CN116194091A - 包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物 - Google Patents
包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供了包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物、通过施用此类插入物来治疗或预防有需要受试者的眼部疾病的方法以及制造此类插入物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及眼部疾病，例如影响眼表的疾病如干眼症或干眼病“DED”的治疗。根据本发明，眼部疾病是通过例如泪小管内施用插入物来治疗，所述插入物是可生物降解的并提供环孢菌素(cyclosporine)的持续释放。
背景技术
眼部疾病和病症，特别是影响眼表的疾病和病症极为常见。例如，干眼病(DED)，也称为干燥性角膜结膜炎(KCS)，是最常见的眼科病症之一。在眼科诊所就诊的患者经常报告干眼症的症状，这使其成为一个日益严重的公共健康问题，并且也成为眼科保健医师最常见的疾患之一。患病率随着年龄的增长而显著增加并且在女性中患病率较高。据估计，超过1600万美国(US)成年人被诊断出患有所述病症，其中有900万人被归类为中度至重度。
DED是泪膜和眼表的多因性病症，其可能导致眼睛不适症状，例如干燥、烧灼感、搔痒、发红、刺痛、视力模糊、砂磨感、疼痛、异物感、视觉障碍、泪膜不稳定、眼疲劳和常见的眼表损伤。DED也可能使患者难以佩戴或无法佩戴隐形眼镜、阅读、在电脑上工作或在夜间开车。
已表明，泪腺和眼表炎症在干眼症中起作用。不利地影响泪膜稳定性和渗透性的因素会引起眼表损伤并引发炎症级联，由此产生先天性和适应性免疫反应。这些免疫炎症性反应导致进一步的眼表损伤和自持续性炎症循环的发展。例如，眼表炎症导致泪液产生减少，由此使所述疾患进一步恶化并可能反过来导致眼表炎症和上皮细胞损伤。在动物模型中，T细胞介导的炎症确实是干眼症的原因和结果。在人类中发现，与对照组相比，干眼症与结膜T细胞的存在和泪液中炎性细胞因子水平升高相关，由此证实炎症是所述病症的驱动源。
DED可分为急性、阵发性或慢性的。在一些情况下，DED可归类为伴随急性发作的慢性病。慢性DED可能需要全年关注。已经探索了几种DED药理学疗法，并且所述疗法包括阶梯式方法，所述方法以非处方润滑剂和人工泪液替代品(以滴剂形式递送)开始，进展至局部抗炎疗法和使用泪点塞阻止泪液排出的泪道闭塞术。
人工泪液增加泪液量，但由于泪液排出和液体因例如经眼上皮蒸发或吸收而丧失，泪液量可能会恢复到其原始状态，因此需要频繁施用。虽然可通过添加粘度增强剂来增加保留时间，但高粘度泪液替代品可能会导致视力模糊。尽管泪点塞已被证明对DED患者有效，但塞子可能会丢失(显示出较差的保留能力)并且可能会很少迁移至鼻泪管中，由此导致炎症或其他危急情况。在一些情况下，可用高温烧灼术手术关闭泪点来治疗DED。在美国，其他批准用于DED患者的疗法是增加泪液产生的
(环孢菌素)、增加泪液产生的
(环孢菌素)以及针对DED的病征和症状的
(利非司特(lifitegrast))。近来，EysuvisTM(洛替泼诺(loteprednol))被批准用于DED的急性治疗。
环孢菌素A是在土壤真菌中发现的一种环状多肽钙调神经磷酸酶抑制因子免疫抑制剂/免疫调节剂，并且其免疫调节活性可用于治疗免疫类病症，例如移植排斥、牛皮癣、溃疡性结肠炎和类风湿性关节炎。钙调神经磷酸酶是一种激活T细胞的酶，其在细胞介导的免疫中起着关键作用。因为钙调神经磷酸酶抑制因子抑制免疫系统，所以所述抑制因子被称为免疫抑制剂。
环孢菌素用于改善干燥性角膜结膜炎(KCS)的病征和症状的确切机制尚未完全确定，但认为其可用作部分免疫调节剂。在DED中，环孢菌素可抑制淋巴细胞浸润，减少免疫炎症反应并抑制泪腺和结膜上皮细胞的凋亡。环孢菌素通过进入T细胞并结合亲环蛋白来干扰T细胞的活性和生长，由此影响免疫功能。所述复合物通过阻断钙调神经磷酸酶的作用并阻止NFATc去磷酸化以及对促炎性细胞因子如IL-2、IL-4、干扰素-γ和TNF-α的产生的调控来影响T细胞活性。
已表明，环孢菌素A的局部施用可增加泪液分泌，这可能是通过促进副交感神经系统相关神经传递质的局部释放实现。兽医眼科医师对124只患有KCS的犬只进行了临床现场试验以评估在每天两次用2.0mg/mL环孢菌素(
眼药膏，Intervet Inc.)或媒介物眼药膏治疗约90天后的功效，所述治疗使泪液产生增加，不过，一些犬只的临床症状有所改善，但泪液没有增加。
这被认为是由环孢菌素抑制眼表炎症而发生的。在81％(对比媒介物治疗的百分比)的使用
眼药膏治疗的眼睛中观察到整体改善并且停止疗法导致除一只测试眼外的所有测试眼均出现快速临床退化，表明需要长期持续疗法。在犬只KCS的管理中，关于环孢菌素引起流泪增加的机制知之甚少，但认为临床改善未必取决于泪液产生的增加。在人类中，环孢菌素A治疗对于DED的有益作用得到了更好的确证，并且几项临床试验的发现均表明，用局部环孢菌素长期治疗在例如角膜表面染色、Schirmer测试、视力模糊、人工泪液施用频率以及疾病严重程度的细胞和分子标志物方面可得到积极的结果。
供眼科使用的环孢菌素在1995年首次被批准用于治疗犬只的KCS。在2003年，环孢菌素作为
(0.5mg/mL环孢菌素眼用乳液，Allergan)被批准用于人类眼科，并适用于增加据推测泪液产生因KCS相关眼部炎症而受到抑制的患者的泪液产生。已表明，局部用环孢菌素滴眼液可减少炎症介质并增加泪液产生。商业化且市场化的局部用环孢菌素滴眼液在世界各地均有销售，用于治疗DED/KCS、春季角膜结膜炎(VKC)和眼部炎症。环孢菌素眼用溶液目前在市场上可用于多个管辖区中多种产品的局部使用，如下所示。
然而，局部用滴剂的施用存在局限，会影响患者的管理。这些局限包括难以处理瓶子、滴注精度有限、滴剂可能洗除以及局部用滴眼液的生物利用度有限(Aldrich等人,2013,Ophthalmic preparations,USP,39(5),第1-21页)。当前可用的环孢菌素滴眼液制剂的具体问题是耐受性问题，例如灼痛和刺痛，以及可能持续数周至数月的缓慢起效时间。较高的施用频率(例如每天数次)会严重影响患者的日常生活。在人类中，到达眼组织的局部用滴眼液的生物利用度低于5％。其他局限包括起效延迟(数周至数月)，以及滴剂中的药物剂量高，这可能成为导致不良反应的原因，例如与局部用环孢菌素滴眼液(
NDA#021023)相关的眼部灼痛。
因此，对于克服当前市面上局部用制剂的缺点的环孢菌素A治疗形式，特别是对于允许环孢菌素A持续释放和相关施用频率降低的剂型的需求有待满足，所述形式可提高生活质量和患者依从性，具有较低的感染风险和较少的不良反应，例如眼灼痛和刺痛。
由泪点塞进行药物递送优于局部用滴剂，因为泪点塞通过形成缓慢释放药物的贮库来实现药物随时间的持续释放。施用由一次性施用泪点塞组成，所述方式解决了以上提到的长期施用局部用滴眼液固有的局限。
然而，泪小管内塞也伴随着挑战。泪小管内施用途径在解剖学上具有一些潜在的限制(所述塞需要足够小以进入泪点)，并且难以开发出这样一种眼科用泪小管内塞，所述塞易于施用并且必要时，在药物贮库耗尽后可去除，配合良好，即，提供适当的保留能力，使得其不会无意中丢失，并且同时也不会引起任何不适或意外的施用部位反应如炎症。
此外，还需要在一段持续时间内具有适当且一致的药物释放。鉴于塞子的大小较小，将其配制成包括足够的载药量和持续释放特性具有挑战性。
在此背景下，很明显，需要可有效治疗眼部疾病如DED的替代性环孢菌素剂型。
本文所公开的所有参考文献都出于所有目的通过引用整体并入本文。
发明内容
本发明的某些实施方案的一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其可在较长时段内有效治疗患者的眼部疾病，特别是DED。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其可在较长时段内有效治疗患者的眼部疾病，特别是睑炎。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其可在较长时段内有效治疗患者的眼部疾病，特别是睑炎、过敏性结膜炎，并且特别是异位性角膜结膜炎和春季角膜结膜炎。
如上所述，当前市售的环孢菌素制剂，例如局部用滴眼液的一个主要缺点是需要频繁施用。本发明旨在通过一次性施用单个插入物，连续地释放活性剂，持续一段较长时间如数周，来实现有效的长期疗法，由此解决这种问题。
因此，本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其提供环孢菌素在眼表的持续释放。
为了确保在插入物佩戴期间提供有效疗法，环孢菌素的释放应保持基本上恒定的水平(例如在治疗窗内)，以提供治疗作用。
因此，本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其提供环孢菌素在眼表的持续释放并且特别是恒定释放。
本发明的某些实施方案的另一个目的还在于，提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其起效更快，例如在数天内或甚至是数小时内起效。
