接的情况下，每一者都是1至40kDa，并且在特定方面，它们的分子量为20和20kDa、10和30kDa、30和30kDa、20和40kDa或40和40kDa。在特定方面，剂(例如，XPR1:KIDINS220拮抗剂)含有mPEG-半胱氨酸。mPEG-半胱氨酸中的mPEG可具有不同的分子量。分子量的范围优选为5kDa至200kDa，更优选为5kDa至100k Da，且进一步优选为20kDa至60kDA。mPEG可以是直链的或支链的。
本公开还考虑了使用PEG模拟物。已经开发了重组PEG模拟物，其保留了PEG的属性(例如，增强的血清半衰期)，同时赋予了若干另外的有利特性。举例来说，可以重组产生能够形成类似于PEG的延伸构象的简单多肽链(包含例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)，并且所述多肽链已经与治疗性蛋白质融合(例如，Amunix的XTEN技术；Mountain View，CA)。这避免了在制备过程期间需要另外的缀合步骤。此外，已建立的分子生物学技术能够控制多肽链的侧链组成，从而允许优化免疫原性和制备特性。
糖基化可以显著地影响蛋白质的物理特性，并且在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位方面也可能很重要(参见例如，Solá和Griebenow，Glycosylation of TherapeuticProteins:An Effective Strategy to Optimize Efficacy.BioDrugs.2010；24(1):9–21)。适当的糖基化对于生物活性可能是必需的。实际上，来自真核生物体的一些基因当在缺少糖基化蛋白质的细胞过程的细菌(例如，大肠杆菌)中表达时产生的蛋白质在被回收时几乎没有或没有活性，因为它们缺少糖基化。出于本公开的目的，“糖基化”意在泛指使聚糖与蛋白质、脂质或其它有机分子连接的酶促过程。结合本公开使用术语“糖基化”通常旨在表示添加或缺失一个或多个碳水化合物部分(通过移除潜在的糖基化位点或者通过经化学和/或酶促方式缺失糖基化)，和/或添加天然序列中可能存在或可能不存在的一个或多个糖基化位点。此外，该短语包括天然蛋白质的糖基化的定性变化，涉及存在的各种碳水化合物部分的性质和比例的变化。
可以通过改变氨基酸序列来实现糖基化位点的添加。对多肽的改变可例如通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(对于N-连接的糖基化位点)或被所述残基取代来进行。见于每种类型中的N-连接和O-连接的寡糖以及糖残基的结构可以是不同的。两者中常见的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(下文称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖的末端残基，并且由于其负电荷的原因，可对糖蛋白赋予酸性特性。本公开的特定实施方案包括N-糖基化变体的产生和使用。
本公开还考虑了采用聚唾液酸化，将肽和蛋白质与天然存在可生物降解的a-(2→8)连接的聚唾液酸(“PSA”)缀合，以便改善它们的稳定性和体内药代动力学。PSA是可生物降解的无毒天然聚合物，具有高度亲水性，使其在血液中具有高表观分子量，这增加了其血清半衰期。此外，一系列肽和蛋白质治疗剂的聚唾液酸化导致蛋白水解显著减少、体内活性的保留以及免疫原性和抗原性的降低(参见例如，G.Gregoriadis等人，Int.J.Pharmaceutics 300(1-2):125-30)。如同用其它缀合物(例如，PEG)的修饰，位点特异性聚唾液酸化的各种技术是可用的(参见例如，T.Lindhout等人，PNAS 108(18)7397-7402(2011))。
用于缀合的另外合适的组分和分子包括例如甲状腺球蛋白；白蛋白，如人血清白蛋白(HAS)；破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸，如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素、流感病毒核蛋白；钥孔虫戚血兰素(KLH)；以及乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或前述的任意组合。
可例如通过遗传操纵来实现白蛋白与本公开的一种或多种多肽的融合，使得编码HSA的DNA或其片段与编码一种或多种多肽序列的DNA连接。白蛋白本身可以被修饰以延长其循环半衰期。可通过上述遗传操纵技术或通过化学缀合来实现修饰的白蛋白与一种或多种多肽的融合；所得融合分子的半衰期超过具有非修饰的白蛋白的融合物的半衰期。(参见WO2011/051489)。
已经开发了若干白蛋白结合策略作为直接融合的替代方案，包括通过缀合的脂肪酸链(酰化)的白蛋白结合。因为血清白蛋白是脂肪酸的转运蛋白，所以这些具有白蛋白结合活性的天然配体已被用于延长小蛋白质治疗剂的半衰期。例如，地特胰岛素(LEVEMIR)是批准用于糖尿病的产品，其包含与遗传修饰的胰岛素缀合的肉豆蔻基链，从而产生了长效胰岛素类似物。
另一种类型的修饰是在多肽序列的N-和/或C-末端缀合(例如，连接)一种或多种另外的组分或分子，如另一种蛋白质或载剂分子。因此，示例性多肽序列可作为与另一组分或分子的缀合物提供。缀合物修饰可导致多肽序列保留具有第二种分子的另外的或互补的功能或活性的活性。例如，多肽序列可以与分子缀合，例如以促进溶解性、储存、体内或存放半衰期或稳定性、免疫原性的降低、延迟或受控的体内释放等。其它功能或活性包括相对于未缀合的多肽序列降低毒性的缀合物、比未缀合的多肽序列更有效地靶向某一种类型的细胞或器官的缀合物或进一步对抗与本文所列出的病症或疾病相关的病因或影响的药物。
本公开考虑使用目前已知或将来开发的多肽的其它修饰来改善一种或多种特性。延长本公开的多肽的循环半衰期、增加稳定性、降低清除率或改变免疫原性或变应原性的一种这样的方法涉及通过羟乙基淀粉化(hesylation)来修饰多肽序列，所述羟乙基淀粉化利用与其它分子连接的羟乙基淀粉衍生物，以便修饰分子的特性。羟乙基淀粉化的各方面描述于例如美国专利申请第2007/0134197和2006/0258607中。
在特定的实施方案中，剂(例如，XPR1:KIDINS220拮抗剂，RBD)包括与N-末端氨基共价连接的保护基团。在示例实施方案中，与蛋白质的N-末端氨基共价连接的保护基团在体内条件下降低氨基末端的反应性。氨基保护基团包括—C1-10烷基、—C1-10取代烷基、—C2-10烯基、—C2-10取代烯基、芳基、—C1-6烷基芳基、—C(O)—(CH2)1-6—COOH、—C(O)—C1-6烷基、—C(O)-芳基、—C(O)—O—C1-6烷基或—C(O)—O-芳基。在特定的实施方案中，氨基末端保护基团选自由乙酰基、丙基、琥珀酰基、苄基、苄氧基羰基和叔丁氧基羰基组成的组。在其它实施方案中，N-末端氨基酸的脱氨基是另一种修饰，其可用于在体内条件下降低氨基末端的反应性。
剂(例如，XPR1:KIDINS220拮抗剂，RBD)的化学修饰组合物也包括在本发明的范围内，其中剂与聚合物连接。所选择的聚合物通常被修饰以具有单个反应性基团，如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，从而可以控制聚合度。聚合物的范围内包括聚合物的混合物。优选地，对于最终产品制剂的治疗用途，聚合物将是药学上可接受的。聚合物或其混合物可包括但不限于聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇。
在其它实施方案中，通过PEG化、胆固醇化或棕榈酰化对剂(例如，XPR1:KIDINS220拮抗剂，RBD)进行修饰。修饰可针对任何氨基酸残基。在优选的实施方案中，修饰是针对剂(例如，XPR1:KIDINS220拮抗剂，RBD)的N-末端氨基酸，或者直接针对N-末端氨基酸，或者经由与添加至N-末端的半胱氨酸残基的硫醇基团或添加至N-末端的接头如均苯三甲酰三(3,5-二溴水杨酸酯(Ttds)偶联。在某些实施方案中，剂(例如，XPR1:KIDINS220拮抗剂，RBD)的N-末端包含半胱氨酸残基，保护基团与半胱氨酸残基的N-末端氨基偶联，并且半胱氨酸硫醇基团用N-乙基马来酰亚胺、PEG基团、胆固醇基团或棕榈酰基团衍生化。在其它实施方案中，将乙酰化半胱氨酸残基添加至剂的N-末端，并且半胱氨酸的硫醇基团用N-乙基马来酰亚胺、PEG基团、胆固醇基团或棕榈酰基团衍生化。在某些实施方案中，本发明的剂是缀合物。在某些实施方案中，本发明的剂是由经由接头与甲氧基聚乙二醇结合的氨基酸序列组成的多肽。
氨基酸的取代可用于修饰本发明的剂。如本文所用的短语“氨基酸的取代”涵盖作为保守和非保守取代两者的结果的氨基酸的取代。保守取代是氨基酸残基被多肽中另一类似的残基置换。典型但非限制性保守取代是脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间的相互置换；含羟基残基的Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的互换、含酰胺的残基Asn与Gln之间的互换、碱性残基Lys和Arg的互换、芳族残基Phe和Tyr的互换以及小型氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的互换。非保守取代是多肽中的氨基酸残基被生物学上不相似的另一残基置换。例如，氨基酸残基用具有基本上不同的电荷、基本上不同的疏水性或基本上不同的空间构型的另一残基置换。
本领域技术人员根据本公开内容和本领域的知识将会了解到，有多种方式产生这类治疗性蛋白质。一般来说，这类治疗性蛋白质可在体外或体内产生。治疗性蛋白质可作为肽或多肽在体外产生，然后可以将其配制成药物组合物并对受试者施用。这种体外产生可通过本领域技术人员已知的多种方法进行，举例如在多种细菌、真核生物或病毒重组表达系统的任一者中自DNA或RNA分子合成或表达肽/多肽，接着纯化表达的肽/多肽。或者，可通过将编码治疗性蛋白质的分子(例如，DNA、RNA、病毒表达系统等)引入到受试者中来体内产生治疗性蛋白质，由此表达编码的治疗性蛋白质。
小分子
在某些实施方案中，一种或多种治疗剂包含抑制XPR1、KINDINS220的表达、抑制XPR1:KINDINS220复合物的形成或通过XPR1:KINDINS220复合物抑制磷酸盐外排的小分子。术语“小分子”是指尺寸与药物中通常使用的那些有机分子相当的化合物，优选有机化合物。该术语不包括生物大分子(例如，蛋白质、肽、核酸等)。优选的小有机分子的尺寸范围最多约5000Da，例如最多约4000，优选最多3000Da，更优选最多2000Da，甚至更优选最多约1000Da，例如最多约900、800、700、600或最多约500Da。在某些实施方案中，小分子可作为拮抗剂或激动剂(例如，通过与配体结合位点结合来阻断酶活性位点或激活受体)。在某些实施方案中，小分子阻断或破坏XPR1:KIDINS220蛋白质复合物发挥从肿瘤细胞中输出无机磷酸盐的作用。在某些实施方案中，小分子阻断XPR1:KIDINS220蛋白质复合物的形成。
在一个示例实施方案中，小分子阻断磷酸盐结合结构域，如KIDINS220的WalkerA/B基序(参见例如Sandall CF、Ziehr BK、MacDonald JA.ATP-Binding and Hydrolysisin Inflammasome Activation.Molecules.2020；25(19):4572)。MCC950是含二芳基磺酰脲的化合物，其通过直接结合可能在Walker B基序内的NLRP3的ATP结合区来阻抑ATP水解(参见例如Coll RC、Hill JR、Day CJ等人，MCC950 directly targets the NLRP3 ATP-hydrolysis motif for inflammasome inhibition.Nat Chem Biol.2019；15(6):556-559)。
适用于本发明的一种类型的小分子为降解剂分子(参见例如Ding等人，EmergingNew Concepts of Degrader Technologies,Trends Pharmacol Sci.2020Jul；41(7):464-474)。术语“降解剂”和“降解剂分子”是指能够特异性靶向用于降解的蛋白质的所有化合物(例如，Ding等人，2020中综述的ATTEC、AUTAC、LYTAC或PROTAC)。蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)技术是快速兴起的替代治疗策略，有望解决当前在现代药物开发项目中面临的许多挑战。PROTAC技术采用小分子募集靶蛋白用于泛素化和通过蛋白酶体移除(参见例如，Zhou等人，Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal(BET)Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable ofAchieving Tumor Regression.J.Med.Chem.2018,61,462-481；Bondeson和Crews，Targeted Protein Degradation by Small Molecules,Annu Rev PharmacolToxicol.2017年1月6日；57:107–123；和Lai等人，Modular PROTAC Design for theDegradation of Oncogenic BCR-ABL Angew Chem Int Ed Engl.2016年1月11日；55(2):807–810)。在某些实施方案中，LYTAC对如本文所述的细胞表面蛋白(例如，XPR1和/或KIDINS220)特别有利。
适体
在某些实施方案中，一种或多种剂是适体。核酸适体是已经通过反复轮体外选择或等同地通过SELEX(配体通过指数富集的系统进化)被工程化以与各种分子靶标如小分子、蛋白质、核酸、细胞、组织和生物体结合的核酸物质。核酸适体通过经典沃森-克里克碱基配对以外的相互作用而对分子具有特异性结合亲和力。适体可用于生物技术和治疗应用，因为它们提供了与抗体类似的分子识别特性。除了它们的区别识别之外，适体提供了优于抗体的优点，因为它们可以在试管中被完全工程化，容易通过化学合成产生，具有期望的储存特性，并且在治疗应用中几乎不引起或不引起免疫原性。在某些实施方案中，RNA适体可自DNA构建体表达。在其它实施方案中，核酸适体可与另一多核苷酸序列连接。多核苷酸序列可以是双链DNA多核苷酸序列。适体可与多核苷酸序列的一条链共价连接。适体可以与多核苷酸序列连接。可以配置多核苷酸序列，使得多核苷酸序列可与固体支持物连接或与另一多核苷酸序列连接。
适体如同通过噬菌体展示或单克隆抗体(“mAb”)产生的肽一样能够与选定的靶标特异性结合并调节靶标的活性，例如通过结合，适体可阻断其靶标发挥作用的能力。典型的适体大小为10-15kDa(30-45个核苷酸)，以亚纳摩尔亲和力结合其靶标，并区别密切相关的靶标(例如，适体通常将不结合来自同一基因家族的其它蛋白质)。结构研究显示，适体能够利用相同类型的结合相互作用(例如，氢键结合、静电互补、疏水接触、空间排阻)，其驱动抗体-抗原复合物中的亲和力和特异性。
适体具有许多用于研究以及用作治疗剂和诊断剂的理想特性，包括高特异性和亲和力、生物功效和优异的药代动力学特性。此外，它们提供了优于抗体及其它蛋白质生物制剂的特定竞争优势。适体是化学合成的，并且很容易根据需要改变规模以满足研究、诊断或治疗应用的生产需求。适体具有化学稳健性。它们在本质上适于在暴露于诸如热和变性剂的因素之后重新获得活性，并且可以作为冻干粉末在室温下长期储存(>1年)。不受理论的约束，可长期储存与固体支持物或珠粒结合的适体。
磷酸二酯形式的寡核苷酸可以被细胞内和细胞外的酶如核酸内切酶和核酸外切酶快速降解。适体可包括修饰的核苷酸，其对配体赋予改善的特性，如改善的体内稳定性或改善的递送特性。这类修饰的实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置的化学取代。SELEX确认的含有修饰核苷酸的核酸配体描述于例如以下专利中：美国专利第5,660,985号，其描述了在核糖的2’位置、嘧啶的5位置和嘌呤的8位置被化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸；美国专利第5,756,703号，其描述了含有各种2’-修饰的嘧啶的寡核苷酸；和美国专利第5,580,737号，其描述了含有一个或多个用2’-氨基(2'-NH2)、2’-氟(2’-F)和/或2’-0-甲基(2’-OMe)取代基修饰的核苷酸的高特异性核酸配体。适体的修饰还可以包括在环外胺处的修饰、4-硫尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；主链修饰、硫代磷酸酯或烯丙基磷酸酯修饰、甲基化和不常见的碱基配对组合，如异碱基、异胞苷和异鸟苷。修饰还可以包括3'和5'修饰，如加帽。如本文所用，术语硫代磷酸酯涵盖在磷酸二酯键中被一个或多个硫原子置换的一个或多个非桥连氧原子。在进一步的实施方案中，寡核苷酸包含修饰的糖基团，例如一个或多个羟基被卤素、脂族基团置换，或者被官能化为醚或胺。在一个实施方案中，呋喃糖残基的2’-位置被O-甲基、O-烷基、O-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基或卤代基团中的任一者取代。合成2’-修饰的糖的方法描述于例如以下文献中：Sproat等人，Nucl.Acid Res.19:733-738(1991)；Cotten等人，Nucl.Acid Res.19:2629-2635(1991)；和Hobbs等人，Biochemistry12:5138-5145(1973)。其它修饰是本领域普通技术人员已知的。在某些实施方案中，适体包括具有改善的解离速率的适体，如国际专利公布第WO 2009012418号“Method for generating aptamers with improved off-rates”中所述，该专利文献以全文引用的方式并入本文。在某些实施方案中，适体选自适体的文库。这类文库包括但不限于Rohloff等人，“Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains:ModifiedAptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents”，MolecularTherapy Nucleic Acids(2014)3,e201中描述的那些。适体也可通过商业途径获得(参见例如，SomaLogic,Inc.，Boulder，Colorado)。在某些实施方案中，本发明可利用含有如本文所述的任何修饰的任何适体。
可编程的遗传修饰剂
在某些示例实施方案中，可编程的核酸酶可用于编辑含有XPR1或KIDINS220的基因组区。可编程的遗传修饰剂是能够被工程化以结合特定靶序列的酶。示例可编程的遗传修饰剂包括锌指核酸酶、TALE核酸酶(TALENS)、大范围核酸酶和CRISPR-Cas系统。在本发明的上下文中，可编程的遗传修饰剂可以被设计成靶向和/或修饰XPR1和/或KIDINS220的基因组DNA或mRNA。所述修饰可降低XPR1和/或KIDINS220的表达，或者可引入抑制XPR1:KIDINS220复合物形成的结构或翻译后修饰。不受理论的约束，正常细胞不容易受到XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出抑制的影响，然而，暂时抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出是有利的。因此，在某些实施方案中，mRNA被靶向(例如，RNA碱基编辑)。
CRISPR-Cas修饰
CRISPR-Cas系统包含能够与引导分子形成复合物的核酸内切酶(Cas蛋白)。引导分子可以被工程化以包含与给定靶序列(例如，XPR1或KIDINS220的区域内的靶序列)互补的序列。引导分子将复合物引导至靶位点，Cas核酸内切酶在此在靶序列中引入单链或双链切割。天然细胞修复途径NHEJ和HDR用于修复肠道。NHEJ可在切割位点引入插入或缺失。因此，可设计CRISPR-Cas系统以引入降低或消除表达或干扰XPR1/KINDS220复合物形成的插入或缺失。或者，可以用CRISPR-Cas系统递送模板分子，该系统利用HDR途径引入所需模板序列的插入。这些插入可引入降低或消除表达或干扰XPR1/KINDS220复合物形成的一个或多个突变。插入可移除或引入翻译后修饰位点，引入过早的终止密码子，或者破坏剪接位点，这些导致蛋白质产物功能丧失或功能降低。CRISPR-Cas系统也可以被修饰成与另外的功能结构域一起工作。在这类实施方案中，Cas蛋白的核酸内切酶活性被消除以产生死Cas(dCas)。然后使dCas9与功能结构域融合。dCas-引导复合物将功能结构域导向靶序列，在此功能结构域引入对DNA或RNA靶序列的修饰。修饰的CRISPR-Cas系统包括DNA和RNA碱基编辑器、引物编辑器和CRISPR相关转座酶(CAST)系统，下文将对其进行更详细的描述。
一般来说，如本文及其它文献如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)中所用的CRISPR-Cas或CRISPR系统统指参与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其它元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-配对序列(在内源性CRISPR系统的上下文中涵盖“直接重复序列”和tracrRNA-加工的部分直接重复序列)、引导序列(在内源性CRISPR系统的上下文中也称为“间隔子”)或如该术语在本文中所用的“RNA”(例如，引导Cas的RNA，如Cas9，例如CRISPRRNA和反式激活(tracr)RNA或单引导RNA(sgRNA)(嵌合R NA))或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。一般来说，CRISPR系统的特征在于促进在靶序列的位点形成CRISPR复合物的元件(在内源性CRISP R系统的上下文中也称为原型间隔子)。参见例如Shmakov等人，(2015)“Di scovery and Functional Characterization of Diverse Class 2CRISPR-Cas Sy stems”,Molecular Cell,DOI:dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008。
CRISPR-Cas系统通常可基于它们的效应分子的结构分为两类，每一类又按类型和亚型进一步细分。这两个类别是1类和2类。1类CRISPR-Cas系统具有由多种Cas蛋白组成的效应子模块，其中的一些形成crRNA结合复合物，而2类CRISPR-Cas系统包括单一多结构域crRNA结合蛋白。
在一些实施方案中，可用于修饰本文所述的本发明的多核苷酸的CRISPR-Cas系统可以是1类CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，可用于修饰本文所述的本发明的多核苷酸的CRISPR-Cas系统可以是2类CRISPR-Cas系统。
1类CRISPR-Cas系统
在一些实施方案中，可用于修饰本文所述的本发明的多核苷酸的CRISPR-Cas系统可以是1类CRISPR-Cas系统。1类CRISPR-Cas系统分为I型、II型和IV型。Makarova等人，2020.Nat.Rev.18:67-83，特别是如图1中所述。I型CRISPR-Cas系统分为9个亚型(I-A、I-B、I-C、I-D、I-E、I-F1、I-F2、I-F3和IG)。Makarova等人，2020。1类I型CRISPR-Cas系统可含有可具有解旋酶活性的Cas3蛋白。III型CRISPR-Cas系统分为6个亚型(III-A、III-B、III-C、III-D、III-E和III-F)。III型CRISPR-Cas系统可含有Cas10，其可以包括被称为Palm的RNA识别基序和可切割多核苷酸的环化酶结构域。Makarova等人，2020。IV型CRISPR-Cas系统分为3个亚型。(IV-A、IV-B和IV-C)。Makarova等人，2020。1类系统还包括CRISPR-Cas变体，包括I-A、I-B、I-E、I-F和I-U型变体，其可以包括由转座子和质粒携带的变体，包括I-F亚型的由Tn7样转座子的大家族编码的型式和Tn7样转座子的编码类似降解的I-B亚型系统的较小组。Peters等人，PNAS 114(35)(2017)；DOI:10.1073/pnas.1709035114；另参见Makarova等人，2018。CRISPR Journal，v.1，n5，图5。