此外，本发明也旨在维持和改善患者依从性，这在当前的商业产品中仍有改进的空间。
因此，本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其耐受性良好并且在插入泪小管期间或之后不会提供无法忍受的不适。
本发明的某些实施方案的另一个目的还在于，提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其易于施用，即，易于插入泪小管中。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其易于处理并且不会像滴眼液一样溢出，或容易破裂。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其不易被患者错误施用并因此避免给药过量和给药不足。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，所述插入物一旦插入后就很好地配合于泪小管中，并且不容易丢失或不会无意地经由泪管排出。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其易于去除或更换，或者不需要去除。
因此，本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，当与例如滴眼液的常见治疗相比时，所述插入物具有较少副作用如眼部灼热、刺痛或搔痒。
因此，本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，当与例如滴眼液的常见治疗相比时，所述插入物具有降低的相关风险如眼部感染或全身毒性。
因此，本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其几乎没有例如经由疗法相关的限制如不能或仅有限可能进行隐形眼镜佩戴、或阅读、在电脑上工作或夜间开车引起的生活质量损害。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，所述插入物制造简单。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其易于储存并且在储存时稳定。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其增加泪液产生并在较长时段内为患者提供适合的泪液量。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种包含环孢菌素的泪小管内插入物，其在较长时段内解决或减轻患者的眼表疾病、特别是DED的症状，例如眼干、烧灼感、搔痒、发红、刺痛、砂磨感、疼痛、异物感、视觉障碍、泪膜不稳定、眼疲劳和眼表损伤。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种在较长时段内治疗或预防患者的眼部疾病，特别是DED的方法，所述方法可解决以上所列目的中所提及的一个或多个问题。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种在较长时段内治疗患者的眼部疾病，特别是睑炎的方法，所述方法可解决以上所列目的中所提及的一个或多个问题。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种在较长时段内治疗患者的眼部疾病，特别是睑炎、过敏性结膜炎，并且特别是异位性角膜结膜炎和春季角膜结膜炎的方法，所述方法可解决以上所列目的中所提及的一个或多个问题。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种治疗或预防DED的方法，所述方法包括将包含水凝胶和环孢菌素的可生物降解插入物插入患者的泪小管中，其中所述方法可解决以上所列针对提供泪小管内插入物的目的的一个或多个问题。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种治疗或预防DED的方法，所述方法包括将包含水凝胶和环孢菌素的可生物降解插入物插入患者的泪小管中，并在较长时段、例如至少约2个月后，将包含水凝胶和环孢菌素的第二可生物降解插入物插入同一泪小管中，其中所述方法可解决以上所列针对提供泪小管内插入物的目的的一个或多个问题。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种在较长时段内治疗或预防患者的眼部疾病，特别是DED的方法，其中实现的治疗作用超过由无药物泪点塞闭塞泪点与施用环孢菌素滴眼液相结合的治疗所实现的治疗作用。
本发明的某些实施方案的另一个目的是提供一种制造泪小管内插入物的方法，所述方法可解决以上所列与泪小管内插入物相关的目的中所提及的一个或多个问题。
本发明此等目的中的一个或多个以及其他目的是通过本文所公开和要求保护的一个或多个实施方案来解决。
本发明的各个方面公开于本说明书中并在独立权利要求中要求保护，而从属权利要求要求保护本发明的这些方面的特定实施方案和变化形式。以下详细描述将提供本发明各个方面的详情。
附图说明
图1是眼睛和泪系统的示意图。
图1.2A描绘了在实施例1.2(操作1和操作2)中制备的干插入物纤维和水合插入物纤维。
图1.2B描绘了在实施例1.2(操作3)中制备的干插入物纤维和水合插入物纤维。
图1.2C描绘了在实施例1.2(低、中等和高剂量)中制备的干插入物纤维和水合插入物纤维。所制备的干插入物纤维的主要部分与剂量无关，呈微粒状、圆柱形，没有任何明显的表面缺陷(左)。此外，还展示出每次剂量具有最高表面变形的插入物(右)。
图1.3描绘了在实施例1.3中制备的干插入物纤维和水合插入物纤维。
图1.4A至1.4E描绘了插入物干密度和每个插入物的载药量、干直径、干密度、显微图像以及显示实施例1.4中制备的插入物纤维的干直径和水合直径分别随水合时间的变化的图。
图2描绘了示出NHS-荧光素转化为荧光素-三赖氨酸缀合物的色谱图。
图3.1描绘了通过实施例3.4的Schirmer泪液测试测定的泪液产生情况随时间变化的结果。
图3.2A和3.2B描绘了实施例3.5在比格犬(beagle)泪液中测量的环孢菌素A(CsA)浓度随时间的变化。
图3.3描绘了实施例3.6在比格犬泪液中测量的环孢菌素A(CsA)浓度随时间的变化。
图4A描绘了实施例4的人体临床研究大纲的一般示意图。
图4B描绘了插入物放置于人眼泪小管内的示例性一般示意图。
图5A至图5D描绘了将插入物放置于人眼泪小管内所需步骤的示例性示意图。
图6A和图6B描绘了由实施例4.1的Schirmer泪液测试测定的研究眼(图6A)和非研究眼(图6B)的泪液产生情况随时间变化的结果。黑色实线代表所有分析个体的平均Schirmer评分，其中虚线代表单一个体的Schirmer评分。
图7A和图7B描绘了实施例4.1中以随时间变化的绝对值以及相对于基线的变化表示的总角膜荧光素染色(tCFS)值(所有眼睛的平均值)
图8A和图8B描绘了实施例4.1中以随时间变化的绝对值以及相对于基线的变化表示的在视觉模拟量表(VAS)上眼干严重程度评分的结果。
图9描绘了实施例4.1中以随时间变化的绝对值表示的在视觉模拟量表(VAS)上眼干频率评分的结果。
图10描绘了实施例4.1中以随时间变化的平均绝对值表示的OSDI的结果。
图11描绘了实施例4.1中以随时间变化的绝对值表示的SPEED评分的结果。
定义
如本文所使用，术语“泪小管内插入物”是指施用，即插入至泪小管中的含有活性剂、具体而言环孢菌素的物体，所述物体在泪小管中保持一定时段，同时其将活性剂释放至周围环境中。插入物可为任何预定形状，最常见的是在插入之前呈棒状，在将所述插入物放置于希望位置时，所述形状可以在一定程度上得到保持，不过，插入物的尺寸(例如长度和/或直径)可在施用后因水合而变化，如本文所进一步公开。换句话说，插入眼中的并非溶液或悬浮液，而是已经成形的、附着的物体。因此，在施用之前，所述插入物已经例如根据本文所公开的方法完全形成。泪小管内插入物可设计成随时间推移可生物降解的(如下文所公开)，并且因此可由此软化，改变其形状和/或减小其大小，并且最后可能通过溶解或崩解而消除，此时插入物的其余部分将沿泪管排出。在本发明中，术语“插入物”用于指当含有水时(例如插入物在施用于眼睛或以其他方式浸入水性环境中后(再)水合后)呈水合(也称为“溶胀”)状态的插入物以及例如当经干燥至例如不超过1重量％的低水含量时呈干(干燥/脱水)状态的插入物。
本发明中使用的术语“眼部”一般是指眼睛，或眼睛的任何部件或部分(“眼部插入物”原则上可施用于眼睛的任何部件或部分)。在某些实施方案中，本发明涉及眼部插入物的泪小管内注射，以及干眼病(DED)的治疗，下文将进一步公开。
术语“可生物降解”是指一种材料或物体(例如根据本发明的泪小管内插入物)在体内，即当放置于人体或动物体内时降解。在本发明的某些实施方案的情形中，如下文详细公开的，包括含有环孢菌素的水凝胶的插入物在被施用于眼睛泪小管中后，就会随着时间缓慢生物降解。在某些实施方案中，生物降解至少部分经由在泪小管的水性环境中进行酯水解而发生。插入物慢慢变软并崩解，导致经由鼻泪管清除。
“水凝胶”是由一种或多种亲水性天然或合成聚合物(如本文所公开)构成的三维网状结构，其可在水中溶胀并保持一定量的水，同时因例如各个聚合物链的化学或物理交联而维持或基本上维持其结构。由于含水量高，水凝胶柔软而有柔韧性，这使其与天然组织极其相似。在本发明中，术语“水凝胶”用于指当含有水时(例如在水溶液中形成水凝胶之后，或在水凝胶插入眼中或以其他方式浸入水性环境中后水合或(再)水合之后)呈水合状态以及当例如干燥至例如不超过1重量％的低水含量时呈干(干燥/脱水)状态的水凝胶。在本发明中，在活性成分包含(例如分散)于水凝胶中时，水凝胶也可被称为“基质”。
术语“聚合物网络”描述由聚合物链(具有相同或不同分子结构和相同或不同分子量的聚合物链)彼此交联形成的结构。适于本发明目的的聚合物的类型公开于下文中。
术语“非晶形”是指在X射线或电子散射实验中未展现出结晶结构的聚合物或聚合物网络。
术语“半结晶”是指在X射线或电子散射实验中具有某种结晶性质，即展现出一些结晶特性的聚合物或聚合物网络。
术语“前体”在本文中是指相互反应并由此经由交联连接形成聚合物网络并且由此形成水凝胶基质的那些分子或化合物。虽然其他材料可能存在于水凝胶中，例如活性剂或缓冲剂，但所述材料不被称为“前体”。
仍存在于最终聚合物网络中的前体分子各部分在本文中也称为“单元”。因此，“单元”是形成水凝胶的聚合物网络的结构单元或成分。例如，适用于本发明中的聚合物网络可含有相同或不同的聚乙二醇单元，如本文将进一步公开。
出于本发明的目的，术语“持续释放”意在表征这样一类产品，所述产品被配制成使环孢菌素在较长时段内可用，由此使给药频率相较于立即释放剂型，例如局部施用至眼睛的环孢菌素溶液(即，含环孢菌素的滴眼液)降低。可在本文中与“持续释放”互换使用的其他术语是“延长释放”或“受控释放”。在本发明的含义内，术语“持续释放”包含环孢菌素的恒定释放、环孢菌素的递减释放以及其任何组合，例如环孢菌素的恒定释放，接着是环孢菌素的递减释放。在本发明的含义内，术语“递减(tapered/tapering)”是指环孢菌素的释放量随时间减少。
如本文所使用，术语“较长时段”是指本领域普通技术人员认为就治疗疾病而言延长的任何时段，并且特别是指例如以下时段：至少约1周、或至少约1个月或更长时间，例如至多约12个月，或任何中间时段，例如约1至约6个月、约2至约4个月、约2至约3个月或约3至约4个月。
如本文所使用，术语“佩戴时间”是指泪小管内插入物存在于泪小管中的时段，即，从施用插入物直至插入物从泪小管消除的时段。在某些实施方案中，插入物的消除可通过去除插入物(其可能是有意或无意的，但在没有施加外力情况下不会自发地发生)或通过在插入物完全生物降解、完全崩解或基本上崩解后较长时段之后自发清除，由此排出插入物的剩余部分来实现。在某些实施方案中，佩戴时间为至少约1周，或至少约1个月或更长时间，例如至多约12个月，或任何中间时段，例如约1至约6个月、约2至约4个月、约2至约3个月或约3至约4个月。
如本文所使用，术语“显色剂”是指当插入至眼睛的泪小管中时可使插入物容易可见的包含在插入物的水凝胶内的分子或组合物。显色剂可为荧光团如荧光素、罗丹明(rhodamine)、香豆素和花青。在某些实施方案中，显色剂是荧光素或包括荧光素部分。
如本文所使用，“眼表”包括结膜和/或角膜，以及组件如泪器，包括泪点，以及泪小管和相关眼睑结构。
如本文所使用，术语“泪液”或“眼泪”是指由泪腺分泌的液体，其润滑眼睛并由此形成泪膜。眼泪由水、电解质、蛋白质、脂质和粘蛋白构成。
如本文所使用，在本发明的上下文中，术语“施用(administration)”、“插入(insertion)”、“施用(administering)”和“插入(inserting)”是同义使用的并且是指例如根据实施例4.II(插入物放置)中所描述的程序，将插入物放置到泪小管中，并且特别是放置于泪小管的垂直部分中。
如本文所使用，术语“两侧地(bilaterally)”或“两侧(bilateral)”在施用本发明的插入物的情形中是指将插入物施用于患者的双眼中。对于每只眼睛，插入物可插入眼睛的上泪小管或下泪小管中，或同时插入眼睛的上泪小管和下泪小管中。
术语“塞”是指这样一种装置，所述装置能够闭塞、基本上闭塞或部分闭塞泪管(“泪管闭塞”)，由此防止或减少泪液排出，这有助于保持眼睛湿润。塞可分为“泪点塞”和“泪小管内塞”。泪小管内塞在文献中也称为“泪小管塞”。两类塞都是经由眼睛的上泪点和/或下泪点插入。泪点塞安置于泪点开口处，使其很容易看到，并且因此可以毫不费力地去除。然而，泪点塞显示出较差的保持率，并且会因其组合物暴露而被微生物污染，在极少数情况下会导致感染。相比之下，泪小管内塞是不可见的，并且与泪点塞相比，由于泪小管内塞被放置在垂直或水平泪小管内，因此提供更好的保持率。然而，泪小管内塞不容易去除并且其迁移的风险增加。市售塞通常由胶原蛋白、丙烯酸系物或硅酮制成。
如本文所使用，术语“泪小管(canaliculus)”(复数“泪小管(canaliculi)”)或者“泪管”是指泪小管，即，在每个眼睑中的小通道，用于将泪液从泪点排到鼻泪管(也参见图1)。因此，泪小管形成泪器的一部分，其将泪液从眼睛表面排到鼻腔。上眼睑中的泪小管被称为“上泪小管”或“上部泪小管”，而下眼睑中的泪小管被称为“下泪小管”或“下部泪小管”。每个泪小管包含沿泪点的垂直区域，称为“垂直泪小管”；和沿垂直泪小管的水平区域，称为“水平泪小管”，其中所述水平泪小管并入鼻泪管中。
术语“泪点(punctum)”(复数“泪点(puncta)”)是指泪点(lacrimal punctum)，即，在眼睑边缘的微小开口，代表泪小管的入口。当眼泪产生时，一些泪液在每次眨眼之间蒸发，并且一些泪液经由泪点排出。上眼睑和下眼睑都显示泪点，因此泪点分别称为“上部泪点”或“上泪点”和“下部泪点”或“下泪点”(也参见图1)。
术语“泪小管内插入物”是指这样一种插入物，所述插入物可经由上泪点或下泪点或经由上泪点和下泪点两者施用于眼睛的上泪小管或下泪小管中或眼睛的上泪小管和下泪小管两者中，特别是施用于眼睛的上垂直泪小管或下垂直泪小管中或施用于眼睛的上垂直泪小管和下垂直泪小管中。由于插入物定位于泪小管内，因此插入物借助于泪道闭塞而阻止泪液排出，如同关于泪小管内塞所观察到的那样。在某些实施方案中，本发明的泪小管内插入物经两侧插入于眼睛的下垂直泪小管中。根据本发明的某些实施方案，泪小管内插入物是持续释放可生物降解插入物。
术语“API”、“活性(医药)成分(ingredient)”、“活性(医药)剂”、“活性(医药)成分(principle)”、“(活性)治疗剂”、“活性剂”和“药物”在本文中可互换使用并且是指在成品药(FPP)中使用的物质以及用于制备此类成品药的物质，其旨在提供药理学活性或以其他方式对诊断、治愈、减轻、治疗或预防疾病产生直接作用，或对恢复、矫正或改变患者的生理功能产生直接作用。
根据本发明使用的API是环孢菌素A。如本文所使用，术语“环孢菌素”是指环孢菌素A，并且特别地并非指作为环孢菌素A的代谢物的环孢菌素B、C、D、E、H和L；也并非指可作为杂质包含在环孢菌素A中的环孢菌素U、G、二氢环孢菌素A或异环孢菌素A。在某些实施方案中，环孢菌素A可含有各自的浓度不超过1.0％或各自的浓度不超过0.7％的环孢菌素B、C、D、E、G、H、L和U、二氢环孢菌素A和异环孢菌素A作为杂质；也可含有各自的浓度不超过0.3％或各自的浓度不超过0.1％的未知杂质，并且可含有总量不超过2.5％或不超过1.5％的杂质。
环孢菌素A的分子式是C62H111N11O12并且其IUPAC名称为30-乙基-33-(1-羟基-2-甲基己-4-烯基)-1,4,7,10,12,15,19,25,28-九甲基-6,9,18,24-四(2-甲基丙基)-3,21-二(丙-2-基)-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十一氮杂环三十三烷-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十一酮(CAS编号59865-13-3)。其分子量为1203道尔顿。其具有以下化学结构：
环孢菌素是一种白色至几乎白色的粉末，可溶于各种有机溶剂，例如丙酮、甲醇和乙醇(96％v/v)中，但几乎不溶于水。在某些实施方案中，环孢菌素被微粉化。
出于本发明的目的，可使用所有可能形式的环孢菌素，包括多晶型物或任何药学上可接受的盐、无水物、水合物、其他溶剂化物或衍生物。当在本说明书或权利要求中提及环孢菌素并且无进一步说明时，即使没有明确陈述，其也指呈环孢菌素的任何此类多晶型物、药学上可接受的盐、无水物、溶剂化物(包括水合物)或衍生物形式的环孢菌素A(参见上文)。对于环孢菌素，合适的固体形式包括但不限于本领域普通技术人员已知的任何物理形式的纯物质形式。例如，环孢菌素可为颗粒形式。颗粒可为非晶形或结晶的，或呈现所述两种形式的混合物，并且可制成任何大小，其可分类为粗颗粒、细颗粒或超细颗粒，但不限于此，所述颗粒的尺寸可特别是肉眼可见的或在显微镜下可见的，并且具有例如单个晶粒和聚集体的形状。颗粒也可被微粉化。如本文所使用，术语“微粉化”是指小尺寸颗粒，特别是微观尺度的颗粒，所述颗粒通过例如但不限于喷射研磨、颚式破碎、锤磨、湿磨、在非溶剂中沉淀、低温研磨(在液氮或干冰下研磨)和球磨来减小粒度。环孢菌素也可呈溶解或分散的状态，例如溶解或分散于溶剂内或水性介质中，例如呈分散于水性悬浮液中的颗粒形式，其可任选地包括其他赋形剂如表面活性剂。