1类系统通常使用多蛋白效应子复合物，其在一些实施方案中可包括辅助性蛋白，如在被称为用于抗病毒防御(级联)的CRISPR相关复合物的复合物中的一种或多种蛋白、一种或多种适应蛋白(例如，Cas1、Cas2、RNA核酸酶)和/或一种或多种辅助蛋白(例如，Cas 4、DNA核酸酶)、含有CRISPR相关Rossman折叠(CARF)结构域的蛋白和/或RNA转录酶。
1类CRISPR-Cas系统效应子复合物的主链可由重复序列相关神秘蛋白(RAMP)家族亚基(例如，Cas 5、Cas6和/或Cas7)的含有RNA识别基序结构域的蛋白形成。RAMP蛋白的特征在于具有一个或多个RNA识别基序结构域。在一些实施方案中，可以存在RAMP的多个拷贝。在一些实施方案中，I类CRISPR-Cas系统可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种Cas5、Cas6和/或Cas 7蛋白。在一些实施方案中，Cas6蛋白是可负责前crRNA加工的RNA酶。当存在于1类CRISPR-Cas系统中时，Cas6可任选与效应子复合物物理缔合。
1类CRISPR-Cas系统效应子复合物在一些实施方案中还可以包括大亚基。大亚基可由Cas8和/或Cas10蛋白组成或包括Cas8和/或Cas10蛋白。参见例如图1和2。Koonin EV,Makarova KS.2019.Phil.Trans.R.Soc.B 374:20180087,DOI:10.1098/rstb.2018.0087和Makarova等人，2020。
1类CRISPR-Cas系统效应子复合物可在一些实施方案中包括小亚基(例如，Cas11)。参见例如图1和2。Koonin EV,Makarova KS.2019Origins and Evolution ofCRISPR-Cas systems.Phil.Trans.R.Soc.B 374:20180087,DOI:10.1098/rstb.2018.0087。
在一些实施方案中，1类CRISPR-Cas系统可以是I型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是I-A亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是I-B亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是I-C亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是I-D亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是I-E亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是I-F1亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是I-F2亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是I-F3亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是I-G亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，I型CRISPR-Cas系统可以是CRISPR Cas变体，如I-A型、I-B型、I-E型、I-F型和I-U型变体，其可以包括由转座子和质粒携带的变体，包括I-F亚型的由Tn7样转座子的大家族编码的型式和Tn7样转座子的编码类似降解的I-B亚型系统的较小组，如先前所述。
在一些实施方案中，1类CRISPR-Cas系统可以是III型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，III型CRISPR-Cas系统可以是III-A亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，III型CRISPR-Cas系统可以是III-B亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，III型CRISPR-Cas系统可以是III-C亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，III型CRISPR-Cas系统可以是III-D亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，III型CRISPR-Cas系统可以是III-E亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，III型CRISPR-Cas系统可以是III-F亚型CRISPR-Cas系统。
在一些实施方案中，1类CRISPR-Cas系统可以是IV型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，IV型CRISPR-Cas系统可以是IV-A亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，IV型CRISPR-Cas系统可以是IV-B亚型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，IV型CRISPR-Cas系统可以是IV-C亚型CRISPR-Cas系统。
1类CRISPR-Cas系统的效应子复合物可在一些实施方案中包括任选与Cas2蛋白、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas10、Cas11或其组合融合的Cas3蛋白。在一些实施方案中，1类CRISPR-Cas系统的效应子复合物可具有任何一种或多种Cas蛋白的多个拷贝，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个拷贝。
2类CRISPR-Cas系统
可以设计本文别处更详细描述的组合物、系统和方法，并使其适用于2类CRISPR-Cas系统。因此，在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是2类CRISPR-Cas系统。2类系统与1类系统的区别在于它们具有单一大的多结构域效应蛋白。在某些示例实施方案中，2类系统可以是II型、V型或VI型系统，这些描述于Makarova等人，“Evolutionary classification ofCRISPR-Cas systems:a burst of class 2and derived variants”Nature ReviewsMicrobiology,18:67-81(Feb 2020)中，该文献以引用的方式并入本文。2类系统的每种类型进一步分为亚型。参见Markova等人，2020，特别是图2。2类II型系统可分为4个亚型：II-A、II-B、II-C1和II-C2。2类V型系统可分为17个亚型：V-A、V-B1、V-B2、V-C、V-D、V-E、V-F1、V-F1(V-U3)、V-F2、V-F3、V-G、V-H、V-I、V-K(V-U5)、V-U1、V-U2和V-U4。2类IV型系统可分为5个亚型：VI-A、VI-B1、VI-B2、VI-C和VI-D。
这些类型的区别特征是它们的效应子复合物由单一大的多结构域蛋白质组成。V型系统不同于II型效应子(例如，Cas9)，后者含有两个核结构域，各自负责靶DNA的一条链的切割，HNH核酸酶插入Ruv-C样核酸酶结构域序列内部。V型系统(例如，Cas12)仅含有切割两条链的RuvC样核酸酶结构域。VI型(Cas13)与II型和V型系统的效应子无关，并且含有两个HEPN结构域和靶RNA。Cas13蛋白还表现出通过靶识别触发的旁切活性(collateralactivity)。还发现一些V型系统在体外环境中具有与两条单链DNA的这种旁切活性。
在一些实施方案中，2类系统是II型系统。在一些实施方案中，II型CRISPR-Cas系统是II-A CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，II型CRISPR-Cas系统是II-B CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，II型CRISPR-Cas系统是II-C1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，II型CRISPR-Cas系统是II-C2 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，II型系统是Cas9系统。在一些实施方案中，II型系统包括Cas9。
在一些实施方案中，2类系统是V型系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-A CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-B1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-B2 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-C CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-DCRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-E CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-F1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-F1(V-U3)CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-F2CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-F3 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-G CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-H CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-I CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-K(V-U5)CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-U1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-U2 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统是V-U4 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，V型CRISPR-Cas系统包括Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、CasX和/或Cas14。
在一些实施方案中，2类系统是VI型系统。在一些实施方案中，VI型CRISPR-Cas系统是VI-A CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，VI型CRISPR-Cas系统是VI-B1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，VI型CRISPR-Cas系统是VI-B2 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，VI型CRISPR-Cas系统是VI-C CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，VI型CRISPR-Cas系统是VI-D CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，VI型CRISPR-Cas系统包括Cas13a(C2c2)、Cas13b(第29/30组)、Cas13c和/或Cas13d。
专门的基于Cas的系统
在一些实施方案中，系统是能够执行专门的功能或活性的基于Cas的系统。例如，Cas蛋白可以与一个或多个功能结构域融合、可操作地偶联或以其它方式缔合。在某些示例实施方案中，Cas蛋白可以是催化死亡的Cas蛋白(“dCas”)和/或具有切口酶活性。切口酶是仅切割双链靶标的一条链的Cas蛋白。在这类实施方案中，dCas或切口酶提供将功能结构域递送至靶序列或使其接近靶序列的序列特异性靶向功能。可以与Cas蛋白融合、可操作地偶联或以其它方式缔合的示例功能结构域可以是或包括但不限于核定位信号(N LS)结构域、核输出信号(NES)结构域、翻译激活结构域、转录激活结构域(例如VP64、p65、MyoD1、HSF1、RTA和SET7/9)、翻译起始结构域、转录抑制结构域(例如，KRAB结构域、NuE结构域、NcoR结构域和SID结构域，如SID4X结构域)、核酸酶结构域(例如，FokI)、组蛋白修饰结构域(例如，组蛋白乙酰转移酶)、光可诱导/可控结构域、化学可诱导/可控结构域、转座酶结构域、同源重组机制结构域、重组酶结构域、整合酶结构域及其组合。产生催化死亡的Cas9或切口酶Cas9(WO 2014/204725、Ran等人，Cell.2013年9月12日；154(6):1380-1389)、Cas12(Liu等人，Nature Communications,8,2095(2017)和Cas13(WO 2019/005884、WO2019/060746)的方法是本领域中已知的，并以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，功能结构域可具有一种或多种以下活性：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、翻译激活活性、翻译起始活性、翻译抑制活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、单链RNA切割活性、双链RNA切割活性、单链DNA切割活性、双链DNA切割活性、分子开关活性、化学诱导性、光诱导性和核酸结合活性。在一些实施方案中，一个或多个功能结构域可包含表位标签或报告子。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告子的实例包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和自发荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)。
一个或多个功能结构域可位于、靠近和/或接近效应蛋白(例如，Cas蛋白)的末端。在具有两个或更多个功能结构域的实施方案中，两个功能结构域中的每一个可位于或靠近或接近效应蛋白(例如，Cas蛋白)的末端。在一些实施方案中，如其中功能结构域与效应蛋白可操作地偶联的那些实施方案中，一个或多个功能结构域可经由合适的接头(包括但不限于GlySer接头)与效应蛋白(例如，Cas蛋白)系链或连接。当有不止一个功能结构域时，功能结构域可以相同或不同。在一些实施方案中，所有的功能结构域是相同的。在一些实施方案中，所有的功能结构域彼此不同。在一些实施方案中，至少两个功能结构域彼此不同。在一些实施方案中，至少两个功能结构域彼此相同。
其它合适的功能结构域可见于例如国际申请公布第WO 2019/018423号。
分裂的CRISPR-Cas系统
在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统是分裂的CRISPR-Cas系统。参见例如Zetche等人，2015.Nat.Biotechnol.33(2):139-142和WO 2019/018423，其组合物和技术可用于和/或适用于本发明。分裂的CRISPR-Cas蛋白在本文和以引用的方式并入本文的文献中有进一步的详细阐述。在某些实施方案中，分裂的CRISPR蛋白的每个部分与特异性结合对的成员连接，并且当彼此结合时，特异性结合对的成员保持CRISPR蛋白的各部分接近。在某些实施方案中，分裂的CRISPR蛋白的每个部分与可诱导的结合对缔合。可诱导的结合对是能够被与可诱导的结合对的两个成员结合的蛋白质或小分子“打开”或“关闭”的结合对。在一些实施方案中，CRISPR蛋白可优选在结构域之间分裂，留下完整的结构域。在特定的实施方案中，所述Cas分裂结构域(例如，在Cas9情况下的RuvC和HNH结构域)可以同时或依序地被引入到细胞中，使得所述分裂的Cas结构域加工藻类细胞中的靶核酸序列。分裂的Cas与野生型Cas相比减小的尺寸允许采用其它方法将系统递送至细胞，如使用如本文所述的细胞穿透肽。
DNA和RNA碱基编辑
在一些实施方案中，可以使用碱基编辑系统修饰本文别处描述的本发明的多核苷酸。在一些实施方案中，Cas蛋白与核苷酸脱氨酶连接或融合。因此，在一些实施方案中，基于Cas的系统可以是碱基编辑系统。如本文所用，“碱基编辑”通常是指经由基于CRISPR-Cas或基于Cas的系统进行多核苷酸修饰的过程，其不包括切除核苷酸以进行修饰。碱基编辑可以在精确的位置转换碱基对，而不会产生使用传统的CRISPR-Cas系统可能产生的过多不需要的编辑副产物。
在某些示例实施方案中，核苷酸脱氨酶可以是与DNA结合Cas蛋白(如但不限于2类II型和V型系统)结合使用的DNA碱基编辑器。两类DNA碱基编辑器是通常已知的：胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(AB E)。CBE将C·G碱基对转换为T·A碱基对(Komor等人，2016.Nature.533:420-424；Nishida等人，2016.Science.353；和Li等人，Nat.Biotech.36:324-327)，并且ABE将A·T碱基对转换为G·C碱基对。总的来说，CBE和ABE可介导所有四种可能的转变突变(C至T、A至G、T至C和G至A)。Re es和Liu.2018.Nat.Rev.Genet.19(12):770-788，特别是图1b、2a-2c、3a-3f和表1。在一些实施方案中，碱基编辑系统包括CBE和/或ABE。在一些实施方案中，可以使用碱基编辑系统修饰本文别处描述的本发明的多核苷酸。Rees和Liu.2018.Nat.Rev.Gent.19(12):770-788。碱基编辑器通常也不需要DNA供体模板和/或依赖同源定向修复。Komor等人，2016.Nature.533:420-424；Nishida等人，2016.Science.353；和Gaudeli等人，2017.Nature.551:464-471。在与DNA中的靶基因座结合后，系统的引导RNA与靶DNA链之间的碱基配对导致“R-环”中ssDNA的小区段发生位移。Nishimasu等人，Cell.156:935-949。ssDNA泡内的DNA碱基被酶组分如脱氨酶修饰。在一些系统中，催化失效的Cas蛋白可以是变体，或者修饰的Cas可具有切口酶功能，并且可以在非编辑的DNA链中产生切口，以诱导细胞使用编辑的链作为模板修复非编辑的链。Komor等人，2016.Nature.533:420-424；Nishida等人，2016.Science.353；和Gaudeli等人，2017.Nature.551:464-471。碱基编辑器可以被进一步工程化以优化核苷酸的转换(例如，A:T至G:C)。Rich ter等人，2020.NatureBiotechnology.doi.org/10.1038/s41587-020-0453-z。
其它示例V型碱基编辑系统描述于WO 2018/213708、WO 2018/213726、PCT/US2018/067207、PCT/US2018/067225和PCT/US2018/067307中，上述专利文献以引用的方式并入本文。
在某些示例实施方案中，碱基编辑系统可以是RNA碱基编辑系统。如同DNA碱基编辑器一样，能够转换核苷酸碱基的核苷酸脱氨酶可以与Cas蛋白融合。然而，在这些实施方案中，Cas蛋白将需要能够结合RNA。示例RNA结合Cas蛋白包括但不限于RNA结合Cas9，如新凶手弗朗西丝菌(Francisell a novicida)Cas9(“FnCas9”)和2类VI型Cas系统。核苷酸脱氨酶可以是胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶，或被工程化以具有胞苷脱氨酶活性的腺苷脱氨酶。在某些示例实施方案中，基于RNA的编辑器可用于在表达的mRNA中缺失或引入翻译后修饰位点。相比于DNA碱基编辑器(其编辑在修饰的细胞中是永久性的)，RNA碱基编辑器可以在可能需要更精细的时间控制之处提供编辑，例如在调节特定的免疫反应中。示例VI型RNA碱基编辑系统描述于C ox等人，2017.Science 358:1019-1027；WO 2019/005884、WO 2019/005886、WO 2019/071048、PCT/US20018/05179、PCT/US2018/067207中，上述文献以引用的方式并入本文。WO 2016/106236中描述了可适用于RNA碱基编辑目的的示例FnCas9系统，该专利文献以引用的方式并入本文。
Levy等人，Nature Biomedical Engineering doi.org/10.1038/s41441-019-0505-5(2019)中描述了用于递送碱基编辑系统的示例方法，包括使用分裂内含肽的方法将CBE和ABE分成可重构的两半，该文献以引用的方式并入本文。
先导编辑器
在一些实施方案中，可以使用先导编辑系统修饰本文别处描述的本发明的多核苷酸(参见例如，Anzalone等人，2019.Nature.576:149-157)。如同碱基编辑系统一样，先导编辑系统能够靶向修饰多核苷酸而不产生双链断裂，并且不需要供体模板。进一步的先导编辑系统能够进行所有12种可能的组合交换。先导编辑可经由“搜索-并-置换”方法操作，并且可介导靶向插入、缺失、所有12种可能的碱基对碱基转换及其组合。一般地，如PE1、PE2和PE3(同上)所例示的先导编辑系统可包括与RNA可编程切口酶融合或以其它方式偶联或缔合的逆转录酶和先导编辑延伸引导RNA(pegRNA)，以便于将遗传信息从pegRNA上的延伸部分直接拷贝到靶多核苷酸中。本发明可以使用的实施方案包括这些及其变化方案。先导编辑可具有比传统CRISPR-Cas系统更低的脱靶活性，并且与传统CRIPSR-Cas系统相比，副产物更少，且效率更高或相近。
在一些实施方案中，先导编辑引导分子可指定靶多核苷酸信息(例如，序列)并含有置换靶多核苷酸的新多核苷酸货物。为了启动从引导分子到靶多核苷酸的转移，PE系统可以在靶侧切开靶多核苷酸以暴露3’羟基，其可引发引导分子(例如，先导编辑引导分子或peg引导分子)的编辑-编码延伸区直接逆转录进入靶多核苷酸中的靶位点。参见例如Anzalone等人，2019.Nature.576:149-157，特别是图1b、1c、相关讨论和补充讨论。
在一些实施方案中，先导编辑系统可由具有切口酶活性的Cas多肽、逆转录酶和引导分子组成。Cas多肽可缺乏核酸酶活性。引导分子可包括靶结合序列以及引物结合序列和含有编辑的多核苷酸序列的模板。引导分子、Cas多肽和/或逆转录酶可以偶联在一起，或以其它方式彼此缔合以形成效应子复合物并编辑靶序列。在一些实施方案中，Cas多肽是2类V型Cas多肽。在一些实施方案中，Cas多肽是Cas9多肽(例如，是Cas9切口酶)。在一些实施方案中，Cas多肽与逆转录酶融合。在一些实施方案中，Cas多肽与逆转录酶连接。
在一些实施方案中，先导编辑系统可以是PE1系统或其变体、PE2系统或其变体或PE3(例如，PE3、PE3b)系统。参见例如Anzalone等人，2019.Nature.576:149-157，特别是第2-3页，图2a、3a-3f、4a-4b，扩展数据图3a-3b、4。
peg引导分子的长度可以为约10至约200个或更多个核苷酸，如长度为10至/或11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个或更多个核苷酸。可如Anzalone等人，2019.Nature.576:149-157中所述实现peg引导分子的优化，特别是第3页、图2a-2b和扩展数据图5a-c。
CRISPR相关转座酶(CAST)系统