如本文所使用，术语“治疗有效”是指在施用后产生所希望的治疗结果所需的环孢菌素的量。例如，在本发明的上下文中，一种所需的治疗结果将是DED相关症状的减少，例如所述减少是通过本领域普通技术人员已知的体内测试测量，例如Schirmer泪液测试评分增加；如通过结膜丽丝胺绿染色(conjunctival lissamine green staining)或角膜荧光素染色所测量的染色值减小；在视觉模拟量表(VAS)上眼干严重程度和/或眼干频率评分降低；眼表疾病指数和/或标准患者眼干评估评分降低；以及最佳矫正视敏度降低。在一个实施方案中，“治疗有效”是指持续释放泪小管内插入物中能够在较长时段内达到0.236μg/mL泪液浓度(这被视为免疫调节所需的；Tang-Liu和Acheampong,Clin.Pharmacokinet.44(3),第247-261页)，并且特别是，在达到所述泪液浓度后，使所述插入物在佩戴期间基本上保持完整的环孢菌素的量。
如本文所使用，值“d10”、“d50”、“d90”和“d100”是指表征粒度分布中满足特定粒度的颗粒的量的值。在给定粒度分布中，10％颗粒呈现的粒度是d10或更小，50％颗粒呈现的粒度是d50或更小，90％颗粒呈现的粒度是d90或更小，并且基本上所有颗粒呈现的粒度是d100或更小。所述百分比可由本领域普通技术人员已知的不同参数给出，例如所述百分比可基于颗粒的体积、重量或数量。因此，d50可以示例性地为基于体积、基于重量或基于数量的中值粒度。例如，基于体积的d90是43μm意味着，以体积计90％颗粒的粒度是43μm或更小。在某些实施方案中，d10、d50和d90是基于体积的值。粒度分布PSD通常可通过本领域普通技术人员已知的方法测量，并且包括筛分法和激光衍射法。在某些实施方案中，PSD是根据USP<429>光衍射粒度测量法中的激光衍射法测量。在某些实施方案中，PSD是使用Beckman Coulter LS 13 320，基于光学模型“Fraunhofer.rf780z”通过激光衍射法测量，其中遮光率值(obscuration value)在7％至9％范围内。
如本文所使用，与测量的数量相关的术语“约”是指本领域普通技术人员在进行测量和付出与测量的物体和测量设备的精度相称的谨慎程度时所预期的测量的数量的正常变化。
与测量的数量相关的术语“至少约”是指本领域普通技术人员在进行测量和付出与测量的物体和测量设备的精度相称的谨慎程度时所预期的测量的数量的正常变化，和高于所述数量的任何数量。
除非上下文另有明确指示，否则如本文所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个/种参考物。
在例如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”在本文中旨在包括“A和B”和“A或B”。
开放式术语如“包括(include/including)”、“含有(contain/containing)”等意指“包含(comprsing)”。这些开放式过渡短语用于说明要素、方法步骤等的开放式列表，不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。
具体实施方式
I.泪小管内插入物
根据某些实施方案，本发明的泪小管内插入物的特征在于，所述插入物提供持续释放，是可生物降解的并且包含水凝胶和环孢菌素。
同样如以上定义部分所概述，在本发明的上下文中，提供持续释放意味着，所述插入物能够使环孢菌素在较长时段内可用。插入物被施用至眼中并将环孢菌素缓慢释放至泪液中。当泪液通过从泪腺产生新泪液而缓慢更新，替代眼表上已经存在的经由泪管排出的泪液时，存在于插入物中的环孢菌素随着每次眨眼缓慢释放至泪液中，无需患者采取任何行动。因此，插入物为传统滴眼液提供一种有利的无需手操作的替代方案。
典型地，持续释放维持例如数周，由此可明显降低当前产品每天多次的给药频率(因为所述产品是呈易于迅速洗脱的局部用滴眼液形式)。这意味着，患者可从插入物的治疗作用中受益，无需每天数次提醒自己施用滴眼液，这本身就是一个巨大的优势，而且也降低由于不准确滴注或不正确处理/施用引起的不正确给药的风险以及由于重复使用滴眼液瓶而导致的感染风险。
此外，如以上定义部分中再次概述的，在某些实施方案中，本发明插入物被设计成在施用后经预先指定的时间缓慢生物降解。这意味着，所述插入物可保留在泪小管中并且不需要外植。通常，不需要去除所述插入物，但患者可以仅仅留下所述插入物，直至其被清除。另一方面，在例如过敏反应、佩戴不适或其他不良事件如刺激感等的意外事件中，可通过施加轻微压力将插入物经泪点逐出至外部或使插入物沿泪小管进一步向下移动以经由鼻泪管清除来去除(部分生物降解的)插入物。在佩戴时间结束，插入物中的环孢菌素耗尽，由此需要用新插入物更换所述插入物以保持治疗作用的情况下，去除和/或易于去除的能力也是有利的。
本发明的泪小管内插入物也包含水凝胶。如定义部分详细解释的，水凝胶能够吸水并从干燥状态转变为水合状态。在某些实施方案中，水凝胶的水合作用使得插入物改变其形状。在特定实施方案中，插入物的直径膨胀并且长度收缩，使得细棒状插入物在干燥状态下能够容易地插入泪小管中，并且在经施用并正确定位后，其直径在泪小管中膨胀，由此使其牢固地配合并降低插入物迁移或丢失的风险。尽管牢固地固定在适合位置，但水合插入物柔软，并且因此佩戴舒适。
在某些实施方案中，水凝胶包含聚合物网络。以下进一步提供关于聚合物网络的详情。
例如，U.S.8,409,606(特此通过引用并入用于所有目的，在有冲突的情况下以本说明书为准)中已公开此类高度溶胀以牢固定位的水凝胶塞的成分。
活性成分：
关于环孢菌素、其化学结构和其特性的详情提供于以上定义部分中。如其中所概述，环孢菌素几乎不溶于水，并且因此，不希望受理论束缚，假设在与泪液接触时，在生理条件下的低药物溶解度(约10μg/mL)与接触泪液的插入物的横截面积以及泪液的有限体积相结合被认为可调控药物的释放速率。
另一方面，包埋于水凝胶中的环孢菌素的形式和量也可能影响环孢菌素的溶解以及治疗有效释放速率的实现。
本发明的某些实施方案的一个方面是一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中环孢菌素是呈颗粒形式并且其中环孢菌素颗粒分散于水凝胶内。
在本发明的某些实施方案中，环孢菌素颗粒均匀地分散于水凝胶内。如本文所使用，分散于水凝胶内是指环孢菌素颗粒是以包埋于基质内的基本上纯的物质形式存在，但不排除会在基质表面上发现少量环孢菌素。在某些实施方案中，环孢菌素颗粒形成独立的疏水相，所述疏水相不含除环孢菌素外的其他赋形剂和可能存在于所用活性材料中的任何杂质，并且特别地并非指截留药物并且包含其他材料如油、脂肪、脂肪酸、蜡、碳氟化合物或早前所提出的其他不与水混溶的任何微球、微粒或疏水性微区。以基本上纯形式存在的环孢菌素具有易于制造的优点，因为不需要进一步处理活性材料来制备例如微球、微粒或疏水性微区。
在某些实施方案中，环孢菌素可具有：在60℃和压力不超过5毫米汞柱的真空中于毛细管塞瓶中以100mg测定的不超过1.5％w/w的干燥失重；不超过0.002％的重金属含量；如实施例2的产品规格部分中所定义的有机杂质，并且特别是，如通过HPLC所测定的不超过1.5％的所有杂质总和；如通过HPLC测定的不低于97.0％并且不超过101.5％的环孢菌素含量；以及如通过GC顶空测量的不超过4500ppm的残留丙酮和不超过2000ppm的残留乙酸乙酯。
在某些实施方案中并且也如实施例(具体参见实施例2)中所示，本发明的插入物在储存时稳定，并且环孢菌素含量在长期储存后基本上不改变。
因此，在某些实施方案中，在2至8℃的温度下储存至少3个月后、至少6个月后或至少12个月后通过HPLC所测量的环孢菌素含量以及在储存前直接通过HPLC所测量的初始环孢菌素含量为约300至约410μg。
在某些实施方案中，在2至8℃的温度下储存至少3个月后、至少6个月后或至少12个月后通过HPLC测量的环孢菌素含量在储存前直接通过HPLC所测量的初始环孢菌素含量的90重量％至110重量％范围内，或在95重量％至105重量％范围内，或在98重量％至102重量％范围内。
在某些实施方案中，在2至8℃的温度下储存至少3个月后、至少6个月后或至少12个月后通过HPLC所测量的杂质量不超过3.0％。
在本发明的某些实施方案中，环孢菌素是颗粒形式。在某些实施方案中，颗粒是微粉化颗粒。不希望受理论束缚，据认为环孢菌素颗粒，并且特别是小的环孢菌素颗粒在分散状态下能够使活性剂足够快地溶解以允许快速起效。
在本发明的某些实施方案中，如通过激光衍射所测量，环孢菌素颗粒具有小于约50μm的d50值，或小于约43μm的d90值，或小于约45μm的d100值。如实施例(参见实施例1.4)所示，据认为大颗粒对泪小管内插入物的机械特性有影响。此外，大颗粒也往往会堵塞管子，由此使浇铸前体混合物(如下文进一步概述)变得困难，甚至不可能。