在一些实施方案中，可以使用CRISPR相关转座酶(“CAST”)系统修饰本文别处描述的本发明的多核苷酸。CAST系统可包括无催化活性或被工程化为有催化活性的Cas蛋白，并且还包含催化RNA引导的DNA转座的转座酶(或其亚基)。这类系统能够在DNA分子中的靶位点插入DNA序列，而不依赖宿主细胞修复机制。CAST系统可以是1类或2类CAST系统。Klompe等人，Nature,doi:10.1038/s41586-019-1323描述了示例1类系统，该文献以引用的方式并入本文。Strecker等人，Science.10/1126/science.aax9181(2019)和PCT/US2019/066835描述了示例2类系统，上述文献以引用的方式并入本文。
引导分子
本文所述的基于CRISPR-Cas或Cas的系统可在一些实施方案中包括一种或多种引导分子。术语引导分子、引导序列和引导多核苷酸是指能够将Cas引导至靶基因组基因座的多核苷酸，并且如在前面引用的文献如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)中那样可互换使用。一般来说，引导序列是与靶多核苷酸序列具有足够的互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。引导分子可以是多核苷酸。
可以通过任意合适的测定法来评估引导序列(在核酸靶向引导RNA内)指导核酸靶向复合物与靶核酸序列的序列特异性结合的能力。例如，可以将足以形成核酸靶向复合物的核酸靶向CRISPR系统的组分(包括要测试的引导序列)提供给具有相应靶核酸序列的宿主细胞，如通过用编码核酸靶向复合物的组分的载体转染，接着评估靶核酸序列内的优先靶向(例如，切割)，如通过Surveyor测定法(Qui等人，2004.BioTechniques.36(4)702-707)。类似地，可以通过提供靶核酸序列、核酸靶向复合物的组分(包括要测试的引导序列和不同于测试引导序列的对照引导序列)，并比较在测试与对照引导序列反应之间的靶序列处的结合或切割速率，由此在试管中评价靶核酸序列的切割。其它测定也是可能的，并且是本领域技术人员能够想到的。
在一些实施方案中，引导分子是RNA。包括在基于CRISPR-Cas或Cas的系统中的引导分子(在本文中也可互换地称为引导多核苷酸和引导序列)可以是与靶核酸序列具有足够的互补性以与靶核酸序列杂交并指导核酸靶向复合物与靶核酸序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，互补性程度可以为约或超过约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。可以使用用于比对序列的任意合适的算法来确定最佳比对，这些算法的非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如，Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(NovocraftTechnologies；可在www.novocraft.com获取)、ELAND(Illumina，San Diego，CA)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获取)和Maq(可在maq.sourceforge.net获取)。
可以选择引导序列，并因此选择核酸靶向引导物，以靶向任何靶核酸序列。靶序列可以是DNA。靶序列可以是任何RNA序列。在一些实施方案中，靶序列可以是选自由以下组成的组的RNA分子内的序列：信使RNA(mRNA)、前mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、双链RNA(dsRNA)、非编码RNA(ncRNA)、长非编码RNA(lncRNA)和小细胞质RNA(scRNA)。在一些优选的实施方案中，靶序列可以是选自由mRNA、前mRNA和rRNA组成的组的RNA分子内的序列。在一些优选的实施方案中，靶序列可以是选自由ncRNA和lncRNA组成的组的RNA分子内的序列。在一些更优选的实施方案中，靶序列可以是mRNA分子或前mRNA分子内的序列。
在一些实施方案中，选择核酸靶向引导物以降低核酸靶向引导物内的二级结构的程度。在一些实施方案中，当最佳折叠时，核酸靶向引导物的约或少于约75％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的核苷酸参与自互补碱基配对。最佳折叠可通过任意合适的多核苷酸折叠算法来确定。一些程序基于计算最小吉布斯自由能。一种这样的算法的一个实例是如Zuker和Stiegler(Nucleic Acids Res.9(1981),133-148)描述的mFold。另一种示例折叠算法是维也纳大学理论化学研究所开发的在线网络服务器RNAfold，其使用质心结构预测算法(参见例如，A.R.Gruber等人，2008,Cell106(1):23-24；以及PA Carr和GM Church，2009,Nature Biotechnology 27(12):1151-62)。
在某些实施方案中，引导RNA或crRNA可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：直接重复(DR)序列和引导序列或间隔序列。在某些实施方案中，引导RNA或crRNA可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与引导序列或间隔序列融合或连接的直接重复序列。在某些实施方案中，直接重复序列可位于引导序列或间隔序列的上游(即，5’)。在其它实施方案中，直接重复序列可位于引导序列或间隔序列的下游(即，3’)。
在某些实施方案中，crRNA包含茎环，优选单个茎环。在某些实施方案中，直接重复序列形成茎环，优选单个茎环。
在某些实施方案中，引导RNA的间隔子长度为15至35nt。在某些实施方案中，引导RNA的间隔子长度为至少15个核苷酸。在某些实施方案中，间隔子长度为15至17nt，例如15、16或17nt；17至20nt，例如17、18、19或20nt；20至24nt，例如20、21、22、23或24nt；23至25nt，例如23、24或25nt；24至27nt，例如24、25、26或27nt；27至30nt，例如27、28、29或30nt；30至35nt，例如30、31、32、33、34或35nt，或者35nt或更长。
“tracrRNA”序列或类似的术语包括与crRNA序列具有足够互补性以进行杂交的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当最佳比对时，tracrRNA序列与crRNA序列之间沿两者中的较短者的长度的互补性程度为约或超过约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高。在一些实施方案中，tracr序列的长度为约或超过约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，tracr序列和crRNA序列包含在单个转录物内，使得两者之间的杂交产生具有二级结构如发夹的转录物。
一般来说，互补性程度参考sca序列和tracr序列沿两个序列中的较短者的长度的最佳比对。最佳比对可通过任意合适的比对算法确定，并且可进一步考虑二级结构，如sca序列或者tracr序列内的自互补性。在一些实施方案中，当最佳比对时，tracr序列与sca序列之间沿两者中的较短者的长度的互补性程度为约或超过约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高。
在一些实施方案中，引导序列与其相应的靶序列之间的互补性程度可以为约或超过约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或100％；引导物或RNA或sgRNA的长度可以为约或超过约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个或更多个核苷酸；或者引导物或RNA或sgRNA的长度可少于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少的核苷酸；且tracr RNA的长度可以为30或50个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列与其相应的靶序列之间的互补性程度大于94.5％或95％或95.5％或96％或96.5％或97％或97.5％或98％或98.5％或99％或99.5％或99.9％或100％。脱靶为序列与引导物之间的互补性低于100％或99.9％或99.5％或99％或99％或98.5％或98％或97.5％或97％或96.5％或96％或95.5％或95％或94.5％或94％或93％或92％或91％或90％或89％或88％或87％或86％或85％或84％或83％或82％或81％或80％，其中有利的是，脱靶是序列与引导物之间的互补性为100％或99.9％或99.5％或99％或99％或98.5％或98％或97.5％或97％或96.5％或96％或95.5％或95％或94.5％。
在根据本发明的一些实施方案中，引导RNA(能够将Cas引导至靶基因座)可包含(1)能够与真核细胞中的基因组靶基因座杂交的引导序列；(2)tracr序列；和(3)tracr配对序列。所有(1)至(3)可存在于单个RNA中，即sgRNA(按5’至3’取向排列)，或者tracr RNA可以是与含有导向和tracr序列的RNA不同的RNA。tracr与tracr配对序列杂交，并将CRISPR/Cas复合物导向靶序列。在tracr RNA在与含有引导和tracr序列的RNA不同的RNA上的情况下，每种RNA的长度可以被优化成从它们各自的天然长度缩短，并且每一者可以被独立地化学修饰以防止被细胞RNA酶降解或以其它方式增加稳定性。
对引导序列的许多修饰是本领域中已知的，并且在本发明的上下文中被进一步考虑。各种修饰可用于增加与靶序列结合的特异性和/或增加Cas蛋白的活性和/或降低脱靶效应。示例引导序列修饰描述于PCT US2019/045582中，特别是第[0178]-[0333]段，该专利文献以引用的方式并入本文。
靶序列、PAM和PFS
靶序列
在形成CRISPR复合物的上下文中，“靶序列”是指引导序列被设计成与其具有互补性的序列，其中靶序列与引导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可包含RNA多核苷酸。术语“靶RNA”是指作为或包含靶序列的RNA多核苷酸。换言之，靶多核苷酸可以是引导序列的一部分被设计成与其具有互补性且由包含CRISPR效应蛋白和引导分子的复合物介导的效应子功能要被导向其的多核苷酸或多核苷酸的一部分。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。
引导序列可特异性地结合靶多核苷酸中的靶序列。靶多核苷酸可以是DNA。靶多核苷酸可以是RNA。靶多核苷酸可具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等或更多个)靶序列。靶多核苷酸可以在载体上。靶多核苷酸可以是基因组DNA。靶多核苷酸可以是游离基因型的。靶多核苷酸的其它形式在本文别处描述。
靶序列可以是DNA。靶序列可以是任何RNA序列。在一些实施方案中，靶序列可以是选自由以下组成的组的RNA分子内的序列：信使RNA(mRNA)、前mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、双链RNA(dsRNA)、非编码RNA(ncRNA)、长非编码RNA(lncRNA)和小细胞质RNA(scRNA)。在一些优选的实施方案中，靶序列(在本文中也称为靶多核苷酸)可以是选自由mRNA、前mRNA和rRNA组成的组的RNA分子内的序列。在一些优选的实施方案中，靶序列可以是选自由ncRNA和lncRNA组成的组的RNA分子内的序列。在一些更优选的实施方案中，靶序列可以是mRNA分子或前mRNA分子内的序列。
PAM和PFS元件
PAM元件是可以被Cas蛋白识别并结合的序列。然后Cas蛋白/效应子复合物可以在邻近PAM元件的位置解链dsDNA。将要了解的是，靶向RNA的Cas蛋白和包括它们的系统不需要PAM序列(Marraffini等人，2010.Nature.463:568-571)。而是，许多为依赖PFS，这在本文别处讨论。在某些实施方案中，靶序列应与PAM(原型间隔子邻近基序)或PFS(原型间隔子侧翼序列或位点)缔合，即由CRISPR复合物识别的短序列。根据CRISPR-Cas蛋白的性质，应选择靶序列，使其在DNA双链体中的互补序列(在本文中也称为非靶序列)处于PAM的上游或下游。在实施方案中，靶序列的互补序列在PAM的下游或3’或PAM的上游或5’。PAM的精确序列和长度要求取决于所用的Cas蛋白而异，但PAM通常是邻近原型间隔子的2-5个碱基对序列(即，靶序列)。下文提供了不同Cas蛋白的天然PAM序列的实例，且本领域技术人员将能够进一步确认用于给定Cas蛋白的PAM序列。
识别不同PAM序列的能力取决于系统中包括的Cas多肽。参见例如Gleditzsch等人，2019.RNA Biology.16(4):504-517。下表3显示了若干Cas多肽以及它们识别的PAM序列。
Figure BDA0004164102410000601
在优选的实施方案中，CRISPR效应蛋白可识别3’PAM。在某些实施方案中，CRISPR效应蛋白可识别3’PAM，其为5’H，其中H是A、C或U。
进一步地，Cas蛋白上的PAM相互作用(PI)结构域的工程化可允许对PAM特异性进行编程，提高靶位点识别保真度，并增加CRISPR-Cas蛋白的多功能性，例如对于Cas9如Kleinstiver BP等人，Engineered CRISPR-Cas9nucleases with altered PAMspecificities.Nature.2015年7月23日；523(7561):481-5.doi:10.1038/nature14592中所述。如本文进一步详述，技术人员将理解的是，可类似地修饰Cas13蛋白。Gao等人，“Engineered Cpf1Enzymes with Altered PAM Specificities,”bioRxiv 091611；doi:http://dx.doi.org/10.1101/091611(2016年12月4日)。Doench等人创建了sgRNA库，将一组六个内源性小鼠和三个内源性人基因的所有可能的靶位点平铺，并通过抗体染色和流式细胞术定量评估它们产生其靶基因的无效等位基因的能力。作者表明，PAM的优化提高了活性，并且还提供了用于设计sgRNA的在线工具。
可以使用适当的设计工具在多核苷酸中确认PAM序列，设计工具可通过商业途径以及在线方式获得。这类可免费获得的工具包括但不限于CRISPRFinder和CRISPRTarget。Mojica等人，2009.Microbiol.155(Pt.3):733-740；Atschul等人，1990.J.Mol.Biol.215:403-410；Biswass等人，2013RNA Biol.10:817-827；和Grissa等人，2007.Nucleic AcidRes.35:W52-57。PAM确认的实验方法可包括但不限于质粒耗竭测定法(Jiang等人，2013.Nat.Biotechnol.31:233-239；Esvelt等人，2013.Nat.Methods.10:1116-1121；Kleinstiver等人，2015.Nature.523:481-485)、通过称为PAM-SCNAR的高通量体内模型进行筛选(Pattanayak等人，2013.Nat.Biotechnol.31:839-843和Leenay等人，2016.Mol.Cell.16:253)以及阴性筛选(Zetsche等人，2015.Cell.163:759-771)。
如先前提到，靶向RNA的CRISPR-Cas系统通常不依赖于PAM序列。而是，这类系统通常识别原型间隔子侧翼位点(PFS)而不是PAM。因此，VI型CRISPR-Cas系统通常识别原型间隔子侧翼位点(PFS)而不是PAM。对于RNA靶标，PFS代表PAM的类似物。VI型CRISPR-Cas系统采用Cas13。迄今为止分析的一些Cas13蛋白，如自沙氏纤毛菌确认的Cas13a(C2c2)(LShCAs13a)，在靶RNA的3’端对G有特异性辨别。在相应的crRNA重复位点存在C可表明在此位置的核苷酸配对被拒绝。然而，一些Cas13蛋白(例如，LwaCAs13a和PspCas13b)似乎不具有PFS偏好。参见例如Gleditzsch等人，2019.RNA Biology.16(4):504-517。
一些VI型蛋白质(如B亚型)对D(G、T、A)具有5′-识别，并且对NAN或NNA具有3′-基序要求。一个实例是在动物溃疡伯格菌中确认的Cas13b蛋白(BzCas13b)。参见例如，Gleditzsch等人，2019.RNA Biology.16(4):504-517。
总体而言，VI型CRISPR-Cas系统似乎比靶向DNA的那些(例如，V型和II型)对底物(例如，靶序列)具有更少的限制性规则。
锌指核酸酶
在一些实施方案中，使用锌指核酸酶或其系统修饰多核苷酸。一种类型的可编程DNA结合结构域由人工锌指(ZF)技术提供，该技术涉及ZF模块阵列靶向基因组中的新DNA结合位点。ZF阵列中的每个指模块靶向三个DNA碱基。个别锌指结构域的定制阵列被组装成ZF蛋白(ZFP)。
ZFP可包含功能结构域。第一种合成的锌指核酸酶(ZFN)是通过将ZF蛋白与IIS型限制酶FokI的催化结构域融合而开发的。(Kim,Y.G.等人，1994,Chimeric restrictionendonuclease,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,883-887；Kim,Y.G.等人，1996,Hybridrestriction enzymes:zinc finger fusions to Fok I cleavage domain.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93,1156-1160)。通过使用成对的ZFN异二聚体可以在脱靶活性降低的情况下获得增加的切割特异性，每个ZFN异二聚体靶向由短间隔子分开的不同核苷酸序列。(Doyon,Y.等人，2011,Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improvedobligate heterodimeric architectures.Nat.Methods 8,74-79)。ZFP也可以被设计为转录激活子和阻遏子，并且已经被用于靶向多种生物体中的许多基因。使用ZFN的基因组编辑的示例性方法可见于例如美国专利第6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185和6,479,626号，所有这些都以引用的方式具体并入。
TALE核酸酶
在一些实施方案中，TALE核酸酶或TALE核酸酶系统可用于修饰多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的方法使用分离的、非天然存在的重组或工程化DNA结合蛋白，其包含TALE单体或TALE单体或半单体作为它们的组织结构的一部分，其使得能够以提高的效率和扩大的特异性靶向核酸序列。
天然存在的TALE或“野生型TALE”是由许多种变形菌分泌的核酸结合蛋白。TALE多肽含有由高度保守的单体多肽的串联重复序列组成的核酸结合结构域，所述单体多肽的长度主要为33、34或35个氨基酸，并且主要在氨基酸位置12和13上彼此不同。在有利的实施方案中，核酸是DNA。如本文所用，术语“多肽单体”、“TALE单体”或“单体”将用于指TALE核酸结合结构域内的高度保守的重复多肽序列，且术语“重复可变双残基”或“RVD”将用于指在多肽单体的位置12和13处的高度可变氨基酸。如整个公开内容所提供，使用氨基酸的IUPAC单字母代码描述RVD的氨基酸残基。包含在DNA结合结构域内的TALE单体的一般表示为X1-11-(X12X13)-X14-33或34或35，其中下标表示氨基酸位置，且X代表任何氨基酸。X12X13表示RVD。在一些多肽单体中，在位置13的可变氨基酸丢失或不存在，并且在这类单体中，RVD由单个氨基酸组成。在这样的情况下，RVD可替代地以X*代表，其中X代表X12，且(*)表示X13不存在。DNA结合结构域包含TALE单体的若干重复序列，并且这可以(X1-11-(X12X13)-X14-33或34或35)z代表，其中在有利的实施方案中，z是至少5至40。在进一步有利的实施方案中，z是至少10至26。
TALE单体可具有由其RVD中的氨基酸的特质决定的核苷酸结合亲和力。例如，RVD为NI的多肽单体可优先与腺嘌呤(A)结合，RVD为NG的单体可优先与胸腺嘧啶(T)结合，RVD为HD的单体可优先与胞嘧啶(C)结合，且RVD为NN的单体可优先与腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)结合。在一些实施方案中，RVD为IG的单体可优先与T结合。因此，TALE的核酸结合结构域中的多肽单体重复序列的数量和顺序决定其核酸靶标特异性。在一些实施方案中，RVD为NS的单体可识别所有四个碱基对，并且可与A、T、G或C结合。TALE的结构和功能进一步描述于例如Moscou等人，Science 326:1501(2009)；Boch等人，Science 326:1509-1512(2009)；和Zhang等人，Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中。
本发明的方法中使用的多肽可以是分离的、非天然存在的重组或工程化核酸结合蛋白，其具有核酸或DNA结合区，所述核酸或DNA结合区含有被设计成靶向特定核酸序列的多肽单体重复序列。
如本文所述，RVD为HN或NH的多肽单体优先与鸟嘌呤结合，从而允许产生对含鸟嘌呤的靶核酸序列具有高结合特异性的TALE多肽。在一些实施方案中，RVD为RN、NN、NK、SN、NH、KN、HN、NQ、HH、RG、KH、RH和SS的多肽单体可优先与鸟嘌呤结合。在一些实施方案中，RVD为RN、NK、NQ、HH、KH、RH、SS和SN的多肽单体可优先与鸟嘌呤结合，并且可因此允许产生对含鸟嘌呤的靶核酸序列具有高结合特异性的TALE多肽。在一些实施方案中，RVD为HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN和SS的多肽单体可优先与鸟嘌呤结合，从而允许产生对含鸟嘌呤的靶核酸序列具有高结合特异性的TALE多肽。在一些实施方案中，对鸟嘌呤具有高结合特异性的RVD是RN、NHRH和KH。此外，RVD为NV的多肽单体可优先与腺嘌呤和鸟嘌呤结合。在一些实施方案中，RVD为H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA和S*的单体以相当的亲和力与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶结合。
核酸或DNA结合结构域的一种或多种多肽单体的预定N-末端至C-末端顺序决定本发明的多肽将与其结合的相应预定靶核酸序列。如本文所用，单体和至少一种或多种半单体被“特异性地指示成靶向”所关注的基因组基因座或基因。在植物基因组中，天然的TALE结合位点总是以胸腺嘧啶(T)开始，这可由TALE多肽的非重复N-末端内的隐蔽信号指定；在一些情况下，此区域可以被称为重复序列0。在动物基因组中，TALE结合位点不一定必须以胸腺嘧啶(T)开始，并且本发明的多肽可以靶向以T、A、G或C开始的DNA序列。TALE单体的串联重复序列总是以半长重复序列或一段序列结束，所述半长重复序列或一段序列可与重复全长TALE单体的仅前20个氨基酸共享同一性，并且此半重复序列可以被称为半单体。因此，结果就是被靶向的核酸或DNA的长度等于完整单体数加上二。
如Zhang等人，Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中所述，可以通过将来自天然存在的TALE的DNA结合区的刚好N-末端或C-末端的“加帽区”的氨基酸序列包括到工程化TALE中位于工程化TALEDNA结合区的N-末端或C-末端的位置来提高TALE多肽结合效率。因此，在某些实施方案中，本文所述的TALE多肽还包含N-末端加帽区和/或C-末端加帽区。
N-末端加帽区的示例性氨基酸序列是：
MDPIRSRTPSPARELLSGPQPDGVQPTADRGVSPPAGGPLDGLPARRTMSRTRLPSPPAPSPAFSADSFSDLLRQFDPSLFNTSLFDSLPPFGAHHTEAATGEWDEVQSGLRAADAPPPTMRVAVTAARPPRAKPAPRRRAAQPSDASPAAQVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLN(SEQ IDNO:3)
C-末端加帽区的示例性氨基酸序列是：
RPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSRHGLLQLFRRVGVTELEARSGTLPPASQRWDRILQASGMKRAKPSPTSTQTPDQASLHAFADSLERDLDAPSPMHEGDQTRAS(SEQ ID NO:4)
如本文所用，N-末端加帽区、包含重复TALE单体的DNA结合结构域和C-末端加帽区的预定“N-末端”至“C末端”取向为本发明的d-TALE或多肽中的不同结构域的组织提供了结构基础。
不需要整个N-末端和/或C-末端加帽区来增强DNA结合区的结合活性。因此，在某些实施方案中，N-末端和/或C-末端加帽区的片段包括在本文所述的TALE多肽中。
在某些实施方案中，本文所述的TALE多肽含有N-末端加帽区片段，其包括N-末端加帽区的至少10、20、30、40、50、54、60、70、80、87、90、94、100、102、110、117、120、130、140、147、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270个氨基酸。在某些实施方案中，N-末端加帽区片段氨基酸在N-末端加帽区的C-末端(DNA结合区近端)。如Zhang等人，Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中所述，包括C-末端240个氨基酸的N-末端加帽区片段将结合活性增强到等于全长加帽区，而包括C-末端147个氨基酸的片段保留了全长加帽区超过80％的功效，且包括C-末端117个氨基酸的片段保留了全长加帽区超过50％的活性。
在一些实施方案中，本文所述的TALE多肽含有C-末端加帽区片段，其包括C-末端加帽区的至少6、10、20、30、37、40、50、60、68、70、80、90、100、110、120、127、130、140、150、155、160、170、180个氨基酸。在某些实施方案中，C-末端加帽区片段氨基酸在C-末端加帽区的N-末端(DNA结合区近端)。如Zhang等人，Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中所述，包括C-末端68个氨基酸的C-末端加帽区片段将结合活性增强到等于全长加帽区，而包括C-末端20个氨基酸的片段保留了全长加帽区超过50％的功效。
在某些实施方案中，本文所述的TALE多肽的加帽区不需要具有与本文提供的加帽区序列同一的序列。因此，在一些实施方案中，本文所述的TALE多肽的加帽区具有与本文提供的加帽区氨基酸序列50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一或共享这些同一性的序列。序列同一性与序列同源性有关。同源性比较可通过肉眼进行，或者更常见的是借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可通过商业途径获得的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的同源性百分比(％)，并且还可以计算两个或更多个氨基酸或核酸序列共享的序列同一性。在一些优选的实施方案中，本文所述的TALE多肽的加帽区具有与本文提供的加帽区氨基酸序列至少95％同一或共享95％同一性的序列。
可通过本领域中已知的多种计算机程序中的任一者生成序列同源性，这些计算机程序包括但不限于BLAST或FASTA。也可以使用用于进行比对的合适计算机程序，如GCGWisconsin Bestfit程序包。一旦软件已产生最佳比对，则可以计算％同源性，优选％序列同一性。软件通常将此作为序列比较的一部分进行，并生成数值结果。
在本文所述的一些实施方案中，本发明的TALE多肽包括与一个或多个效应子结构域连接的核酸结合结构域。术语“效应子结构域”或“调控和功能结构域”是指具有与由核酸结合结构域识别的核酸序列结合以外的活性的多肽序列。通过将核酸结合结构域与一个或多个效应子结构域结合，本发明的多肽可用于将由效应子结构域介导的一种或多种功能或活性靶向至核酸结合结构域与其特异性结合的特定靶DNA序列。
在本文所述的TALE多肽的一些实施方案中，效应子结构域介导的活性是生物活性。例如，在一些实施方案中，效应子结构域是转录抑制剂(即，阻遏子结构域)，如mSin相互作用结构域(SID)。SID4X结构域或Krüppel相关盒(KRAB)或KRAB结构域的片段。在一些实施方案中，效应子结构域是转录的增强子(即，激活结构域)，如VP16、VP64或p65激活结构域。在一些实施方案中，核酸结合例如与效应子结构域连接，所述效应子结构域包括但不限于转座酶、整合酶、重组酶、解离酶、转化酶、蛋白酶、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰化酶、组蛋白脱乙酰酶、核酸酶、转录阻遏子、转录激活子、转录因子募集、蛋白质核定位信号或细胞摄取信号。
在一些实施方案中，效应子结构域是表现出活性的蛋白质结构域，所述活性包括但不限于转座酶活性、整合酶活性、重组酶活性、解离酶活性、转化酶活性、蛋白酶活性、DNA甲基转移酶活性、DNA脱甲基酶活性、组蛋白乙酰化酶活性、组蛋白脱乙酰酶活性、核酸酶活性、核定位信号传导活性、转录阻遏子活性、转录激活子活性、转录因子募集活性或细胞摄取信号传导活性。本发明的其它优选实施方案可包括本文所述的活性的任意组合。
大范围核酸酶
在一些实施方案中，大范围核酸酶或其系统可用于修饰多核苷酸。大范围核酸酶是以大识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)为特征的内切脱氧核糖核酸酶。使用大范围核酸酶的示例性方法可见于美国专利第8,163,514、8,133,697、8,021,867、8,119,361、8,119,381、8,124,369和8,129,134号，这些专利以引用的方式具体并入。
与核靶向和转运有关的序列
在一些实施方案中，用于工程化细胞的组合物中的一种或多种组分(例如，Cas蛋白和/或脱氨酶、Zn指蛋白、TALE或大范围核酸酶)可包含一个或多个与核靶向和转运有关的序列。这种序列可促进组合物中的一种或多种组分靶向细胞内的序列。为了改善本公开的方法中使用的CRISPR-Cas蛋白和/或核苷酸脱氨酶蛋白或其催化结构域对细胞核的靶向，可能有利的是为这些组分中的一者或两者提供一个或多个核定位序列(NLS)。
在一些实施方案中，在本公开的上下文中使用的NLS与蛋白质是异源的。NLS的非限制性实例包括来源于以下的NLS序列：SV40病毒大T抗原的NLS，其具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:5)或PKKKRKVEAS(SEQ ID NO:6)；来自核质蛋白的NLS(例如，具有序列KRPAATKKAGQ AKKKK(SEQ ID NO:7)的核质蛋白二分体NLS)；具有氨基酸序列PAAK RVKLD(SEQ ID NO:8)或RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:9)的c-myc NLS；具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:10)的hRNPA1 M9 NLS；来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:11)；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ ID NO:12)和PPKKARED(SEQ ID NO:13)；人p53的序列PQPKKKPL(SEQ IDNO:14)；小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:15)；流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQ ID NO:16)和PKQKKRK(SEQ ID NO:17)；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ IDNO:18)；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO:19)；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:20)；和类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:21)。一般来说，一个或多个NLS的强度足以驱动DNA靶向Cas蛋白以可检测的量在真核细胞的细胞核中积累。一般来说，核定位活性的强度可来源于CRISPR-Cas蛋白中的NLS的数目、所使用的特定NLS或这些因素的组合。可通过任意合适的技术检测在细胞核中的积累。例如，可检测标志物可与核酸靶向蛋白融合，使得细胞内的位置可以被可视化，例如与检测细胞核的位置的手段(例如，对细胞核特异性的染色，如DAPI)相结合。也可以将细胞核从细胞中分离出来，然后可以通过检测蛋白质的任意合适的方法分析其内容物，如通过免疫组织化学、蛋白质印迹或酶活性测定。与未暴露于CRISPR-Cas蛋白和脱氨酶蛋白或暴露于缺少一个或多个NLS的CRISPR-Cas和/或脱氨酶蛋白的对照相比，也可以间接测定在细胞核中的积累，如通过测定靶序列处核酸靶向复合物形成的影响(例如，测定脱氨酶活性)，或测定受DNA靶向复合物形成和/或DNA靶向影响改变的基因表达活性。
CRISPR-Cas和/或核苷酸脱氨酶蛋白可提供有1个或多个(如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)异源NLS。在一些实施方案中，蛋白质包含在氨基-末端处或附近的约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS；在羧基-末端处或附近的约或超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS；或这些的组合(例如，在氨基-末端处零个或至少一个或多个NLS以及在羧基末端处零个或至少一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每一个可独立于其它的进行选择，使得单个NLS可存在于多于一个拷贝中和/或与一个或多个其它NLS组合存在于一个或多个拷贝中。在一些实施方案中，当NLS的最近氨基酸在沿着多肽链从N-或C-末端起约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个或更多个氨基酸以内时，NLS被认为接近N-或C-末端。在CRISPR-Cas蛋白的优选实施方案中，NLS连接于蛋白质的C-末端。
在某些实施方案中，CRISPR-Cas蛋白和脱氨酶蛋白被递送至细胞或作为单独的蛋白质在细胞内表达。在这些实施方案中，CRISPR-Cas和脱氨酶蛋白中的每一者可提供有如本文所述的一个或多个NLS。在某些实施方案中，CRISPR-Cas和脱氨酶蛋白被递送至细胞或作为融合蛋白与细胞一起表达。在这些实施方案中，CRISPR-Cas和脱氨酶蛋白中的一者或两者被提供有一个或多个NLS。在核苷酸脱氨酶如上所述与衔接蛋白(如MS2)融合的情况下，一个或多个NLS可提供在衔接蛋白上，条件是这不干扰适体结合。在特定的实施方案中，一个或多个NLS序列也可充当核苷酸脱氨酶与CRISPR-Cas蛋白之间的接头序列。
在某些实施方案中，本公开的引导物包含衔接蛋白的特异性结合位点(例如适体)，其可与核苷酸脱氨酶或其催化结构域连接或融合。当这种引导物形成CRISPR复合物(例如，与引导物和靶标结合的CRISPR-Cas蛋白)时，衔接蛋白结合，并且与衔接蛋白缔合的核苷酸脱氨酶或其催化结构域以有利于赋予的功能有效的空间取向定位。
技术人员将理解的是，允许衔接子+核苷酸脱氨酶的结合但不允许衔接子+核苷酸脱氨酶的正确定位(例如，由于CRISPR复合物的三维结构内的空间位阻)的对引导物的修饰不是预期的修饰。一种或多种修饰的引导物可以在四环、茎环1、茎环2或茎环3处被修饰，如本文所述，优选在四环或茎环2处，并且在一些情况下在四环和茎环2两者处。
在一些实施方案中，系统中的组分(例如，死Cas蛋白、核苷酸脱氨酶蛋白或其催化结构域或其组合)可包含一个或多个核输出信号(NES)、一个或多个核定位信号(NLS)或其任意组合。在一些情况下，NES可以是HIV Rev NES。在某些情况下，NES可以是MAPK NES。当组分是蛋白质时，NES或NLS可以在组分的C末端。替代地或者另外地，NES或NLS可以在组分的N末端。在一些实例中，Cas蛋白和任选所述核苷酸脱氨酶蛋白或其催化结构域包含一个或多个异源核输出信号(NES)或核定位信号(NLS)，优选HIV Rev NES或MAPK NES，优选C-末端。
模板
在一些实施方案中，用于工程化细胞的组合物包含模板，例如重组模板。模板可以是如本文所述的另一载体的组分，包含在单独的载体中，或作为单独的多核苷酸提供。在一些实施方案中，重组模板被设计成用作同源重组中的模板，如在被作为核酸靶向复合物的一部分的核酸靶向效应蛋白切开或切割的靶序列以内或附近。
在实施方案中，模板核酸改变靶位置的序列。在实施方案中，模板核酸导致修饰或非天然存在的碱基结合到靶核酸中。
模板序列可经历断裂介导或催化的与靶序列的重组。在实施方案中，模板核酸可包括对应于靶序列上由Cas蛋白介导的切割事件切割的位点的序列。在实施方案中，模板核酸可包括对应于在第一Cas蛋白介导的事件中被切割的靶序列上的第一位点和在第二Cas蛋白介导的事件中被切割的靶序列上的第二位点两者的序列。
在某些实施方案中，模板核酸可包括导致翻译序列的编码序列改变的序列，例如导致蛋白质产物中一个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，例如将突变等位基因转换为野生型等位基因，将野生型等位基因转换为突变等位基因，和/或引入终止密码子、插入氨基酸残基、缺失氨基酸残基或无义突变。在某些实施方案中，模板核酸可包括导致非编码序列改变的序列，例如外显子或5’或3’非翻译或非转录区的改变。这类改变包括控制元件的改变，例如启动子、增强子，以及顺式作用或反式作用控制元件的改变。
与靶基因中的靶位置具有同源性的模板核酸可用于改变靶序列的结构。模板序列可用于改变不需要的结构，例如不需要的或突变的核苷酸。模板核酸可包括当整合时导致以下结果的序列：降低阳性控制元件的活性；增加阳性控制元件的活性；降低阴性控制元件的活性；增加阴性控制元件的活性；降低基因的表达；增加基因的表达；增加对病症或疾病的抵抗力；增加对病毒进入的抵抗力；纠正突变或改变不需要的氨基酸残基，从而赋予、增加、消除或减少基因产物的生物学特性，例如增加酶的酶活性或增加基因产物与另一种分子相互作用的能力。
模板核酸可包括导致靶序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个核苷酸的序列改变的序列。
模板多核苷酸可具有任意合适的长度，如长度为约或超过约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000个或更多个核苷酸。在实施方案中，模板核酸长度可以为20+/-10、30+/-10、40+/-10、50+/-10、60+/-10、70+/-10、80+/-10、90+/-10、100+/-10、1 10+/-10、120+/-10、130+/-10、140+/-10、150+/-10、160+/-10、170+/-10、1 80+/-10、190+/-10、200+/-10、210+/-10或220+/-10个核苷酸。在实施方案中，模板核酸长度可以为30+/-20、40+/-20、50+/-20、60+/-20、70+/-20、80+/-20、90+/-20、100+/-20、1 10+/-20、120+/-20、130+/-20、140+/-20、150+/-20、160+/-20、170+/-20、180+/-20、190+/-20、200+/-20、210+/-20或220+/-20个核苷酸。在实施方案中，模板核酸长度为10至1,000、20至900、30至800、40至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200或50至100个核苷酸。
在一些实施方案中，模板多核苷酸与包含靶序列的多核苷酸的一部分互补。当最佳比对时，模板多核苷酸可与靶序列的一个或多个核苷酸(例如，约或超过约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸)重叠。在一些实施方案中，当模板序列和包含靶序列的多核苷酸最佳比对时，模板多核苷酸的最近核苷酸在离靶序列约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000个或更多个核苷酸以内。
外源性多核苷酸模板包含要整合的序列(例如，突变基因)。用于整合的序列可以是细胞内源性或外源性的序列。要整合的序列的实例包括编码蛋白质或非编码RNA(例如，微RNA)的多核苷酸。因此，用于整合的序列可与适当的控制序列或多个控制序列可操作性连接。或者，要整合的序列可提供调控功能。
上游或下游序列可包含约20bp至约2500bp，例如约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500bp。在一些方法中，示例性上游或下游序列具有约200bp至约2000bp、约600bp至约1000bp，或更特别地约700bp至约1000。
上游或下游序列可包含约20bp至约2500bp，例如约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500bp。在一些方法中，示例性上游或下游序列具有约200bp至约2000bp、约600bp至约1000bp，或更特别地约700bp至约1000。
在某些实施方案中，可以缩短一个或两个同源臂以避免包括某些序列重复元件。例如，可以缩短5’同源臂以避免序列重复元件。在其它实施方案中，可以缩短3’同源臂以避免序列重复元件。在一些实施方案中，可以缩短5'和3'同源臂两者以避免包括某些序列重复元件。
在一些方法中，外源性多核苷酸模板可还包含标志物。这种标志物可以使靶向整合的筛选变得容易。合适标志物的实例包括限制位点、荧光蛋白或可选择标志物。可以采用重组技术构建本公开的外源性多核苷酸模板(参见例如Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996)。
在某些实施方案中，用于纠正突变的模板核酸可以被设计成用作单链寡核苷酸。当使用单链寡核苷酸时，5’和3’同源臂的长度范围可最多约200个碱基对(bp)，例如长度为至少25、50、75、100、125、150、175或200bp。
在某些实施方案中，用于纠正突变的模板核酸可以被设计成与同源非依赖性靶向整合系统一起使用。Suzuki等人描述了经由CRISPR/Cas9介导的同源非依赖性靶向整合的体内基因组编辑(2016,Nature 540:144–149)。Schmid-Burgk等人描述了使用CRISPR-Cas9系统在用户定义的基因组位置引入双链断裂(DSB)和通用供体DNA的插入(NatCommun.2016年7月28日；7:12338)。Gao等人描述了“采用同源非依赖性通用基因组工程化的即插即用蛋白质修饰(Plug-and-Play Protein Modification Using Homology-Independent Unive rsal Genome Engineering)”(Neuron.2019年8月21日；103(4):583-597)。
RNAi
在一些实施方案中，遗传修饰剂可以是干扰RNA。在某些实施方案中，通过使用RNAi使突变基因沉默来靶向由基因中的显性突变引起的疾病。在一些情况下，核苷酸序列可包含一种或多种干扰RNA的编码序列。在某些实例中，核苷酸序列可以是干扰RNA(RNAi)。如本文所用，术语“RNAi”是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于siRNAi、shRNAi、内源性微RNA和人工微RNA。例如，其包括先前确认为siRNA的序列，而不管RNA的下游加工机制如何(即，尽管siRNA被认为具有导致mRNA的切割的体内加工的特定方法，但在本文所述的侧翼序列的上下文中，这类序列可结合到载体中)。术语“RNAi”既可以包括基因沉默RNAi分子，也可以包括激活基因表达的RNAi效应分子。
在某些实施方案中，调节剂可包括沉默一个或多个内源性基因。如本文所用，关于RNAi分子例如siRNA或miRNA的活性的“基因沉默”或“基因沉默的”是指靶基因在细胞中的mRNA水平降低了见于不存在miRNA或RNA干扰分子的细胞中的mRNA水平的至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。在一个优选的实施方案中，mRNA水平降低至少约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。
如本文所用，“siRNA”是指形成双链RNA的核酸，当siRNA在与靶基因相同的细胞中存在或表达时，所述双链RNA具有降低或抑制基因或靶基因的表达的能力。双链RNA siRNA可由互补链形成。在一个实施方案中，siRNA是指可形成双链siRNA的核酸。siRNA的序列可对应于全长靶基因或其子序列。通常，siRNA的长度为至少约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度为约15-50个核苷酸，且双链siRNA的长度为约15-50个碱基对，优选约19-30个碱基核苷酸，优选长度约20-25个核苷酸，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。
如本文所用，“shRNA”或“小发夹RNA”(也称为茎环)是siRNA的一种类型。在一个实施方案中，这些shRNA由短的(例如，约19至约25个核苷酸)反义链、接着是约5至约9个核苷酸的核苷酸环和类似的有义链组成。或者，有义链可在核苷酸环结构之前，且反义链可在其后。
在本文中可互换使用的术语“微RNA”或“miRNA”是内源性RNA，已知其中的一些在转录后水平上调控蛋白质编码基因的表达。内源性微RNA是天然存在于基因组中的能够调节mRNA的生产性利用的小RNA。术语人工微RNA包括除内源性微RNA之外的能够调节mRNA的生产性利用的任何类型的RNA序列。微RNA序列描述于诸如以下的出版物中：Lim等人，Genes&Development,17,p.991-1008(2003)；Lim等人，Science 299,1540(2003)；Lee和Ambros，Science,294,862(2001)；Lau等人，Science 294,858-861(2001)；Lagos-Quintana等人，Current Biology,12,735-739(2002)；Lagos Quintana等人，Science 294,853-857(2001)；和Lagos-Quintana等人，RNA,9,175-179(2003)，上述文献以引用的方式并入。也可以将多个微RNA结合到前体分子中。此外，miRNA样茎环可以在细胞中表达，作为递送人工miRNA和短干扰RNA(siRNA)的媒介物，目的是通过miRNA和/或RNAi途径调节内源性基因的表达。
如本文所用，“双链RNA”或“dsRNA”是指由两条链组成的RNA分子。双链分子包括由自身加倍形成双链结构的单个RNA分子组成的分子。例如，作为单链miRNA的来源的祖分子的茎环结构(被称为前miRNA，Bartel等人，2004.Cell 1 16:281-297)包含dsRNA分子。
治疗剂的施用
对于治疗用途，本文所述的组合物或剂可全身性施用，例如配制在药学上可接受的缓冲液如生理盐水中。优选的施用途径包括例如皮下、静脉内、腹膜间、肌内或皮内注射，其在患者体内提供连续、持续的药物水平。人患者或其它动物的治疗将使用在生理上可接受的载剂中的治疗有效量的本文确认的治疗剂来进行。合适的载剂及其制剂描述于例如E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中。要施用的治疗剂的量根据施用方式、患者的年龄和体重以及肿瘤形成的临床症状而变化。量将在用于治疗与肿瘤形成相关的其它疾病的其它的剂的用量范围内，尽管在某些情况下将需要更低的量，因为化合物的特异性增加。例如，以对肿瘤细胞有细胞毒性的剂量施用治疗性化合物。
最初可由化合物在小鼠中的用量外推来确定人的剂量，正如技术人员认识到的那样，与动物模型相比修改用于人的剂量是本领域中的惯例。在某些实施方案中，预想剂量可以在以下之间变化：约1μg化合物/Kg体重至约5000mg化合物/Kg体重；或约5mg/Kg体重至约4000mg/Kg体重或约10mg/Kg体重至约3000mg/Kg体重；或约50mg/Kg体重至约2000mg/Kg体重；或约100mg/Kg体重至约1000mg/Kg体重；或约150mg/Kg体重至约500mg/Kg体重。在其它情况下，此剂量可以是约1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000mg/Kg体重。在其它方面，设想剂量可以在约5mg化合物/Kg身体至约20mg化合物/Kg身体的范围内。在其它实施方案中，剂量可以为约8、10、12、14、16或18mg/Kg体重。当然，可以向上或向下调整此剂量，如在这类治疗方案中常规进行的那样，这取决于初始临床试验的结果和特定患者的需求。