在本发明的某些实施方案中，环孢菌素颗粒的d50值范围为约3至约17μm，或约4至约12μm，或约5至约8μm。如实施例(参见实施例1.4)所示，粒度对插入物的密度、溶胀行为以及表面质量有很大影响，并且需要在较小颗粒所能实现的高密度和较光滑的插入物表面与大颗粒的优选水合作用和溶胀行为之间作出权衡。
在某些实施方案中，d50、d90和d100值是指用于制造插入物的环孢菌素颗粒的值，或存在于插入物中的环孢菌素颗粒的值。
就插入物中所含环孢菌素的量而言，在某些实施方案中，需要插入物中具有高浓度活性剂，因为其将允许在相同插入物尺寸下，或相同剂量但较小的产品尺寸下有高剂量活性剂(引起持续较长时间和/或以恒定速率进行的持续释放，下文将进一步论述)，而相同剂量但较小的产品尺寸在施用便利性和佩戴舒适度方面是优选的。另一方面，浓度对插入物质量具有不可忽略的影响，如实施例1.1中所示。即，过高或过低的浓度往往会导致制造的插入物是“吸管状(strawed)”，具有较大干直径和中空孔。此外，较低的药物浓度看来会改善溶胀/水合行为。
在本发明的某些实施方案中，插入物在干燥状态下含有以插入物的总重量计约15重量％至约80重量％，或约30重量％至约65重量％，或约45重量％至约55重量％的环孢菌素。
本发明的一个方面是一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以插入物的总重量计约40重量％至约80重量％的环孢菌素。
就活性剂的绝对量而言，剂量是实现持续释放的重要因素。
在本发明的某些实施方案中，插入物包含在约100μg至约800μg范围内的量的环孢菌素。
环孢菌素是以一定剂量范围包含在本发明的插入物中，例如约100μg至约800μg、约100μg至约300μg、约300μg至约450μg或约500μg至约800μg。可使用在这些范围内的任何量，例如约250μg、约360μg、约600μg或约670μg，所有值还包括+25％和-20％的偏差，或+/-15％的偏差，或+/-10％的偏差。
所公开的环孢菌素量，包括所提及的偏差在内，是指插入物中活性成分的最终含量，以及在制造插入物时用作起始组分的活性成分的量。
聚合物网络：
如上所述，在某些实施方案中，水凝胶包含聚合物网络。水凝胶可由具有官能团的前体形成，所述官能团形成交联以产生此类聚合物网络。聚合物链或臂之间的这些交联可为化学性的(即，可为共价键)和/或物理性的(例如离子键、疏水性缔合、氢桥等)。
聚合物网络可由前体制备，所述前体是来自一种类型的前体或来自能够反应的两种或更多种类型的前体。前体是考虑到所得水凝胶所希望的特性来选择。有多种合适的前体可用于制造水凝胶。通常，形成水凝胶的任何药学上可接受并且可交联的聚合物均可用于本发明的目的。水凝胶并且由此并入其中的组分，包括用于制造聚合物网络的聚合物在内，应当是生理上安全的，使得它们不会引起例如免疫反应或其他不良作用。水凝胶可由天然、合成或生物合成聚合物形成。
天然聚合物可包括糖胺聚糖、多糖(例如聚葡萄糖)、聚氨基酸和蛋白质，或其混合物或组合。
合成聚合物一般可为由多种原料，通过不同类型的聚合反应合成制造的任何聚合物，所述聚合反应包括自由基聚合、阴离子或阳离子聚合、链增长或加成聚合、缩聚、开环聚合等。所述聚合反应可由某些引发剂、由光和/或热引发，并且可由催化剂介导。
通常，出于本发明的目的，可使用包含一个或多个单元的聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、无规或嵌段共聚物或这些中任一种的组合/混合物的组的一种或多种合成聚合物，但这个列表并不旨在作为限制。
为了形成共价交联的聚合物网络，前体可彼此共价交联。在某些实施方案中，具有至少两个反应性中心的前体(例如在自由基聚合中)可用作交联剂，因为每个反应性基团均可参与形成不同的生长聚合物链。
前体可具有呈生物惰性和亲水性的部分，例如核心。在分支聚合物的情况下，核心是指分子中与从核心延伸的臂接合的连续部分，其中所述臂带有官能团，所述官能团通常位于臂或分支的末端。多臂PEG前体是此类前体的实例并且在下文中将进一步公开。
因此，用于本发明的水凝胶可由例如具有第一(组)官能团的一种多臂前体和具有第二(组)官能团的另一种多臂前体制成。举例来说，多臂前体可具有亲水性臂，例如聚乙二醇单元，以伯胺封端(亲核试剂)，或者可具有活性酯端基(亲电子试剂)。根据本发明的聚合物网络可含有彼此交联的相同或不同聚合物单元。前体可为高分子量组分(例如具有官能团的聚合物)或低分子量组分(例如低分子量胺、硫醇、酯等)。
通过使用活化基团可以使某些官能团更具反应性。此类活化基团包括(但不限于)羰基二咪唑、磺酰氯、芳基卤化物、磺基琥珀酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、琥珀酰亚胺酯、环氧化物、醛、马来酰亚胺、酰亚胺酯、丙烯酸酯等。NHS酯是用于交联亲核聚合物，例如伯胺封端或硫醇封端的聚乙二醇的有用基团。NHS-胺交联反应可在水溶液中并在缓冲液，例如磷酸盐缓冲液(pH 5.0-7.5)、三乙醇胺缓冲液(pH 7.5-9.0)、硼酸盐缓冲液(pH9.0-12)或碳酸氢钠缓冲液(pH9.0-10.0)存在下进行。
在某些实施方案中，每种前体可仅包含亲核官能团或仅包含亲电子官能团，只要在交联反应中使用亲核前体和亲电子前体两者即可。因此，例如，如果交联剂仅具有亲核官能团，例如胺，则前体聚合物可具有亲电子官能团，例如N-羟基琥珀酰亚胺。另一方面，如果交联剂具有亲电子官能团，例如磺基琥珀酰亚胺，则官能性聚合物可具有亲核官能团，例如胺或硫醇。因此，官能性聚合物，例如蛋白质、聚(烯丙基胺)或胺封端的双官能或多官能聚(乙二醇)，也可用于制备本发明的聚合物网络。
在本发明的一个实施方案中，形成水凝胶的聚合物网络的前体各自具有约2至约16个亲核官能团(称为官能度)，在所述水凝胶中分散有环孢菌素以形成根据本发明的插入物，并且在另一个实施方案中，前体各自具有约2至约16个亲电子官能团(称为官能度)。具有4的倍数个反应性(亲核或亲电子)基团，因此例如具有4、8和16个反应性基团的反应性前体，特别适用于本发明。根据本发明使用的前体可具有任何数量个官能团，例如包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个中任何数量个基团，同时确保官能度足以形成充分交联的网络。
PEG水凝胶：
在本发明的某个实施方案中，形成水凝胶的聚合物网络含有聚乙二醇(PEG)单元。本领域中已知PEG在交联时形成水凝胶，并且这些PEG水凝胶适于医药应用，例如作为旨在施用于人体或动物体所有部分的药物的基质。
本发明的水凝胶插入物的聚合物网络可包含一个或多个具有2至10个臂、或4至8个臂、或4、5、6、7或8个臂的多臂PEG单元。在某些实施方案中，本发明的水凝胶中使用的PEG单元具有4个和/或8个臂。在某些特定实施方案中，使用4臂PEG。
所用PEG的臂数有助于控制所得水凝胶的柔韧性或柔软度。例如，由4臂PEG交联形成的水凝胶通常比由相同分子量的8臂PEG形成的水凝胶要柔软并且更具柔韧性。特别是，如果如下文在与插入物的制造相关的部分中所公开，需要在干燥之前(或之后)拉伸水凝胶，则可以使用更柔韧的PEG单元，例如4臂PEG，任选地结合使用另一种多臂PEG，例如上文所公开的8臂PEG，或另一种(不同的)4臂PEG。
在本发明的某些实施方案中，用作前体的聚乙二醇单元的平均分子量在约2,000至约100,000道尔顿范围内，或在约10,000至约60,000道尔顿范围内。在某些特定实施方案中，聚乙二醇单元的平均分子量在约10,000至约40,000道尔顿范围内。在具体实施方案中，用于制造根据本发明的水凝胶的聚乙二醇单元具有约20,000道尔顿的分子量。
聚乙二醇和聚乙二醇衍生物的分子量可通过若干方法测定，包括凝胶电泳，例如SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)；凝胶渗透色谱法(GPC)；GPC结合动态光散射(DLS)；以及基质辅助激光脱附/电离飞行时间(MALDI-TOF)光谱法。如本文所公开的聚乙二醇前体的分子量可通过本领域普通技术人员已知的任何方法测定，包括SDS-PAGE、GPC和MALDI-TOF，并且特别是，使用已知分子量(例如由MALDI-TOF测定)和多分散性(例如由GPC测定)的PEG标准品，通过GPC测定。如果需要高精度，则可使用MALDI-TOF。
聚乙二醇的分子量是指平均分子量，其可选自本领域普通技术人员已知的各种平均值，包括数量平均分子量(Mn)、重量平均分子量(Mw)和峰值平均分子量。在本发明的上下文中，可使用任何此类平均值，并且特别是上述三种平均分子量。在某些实施方案中，如本文所公开的聚乙二醇单元和前体的平均分子量是以数量平均分子量给出。
如本文所使用，具有指定分子量的多臂PEG单元可缩写为例如4a20kPEG形式，意思指分子量为20,000的4臂PEG单元。