在一些情况下，本发明的化合物或组合物以低于没有观察到的副作用水平(NOAEL)的人等效剂量(HED)的剂量施用，施用期为三个月、四个月、六个月、九个月、1年、2年、3年、4年或更长时间。在动物研究中确定的NOAEL可用于确定用于人临床试验的最大推荐起始剂量。例如，可以外推NOAEL以确定人等效剂量。通常，基于针对体表面积标准化的剂量(即，mg/m2)进行物种之间的这类外推。在具体实施方案中，在小鼠、仓鼠、大鼠、雪貂、豚鼠、兔、狗、灵长类动物、灵长类动物(猴、狨猴、松鼠猴、狒狒)、微型猪或小型猪中确定NOAEL。有关使用NOAEL及其外推以确定人等效剂量的讨论，参见Guidance for IndustryEstimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials forTherapeutics in Adult Healthy Volunteers，U.S.Department of Health and HumanServices Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research(CDER)，Pharmacology and Toxicology，2005年7月，其以引用的方式并入本文。
在有效预防、治疗和/或管控癌症的预防和/或治疗方案中使用的本发明的剂的量可基于该剂的当前处方剂量以及通过本文公开和本领域中已知的方法评估。频率和剂量也将根据对每一患者特异的因素而变化，这取决于所施用的具体化合物、癌症疾患的严重程度、施用途径以及患者的年龄、体重、反应和既往病史。例如，可通过对动物模型(举例如本文公开或本领域技术人员已知的动物模型)施用所述化合物来确定将有效治疗、预防和/或管控癌症的本发明的剂的剂量。此外，可任选采用体外测定来帮助确认最佳剂量范围。
在一些方面，预防和/或治疗方案包括滴定对患者施用的剂量，以便获得治疗功效的指定量度。这类量度包括患者体内癌细胞群的减少。
在某些情况下，调整本发明的化合物在预防和/或治疗方案中的剂量，以便实现与参考样品相比，在从经历预防和/或治疗方案后的患者中提取的测试样本中发现的癌细胞的数目或量减少。这里，参考样品是从经受治疗的患者中提取的样本，其中样本是在较早时间点从患者中提取的。一方面，参考样品是在接受预防和/或治疗方案之前从同一患者中提取的样本。例如，测试样本中的癌细胞的数目或量比参考样品中低至少2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
在一些情况下，调整本发明的化合物在预防和/或治疗方案中的剂量，以便使癌细胞的数目或量落入预定的参考范围内。在这些实施方案中，将测试样本中的癌细胞的数目或量与预定的参考范围进行比较。
在其它实施方案中，调整本发明的化合物在预防和/或治疗方案中的剂量，以便实现与参考样品相比，在从经历预防和/或治疗方案后的患者中提取的测试样本中发现的癌细胞的数目或量减少，其中参考样品是从健康的未患癌症的患者中提取的样本。例如，测试样本中的癌细胞的数目或量至少在参考样品中的癌细胞的数目或量的60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或2％以内。
在治疗患有实体肿瘤的某些人患者时，从疑似肿瘤部位提取多个组织样本可能是不切实际的。在这些情况下，本发明的化合物在用于人患者的预防和/或治疗方案中的剂量是由动物模型中的剂量外推的，所述动物模型中的剂量有效减少在那些动物模型中的癌症群体。在动物模型中，调整预防和/或治疗方案，以便实现与参考样品相比，在从经历预防和/或治疗方案后的动物中提取的测试样本中发现的癌细胞的数目或量减少。参考样品可以是在接受预防和/或治疗方案之前从同一动物中提取的样本。在具体的实施方案中，测试样本中的癌细胞的数目或量比参考样品中低至少2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％或60％。可以针对体表面积标准化有效减少动物中的癌细胞的数目或量的剂量(例如，mg/m2)，以提供等效的人剂量。
本文公开的预防和/或治疗方案包括以单剂量或以多剂量(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20个或更多个剂量)对患者施用本发明的化合物或其药物组合物。
一方面，预防和/或治疗方案包括以多剂量施用本发明的化合物或其药物组合物。当以多剂量施用时，化合物或药物组合物以足以预防、治疗和/或管控疾患的频率和量施用。例如，施用的频率范围从一天一次直到约每八周一次。在另一实例中，施用的频率范围从约一周一次直到约每六周一次。在另一实例中，施用的频率范围从约每三周一次直到约每四周一次。
一般地，对受试者施用以预防、治疗和/或管控癌症的本发明的化合物的剂量在0.01至500mg/kg受试者体重的范围内，例如在0.1mg/kg至100mg/kg受试者体重的范围内。例如，对受试者施用的剂量在0.1mg/kg至50mg/kg或1mg/kg至50mg/kg受试者体重的范围内，更优选在0.1mg/kg至25mg/kg或1mg/kg至25mg/kg患者体重的范围内。在另一实例中，对受试者施用以预防、治疗和/或管控患者的癌症的本发明的化合物的剂量为500mg/kg患者体重或更少，优选为250mg/kg患者体重或更少、100mg/kg患者体重或更少、95mg/kg患者体重或更少、90mg/kg患者体重或更少、85mg/kg患者体重或更少、80mg/kg患者体重或更少、75mg/kg患者体重或更少、70mg/kg患者体重或更少、65mg/kg患者体重或更少、60mg/kg患者体重或更少、55mg/kg患者体重或更少、50mg/kg患者体重或更少、45mg/kg患者体重或更少、40mg/kg患者体重或更少、35mg/kg患者体重或更少、30mg/kg患者体重或更少、25mg/kg患者体重或更少、20mg/kg患者体重或更少、15mg/kg患者体重或更少、10mg/kg患者体重或更少、5mg/kg患者体重或更少、2.5mg/kg患者体重或更少、2mg/kg患者体重或更少、1.5mg/kg患者体重或更少或1mg/kg患者体重或更少。
在另一实例中，对受试者施用以预防、治疗和/或管控患者的癌症的本发明的化合物的剂量为0.1至50mg、0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7mg、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg或1mg至2.5mg的单位剂量。
在另一实例中，对受试者施用以预防、治疗和/或管控患者的癌症的本发明的化合物的剂量在受试者体重的0.01至10g/m2范围内，并且更典型地在受试者体重的0.1g/m2至7.5g/m2范围内。例如，对受试者施用的剂量为0.5g/m2受试者身体表面积至5g/m2受试者身体表面积或1g/m2受试者身体表面积至5g/m2受试者身体表面积。
在另一实例中，预防和/或治疗方案包括对患者施用一个或多个剂量的有效量的本发明的化合物，其中有效量的剂量达到至少0.1μg/mL、至少0.5μg/mL、至少1μg/mL、至少2μg/mL、至少5μg/mL、至少6μg/mL、至少10μg/mL、至少15μg/mL、至少20μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少125μg/mL、至少150μg/mL、至少175μg/mL、至少200μg/mL、至少225μg/mL、至少250μg/mL、至少275μg/mL、至少300μg/mL、至少325μg/mL、至少350μg/mL、至少375μg/mL或至少400μg/mL本发明的化合物的血浆水平。
在另一实例中，预防和/或治疗方案包括对患者施用多个剂量的有效量的本发明的化合物，其中所述多个剂量维持至少0.1μg/mL、至少0.5μg/mL、至少1μg/mL、至少2μg/mL、至少5μg/mL、至少6μg/mL、至少10μg/mL、至少15μg/mL、至少20μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少125μg/mL、至少150μg/mL、至少175μg/mL、至少200μg/mL、至少225μg/mL、至少250μg/mL、至少275μg/mL、至少300μg/mL、至少325μg/mL、至少350μg/mL、至少375μg/mL或至少400μg/mL本发明的化合物的血浆水平至少1天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、15个月、18个月、24个月或36个月。
在其它实施方案中，预防和/或治疗方案包括对患者施用多个剂量的有效量的本发明的化合物，其中所述多个剂量维持至少0.1μg/mL、至少0.5μg/mL、至少1μg/mL、至少2μg/mL、至少5μg/mL、至少6μg/mL、至少10μg/mL、至少15μg/mL、至少20μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL、至少100μg/mL、至少125μg/mL、至少150μg/mL、至少175μg/mL、至少200μg/mL、至少225μg/mL、至少250μg/mL、至少275μg/mL、至少300μg/mL、至少325μg/mL、至少350μg/mL、至少375μg/mL或至少400μg/mL本发明的化合物的血浆水平至少1天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、15个月、18个月、24个月或36个月。
药物组合物的释放
根据本发明的药物组合物可以被配制成在施用时或施用后的任何预定时间或时间段基本上立即释放活性化合物。后面类型的组合物通常被称为受控释放制剂，其包括(i)在延长的时间段内在体内产生基本上恒定的药物浓度的制剂；(ii)在延长的时间段内在体内在预定的滞后时间后产生基本上恒定的药物浓度的制剂；(iii)通过在体内维持相对恒定的有效水平、同时最大限度地减少与活性物质的血浆水平波动相关的不良副作用(锯齿形动力学模式)而在预定的时间段期间维持作用的制剂；(iv)通过例如将受控释放组合物在空间上放置成邻近或接触胸腺来定位作用的制剂；(v)允许方便给药的制剂，使得剂量是例如每一或两周一次施用；和(vi)通过使用载剂或化学衍生物向特定细胞类型(例如，肿瘤性细胞)递送治疗剂来靶向肿瘤形成的制剂。对于一些应用，受控释放制剂无需在白天频繁给药即可将血浆水平维持在治疗水平。
为了获得受控释放，可以采用多种策略中的任何一种，其中释放速率超过所讨论的化合物的代谢速率。在一个实例中，通过适当选择各种制剂参数和成分获得受控释放，包括例如各种类型的受控释放组合物和包衣。因此，将治疗剂与适当的赋形剂一起配制成药物组合物，其在施用时以受控的方式释放治疗剂。实例包括单个或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。
肠胃外组合物
药物组合物可以以剂型、制剂的形式通过注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌内、腹膜内等)肠胃外施用，或经由含有常规的无毒药学上可接受的载体和佐剂的合适的递送装置或植入物施用。这类组合物的制剂和制备是药物制剂领域的技术人员熟知的。制剂可见于Remington:The Science and Practice of Pharmacy，同上。
肠胃外使用的组合物可以以单位剂型(例如，单剂量安瓿)或以含有若干剂量的小瓶提供，且其中可添加合适的防腐剂(参见下文)。组合物的形式可以是溶液、悬浮液、乳液、输注装置或用于植入的递送装置，或者其可呈现为在使用前用水或另一种合适的媒介物重构的干粉。除了减少或改善肿瘤形成的活性剂之外，组合物可包括合适的肠胃外可接受的载剂和/或赋形剂。可以将活性治疗剂结合到微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中用于受控释放。此外，组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张力调节剂和/或分散剂。
如上所示，根据本发明的药物组合物可以呈适于无菌注射的形式。为了制备这种组合物，将合适的活性抗肿瘤治疗剂溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体媒介物中。可以使用的可接受的媒介物和溶剂当中有水、通过添加适量的盐酸调节至合适pH的水、氢氧化钠或合适的缓冲剂、1,3-丁二醇、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和右旋糖溶液。水性制剂还可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在其中化合物之一仅稍溶或微溶于水的情况下，可以添加溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可包括10-60％w/w的丙二醇。
受控释放肠胃外组合物
受控释放肠胃外组合物可以呈水性悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液或乳液的形式。或者，可以将活性药物结合到生物相容性载剂、脂质体、纳米颗粒、植入物或输注装置中。
用于制备微球和/或微胶囊的物质有例如可生物降解/可生物侵蚀的聚合物，如聚泌乳素(polygalactin)、聚-(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)和聚(乳酸)。在配制受控释放肠胃外制剂时可以使用的生物相容性载剂有碳水化合物(例如，葡聚糖)、蛋白质(例如，白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于植入物的物质可以是不可生物降解的(例如，聚二甲基硅氧烷)或可生物降解的(例如，聚(己内酯)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(原酸酯)或其组合)。
载体递送
本发明还提供包含一种或多种载体或一种或多种多核苷酸分子的递送系统，所述一种或多种载体或多核苷酸分子包含一种或多种编码非天然存在的或工程化的组合物的组分的多核苷酸分子，所述组合物是具有如本文所讨论或任何本文所述的方法中定义的特征的组合物。用于表达核酸靶向系统的一个或多个元件的递送媒介物、载体、颗粒、纳米颗粒、制剂及其组分是如在前述文献中使用的，如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)。
一般来说，并且在整个本说明书中，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。载体包括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个自由端、无自由端(例如，环状)的核酸分子；包含DNA、RNA或这两者的核酸分子；和本领域中已知的其它种类的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，另外的DNA区段可插入其中，如通过标准的分子克隆技术。另一类型的载体是病毒载体，其中病毒来源的DNA或RNA序列存在于用于包装到病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)中的载体中。病毒载体还包括由病毒携带的用于转染到宿主细胞中的多核苷酸。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离基因型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离基因型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，从而连同宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能够指导它们与其可操作性连接的基因的表达。这类载体在本文中被称为“表达载体”。用于并导致在真核细胞中表达的载体在本文中可以被称为“真核表达载体”。在重组DNA技术中有用的常见表达载体通常呈质粒的形式。
核糖核蛋白(RNP)
在特定的实施方案中，预复合的引导RNA和CRISPR效应蛋白(任选地，与CRISPR蛋白或衔接子融合的腺苷脱氨酶)作为核糖核蛋白(RNP)递送。RNP的优点在于，它们比RNA方法更能导致快速的编辑效果，因为这一过程避免了对转录的需求。一个重要的优点是，RNP递送都是瞬时的，从而减少了脱靶效应和毒性问题。Kim等人，(2014,Genome Res.24(6):1012-9)；Paix等人，(2015,Genetics 204(1):47-54)；Chu等人，(2016,BMCBiotechnol.16:4)；和Wang等人，(2013,Cell.9；153(4):910-8)已经观察到不同细胞类型中的高效基因组编辑。
在特定的实施方案中，核糖核蛋白通过基于多肽的穿梭剂递送，如WO2016161516中所述。WO2016161516描述了使用包含与细胞穿透结构域(CPD)可操作性连接的核内体渗漏结构域(ELD)的合成肽将多肽货物高效转导至富组氨酸结构域和CPD。类似地，这些多肽可用于在真核细胞中递送基于CRISPR-效应子的RNP。
蛋白质的施用
在理解治疗性蛋白质在动物和人中的药代动力学(PK)、药效动力学(PD)以及毒性特征方面已经取得了显著的进展，它们的商业开发已经超过三十年(参见例如，Vugmeyster等人，Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins:Advances andchallenges,World J Biol Chem.2012年4月26日；3(4):73–92)。在某些实施方案中，通过肠胃外途径施用治疗性蛋白质，如静脉内(IV)、皮下(SC)或肌内(IM)注射。分子大小、亲水性和胃降解是妨碍治疗性蛋白质的胃肠道(GI)吸收的主要因素(参见例如，Keizer等人，Clinical pharmacokinetics of therapeutic monoclonal antibodies.ClinPharmacokinet.2010年8月；49(8):493-507)。用气溶胶制剂或干粉吸入器的肺部递送已经用于选定的蛋白质，例如吸入性胰岛素(TM)(参见例如，Scheuch和Siekmeier，Novelapproaches to enhance pulmonary delivery of proteins and peptides.J PhysiolPharmacol.2007年11月；58Suppl 5(Pt 2):615-25)。玻璃体内注射已经用于仅需要局部活性的肽和蛋白质(参见例如，Suresh等人，Ocular Delivery of Peptides andProteins.In:Van Der Walle C.，编辑。Peptide and Protein Delivery.London:Academic Press；2011，第87-103页)。在某些实施方案中，治疗性蛋白质的SC施用通常是优选的途径。特别地，SC给药对于自行施用的适宜性转化为显著降低的治疗成本。
护理标准
本发明的方面涉及基于对如本文所述的任何生物标志物的检测在护理标准内修改疗法。在一个实施方案中，在护理标准内施用包含剂的疗法，其中剂的添加在护理标准的步骤内是协同的。在一个实施方案中，剂靶向肿瘤和/或将肿瘤转移成更易受靶向XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂(例如，抑制剂)的攻击。在一个实施方案中，剂抑制参与磷酸盐体内稳态的一种或多种基因的表达或活性。如本文所用的术语“护理标准”是指当前被医学专家接受为某种类型疾病的适当治疗并且被医疗保健专业人员广泛采用的治疗。护理标准也被称为最佳实践、标准医疗护理和标准疗法。癌症的护理标准通常包括手术、淋巴结切除、放射、化疗、靶向疗法、靶向肿瘤的抗体和免疫疗法。免疫疗法可包括检查点阻断剂(CBP)、嵌合抗原受体(CAR)和过继性T细胞疗法。最常见的癌症的护理标准可见于国家癌症研究所(National Cancer Institute)的网站(www.cancer.gov/cancertopics)。治疗临床试验是旨在帮助改善当前治疗或者获得癌症患者新的治疗信息的研究。当临床试验显示新的治疗优于标准治疗时，新的治疗可被认为是新的标准治疗。
在某些实施方案中，本发明提供了可与癌症的护理标准结合使用的一种或多种治疗剂(例如，抑制剂)。在护理标准内结合靶向XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出可在疾病的治疗中提供增强的或不然以前未知的活性。
在某些实施方案中，本发明提供了组合疗法，包括本文所述的治疗与作为癌症的护理标准(即，治疗方案)的一部分的治疗。在某些实施方案中，治疗卵巢癌的护理标准包括手术、化疗和靶向疗法(参见例如Lheureux等人，Epithelial ovarian cancer:Evolutionof management in the era of precision medicine.CA Cancer J Clin.2019年7月；69(4):280-304)。卵巢癌是在卵巢内或卵巢上形成的癌症。症状尤其可包括腹胀、骨盆疼痛、腹部肿胀和食欲不振。癌症可能扩散到的常见区域包括腹部内壁、淋巴结、肺和肝脏。最常见的卵巢癌类型是卵巢癌(ovarian carcinoma)(所有病例中>95％)。卵巢癌有五种主要亚型，其中高级别浆液性癌最常见。这些肿瘤被认为起源于覆盖卵巢的细胞中，尽管一些可能是在输卵管形成。不太常见的卵巢癌类型包括生殖细胞肿瘤和性索间质肿瘤。卵巢癌的诊断通过组织的活检(通常在手术期间切除)来确认。
如果早期发现并治疗，卵巢癌往往是可以治愈的。治疗通常包括手术、放疗和化疗的某种组合。结果取决于疾病的程度、存在的癌症亚型及其它医疗条件。美国的总体五年生存率为45％。
如果卵巢癌复发，基于最后一次用铂治疗复发的时间，其被认为是部分铂敏感性或铂耐药性的：部分铂敏感性癌症在最后一次治疗后6-12个月复发，且铂耐药性癌症具有不到6个月的间隔。
对于铂敏感性肿瘤，铂类药物用于二线化疗，通常与其它细胞毒性剂结合使用。方案包括卡铂与聚乙二醇化脂质体多柔比星、吉西他滨或紫杉醇结合。如果确定肿瘤为铂耐药性的，则长春新碱、更生霉素和环磷酰胺(VAC)或紫杉醇、吉西他滨和奥沙利铂的某种组合可用作二线疗法。
全身疗法可包括单独或与靶向疗法组合的单一至组合化疗方法。在某些实施方案中，手术包括用于准确手术分期的手术、初次减积手术、间隔减积手术和二次减积手术。在某些实施方案中，化疗包括卡铂、顺铂和紫杉醇。在某些实施方案中，靶向疗法包括贝伐单抗(针对血管内皮生长因子(VEGF)的人源化单克隆抗体)和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂(例如，奥拉帕尼、尼拉帕利和卢卡帕尼)。可与本发明组合使用的其它疗法包括靶向叶酸受体的剂(例如，米维妥昔单抗-索拉夫坦辛(IMGN853)，其是由与微管蛋白-破坏性美登素生物碱DM4药物(一种强效抗有丝分裂剂)连接的抗-FRα抗体组成的ADC)。在某些实施方案中，在组合疗法中采用检查点阻断疗法。如本文所用，检查点阻断疗法(CPB)是指阻断检查点受体(包括单独或组合的CTLA-4、PD-1、Tim-3、Lag-3和TIGIT)的活性的抗体。检查点阻断疗法可包括抗TIM3、抗CTLA4、抗PD-L1、抗PD1、抗TIGIT、抗LAG3或其组合。抗PD1抗体公开于美国专利第8,735,553号中。针对LAG-3的抗体公开于美国专利第9,132,281号中。抗CTLA4抗体公开于美国专利第9,327,014号；美国专利第9,320,811号；和美国专利第9,062,111号中。特定的检查点抑制剂包括但不限于抗CTLA4抗体(例如，伊匹单抗和曲美木单抗)、抗PD-1抗体(例如，纳武单抗、派姆单抗)和抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)。在某些实施方案中，化疗与免疫疗法结合用于卵巢癌的治疗。在某些实施方案中，组合疗法包括紫杉醇加派姆单抗，优选用于铂耐药性卵巢癌患者。在某些实施方案中，组合疗法包括免疫疗法与PARP抑制剂结合。
在一个实例中，在组合疗法中施用治疗剂，即与其它的剂结合，例如可用于治疗病理状况或病症如各种形式的癌症的治疗剂。本文上下文中的术语“组合”意指剂基本上是同步给予的，要么同时要么依序。如果依序给予，则在开始施用第二种剂时，在一些情况下仍可在治疗部位检测到有效浓度的两种剂中的第一种。