在4臂PEG中，每个臂的平均臂长(或分子量)可为PEG的总分子量除以4。因此，作为特别适合用于本发明的前体，4a20kPEG前体具有平均分子量各为约5,000道尔顿的4个臂。因此，可与4a20kPEG前体组合使用或作为其替代用于本发明中的8a20k PEG前体具有平均分子量各为2,500道尔顿的8个臂。与较短的臂相比，较长的臂可提供较高的柔韧性。与臂较短的PEG相比，臂较长的PEG可溶胀得更大。相较于臂数较多的PEG，臂数较少的PEG也可能溶胀得更大并且可能更具柔韧性。在某些特定实施方案中，本发明仅使用4臂PEG前体。在某些特定实施方案中，本发明使用两种不同的4臂PEG前体。在某些其他实施方案中，本发明使用4臂PEG前体和8臂前体的组合。此外，较长的PEG臂在干燥时具有较高的熔化温度，由此在储存期间可提供较高的尺寸稳定性。
在某些实施方案中，与用于制备本发明的水凝胶的PEG前体一起使用的亲电子端基是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，包括但不限于NHS二羧酸酯，例如琥珀酰亚胺丙二酸酯基团、琥珀酰亚胺马来酸酯基团、琥珀酰亚胺富马酸酯基团、表示琥珀酰亚胺壬二酸酯端基的“SAZ”、表示琥珀酰亚胺己二酸酯端基的“SAP”、表示琥珀酰亚胺戊二酸酯端基的“SG”和表示琥珀酰亚胺琥珀酸酯端基的“SS”。
因此，在某些实施方案中，PEG前体是NHS二羧酸酯封端的多臂PEG前体，其可由下式表示：
其中n由各个PEG臂的分子量决定，m为0至10的整数，并且具体而言为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，并且x是臂数(并且因此可为例如2、4、8等，见上文)。当m为1时，每个臂以琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)端基封端；当m为2时，每个臂以琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG)基团封端；当m为3时，每个臂以琥珀酰亚胺己二酸酯(SAP)基团封端；并且当m为6时，每个臂以琥珀酰亚胺壬二酸酯(SAZ)基团封端。在这些特定亲电子端基存在下，多臂PEG单元可缩写为例如4a20kPEG-SAP形式，意思指具有琥珀酰亚胺己二酸酯端基并且分子量为20,000(4臂，各约5,000道尔顿)的4臂PEG。在上式中，R是适合提供所需臂数的核心结构。对于4臂PEG单元和前体，R可为季戊四醇结构，而对于8臂PEG单元和前体，R可为六甘油结构。
在某些实施方案中，PEG前体是4a20kPEG-SG或4a20kPEG-SAP。
在某些实施方案中，与用于制备本发明的水凝胶的含亲电子基团的PEG前体一起使用的亲核端基是胺(表示为“NH2”)端基。硫醇(-SH)端基或其他亲核端基也是可能的。
在某些实施方案中，具有约20,000道尔顿的平均分子量和如上文所公开的亲电子端基(例如SAZ、SAP、SG和SS端基)的4臂PEG交联形成聚合物网络并因此形成根据本发明的水凝胶。
例如含亲核基团的交联剂与含亲电子基团的PEG单元反应，例如含胺基团的交联剂与含活性酯基的PEG单元反应，产生通过交联剂经酰氨基团交联的多个PEG单元。
在具有NHS-酯端基的PEG如琥珀酰亚胺壬二酸酯(SAZ)封端、琥珀酰亚胺己二酸酯(SAP)封端或琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG)封端的PEG单元(见上文)的情况下，与含胺基团的交联剂的反应产生通过交联剂经具有下式的可水解连接基团交联的多个PEG单元：
其中m为0至10的整数，并且具体而言为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。对于SAZ端基，m为6。对于SAP端基，m为3；对于SG端基，m为2；并且对于SS端基，m为1。
在特定实施方案中，本发明使用SG或SAP端基。当与使用其他琥珀酰亚胺端基(SS基团除外)如SAZ端基相比时，SG端基在水凝胶生物降解之前可保持的时间较短，而SAZ端基在连接基团中具有较多数量的碳原子，并且由此可能具有较高疏水性，并因此相较于SG端基，不太容易发生酯水解。
在某些实施方案中，含亲电子基团的多臂聚合物前体，并且特别是具有SG或SAP端基(如上定义)的多臂PEG前体与含亲核基团的交联剂交联。亲核基团可为胺，并且特别是伯胺。
在某些实施方案中，含亲核基团的交联剂是含亲核基团的多臂聚合物前体。
在某些其他实施方案中，所使用的交联剂是含有例如胺或硫醇端基的亲核端基的低分子量组分。在某些实施方案中，含亲核基团的交联剂是分子量低于1,000Da的小分子胺，其包含两个或更多个脂族伯胺基团。用于本发明的特定交联剂是例如二赖氨酸、三赖氨酸、四赖氨酸、乙二胺、1,3-二氨基丙烷、1,3-二氨基丙烷、二亚乙基三胺、三甲基六亚甲基二胺、其药学上可接受的盐、水合物，以及衍生物，例如缀合物(只要存在足够的供交联的亲核基团)，以及其任何混合物。在某些优选实施方案中，三赖氨酸用作交联剂。应理解，本文所使用的三赖氨酸是指任何形式的三赖氨酸，包括三赖氨酸盐，例如乙酸三赖氨酸或三赖氨酸衍生物，例如经标记的三赖氨酸。
在某些实施方案中，含亲核基团的交联剂是经标记的交联剂，并且特别是经标记的三赖氨酸。交联剂可用显色剂标记以帮助医师在例如对照检查过程中确认插入物的存在。荧光团如荧光素、罗丹明、香豆素和花青可用作标记交联剂的显色剂。标记可例如通过化学缀合，并且特别是通过使用交联剂的亲核基团与标记缀合来实现。由于交联需要足够量的亲核基团(至少超过一摩尔当量)，因此“缀合(conjugated/conjugation)”通常包括部分缀合，意味着只有一部分亲核基团用于与标记缀合。因此，在某些实施方案中，交联剂是通过与显色剂进行部分缀合来标记的三赖氨酸，其中特别是，约1％至约20％、或约5％至约10％、或约8％的三赖氨酸胺基团与显色剂缀合。
在某些实施方案中，含亲核基团的交联剂是荧光素缀合的三赖氨酸。荧光素缀合的三赖氨酸可通过使乙酸三赖氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-荧光素反应获得。
在某些实施方案中，多臂聚合物单元包含4a20kPEG单元并且交联单元包含荧光素缀合的三赖氨酸酰胺单元。
在某些实施方案中，聚合物网络是通过使4a20kPEG-SG与荧光素缀合的三赖氨酸以在约1:2至约2:1范围内的摩尔比反应获得。在某些其他实施方案中，聚合物网络是通过使4a20kPEG-SS或4a20kPEG-SAZ与荧光素缀合的三赖氨酸以在约1:2至约2:1范围内的摩尔比反应获得。
在某些实施方案中，彼此反应的亲核端基与亲电子端基的摩尔比为约1:1，即，每个亲电子基团如SG或SAP端基提供一个胺基团。在作为含亲电子基团的聚合物单元的4a20kPEG-SG或4a20kPEG-SAP和荧光素缀合的三赖氨酸的情况下，假设三赖氨酸平均使用四个伯胺中的一个进行部分缀合，三赖氨酸则具有三个伯胺基团可与亲电子SG或SAP酯基反应，由此两种组分的摩尔比为约1:1。然而，可使用过量的亲电子(例如NHS端基，如SG)端基前体或亲核(例如胺)端基前体。
因此，在某些实施方案中，聚合物网络是通过使4a20kPEG-SG与荧光素缀合的三赖氨酸以在约1:2至约2:1范围内，并且特别是以约1:1的摩尔比反应获得。
在某些实施方案中，聚合物网络是通过使4a20kPEG-SAP与荧光素缀合的三赖氨酸以在约1:2至约2:1范围内的摩尔比，并且特别是以约1:1的摩尔比反应获得。
表面活性剂：
本发明的一个方面是一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有表面活性剂。
如上文进一步概述的，环孢菌素是实际上不与亲水性水凝胶材料混溶的疏水性活性剂，并且在某些实施方案中，其以具有特定粒度的分散颗粒的形式存在。已表明，就插入物特性而言，一定粒度是有利的。然而，小颗粒也易于聚集。不希望受理论束缚，据认为表面活性剂的存在可防止聚集并改善水凝胶的含量均一性。
此外，实验结果指示，表面活性剂的存在有助于防止在插入物制造期间浇铸的水凝胶发生不希望的管粘附(参见实施例1.2)并改善插入物的质量。
因此，在某些实施方案中，插入物含有表面活性剂。
在某些实施方案中，插入物在干燥状态下含有以插入物的总重量计约0.01重量％至约5重量％、或约0.01重量％至约2重量％、或约0.2重量％至约2重量％、或约0.05重量％至约0.5重量％的表面活性剂。
如实施例1.2中所示，考虑到防止环孢菌素颗粒聚集的能力，表面活性剂类型可能很重要。在某些实施方案中，插入物含有非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂可包含聚(乙二醇)链。可用于本文中的示例性非离子型表面活性剂是以
市售的聚(乙二醇)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(并且特别是
20，即PEG-20-脱水山梨糖醇单月桂酸酯；或
80，即PEG-80-脱水山梨糖醇单月桂酸酯)；以Cremophor市售的蓖麻油的聚(乙二醇)酯(并且特别是Cremophor40，其为PEG-40-蓖麻油)；以及以Tyloxapol市售的乙氧基化4-叔辛基苯酚/甲醛缩聚物。
额外成分：