用于治疗肿瘤形成的剂或剂组合的施用可通过导致与其它组分结合的治疗剂的浓度有效改善、减少或稳定肿瘤形成的任意合适的方式进行。剂可以以任何适当的量包含在任意合适的载剂物质中，并且通常以组合物总重量的1-95重量％的量存在。组合物可以以适合肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌内或腹膜内)施用途径的剂型提供。可根据常规的药学实践配制药物组合物(参见例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版)，编著A.R.Gennaro，Lippincott Williams&Wilkins，2000和Encyclopedia ofPharmaceutical Technology，编著J.Swarbrick和J.C.Boylan，1988-1999，MarcelDekker，New York)。
因此，在一些实例中，预防和/或治疗方案包括施用本发明的剂与一种或多种另外的抗癌治疗剂组合。在一个实例中，组合疗法中使用的一种或多种另外的抗癌治疗剂的剂量低于已经用于或目前正用于预防、治疗和/或管控癌症的剂量。目前用于预防、治疗和/或管控癌症的一种或多种另外的抗癌治疗剂的推荐剂量可以从本领域的任何参考文献中获得，包括但不限于Hardman等人编著，Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第10版，McGraw-Hill，New York，2001；Physician’s Desk Reference(第60版，2006)，上述文献以全文引用的方式并入本文。
本发明的剂和一种或多种另外的抗癌治疗剂可以分开、同时或依序施用。在各个方面，本发明的剂和另外的抗癌治疗剂的施用间隔少于5分钟、间隔少于30分钟、间隔少于1小时、间隔约1小时、间隔约1至约2小时、间隔约2小时至约3小时、间隔约3小时至约4小时、间隔约4小时至约5小时、间隔约5小时至约6小时、间隔约6小时至约7小时、间隔约7小时至约8小时、间隔约8小时至约9小时、间隔约9小时至约10小时、间隔约10小时至约11小时、间隔约11小时至约12小时、间隔约12小时至18小时、间隔18小时至24小时、间隔24小时至36小时、间隔36小时至48小时、间隔48小时至52小时、间隔52小时至60小时、间隔60小时至72小时、间隔72小时至84小时、间隔84小时至96小时或96小时至120小时。在另一实例中，两种或更多种抗癌治疗剂在同一次患者访视之内施用。
在某些方面，循环施用本发明的剂和另外的抗癌治疗剂。循环疗法涉及持续一段时间施用一种抗癌治疗剂，接着持续一段时间施用第二种抗癌治疗剂，并重复这种依序施用，即循环，以便减少对一种或两种抗癌治疗剂产生的耐药性，以避免或减少一种或两种抗癌治疗剂的副作用和/或提高治疗的功效。在一个实例中，循环疗法涉及持续一段时间施用第一种抗癌治疗剂，接着持续一段时间施用第二种抗癌治疗剂，任选接着持续一段时间施用第三种抗癌治疗剂，如此等等，并重复这种依序施用，即循环，以便减少对抗癌治疗剂之一产生的耐药性，以避免或减少抗癌治疗剂之一的副作用和/或提高抗癌治疗剂的功效。
在另一实例中，抗癌治疗剂以分开的组合物对受试者同时施用。可通过相同或不同的施用途径对受试者施用本发明的组合抗癌治疗剂。
当同时对受试者施用本发明的剂和另外的抗癌治疗剂时，术语“同时”不限于在完全相同的时间施用抗癌治疗剂，而是意指依序且在一定的时间间隔内对受试者施用，使得它们可以一起作用(例如，协同地提供比它们以其它方式施用时增加的益处)。例如，抗癌治疗剂可以在同一时间施用或在不同的时间点按任何顺序依序施用；然而，如果不在同一时间施用，则它们应在时间上足够接近地施用，以便提供所需的治疗效果，优选以协同的方式。可以以任何适当的形式并通过任意合适的途径分开施用本发明的组合抗癌治疗剂。当组合抗癌治疗剂的组分不在同一药物组合物中施用时，要理解的是，它们可以按任何顺序对有需要的受试者施用。例如，可以在对有需要的受试者施用另外的抗癌治疗剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)施用本发明的剂。在各个方面，抗癌治疗剂的施用间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔少于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、间隔不超过24小时或间隔不超过48小时。在一个实例中，抗癌治疗剂在同一次就诊之内施用。在另一实例中，本发明的组合抗癌治疗剂间隔1分钟至24小时施用。
诊断方法
本发明提供了用于细胞特性的确认、诊断、预后和操纵的生物标志物(例如，恶性细胞特异性标志物)，用于多种诊断和/或治疗适应症。在某些实施方案中，标志物可以是SLC34A2、SLC20A1、FGF23和/或PAX8。在某些实施方案中，标志物是与SLC34A2共变异的基因(例如，PAX8)，因此可以组合或单独检测。在某些实施方案中，检测肿瘤标志物可指示罹患癌症的受试者能对XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制有响应。在某些实施方案中，检测肿瘤标志物可指示罹患癌症的受试者的预后。在某些实施方案中，检测肿瘤标志物可指示治疗是有效的(即，监测治疗的功效)。在某些实施方案中，表达SLC34A2高于正常组织的肿瘤细胞易受XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制的影响(参见治疗方法)。在某些实施方案中，XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制导致SLC34A2和/或SLC20A1表达的减少和/或FGF23表达的增加。
在某些实施方案中，形态学变化可用于确定治疗是否有效。在某些实施方案中，用XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制剂治疗受试者导致肿瘤细胞中液泡样结构的增加。在某些实施方案中，通过显微镜检查检测形态学变化。
在某些实施方案中，如治疗方法中所述的RBD蛋白可用于检测XPR1表达细胞。Giovannini等人，2013显示用来源于X-MLV Env RBD(XRBD)的可溶性配体监测XPR1的细胞表面表达，另参见US 9,791,435 B2；和US 2015/0099653A1。
本发明上下文中的生物标志物涵盖但不限于核酸、蛋白质、反应产物和代谢物，以及它们的多态性、突变、变体、修饰、亚基、片段及其它分析物或样品来源的量度。在某些实施方案中，生物标志物包括如本文所述的签名基因或签名基因产物和/或细胞。
生物标志物可用于通过检测一种或多种生物标志物的表达、活性和/或功能的第一水平并将检测的水平与水平的对照进行比较来对受试者中的免疫反应进行诊断、预测和/或分期的方法，其中检测的水平和对照水平的差异指示受试者中存在免疫反应。
术语“诊断”和“监测”在医疗实践中是司空见惯的，并且被充分理解。借助于进一步解释而非限制的方式，术语“诊断”通常是指基于症状和体征和/或根据各种诊断程序的结果(举例如，根据获知所诊断的疾病或疾患所特有的一种或多种生物标志物的存在、不存在和/或数量)来识别、判定或断定受试者的疾病或疾患的过程或行为。
术语“预测”或“预后”通常是指对疾病或疾患的进展和康复的前景(例如，概率、持续时间和/或程度)的预期。本文教导的疾病或疾患的良好预后通常可涵盖所述疾病或疾患的令人满意的部分或完全康复的预期，优选在可接受的时间段内。这种情况的良好预后更常见的是可涵盖这种情况不会进一步恶化或加重的预期，优选在给定的时间段内。如本文教导的疾病或疾患的不良预后通常可涵盖这种情况的低于标准的康复和/或不令人满意的缓慢康复或者基本上没有康复或甚至进一步恶化的预期。
本发明的生物标志物可用于确认有患癌症的风险或罹患癌症的患者群体的方法，或用于基于一种或多种生物标志物的表达、活性和/或功能的检测水平来确认将对特定治疗有响应的患者。这些生物标志物也可用于监测经受治疗和疗法的受试者的合适或异常反应以确定治疗或疗法的有效性，并用于选择或修改在治疗症状、延迟症状进展或以其它方式改善症状方面有效的疗法和治疗。本文提供的生物标志物可用于以有助于选择治疗的准确性选择处于特定疾病状态的患者组。
术语“监测”通常是指追踪受试者的疾病或状况随时间推移可能发生的任何变化。
所述术语还涵盖疾病的预测。术语“预测(predicting/prediction)”通常是指预先声明、指示或预言受试者的疾病或疾患，而受试者(还)没患有所述疾病或疾患。例如，预测受试者的疾病或疾患可指示受试者例如在一定时间段内或到一定年龄时将患所述疾病或疾患的概率、机会或风险。所述概率、机会或风险尤其可表示为绝对值、范围或统计数据，或者可相对于合适的对照受试者或受试者群体(举例如，相对于一般的正常或健康受试者或受试者群体)来表示。因此，相对于合适的对照受试者或受试者群体，受试者将患疾病或疾患的概率、机会或风险可有利地表示为增加或减少，或表示为倍数增加或倍数减少。如本文所用，如本文教导的术语在受试者中“预测”疾患或疾病也可特别意指受试者具有这种情况的“阳性”预测，即受试者有发生这种情况的风险(例如，风险相对于对照受试者或受试者群体显著增加)。如本文所述和如本文教导的术语在受试者中“预测没有”疾病或疾患可特别意指受试者具有这种情况的“阴性”预测，即受试者发生这种情况的风险相对于对照受试者或受试者群体没有显著增加。
合适地，与具有正常免疫状态或未患包含免疫组分的疾病的对照受试者相比，受试者中免疫细胞的数量或表型的改变指示受试者免疫状态受损，或患有包含免疫组分的疾病或将受益于免疫疗法。
因此，所述方法可依赖于将在来自患者的样品中测量的免疫细胞群体、生物标志物或基因或基因产物签名的数量与参考值进行比较，其中所述参考值代表如本文所教导的疾病或疾患的已知预测、诊断和/或预后。
例如，不同的参考值可代表患如本文所教导的给定疾病或疾患的风险的预测(例如，风险异常升高)相比没有患所述疾病或疾患的风险或患所述疾病或疾患的风险正常的预测。在另一实例中，不同的参考值可代表患这种疾病或疾患的风险的不同程度的预测。
在进一步的实例中，不同的参考值可代表如本文所教导的给定疾病或疾患的诊断相比没有这种疾病或疾患的诊断(举例如，健康或所述疾病或疾患康复者的诊断等)。在另一实例中，不同的参考值可代表不同严重程度的这种疾病或疾患的诊断。
在又一实例中，不同的参考值可代表如本文所教导的给定疾病或疾患的良好预后相比所述疾病或疾患的不良预后。在进一步的实例中，不同的参考值可代表对这种疾病或疾患的各种有利或不利的预后。
这种比较通常可包括用于确定所比较的值之间是否存在至少一处差异以及任选这种差异的大小的任何方法。比较可包括目视检查、测量值的算术或统计比较。这类统计比较包括但不限于应用规则。
可根据先前用于其它细胞群体、生物标志物和基因或基因产物签名的已知程序建立参考值。例如，可以在以所述疾病或疾患的特定诊断、预测和/或预后为特征的个体或个体的群体(即，其疾病或疾患的所述诊断、预测和/或预后有效)中建立参考值。这种群体可包括但不限于2个或更多、10个或更多、100个或更多或者甚至数百个或更多的个体。
第一值与第二值的“偏差”通常可涵盖任何方向(例如，增加：第一值>第二值；或减少：第一值<第二值)和任何程度的改变。
例如，偏差可涵盖第一值相对于与其进行比较的第二值减少(不限于)至少约10％(约0.9倍或更少)或至少约20％(约0.8倍或更少)或至少约30％(约0.7倍或更少)或至少约40％(约0.6倍或更少)或至少约50％(约0.5倍或更少)或至少约60％(约0.4倍或更少)或至少约70％(约0.3倍或更少)或至少约80％(约0.2倍或更少)或至少约90％(约0.1倍或更少)。
例如，偏差可涵盖第一值相对于与其进行比较的第二值增加(不限于)至少约10％(约1.1倍或更多)或至少约20％(约1.2倍或更多)或至少约30％(约1.3倍或更多)或至少约40％(约1.4倍或更多)或至少约50％(约1.5倍或更多)或至少约60％(约1.6倍或更多)或至少约70％(约1.7倍或更多)或至少约80％(约1.8倍或更多)或至少约90％(约1.9倍或更多)或至少约100％(约2倍或更多)或至少约150％(约2.5倍或更多)或至少约200％(约3倍或更多)或至少约500％(约6倍或更多)或至少约700％(约8倍或更多)等。
优选地，偏差可以指统计学上显著的观察到的改变。例如，偏差可以指在给定群体中观察到的落在参考值的误差容限之外的改变(例如通过标准偏差或标准误差或通过其预定的倍数表示，例如±1xSD或±2xSD或±3xSD或±1xSE或±2xSE或±3xSE)。偏差还可以指落在由给定群体中的值定义的参考范围之外的值(例如，包括≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥75％或≥80％或≥85％或≥90％或≥95％或甚至≥100％的所述群体中的值的范围之外)。
在进一步的实施方案中，如果观察到的改变超出给定的阈值或截止值，则可以推断出偏差。可以如本领域中通常已知的那样选择这种阈值或截止值以提供所选择的预测方法的灵敏度和/或特异性，例如至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％的灵敏度和/或特异性。
例如，接受者操作特征(ROC)曲线分析可用于基于可接受的灵敏度和特异性或本身熟知的相关性能测量，如阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性似然比(LR+)、阴性似然比(LR-)、尤登指数或类似项，来选择给定免疫细胞群体、生物标志物或基因或基因产物签名的量的最佳截止值，用于本发明诊断测试的临床用途。
在一个实施方案中，可以通过免疫荧光、免疫组织化学(IHC)、显微镜检查、荧光激活细胞分选(FACS)、质谱法(MS)、质谱流式细胞技术(CyTOF)、RNA-seq、单细胞RNA-seq(本文进一步描述)、定量RT-PCR、单细胞qPCR、荧光原位杂交(FISH)、RNA-FISH、MERFISH(多重(原位)RNA FISH)和/或通过原位杂交来检测或分离签名基因、生物标志物和/或细胞。包括吸光度测定和比色测定在内的其它方法是本领域中已知的，并且可用在本文中。检测可包括用于与RNA杂交的引物和/或探针或荧光条编码的寡核苷酸探针(参见例如Geiss GK等人，Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probepairs.Nat Biotechnol.2008年3月；26(3):317–25)。
SLC34A2的检测
在某些实施方案中，检测到SLC34A2和/或共变异基因的表达增加表明肿瘤对XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制敏感。可通过采用本文进一步描述的任何方法检测蛋白质或RNA转录物来确定SLC34A2表达。已经开发了能够检测SLC34A2的抗体(参见例如，MX35：Yin BW等人，Monoclonal antibody MX35 detects the membrane transporterNaPi2b(SLC34A2)in human carcinomas.Cancer Immun.2008；8:3；Levan K等人，Immunohistochemical evaluation of epithelial ovarian carcinomas identifiesthree different expression patterns of the MX35 antigen,NaPi2b.BMCCancer.2017；17(1):303；和RebMab200：Lopes dos Santos等人，Rebmab200,a HumanizedMonoclonal Antibody Targeting the Sodium Phosphate Transporter NaPi2bDisplays Strong Immune Mediated Cytotoxicity against Cancer:A Novel Reagentfor Targeted Antibody Therapy of Cancer.PLoS One.2013；8(7):e70332)，并且适用于本发明。已经描述了用抗NaPi2b抗体检测SLC34A2以确定癌症是否对NaPi2b靶向抗体药物缀合物有反应(参见US 2019/0160181 A1)。任何将来开发的抗体也适用于本发明。在某些实施方案中，可以使用如治疗方法中所述的抗体。
在某些实施方案中，检测包括以下中的一种或多种：免疫组织化学(IHC)、原位RNA-seq(Ke,R.等人，In situ sequencing for RNA analysis in preserved tissue andcells.Nat.Methods 10,857–860(2013))、定量PCR、RNA-seq、CITE-seq(Stoeckius,M.等人，Simultaneous epitope and transcriptome measurement in singlecells.Nat.Methods 14,865–868(2017))、蛋白质印迹、荧光原位杂交(FISH)、MERFISH(Chen,K.H.、Boettiger,A.N.、Moffitt,J.R.、Wang,S.和Zhuang,X.Spatially resolved,highly multiplexed RNA profiling in single cells.Science 348,(2015))、RNA-FISH、质谱法或FACS。
拷贝数变异
在某些实施方案中，在肿瘤(例如，XPR1)中检测拷贝数变异(CNV)(参见例如，Carter SL等人，Absolute quantification of somatic DNA alterations in humancancer.Nat Biotechnol.2012年5月；30(5):413-21；Tirosh,I.等人，Dissecting themulticellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq.Science352,189–196(2016)；Sathirapongsasuti,J.F.等人，Exome sequencing-based copy-number variation and loss of heterozygosity detection:ExomeCNV.Bioinformatics27,2648–2654(2011)；Krumm,N.等人，Copy number variation detection andgenotyping from exome sequence data.Genome Res.22,1525–1532(2012)；de
Figure BDA0004164102410000931
Lima,L.和Wang,K.PennCNV in whole-genome sequencing data.BMC Bioinformatics18,383(2017)；Fan,J.等人，Linking transcriptional and genetic tumorheterogeneity through allele analysis of single-cell RNA-seq data.GenomeRes.28,1217–1227(2018)；Campbell,K.R.等人，Clonealign:statistical integrationof independent single-cell RNA and DNA sequencing data from humancancers.Genome Biol.20,54(2019)；Chen,M.、Gunel,M.和Zhao,H.SomatiCA:Identifying,characterizing and quantifying somatic copy number aberrationsfrom cancer genome sequencing data.PLoS ONE 8,e78143(2013)；Serin Harmanci,A.等人，CaSpER identifies and visualizes CNV events by integrative analysis ofsingle-cell or bulk RNA-sequencing data.Nat Commun 11,89(2020)；和Oh等人，Reliable Analysis of Clinical Tumor-Only Whole-Exome Sequencing Data.JCO ClinCancer Inform.2020；4)。在某些实施方案中，在XPR1中检测扩增以确认对XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制敏感的肿瘤。在某些实施方案中，FISH用于检测CNV。在某些实施方案中，通过全外显子组测序(WES)或靶向组测序检测CNV。在某些实施方案中，通过根据靶测序组推断来检测CNV。在某些实施方案中，采用RNA-seq确定CNV。
显微镜检查
在某些实施方案中，通过显微镜检查检测形态学变化。显微镜检查属于使用显微镜观察肉眼看不到的物体和物体的区域(不在正常眼睛分辨率范围以内的物体)的技术领域(参见例如，Mualla等人编著，In:Medical Imaging Systems:An Introductory Guide[Internet].Cham(CH):Springer；2018.第5章.2018年8月3日.DOI:10.1007/978-3-319-96520-8_5)。在本发明中可以采用任何显微镜检查方法(例如，光学、电子和扫描探针显微镜检查或X射线显微镜检查)。在优选的实施方案中，采用相衬、荧光或共聚焦显微镜检查。
MS方法
也可以采用质谱方法评价生物标志物检测。质谱仪的多种配置可用于检测生物标志物值。多种类型的质谱仪可供选择，或者可用各种配置生产。一般来说，质谱仪具有以下主要部件：进样口、离子源、质量分析仪、检测器、真空系统和仪器控制系统及数据系统。进样口、离子源和质量分析仪的差异通常限定了仪器的类型及其能力。例如，进口可以是毛细管柱液相色谱源，或者可以是直接探针或载台，如在基质辅助激光解吸中使用的。常见的离子源例如是电喷雾，包括纳喷雾和微喷雾或基质辅助激光解吸。常见的质量分析仪包括四极质量过滤器、离子阱质量分析仪和飞行时间质量分析仪。另外的质谱方法是本领域中熟知的(参见Burlingame等人，Anal.Chem.70:647R-716R(1998)；Kinter和Sherman，New York(2000))。
可通过以下中的任何方法检测和测量蛋白质生物标志物和生物标志物值：电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法(SELDI-TOF-MS)、硅上解吸/电离(DIOS)、二次离子质谱法(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、串联飞行时间(TOF/TOF)技术(称为ultraflex III TOF/TOF)、大气压化学电离质谱法(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS).sup.N大气压光电离质谱法(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS).sup.N四极质谱法、傅里叶变换质谱法(FTMS)、定量质谱法和离子阱质谱法。
样品制备策略用于在蛋白质生物标志物的质谱表征和测定生物标志物值之前标记和富集样品。标记方法包括但不限于用于相对和绝对定量的等压标签(iTRAQ)以及用细胞培养物中的氨基酸进行稳定同位素标记(SILAC)。用于在质谱分析之前选择性地富集候选生物标志物蛋白的样品的捕获试剂包括但不限于适体、抗体、核酸探针、嵌合体、小分子、F(ab')2片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、亲和体、纳米抗体、锚蛋白、结构域抗体、替代性抗体支架(例如，双抗体等)印迹聚合物、高亲和性多聚体、模拟肽、类肽、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体和合成受体以及这些的修饰物和片段。
免疫测定法
免疫测定方法基于抗体与其相应靶标或分析物的反应，并且可根据具体的测定形式检测样品中的分析物。为了提高基于免疫反应性的测定方法的特异性和灵敏度，通常使用单克隆抗体，因为它们具有特异性表位识别。多克隆抗体也已成功地用于各种免疫测定，因为与单克隆抗体相比，它们对靶标的亲和力增加。免疫测定法已经被设计用于广泛的生物样品基质。免疫测定形式已经被设计成提供定性、半定量和定量的结果。
可通过使用用要检测的特定分析物的已知浓度创建的标准曲线生成定量结果。将来自未知样品的反应或信号绘制到标准曲线上，并确立与未知样品中的靶标相对应的量或值。
已经设计了许多种免疫测定形式。ELISA或EIA可用于定量检测分析物/生物标志物。这种方法依赖于标签与分析物或抗体的连接，并且标签组分直接或间接地包括酶。ELISA测试可以被格式化成用于分析物的直接、间接、竞争或夹心检测。其它方法依赖于标签，举例如放射性同位素(I125)或荧光。另外的技术包括例如凝集、比浊法、浊度法、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞术、Luminex测定法等(参见ImmunoAssay:A Practical Guide，Brian Law编著，Taylor&Francis,Ltd.出版，2005年版)。
示例性测定形式包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、荧光、化学发光和荧光共振能量转移(FRET)或时间分辨FRET(TR-FRET)免疫测定。用于检测生物标志物的程序的实例包括生物标志物免疫沉淀，接着是允许区分大小和肽水平的定量方法，如凝胶电泳、毛细管电泳、平面电色谱法等。
检测和/或定量可检测标记或信号产生物质的方法取决于标记的性质。由适当的酶催化的反应的产物(其中可检测标记是酶；参见上文)可以是但不限于荧光、发光或放射性的，或者它们可以吸收可见光或紫外光。适用于检测这类可检测标记的检测器的实例包括但不限于x射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、比色计、荧光计、光度计和密度计。
可以以允许进行任意合适的反应物制备、处理和分析的任何形式进行任何检测方法。这可以是例如在多孔测定板(例如，96孔或384孔)中或使用任意合适的阵列或微阵列。可以手动或自动制备各种剂的储备溶液，并且可以使用可通过商业途径获得的分析软件、机器人和能够检测可检测标记的检测仪器自动完成所有后续的移液、稀释、混合、分配、洗涤、孵育、样品读出、数据收集和分析。
杂交测定法
这类应用是杂交测定法，其中使用在要产生的图谱中显示要测定/分析的每个基因的“探针”核酸的核酸。在这些测定中，首先由被测定的初始核酸样品制备靶核酸的样品，其中制备可包括用标记物(例如，信号产生系统的成员)标记靶核酸。在靶核酸样品制备之后，使样品在杂交条件下与阵列接触，由此在与附着于阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。然后定性或定量检测杂交复合物的存在。可实施以产生主题方法中所采用的表达谱的具体杂交技术包括美国专利第5,143,854号；5,288,644号；5,324,633号；5,432,049号；5,470,710号；5,492,806号；5,503,980号；5,510,270号；5,525,464号；5,547,839号；5,580,732号；5,661,028号；5,800,992号(这些专利的公开内容以引用的方式并入本文)以及WO 95/21265；WO 96/31622；WO 97/10365；WO 97/27317；EP 373 203；和EP 785280中所述的技术。在这些方法中，使“探针”核酸的阵列与如上所述的靶核酸接触，所述“探针”核酸的阵列包括用于其表达被测定的生物标志物中的每一者的探针。接触在杂交条件下进行，例如如上所述的严格杂交条件，然后移除未结合的核酸。杂交核酸的所得模式提供了关于已经被探测的生物标志物中的每一者的表达的信息，其中表达信息是关于基因是否被表达，并且通常以什么水平被表达，其中表达数据(即，表达谱)可以是定性的和定量的。
最佳杂交条件将取决于标记探针和固定多核苷酸或寡核苷酸的长度(例如，寡聚物相比大于200个碱基的多核苷酸)和类型(例如，RNA、DNA、PNA)。核酸的特定(即，严格)杂交条件的一般参数描述于Sambrook等人，上文和Ausubel等人，“Current Protocols inMolecular Biology”，Greene Publishing and Wiley-interscience，NY(1987)中，上述文献出于所有目的全文并入。当使用cDNA微阵列时，典型的杂交条件是在5xSSC加0.2％ SDS中在65C下杂交4小时，接着在25℃下在低严格性洗涤缓冲液(1xSSC加0.2％ SDS)中洗涤，接着在25℃下在高严格性洗涤缓冲液(0.1SSC加0.2％ SDS)中洗涤10分钟(参见Shena等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第93卷，第10614页(1996))。在例如Tijessen，Hybridization With Nucleic Acid Probes"，Elsevier Science Publishers B.V.(1993)和Kricka，"Nonisotopic DNA Probe Techniques"，Academic Press，San Diego，Calif.(1992)中也提供了有用的杂交条件。
测序和核酸分析
在某些实施方案中，本发明涉及靶向核酸分析(例如，测序、定量逆转录聚合酶链反应等)(参见例如，Geiss GK等人，Direct multiplexed measureme nt of geneexpression with color-coded probe pairs.Nat Biotechnol.2008年3月；26(3):317–25)。在某些实施方案中，可通过本领域中已知的任何方法对靶核酸分子(例如，RNA分子)进行测序，例如通过高通量测序的方法，也称为下一代测序或深度测序。可以用条形码对用条形码(例如，来源特异性条形码)标记的核酸靶分子进行测序以产生含有靶分子和条形码两者的序列或其部分的单个读数和/或重叠群。示例性的下一代测序技术包括例如Illumina测序、Ion Torrent测序、454测序、SOLiD测序和纳米孔测序等。
在某些实施方案中，本发明涉及单细胞RNA测序以检测或定量易受XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的影响的细胞(参见例如，Kalisky,T.、Blainey,P.和Quake,S.R.Genomic Analysis at the Single-Cell Level.Annual review of genetics 45,431-445,(2011)；Kalisky,T.和Quake,S.R.Single-cell genomics.Nature Methods 8,311-314(2011)；Islam,S.等人，Characterization of the single-celltranscriptional landscape by highly multiplex RNA-seq.Genome Research,(2011)；Tang,F.等人，RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of asingle cell.Nature Protocols 5,516-535,(2010)；Tang,F.等人，mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.Nature Methods 6,377-382,(2009)；Ramskold,D.等人，Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA andindividual circulating tumor cells.Nature Biotechnology 30,777-782,(2012)；和Hashimshony,T.、Wagner,F.、Sher,N.和Yanai,I.CEL-Seq:Single-Cell RNA-Seq byMultiplexed Linear Amplification.Cell Reports,Cell Reports，第2卷，第3期，第666–673页，2012)。
在某些实施方案中，本发明涉及基于板的单细胞RNA测序(参见例如Picelli,S.等人，2014,“Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2”Natureprotocols 9,171-181,doi:10.1038/nprot.2014.006)。
在某些实施方案中，本发明涉及高通量单细胞RNA-seq。在这方面可参考Macosko等人，2015,“Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of IndividualCells Using Nanoliter Droplets”Cell 161,1202–1214；国际专利申请第PCT/US2015/049178号，2016年3月17日公布为WO2016/040476；Klein等人，2015,“Droplet Barcodingfor Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells”Cell 161,1187–1201；国际专利申请第PCT/US2016/027734号，2016年10月20日公布为WO2016168584A1；Zheng等人，2016,“Haplotyping germline and cancer genomes withhigh-throughput linked-read sequencing”Nature Biotechnology 34,303–311；Zheng等人，2017,“Massively parallel digital transcriptional profiling of singlecells”Nat.Commun.8,14049doi:10.1038/ncomms14049；国际专利公布第WO2014210353A2号；Zilionis等人，2017,“Single-cell barcoding and sequencing using dropletmicrofluidics”Nat Protoc.Jan；12(1):44-73；Cao等人，2017,“Comprehensive singlecell transcriptional profiling of a multicellular organism by combinatorialindexing”，bioRxiv预印本在2017年2月2日首次在线发布，doi:dx.doi.org/10.1101/104844；Rosenberg等人，2017,“Scaling single cell transcriptomics through splitpool barcoding”，bioRxiv预印本在2017年2月2日首次在线发布，doi:dx.doi.org/10.1101/105163；Rosenberg等人，“Single-cell profiling of the developing mousebrain and spinal cord with split-pool barcoding”Science 2018年3月15日；Vitak等人，“Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing”Nature Methods,14(3):302–308,2017；Cao等人，Comprehensive single-celltranscriptional profiling of a multicellular organism.Science,357(6352):661–667,2017；Gierahn等人，“Seq-Well:portable,low-cost RNA sequencing of singlecells at high throughput”Nature Methods 14,395–398(2017)；和Hughes等人，“HighlyEfficient,Massively-Parallel Single-Cell RNA-Seq Reveals Cellular States andMolecular Features of Human Skin Pathology”bioRxiv 689273；doi:doi.org/10.1101/689273，上述文献的所有内容和公开以全文引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，本发明涉及单核RNA测序。在这方面可参考Swiec h等人，2014,“In vivo interrogation of gene function in the mammalian bra in usingCRISPR-Cas9”Nature Biotechnology第33卷，第102–106页；Ha bib等人，2016,“Div-Seq:Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons”Science，第353卷，第6302期，第925-928页；H abib等人，2017,“Massively parallelsingle-nucleus RNA-seq with DroNc-se q”Nat Methods.2017年10月；14(10):955-958；国际专利申请第PCT/US2016/059239号，2017年9月28日公布为WO2017164936；国际专利申请第PC T/US2018/060860号，2019年5月16日公布为WO/2019/094984；国际专利申请第PCT/US2019/055894号，2020年4月16日公布为WO/2020/077236；和Drokhlyansky等人，“Theenteric nervous system of the human and mous e colon at a single-cellresolution,”bioRxiv 746743；doi:doi.org/10.1101/746743，上述文献以全文引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，本发明涉及采用如所述的测序(ATAC-seq)测定转座酶可及染色质。(参见例如，Buenrostro等人，Transposition of native chromatin for fast andsensitive epigenomic profiling of open chromatin,DNA-binding proteins andnucleosome position.Nature methods 2013；10(12):1213-1218；Buenrostro等人，Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatoryvariation.Nature 523,486-490(2015)；Cusanovich,D.A.、Daza,R.、Adey,A.、Pliner,H.、Christiansen,L.、Gunderson,K.L.、Steemers,F.J.、Trapnell,C.和Shendure，J.Multiplex single-cell profiling of chromatin accessibility by combinatorialcellular indexing.Science.2015年5月22日；348(6237):910-4.doi:10.1126/science.aab1601.2015年5月7日电子出版；US20160208323A1；US20160060691A1；和WO2017156336A1)。
筛选方法
在某些实施方案中，筛选能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂。筛选可以在体外或体内进行。例如，可以在体内筛选调节肿瘤微环境中磷酸盐输出的剂。在某些实施方案中，可以如本文所述测定癌细胞系的磷酸盐外排。
本发明进一步的方面涉及确认能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的剂的方法，包括：a)对癌细胞或细胞群体施加候选剂；b)检测候选剂对所述细胞或细胞群体中的磷酸盐外排的调节，从而确认所述剂。术语“调节”广义地表示被调节项的定性和/或定量的改变、变化或变异。在可以定量评估调节的情况下–例如在调节包括可量化的变量(如细胞的可量化特性)改变或由可量化的变量(如细胞的可量化特性)改变组成的情况下或在可量化的变量为调节提供合适的替代项的情况下–调节具体涵盖所测量的变量的增加(例如，激活)或减少(例如，抑制)。该术语涵盖任何程度的这种调节，例如任何程度的这种增加或减少，并且可以更特别指所测量的变量的统计学上显著的增加或减少。举例来说，与没有所述调节的参考情况相比，调节可涵盖所测量的变量的值增加至少约10％，例如至少约20％，优选至少约30％，例如至少约40％，更优选至少约50％，例如至少约75％，甚至更优选至少约100％，例如至少约150％、200％、250％、300％、400％或至少约500％；或者与没有所述调节的参考情况相比，调节可涵盖所测量的变量的值减少或降低至少约10％，例如至少约20％、至少约30％，例如至少约40％、至少约50％，例如至少约60％、至少约70％，例如至少约80％、至少约90％，例如至少约95％，如至少约96％、97％、98％、99％或甚至100％。优选地，调节可以是特异性的或选择性的，因此，可以调节免疫细胞或免疫细胞群体的一个或多个所需的表型方面，而基本上不改变其它(非预期、非所需的)表型方面。
术语“剂”广义上涵盖能够调节如本文公开的细胞或细胞群体的一个或多个表型方面的任何条件、物质或剂。这类条件、物质或剂可以是物理、化学、生物化学和/或生物学性质的。术语“候选剂”是指在包括将候选剂施加于细胞或细胞群体(例如，使细胞或细胞群体暴露于候选剂或使细胞或细胞群体与候选剂接触)并观察是否发生所需调节的方法中检查调节如本文公开的细胞或细胞群体的一个或多个表型方面的能力的任何条件、物质或剂。
剂可包括任何潜在类别的生物活性条件、物质或剂，举例如本文所述的抗体、蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸、小分子或其组合。
筛选方法可用于评价环境压力和/或状态，用于筛选化学文库，并筛选或确认结构、合成、基因组和/或生物体及物种变异。例如，可以使细胞的培养物暴露于环境压力，如但不限于热休克、渗透压、低氧、寒冷、氧化应激、辐射、饥饿、化学物质(例如治疗剂或潜在治疗剂)等。施加压力后，可以对代表性样品进行分析，例如在不同的时间点，并与对照如来自生物体或细胞(例如来自生物体的细胞)的样品或标准值进行比较。通过将细胞或其部分、组织或甚至整个动物暴露于化学文库的不同成员，并进行本文所述的方法，可例如采用高通量方法在相对较短的时间内同时筛选化学文库的不同成员对其表型的影响。
在一些实施方案中，测试剂的筛选涉及测试含有大量潜在调节剂的组合文库。组合化学文库可以是通过化学合成或生物合成、通过组合许多化学“构建块”如试剂产生的各种化学药剂的集合。例如，对于给定的药剂长度(例如多肽剂中的氨基酸数目)，通过以每种可能的方式组合一组化学构建块(氨基酸)来形成线性组合化学文库，如多肽文库。通过化学构建块的这种组合混合可以合成数百万种化学药剂。
在某些实施方案中，通过从癌症中筛选肿瘤细胞来确认对XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制敏感的癌症。所述方法可包括将XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制剂施加于癌细胞或细胞群体(例如，RBD)；并检测细胞或细胞群体中的磷酸盐浓度，其中如果与未用抑制剂处理的对照细胞或群体相比磷酸盐浓度增加，则所述癌症是敏感的。在某些实施方案中，XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制剂是根据本文的任何实施方案的一种或多种治疗剂。在某些实施方案中，癌细胞或群体获自或来源于有需要的受试者。例如，所述方法可包括将治疗剂个体化，使得来自受试者的肿瘤细胞生长，并测定对XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制的敏感性。在某些实施方案中，筛选来源于特定癌症的细胞系。
药盒或药物系统
本发明的组合物可组装成用于改善肿瘤形成的药盒或药物系统。根据本发明的这方面的药盒或药物系统包括承载装置，如盒、纸盒、管等，其中紧密封闭有一个或多个容器装置，如小瓶、管、安瓿或瓶。本发明的药盒或药物系统还可以包括使用本发明的剂的相关说明书。本发明还可以包括具有检测试剂的药盒，所述检测试剂与一种或多种生物标志物结合或可用于检测一种或多种生物标志物。
进一步的实施方案在以下实施例中说明，给出这些实施例仅用于说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1–经由新型XPR1:KIDINS220蛋白质复合物的磷酸盐调节异常是卵巢癌中的治疗易感性
申请人通过检查卵巢癌中具有活力缺陷的靶标的癌症依赖性图谱假设磷酸盐调节异常对癌症具有治疗潜力18,19。在用CRISPR/Cas9筛选的所有733种癌细胞系中，磷酸盐输出蛋白XPR1在所有基因中具有最具选择性和预测性的特征之一(图1a)，特别是对于在卵巢癌和子宫癌中观察到的少数遗传依赖性。XPR1失活对大多数癌细胞系没有影响，而卵巢癌和子宫癌细胞系显示出对XPR1的高度依赖性(63个细胞系中有15个的CERES评分<-0.6)。这种选择性依赖性概况与新出现的(例如WRN 20、EGLN1 21)和成熟的癌症治疗靶标(例如，EGFR或IKZF1)相当。XPR1的治疗性抑制也比其它高选择性但具有挑战性的靶标(例如转录因子，如PAX8、HGM1和WT1)更可行12。
申请人接下来探讨对XPR1的选择性依赖的分子基础。申请人根据每个癌细胞系的许多细胞和分子特征中与XPR1依赖性最相关的特征构建了多变量预测模型22。采用最准确模型的变量重要性分析(r＝0.391)(图1a，Y轴)，最主要的预测特征是磷酸盐输入蛋白基因SLC34A2的表达(图1b，0.38标准化基尼重要性)。高SLC34A2表达与XPR1依赖性之间的相关性主要由卵巢和子宫组织中的强关系驱动(在所有组织中R2＝0.15，n＝731，对比在卵巢/子宫中R2＝0.33，n＝63，图2a)。有意思的是，尽管在卵巢癌中增加的SLC34A2表达后果未知，但其增强的表达已得到充分确立23–25。
观察到SLC34A2的高表达与对XPR1的依赖性相关，这使我们假设XPR1失活时细胞内磷酸盐的积累对卵巢癌和子宫癌细胞具有选择性毒性(图1c)。申请人首先通过评估具有低或高SLC334A2表达的一组卵巢癌和子宫癌细胞系中XPR1的遗传失活后的细胞活力验证了这些观察结果。通过CRISPR/Cas9的XPR1失活将SLC34A2-高细胞系中的细胞活力降低到与泛必需对照的失活类似的水平。相比之下，申请人发现SLC34A2-低细胞系中的活力没有降低(图1d)。类似地，当使用shRNA试剂阻抑XPR1时，观察到了这种活力缺陷(图2b-d)。
申请人接下来试图通过进行基因组规模的遗传功能丧失修饰物筛选来系统地确定SLC34A2-或其它基因-在多大程度上必需赋予对XPR1的依赖性(图3a-b26)。在测试的～17,000个基因中，拯救XPR1失活的活力缺陷的唯一遗传敲除是SLC34A2(图1e，图3c)。申请人通过在若干细胞系中稳定失活或过表达SLC34A2进一步测试了SLC34A2的必要性和充分性。改变的SLC34A2表达单独不导致生长或活力缺陷(参见图1b中的依赖性概况)，但其表达对于赋予XPR1依赖性是必要且充分的(图1f)。
在组织培养与生理学上更相关的环境之间，对代谢环境的敏感依赖性往往可以是不同的。申请人接下来研究了申请人是否可以在原发性卵巢或子宫肿瘤中找到磷酸盐调节异常的证据，以及申请人是否可以确认出XPR1可能被预测为依赖性的肿瘤样品。申请人首先评价了XPR1与SLC34A2之间的关系，申请人首先在来自癌症基因组图谱(TCGA)27,28中的肿瘤的原始样品和来自基因型-组织表达项目(GTEx)29,30的正常组织中寻找证据。申请人发现卵巢癌和子宫癌是少数显示出SLC34A2表达增强的组织(图5a)。有意思的是，尽管已知输卵管在磷酸盐体内稳态中没有作用，但这些正常样品的SLC34A2的表达相对于正常卵巢或子宫组织略高(图4a)。与可能是这些肿瘤的起源细胞(
Figure BDA0004164102410001031
等人，2008；Piek等人，2001；Jarboe等人，2008；Hu等人，2020)的正常输卵管上皮相比，在卵巢癌和子宫癌中分别有16.3和2.66倍的增加(图4a)。大多数肿瘤样品具有与高度依赖XPR1的癌细胞系等同的SLC34A2表达。