除了如上文所公开的形成聚合物网络的聚合物单元、活性成分和表面活性剂之外，本发明的插入物还可含有其他额外成分。此类额外成分是例如来源于在水凝胶制备期间使用的缓冲液的盐，例如磷酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐或其他缓冲剂如三乙醇胺。在本发明的某些实施方案中，使用磷酸钠缓冲液(具体而言磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)。
任选地，防腐剂可用于本发明的插入物中。然而，如实施例中另借助于储存稳定性测试数据以及展示插入物保持安全的临床结果所展示，本发明的插入物不需要防腐剂的存在，与例如某些滴眼液形成对比。由于据认为防腐剂也是引起受试者不适如眼睛刺痛和刺激的原因，因此在本发明的一个实施方案中，插入物不含或基本上不含防腐剂。
制剂：
在某些实施方案中，根据本发明的插入物包含环孢菌素；由一种或多种如上文所公开的聚合物前体制成的呈水凝胶形式的聚合物网络；以及任选的额外组分，例如表面活性剂，而且还包含插入物中由制造工艺残留的盐等(例如用作缓冲剂的磷酸盐等)。
在某些实施方案中，根据本发明的插入物在干燥状态下含有以插入物的总重量计约15重量％至约80重量％的环孢菌素和以插入物的总重量计约20重量％至约60重量％的聚合物单元；或以插入物的总重量计约30重量％至约65重量％的环孢菌素和以插入物的总重量计约25重量％至约50重量％的聚合物单元；或以插入物的总重量计约45重量％至约55重量％的环孢菌素和以插入物的总重量计约37重量％至约47重量％的聚合物单元。
在另一个特定实施方案中，以干重计，环孢菌素与PEG的比率为以插入物的总重量计约50重量％至60重量％的环孢菌素比约40重量％的PEG，余量为磷酸盐和其他赋形剂。
在某些实施方案中，呈干燥状态的插入物的余量(即，当已计入环孢菌素、聚合物水凝胶如PEG水凝胶，和任选的表面活性剂时，制剂的其余部分)可为由如以上所公开的缓冲溶液残留的盐。在某些实施方案中，此类盐是磷酸盐、硼酸盐或碳酸(氢)盐。在一个实施方案中，缓冲盐是磷酸钠(磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠)。
环孢菌素和聚合物的量可变化，并且环孢菌素和聚合物水凝胶的其他量可用于制备根据本发明的插入物。
在某些实施方案中，制剂内药物的量小于聚合物(例如PEG)单元的量的约两倍，但在某些情况下可能较高，而且希望包含例如前体、缓冲液和药物(在水凝胶完全胶凝之前的状态)的混合物可均一地浇铸于模具或管中。
在本发明的一个实施方案中，水凝胶在形成之后并且在干燥之前，即在潮湿状态下，包含约3％至约20％的聚乙二醇，表示聚乙二醇重量除以流体重量×100。在一个实施方案中，水凝胶在潮湿状态下包含约7.5％至约15％的聚乙二醇，表示聚乙二醇重量除以流体重量×100。
在某些实施方案中，利用约10％至约30％(w/v)的固体含量(其中“固体”是指溶液中的一种或多种聚合物前体、盐和药物的总重量)形成用于根据本发明的插入物的水凝胶。
在某些实施方案中，水凝胶在干(脱水/干燥)状态下的水含量，例如在插入眼睛泪小管中之前的水含量，可能极低，例如不超过1重量％水。换句话说，在某些实施方案中，插入物在干燥状态下含有不超过约1重量％的水。在某些实施方案中，以插入物的总重量计，水含量也可低于所述值，例如不超过0.25重量％或不超过0.1重量％。
插入物的尺寸和在水合后经由拉伸引起的尺寸变化：
干燥的插入物可取决于制造方法，例如模具或管的使用而具有不同的几何形状，包含包括环孢菌素的水凝胶前体的混合物在完全胶凝之前将浇铸于所述模具或管中。在一个实施方案中，插入物具有横截面呈圆形或基本上呈圆形的圆柱形或基本上圆柱形的形状。插入物的形状也可描述为纤维状(因为圆柱体的长度远超过直径)或棒状。
根据本发明的某些实施方案的水凝胶插入物的聚合物网络，例如PEG网络，在室温或低于室温下在干燥状态下可为半结晶的，而在潮湿状态下可为非晶形的。甚至在拉伸形式中，干插入物在室温或低于室温下也可为尺寸稳定的，这可有利于将插入物插入泪小管中。
在插入物在眼中水合后(这可通过在37℃下将插入物浸入pH 7.4PBS中模拟)，根据本发明的插入物的尺寸可能会改变：通常，插入物的直径可能会增加，而其长度可能减小或至少可保持不变或基本上不变。这种尺寸变化的一个优点在于，虽然插入物在干燥状态下足够薄以便容易地插入泪小管中，但一旦其已被放入泪小管中，插入物不仅会变短而改善在泪小管较短的垂直部分和相应的有限可用空间中的佩戴舒适度，而且其直径也变大，由此使其紧密配合泪小管壁，将插入物锁定于适当位置，并由此防止插入物的意外迁移和丢失。由于插入物也可能变软，因此尽管紧密配合，佩戴起来也很舒适。在某些实施方案中，尺寸变化至少部分地通过在制造期间借助于在纵向方向上拉伸插入物而引入插入物中的“形状记忆”效应来实现(在下文“制造方法”部分中也有公开)。在某些实施方案中，拉伸可在干状态或潮湿状态下执行，即，在干燥水凝胶插入物之后，或在干燥之前执行。需要注意的是，如果不执行拉伸，而仅将水凝胶插入物干燥并切成所需长度，则插入物的尺寸基本上不会发生变化，或者水合后，插入物的直径和长度都会增加。如果这并非所希望的，则水凝胶纤维可经历干拉伸或湿拉伸，即，在干燥之前或之后进行拉伸。特别是，纤维可在干燥之前进行拉伸。
在预先形成的干燥水凝胶中，可通过对材料进行干拉伸，然后使其固化，锁定分子定向来赋予一定程度的分子取向。在某些实施方案中，这可通过牵拉材料(任选地同时将材料加热至高于所述材料可结晶区的熔点的温度)，然后使所述可结晶区结晶来实现。或者，在某些实施方案中，可使用干燥水凝胶的玻璃化转变温度锁定具有合适玻璃化转变温度的聚合物如PVA的分子定向。另一个替代方案是在完全干燥之前拉伸凝胶(也称为“湿拉伸”)，并且然后在张力下干燥材料。分子定向提供在引入水合介质如玻璃体中后进行各向异性溶胀的一种机制。在水合时，某些实施方案的插入物将仅在径向维度上溶胀，而长度将减小或保持或基本上保持不变。术语“各向异性溶胀”是指相对于另一个方向，优先在一个方向上溶胀，如在圆柱体中，主要在直径上溶胀，但在纵向维度上未明显膨胀(或甚至发生收缩)。
水合时的尺寸变化程度尤其可取决于拉伸因子。如本文所使用，拉伸因子是指在拉伸方向上测量的水凝胶被拉伸的因子，即，在即将拉伸前和拉伸后长度而非直径的变化，不考虑任何最终的进一步尺寸变化(例如由干燥或再水合引起的尺寸变化)。举例来说，以例如约1.3的拉伸因子拉伸(例如借助于湿拉伸)可能具有不太明显的效果或在水合期间中不会大幅改变长度。相比之下，以例如约1.8的拉伸因子拉伸(例如借助于湿拉伸)可在水合期间中使长度明显缩短。以例如4的拉伸因子拉伸(例如借助于干拉伸)可在水合时使长度变短(例如长度从15mm减小至8mm)。本领域技术人员应了解，除拉伸之外的其他因素也可影响溶胀行为。
本发明的一个方面是一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物呈纤维形式，其中所述纤维经拉伸。
在某些实施方案中，在纵向方向上以约1.0至约4.0、或约1.5至约3.0、或约2.7的拉伸因子拉伸纤维。
影响拉伸水凝胶和在水合时引起插入物的尺寸变化可能性的因素有聚合物网络的组成。在使用PEG前体的情况下，相较于臂数较多的PEG前体(例如8臂PEG前体)，臂数较少的PEG前体(例如4臂PEG前体)有助于使水凝胶具有较高柔韧性。如果水凝胶含有较多柔韧性较低的组分(例如含有较多臂数的PEG前体的量较多，如8臂PEG单元)，则所述水凝胶可能较硬并且不太容易在不造成破裂的情况下拉伸。另一方面，含有柔韧性较高的组分的水凝胶(例如含有较少臂数的PEG前体，例如4臂PEG单元)可能更容易拉伸并且更柔软，而且在水合时溶胀程度更大。因此，一旦将插入物放入眼中(即，一旦水凝胶变得(再)水合)，就可借助于改变结构特征以及在最初形成插入物后，通过改变所述插入物的加工来定制插入物的行为和特性。
下文实施例中使用的插入物的示例性尺寸提供于实施例部分的表2.1中。干燥插入物的尺寸尤其取决于所并入的环孢菌素的量以及环孢菌素与聚合物单元的比率，并且也可通过允许水凝胶胶凝的模具或管的直径和形状来控制。此外，在插入物形成后，插入物的直径尤其由(湿或干)拉伸水凝胶纤维进一步测定。将干燥纤维(拉伸后)切成所需长度的节段以形成插入物。因此，可根据需要调整插入物的直径和长度。另一方面，泪小管的解剖尺寸提供对于要满足的泪小管内插入物的某些尺寸要求。
在某些实施方案中，插入物是呈纤维形式。纤维可具有约1.5mm至约4.0mm的平均长度和在其干燥状态下不超过0.8mm的平均直径；约2.0mm至约2.5mm的平均长度和在其干燥状态下不超过0.62mm的平均直径；或约2.5mm至约2.9mm的平均长度和在其干燥状态下不超过0.62mm的平均直径。
在某些实施方案中，并且如实施例(具体参见实施例2)中所示，本发明的插入物在储存时稳定，并且产品尺寸在长期储存时不会改变或基本上不改变。
因此，在某些实施方案中，在2至8℃的温度下储存至少3个月、至少6个月或至少12个月后，插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
插入物的尺寸可例如通过根据并入插入物中的环孢菌素的剂量，选择适当活性剂浓度来调整。通过增加活性剂浓度，可减小插入物的尺寸。另一方面，活性剂浓度也影响释放行为以及插入物的特性和质量，例如溶胀行为或干燥后的直径(具体参见实施例1.1)。在某些实施方案中，发明人意外地发现，插入物尺寸、活性剂浓度和/或剂量的某些组合不仅会产生具有适当溶胀行为，易于制造、易于施用和有高佩戴舒适性的高质量插入物，而且也在较长时段内提供有效的释放。