申请人接下来寻找是什么在这些肿瘤样品中驱动高水平的SLC34A2表达的证据。先前已报道SLC34A2是配对盒8(PAX8)转录程序的组分35。PAX8是在卵巢癌发生的过程中被扩增和上调的谱系限定转录因子(Mittag等人，2007；Cheung等人，2011)。申请人发现，所有表达高水平的SLC34A2的卵巢细胞系也表达高水平的PAX8(图5b-c)。这可能表明PAX8表达驱动SLC34A2在卵巢癌中的过表达，这是一个有吸引力的假设，需要进一步研究。
根据治疗假设(图1c)，SLC34A2在肿瘤样品中增加的表达导致对磷酸盐外排的需求增加以及对XPR1的依赖。根据这一假设，申请人发现了卵巢癌和子宫癌中XPR1拷贝数扩增的有力证据(图4b)27。在卵巢癌中，XPR1基因座经历显著和反复的拷贝增加或扩增(图4c；由GISTIC得到q＝0.0015 38)，其往往是局灶性的，并且仅包括XPR1。子宫样品也具有频繁的XPR1拷贝增加(44％的样品)，尽管它们的反复不显著(图5d，q＝0.568；参考文献39)。因此，XPR1 mRNA表达水平与XPR1拷贝数改变相关联，但其它机制另外也驱动XPR1 mRNA表达(图4c)。虽然根据这些分析尚不清楚XPR1和SLC34A2两者表达增加背后的起因事件，但申请人提出，依赖增加的XPR1表达是增加的SLC34A2的结果。总之，这些数据表明，卵巢肿瘤相对于正常组织具有改变的磷酸盐体内稳态，并且SLC34A2的高表达可作为预测对XPR1抑制有响应的治疗性生物标志物。
申请人接下来寻找XPR1依赖性不是来自体外培养的超生理磷酸盐水平的人为现象的证据。申请人首先注意到，虽然磷酸盐浓度在不同细胞系的生长培养基之间有大幅度差异(范围从15至接近80mg/dL)，但与XPR1依赖性的强度没有关联(R2＝0.00，n＝658，图6a)。此外，当申请人将高XPR1依赖性细胞系中的磷酸盐浓度降低到～1/10(从72.8至7.8mg/dL)时，细胞仍然高度依赖XPR1(图6b-c)，表明细胞外磷酸盐的生理浓度足以抑制癌细胞存活。
申请人接下来直接评价XPR1失活是否将影响癌细胞系异种移植物的起始和维持。申请人首先在基于CRISPR/Cas9的肿瘤形成竞争测定中进行开发，其中sgRNA的小文库经由慢病毒被体外递送至癌细胞系，并快速进行皮下接种(图7a)。XPR1失活sgRNA被耗竭在本测定法中造成了竞争劣势，并且在测试的两个SLC34A2高表达细胞系的组织培养物和所有异种移植物肿瘤中都注意到了其耗竭(图4d-e，补充表1和图7b-e)。相比之下，其它代谢基因(最显著的是铁死亡调控子GPX4)在它们的体外与体内活力效应之间显示出差异(图4d-e)，表明此测定可检测对代谢环境敏感的依赖性。接下来，申请人评价XPR1阻抑对确立的卵巢腹膜癌(一种临床相关模型)的影响。申请人将表达荧光素酶的SLC34A2高表达卵巢癌细胞系和靶向XPR1的多西环素诱导型shRNA或种子匹配对照shRNA(图2)注射到腹膜腔中(参见图8a以及研究设计和时间线的方法)。在肿瘤生长并适应生理相关水平的磷酸盐三周后，动物间的肿瘤负荷一致(图8b-d)，因此申请人用对照或多西环素饮食处理动物(图4f-g，插图，每组n＝4只)。XPR1阻抑显著延迟了多西环素处理之后两周的肿瘤进展(图4f)，而对照shRNA的诱导对肿瘤生长没有显著影响(图4g)。总之，皮下sgRNA竞争测定和腹膜内异种移植物的结果表明，XPR1依赖性在体内与生理水平的无机磷酸盐一起得以保留。
申请人接下来寻求理解SLC34A2过表达细胞系为什么在XPR1敲除后丧失活力的机制。与治疗假设一致，申请人在敲除XPR1后观察到细胞内磷酸盐增加2-4倍，这与活力缺陷发生在同一时间框架内(图9a，图10a)。由于在人生物学中对管控细胞内磷酸盐的机制了解不充分10，所以申请人进行基因表达谱分析。申请人采用MixSeq40(一种多重单细胞RNA测序测定法)来比较在对XPR1有不同程度的依赖性的细胞系中的转录反应。申请人在使用CRISPR/Cas9进行XPR1失活后4天从代表8种不同卵巢癌和子宫癌细胞系的2,501个单细胞中收集数据。选择这个时间点是为了确认主要磷酸盐体内稳态机制而不是次要效应。在此时间点，对照与XPR1失活条件之间的细胞数量没有显著差异，表明活力影响还没有发生。
申请人在最依赖XPR1的细胞系当中观察到强且高度相关的转录反应。虽然在此签名中很少有规范的基因集(图10f-i)，但此转录程序-至少部分地-试图恢复磷酸盐体内稳态，申请人基于若干基因的差异表达得出这个结论。首先，申请人观察到FGF23的上调(图9f)，FGF23是通常由成骨骨细胞响应升高的血清磷酸盐而表达的关键磷酸盐体内稳态激素41。这与申请人观察到的增加的细胞内磷酸盐是一致的(图9a)。输卵管、卵巢和子宫组织不涉及磷酸盐体内稳态，因此这些细胞系调控FGF23-尽管部分地(图10j)-的能力是出乎意料的。9
申请人还观察到磷酸盐输入的下调。在XPR1敲除后，两个磷酸盐输入蛋白基因SLC20A1和SLC34A2显著减少(图9f)。在敲除XPR1后，SLC34A2蛋白水平也大幅度降低(图9g)，并且XPR1敲除导致磷酸盐摄取减少～60％，这很可能是由于SLC34A2的部分阻抑(图9h)。这些结果有些自相矛盾，因为SLC34A2的完全敲除可以完全拯救XPR1活力缺陷(比较图1e-f)，并且表明了SLC34A2的调节异常。SLC34A2的不完全阻抑可能是由于替代的调控机制(如PAX8的调控机制35)，但这一假设需要进一步研究。总体而言，这些数据强调了试图抵消细胞内磷酸盐增加的磷酸盐感测机制的存在。
这些结果促使申请人寻找磷酸盐外排是细胞存活所需的直接证据。相关的依赖性关系通常会确认作为相同途径或过程的一部分的基因，其告知细胞杀伤的机制42,43，并且高度相关的依赖性通常是同一复合物的一部分。申请人感到意外的是，无关基因-激酶D相互作用底物22044–47(KIDINS220，图11a和图12a-b)-的依赖性概况与对XPR1的依赖性强烈相关。XPR1和KIDINS220表达在不同组织中高度相关(图12c)，这导致我们假设这些基因可能协作以实现磷酸盐外排。实际上，KIDINS220或XPR1的丢失导致细胞内磷酸盐的类似增加(图12d)。虽然磷酸盐外排的确切机制尚不清楚，但先前的工作表明，XPR1及其它直系同源物使用跨膜蛋白结构域-称为EXS结构域-在高尔基器与质膜之间移动，以便实现磷酸盐外排在质膜与高尔基器之间移动，从而实现磷酸盐外排，并且这种移动需要C-末端EXS结构域48,49。有意思的是，KIDINS220也在这些隔间之间移动50。这促使我们评价XPR1的定位和磷酸盐外排是否需要KIDINS220。
通过使用可公开获得的质谱数据库(图12e)、共免疫沉淀和免疫荧光，申请人证实XPR1和KIDINS220形成磷酸盐外排所需的蛋白质复合物。首先，申请人能够采用常规的免疫沉淀方法确认复合物。申请人发现his相互作用不是由N-末端SPX结构域介导17,51，而是似乎需要XPR1的C-末端EXS结构域的一部分，这对于蛋白质的正确定位是至关重要的48(图11b，图13a-c)。其次，申请人注意到KIDINS220的失活导致XPR1的错误定位(图11c)。最后，申请人直接测量了卵巢癌细胞系中的磷酸盐外排，并发现XPR1或KIDINS220的失活类似程度地减少磷酸盐外排(图11d)。XPR1敲除后KIDINS220蛋白丢失(图2b)以及观察到一者不能补偿另一者的丢失(图11a)，表明这些蛋白质是同一蛋白质复合物的功能所需的，并不是单独的外排复合物。因此，两种先前未连接的跨膜蛋白的相互依赖性集中于根本无法输出无机磷酸盐。
申请人用若干实验证实XPR1和KIDINS220形成磷酸盐外排所需的蛋白质复合物。首先，在可公开获得的质谱数据集中，XPR1和KIDINS220一起并且与分泌途径内的其它蛋白质相互作用(图13a)。其次，申请人用共免疫沉淀证实了XPR1:KIDINS220蛋白质复合物，并且发现XPR1的EXS结构域对这种相互作用是至关重要的(图11b)。有意思的是，XPR1的N-末端SPX结构域-其涉及磷酸盐外排和调控-对于结合KIDINS220既不必要也不充分。与这种物理相互作用一致，KIDINS220蛋白水平在XPR1的阻抑后大幅度降低(图2b)。第三，通过使用免疫荧光，申请人注意到KIDINS220失活导致XPR1从点状分泌囊泡错误定位成更弥散的细胞质模式。最后，申请人直接测量了磷酸盐外排，并且发现XPR1和KIDINS220失活在相同程度上损害磷酸盐外排(图11d)。重要的是，XPR1敲除后KIDINS220蛋白丢失(图2b)以及观察到一者不能补偿另一者的丢失(图11a)，表明这些蛋白质是同一蛋白质复合物的功能所需的，并不是单独的外排复合物。因此，两种先前未连接的跨膜蛋白的相互依赖性集中于根本无法输出无机磷酸盐。
为了进一步证实XPR1的磷酸盐外排能力是癌细胞活力所需的，申请人采用了在罕见脑钙化病症中报道的XPR1的亚形态(hypomorphic)突变15,52。虽然内源性XPR1的敲除可以通过全长野生型XPR1的异位表达来拯救，但尽管定位正确，L218S突变并不支持细胞活力(图11e和图13)。这种突变具有一些残留的磷酸盐外排能力15，可能表明这些癌细胞对甚至部分的功能丧失也是敏感的。这些数据清楚地表明，在SLC34A2过表达的卵巢癌中，功能性磷酸盐外排是细胞活力所需的。
液泡样结构已被描述为植物中的磷酸盐储存机制。在这些研究过程期间，申请人注意到在XPR1或KIDINS220失活后，XPR1依赖性细胞在细胞质中形成大的“液泡样”结构，这是具有高SLC34A2表达的细胞的形态的无细胞质显著且高渗透的变化(图11f和图14a)。这些细胞在细胞质中形成大的“液泡样”结构。在测试的所有XPR1依赖性卵巢癌细胞系中观察到了所述结构，它们总是先于细胞活力的丧失(补充影片)，并且经常出现在多核细胞中。在一些情况下，整个细胞质充满了这些结构，申请人显示这些结构不是来源于内质网、高尔基器、线粒体、细胞核或早期内体(图14b)。然而，这些结构被酸性染料Lysotracker染色(图11g)，并且似乎与溶酶体标志物LAMP1共定位(图14b)，表明它们可能与溶酶体系统有关。通过透射电子显微镜进行的超微结构分析揭示，这些结构通过双膜结合，并且通常是穿孔的(图11h)。它们不具有溶酶体典型的电子致密外观，但申请人确实观察到溶酶体与这些“液泡样”结构的融合。申请人假设这些是新型结构，但与已在人生物学53–55或其它生物体中报道的磷酸盐储存结构有关。可能XPR1或KIDINS220的失活导致磷酸盐外排过程中使用的囊泡的过度细胞质积累和融合。49,56,57这些结构是否支持在这些癌细胞系中观察到的细胞存活或“细胞质拥挤”与观察到的细胞周期停滞有关(图9c)并且细胞活力的丧失仍有待确定。
之前已经显示用高浓度的磷酸盐处理细胞是有毒的58,59，但此研究利用了SLC34A2过表达与XPR1抑制之间的独特的合成致死相互作用。不管SLC34A2的高表达如何，XPR1失活在具有已知的生物体磷酸盐体内稳态作用的组织(例如，肺癌60,61，图2a)中都是无毒的。这可能是由于在细胞内磷酸盐增加时阻抑磷酸盐输入的反馈机制(如图9中观察到的和之前报道的16)。相比之下，SLC34A2的过表达-可能是通过PAX8或另一种途径-破坏了卵巢癌和子宫癌中的这种反馈机制，导致细胞内磷酸盐的积累和细胞死亡。这种反馈机制的特性以及其抑制是否会增强XPR1依赖性需要进一步研究。
在卵巢癌中利用磷酸盐调节异常的治疗策略应着重于抑制XPR1:KIDINS220的磷酸盐外排能力，可能是通过蛋白质配体的细胞外结合12。申请人预期具有SLC34A2过表达的大量患者群体将对这种疗法有响应，尽管将需要评价肿瘤内异质性23,25。抑制XPR1:KIDINS220的副作用可能极小且可以管控。虽然磷酸盐毒性不太可能对单个细胞有毒-因为大多数细胞系不依赖于XPR1或KIDINS220-但应避免磷酸盐体内稳态的生物体扰动13,41。然而，XPR1的短暂或部分抑制可能是耐受的15,52,62，并且低磷酸盐血症的临床管控有先例41,63。申请人希望这种策略有朝一日能惠及癌症患者。
实施例2–XPR1:KIDINS220的治疗靶向
申请人通过抑制卵巢癌细胞系中的XPR1依赖性磷酸盐外排表明XRBD是XPR1的药物样抑制剂(图17A)。在293T细胞中利用XPR1或KIDINS220的稳定敲除，申请人显示XPR1和KIDINS220在蛋白质复合物中，并且KIDINS220蛋白质水平可以是XPR1失活的替代标志物和治疗反应的潜在生物标志物(图17B，且对应于图2B)。利用图17B中分析的293T细胞的XRBD流式细胞术分析，申请人显示KIDINS220失活导致XPR1细胞表面定位急剧下降(图17C，且对应于图11C)。申请人通过用XRBD处理卵巢癌细胞系、使得处理导致卵巢癌细胞系中的活力缺陷(图17D)而进一步显示XRBD是XPR1的药物样抑制剂。XRBD敏感性(相对于媒介物对照用最高剂量的XRBD处理五天后细胞活力降低)与每个细胞系的XPR1失活敏感性(通过CRISPR活力测定评估)相关。申请人分析了在一小组肺癌细胞系中的XRBD处理(图17E且对应于图5A)。虽然以高水平表达了预测性生物标志物(SLC34A2)，但肺癌细胞系可阻抑SLC34A2磷酸盐输入蛋白以防止XPR1抑制后的细胞活力缺陷。在有或没有KIDINS220失活的情况下利用含有XPR1的天然蛋白质复合物的甘油梯度沉降分析，申请人显示KIDINS220失活导致XPR1蛋白质复合物的分子量急剧降低，表明蛋白质复合物组成改变(图17F)。利用XPR1 RT-PCR，申请人显示XPR1的失活导致磷酸盐相关基因的改变(例如，FGF23的上调)，表明了磷酸盐调节异常状态(图17G)。
图17中使用的XRBD蛋白的序列是：
MLVMEGSAFSKPLKDKINPWGPLIVMGILVRAGASVQRDSPHQIFNVTWRVTNLMTGQTANATSLLGTMTDTFPKLYFDLCDLVGDYWDDPEPDIGDGCRTPGGRRRTRLYDFYVCPGHTVPIGCGGPGEGYCGKWGCETTGQAYWKPSSSWDLISLKRGNTPKDQGPCYDSSVSSGVQGATPGGRCNPLVLEFTDAGRKASWDAPKVWGLRLYRSTGADPVTRFSLTRQVLNVGPRVPIGSVDVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:2)。
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在不脱离本发明的范围和实质的情况下，对本发明的所述方法、药物组合物和药盒的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。虽然已经结合具体实施方案对本发明进行了描述，但是要理解的是，能够进行进一步的修改，并且要求保护的本发明不应被不适当地限制于这类具体实施方案。实际上，对本领域技术人员显而易见的对所描述的实施本发明的方式的各种修改都旨在落入本发明的范围内。本申请旨在覆盖总体上遵循本发明的原理的本发明的任何变化、用途或改动，并且包括在本发明所属领域内的已知惯例实践内出现的与本公开的这类偏离，并且可适用于本文之前阐述的基本特征。
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Claims (37)

1.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用一种或多种能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌和肺癌组成的组。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症的特征在于SLC34A2在肿瘤组织中的表达与在正常组织中的表达相比更高。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂抑制XPR1的表达或活性，抑制KIDINS220的表达或活性，和/或破坏XPR1/KIDINS220相互作用。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂包含来源于包膜病毒糖蛋白并且能够与XPR1膜受体相互作用的受体结合结构域(RBD)蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述RBD蛋白是融合蛋白，其中所述融合蛋白包含能够使所述蛋白质二聚化和/或稳定化的结构域。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述RBD蛋白与Fc结构域、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和/或血清白蛋白融合。
8.如权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述RBD蛋白来源于异嗜性或多嗜性鼠白血病逆转录病毒(X-和P-MLV)Env。
9.如权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述RBD融合蛋白包含氨基酸序列：MLVMEGSAFSKPLKDKINPWGPLIVMGILVRAGASVQRDS PHQIFNVTWRVTNL MTGQTANATSLLGTMTDTFPKLYFDLCDLVGDYWDDPEPDIGDGCRTPGGRRRTRLYDFYVCPGHTVPIGCGGPGEGYCGKWGCETTGQAYWKPSSSWDLISLKRGNTPKDQGPCYDSSVSSGVQGATPGGRCNPLVLEFTDAGRKASWDAPKVWGLRLYRSTGADPVTRFSLTRQVLNVGPRVPIGSVDVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:2)。
10.如权利要求5至9中任一项所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂包含编码所述RBD蛋白的载体。
11.如权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂包括对XPR1特异性的抗体、对KIDINS220特异性的抗体或对XPR1/KIDINS220蛋白质复合物特异性的抗体。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述抗体靶向KIDINS220的Walker A/B基序。
13.如权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂包含降解剂分子。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述降解剂分子是LYTAC分子，由此细胞表面蛋白被靶向。
15.如权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂包括能够抑制XPR1或KIDINS220的表达的遗传修饰剂。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述遗传修饰剂包括CRISPR-Cas系统、RNAi、锌指核酸酶、TALE系统或大范围核酸酶。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述CRISPR-Cas系统是CRISPR-Cas碱基编辑系统、先导编辑器系统或CAST系统。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述受试者施用一种或多种能够抑制FGF23的表达或活性、能够抑制SLC34A2的阻抑或能够调节响应于XPR1抑制而上调或下调的一个或多个基因的治疗剂。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在标准的护理治疗方案内共同施用一种或多种能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述标准的护理治疗方案包括手术和化疗。
21.如权利要求19中任一项所述的方法，其中所述标准的护理治疗方案包括施用免疫疗法、检查点阻断疗法或PARP抑制剂。
22.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：
通过检测SLC34A2相对于对照的表达增加来检测对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤，其中
如果所述受试者患有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤，则包括施用一种或多种根据权利要求4至17中任一项所述的能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂；
如果所述受试者没患有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤，则施用标准的护理治疗，所述标准的护理治疗不包括施用一种或多种能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的治疗剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述癌症选自由卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌和肺癌组成的组。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述标准的护理治疗包括手术、化疗、免疫疗法、检查点阻断疗法或施用PARP抑制剂中的一种或多种。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述治疗的功效，所述监测所述治疗的功效包括在获自所述受试者的肿瘤样品中检测选自由SLC34A2、SLC20A1和FGF23组成的组的一个或多个基因的表达，其中如果SLC34A2和/或SLC20A1减少，和/或FGF23增加，则所述治疗是有效的。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述治疗的功效，所述监测所述治疗的功效包括检测获自所述受试者的肿瘤细胞中与磷酸盐调节异常相关的增加的形态学变化，其中如果检测到与磷酸盐调节异常相关的增加的形态学变化，则所述治疗是有效的。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述与磷酸盐调节异常相关的形态学变化包括肿瘤细胞中的液泡样结构。
28.一种确定罹患癌症的受试者是否患有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤的方法，所述方法包括检测SLC34A2在获自所述受试者的肿瘤样品中的表达，其中如果SLC34A2在所述肿瘤样品中的表达与在正常组织中的表达相比更高，则所述肿瘤是敏感的。
29.如权利要求28所述的方法，所述方法还包括检测PAX8。
30.一种确定罹患癌症的受试者是否患有对磷酸盐调节异常敏感的肿瘤的方法，所述方法包括检测获自所述受试者的肿瘤样品中的XPR1拷贝数的扩增，其中如果在所述肿瘤样品中检测到XPR1拷贝数扩增，则所述肿瘤是敏感的。
31.如权利要求30所述的方法，其中通过根据在1号染色体上的XPR1基因座处的靶测序组推断来检测拷贝数。
32.如权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、胆管癌、肝癌和肺癌组成的组。
33.如权利要求28至32中任一项所述的方法，其中检测包括免疫组织化学(IHC)、原位RNA-seq、定量PCR、RNA-seq、CITE-seq、蛋白质印迹、荧光原位杂交(FISH)、RNA-FISH、质谱法或FACS中的一种或多种。
34.一种确认能够抑制XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的剂的方法，所述方法包括：
对癌细胞或细胞群体施加候选剂；以及
检测所述候选剂对所述细胞或细胞群体中的磷酸盐外排的调节，从而确认所述剂。
35.一种确认对XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制敏感的癌症的方法，所述方法包括：
对癌细胞或细胞群体施加XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制剂；以及
检测所述细胞或细胞群体中的磷酸盐浓度，其中如果与未用所述抑制剂处理的对照细胞或群体相比所述磷酸盐浓度增加，则所述癌症是敏感的。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述XPR1:KIDINS220介导的磷酸盐输出的抑制剂是根据权利要求4至17中任一项所述的一种或多种治疗剂。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述癌细胞或群体获自或来源于有需要的受试者。
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