鉴于上述，本发明的一个方面是一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含水凝胶和约360μg的量的环孢菌素，所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过约0.62mm的纤维(或圆柱体)形式。本发明的另一方面是一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含水凝胶和以插入物的总重量计约45重量％至约55重量％的环孢菌素，所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过约0.62mm的纤维(或圆柱体)形式。
此类插入物，以及在某些其他实施方案中本发明的插入物在体内于眼睛中，即在泪小管中，或在体外(其中体外水合是在37℃下于pH7.4的磷酸盐缓冲盐水中24小时后测量)水合后可减小长度并增加直径，即体外在37℃下于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中水合10分钟后，在膨胀状态下的平均直径为至少1.0mm，或体外在37℃下于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中水合24小时后，在平衡状态下的平均直径为至少1.3mm。在一个实施方案中，这种尺寸变化可通过以约1至约4的拉伸因子、或约1.5至约3.0的因子、或约2.7的因子干拉伸水凝胶纤维来实现。
在某些实施方案中，拉伸由此产生形状记忆，意味着插入物当施用于泪小管中时水合后将缩小长度(也称为回弹)并增宽直径，直至其接近(或多或少)其平衡尺寸，所述平衡尺寸是由原始模制尺寸和组成变量决定。虽然狭窄的干尺寸有助于将产品插入泪小管中，但在施用后增宽的直径和缩短的长度产生较短且较厚的插入物，所述插入物佩戴舒适并且仍牢固锁定于适当位置，由此最大限度地减少意外迁移的风险。因此，在一个方面，本发明还涉及一种通过在纵向方向上拉伸水凝胶混合物纤维来赋予水凝胶混合物纤维以形状记忆的方法，所述水凝胶混合物纤维包含环孢菌素颗粒分散于水凝胶中。
体外释放：
本发明的插入物中环孢菌素的体外释放可通过各种方法并且例如在37℃下，在PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)中的非漏槽模拟生理条件下确定，并每天更换与人眼中的泪液体积相当的体积的PBS。
体外释放测试可用于比较不同插入物(例如属于不同制造批次、具有不同组成和不同剂量浓度等)，例如以实现质量控制或其他定性评定的目的。
体内释放和耐久性：
在本发明的一个实施方案中，当将本发明的干燥插入物插入到泪小管中时，如上文所公开，所述插入物变成水合的并改变其尺寸，并且然后随时间推移而出现生物降解和崩解，直至其完全崩解并且任何残留物从泪管排出。当插入物生物降解，例如经由酯水解而生物降解时，其可能会逐渐溶胀和软化。本发明人从下文实施例部分中所呈现的临床研究将认识到，根据本发明的某些实施方案的插入物可保持数月，例如约2至约4个月或更长时间，也使环孢菌素能够经数月持续释放。
在插入物完全崩解后，任何残留的未溶解的环孢菌素颗粒均可经由泪液排泄系统排出。因此，如果包括足量的环孢菌素，持续插入物完全崩解所需的时间，则持续释放的时间长度尤其可通过调整崩解时间来设计。如果在某些实施方案中，使用两个插入物治疗一只眼睛，例如每个下泪小管和上泪小管各一个插入物，以达到希望的总剂量，则所述插入物可设计成经相同或基本上相同的时间崩解。
在某些实施方案中，在泪小管中，本发明的插入物在较长时段内，例如在插入后约1至约6个月内，或在插入后约2至约4个月内，或在插入后约2至约3个月内，或在插入后约3至约4个月内崩解。这已在临床试验中得到证实，参见实施例部分，特别是实施例4。
在一个实施方案中，在插入到泪小管后，插入物在插入后经至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月或至少4个月的时段释放治疗有效量的环孢菌素。
在本发明的一个实施方案中，在插入物插入后，环孢菌素以每天约0.1μg至每天约10μg、或每天约1μg至每天约5μg、或每天约2μg至每天约4μg的平均速率从插入物中释放。
在本发明的一个实施方案中，在插入物插入到人类受试者后，环孢菌素以每天约0.1μg至每天约10μg、或每天约1μg至每天约5μg、或每天约2μg至每天约4μg的平均速率从插入物中释放。
如本文实施例部分中所示，在动物中进行的临床前研究以及在人体中进行的临床研究显示，本发明的某些实施方案的插入物可经较长时段连续释放治疗有效量的环孢菌素，直至插入物完全崩解。然而，在某些实施方案中，在插入物完全生物降解之前，插入物中所包含的全部量的环孢菌素已从插入物中释放。
本发明的一个方面是一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含水凝胶和约360μg的量的分散于水凝胶内的环孢菌素，其中在插入到泪小管后，插入物在插入后经至少约3个月时段释放治疗有效量的环孢菌素。
在某些实施方案中，在插入到人类受试者后，环孢菌素的泪液浓度在约0.1μg/mL至约10μg/mL范围内。
在某些实施方案中，在插入插入物后，环孢菌素的泪液浓度在约0.1μg/mL至约10μg/mL范围内，或在约1μg/mL至约5μg/mL范围内。
在某些实施方案中，在插入物中所包含的环孢菌素颗粒完全溶解之前，插入物在泪小管中崩解。
在某些实施方案中，本发明的插入物可设计成在插入后约1至约6个月内，或在插入后约2至约4个月内，或在插入后约2至约3个月内，或在插入后约3至约4个月内在泪小管内崩解。
在一个实施方案中，在水凝胶的聚合物网络是基于衍生自NHS酯端基如SG端基、SAP端基或如上文所公开的类似基团的连接基团交联的情况下，水凝胶在水性环境中和在泪小管内的耐久性尤其取决于可降解酯基附近碳链的疏水性。在本文实施例中使用的插入物中，这个碳链包含3或4个碳原子，因为所述碳链是源自4a20k PEG前体的SG和SAP官能团。这可在人眼中分别提供约2至约3个月或约3至约4个月的较长耐久性。在其他实施方案中，可使用不同于4a20kPEG-SG-/-SAP和交联剂三赖氨酸的前体来制备在人眼中生物降解并且具有与实施例中举例说明的插入物类似或不同的耐久性的水凝胶插入物。
在某些实施方案中，水凝胶插入物随着其降解而随时间软化，这尤其可取决于水凝胶中交联PEG单元的连接基团的结构。本申请实施例中使用的由4a20kPEG-SAZ和8a20kPEG-NH2形成的插入物随时间相当缓慢地软化。
释放机制：
不希望受理论束缚，环孢菌素从本发明的插入物释放的机制可解释如下：
如上文所概述，疏水性活性剂环孢菌素几乎与亲水性水凝胶材料不混溶。在插入物插入并放置于泪小管中后，所述插入物就会与泪液接触，泪液会慢慢吸收并渗透亲水性水凝胶。生物降解，即水凝胶基质的水解降解导致水凝胶变软并允许泪液渗透得更远，但疏水性活性剂，特别是呈均匀分散的环孢菌素颗粒形式的疏水性活性剂，仍被截留在水凝胶基质中并因在水溶液中的低溶解性而通过缓慢分配至水凝胶中来释放。
此外，不希望受特定理论束缚，据认为泪液在泪小管内插入物顶部提供流体柱，所述流体柱往往会使活性剂释放受柱塞近端部分的横截面积限制。泪小管壁看来以比治疗剂经由流体柱耗尽要慢得多的速率释放药物，和/或泪小管壁可能会充满药物，由此减慢通过壁的释放。因此，在某些实施方案中，如先前所提出的，本发明的泪小管内插入物不需要并且特别是不包含任何复杂且更难以制造的屏障或储库系统(例如插入物侧壁上的涂层阻止并将活性剂的释放局限于从横截面区域的释放)。
药物从插入物的横截面区域释放至泪液中可能最先在水凝胶的与液体环境接触的外部区域发生(即，位于水凝胶靠近泪点的区域中的药物颗粒最先溶解和扩散，而靠近插入物另一端，即靠近泪管的药物颗粒最后扩散)。因此，在某些实施方案中，水凝胶中比较靠近泪点的区域变得没有药物颗粒。因此，这个区域也被称为“清除区”，仅限于溶解的药物，药物浓度等于或低于药物的溶解度。
在清除区已在药物溶解并扩散出水凝胶时形成的某些实施方案中，水凝胶的这个区域形成空隙并变软并且易破。在药物从水凝胶中扩散出来的同时，水凝胶也可借助于在例如眼睛水性环境中的酯水解而缓慢降解。这种降解在整个水凝胶中均一地发生。在降解的晚期阶段，水凝胶开始发生变形和侵蚀(如本文所使用，也称为崩解)。当这种情况发生时，水凝胶变软并且流动性变高(并且因此其形状变得扭曲)，直至水凝胶最终完全崩解，并且水凝胶和/或活性剂的任何剩余部分被泪液排出系统清除。
由于环孢菌素是溶解度相对较低的药物，因此在插入物完全崩解时，未溶解的环孢菌素颗粒可能保留，即，在插入物中所包含的环孢菌素颗粒完全溶解之前，插入物可能已在泪小管中崩解，但如上文所概述，在此类情形中，任何残留的活性剂颗粒均被泪液排出系统清除掉。
然而，在一个实施方案中，在水凝胶完全崩解之前，释放出全部量的环孢菌素。由于水凝胶可将环孢菌素颗粒保持在适当位置并防止其聚集，因此水凝胶中环孢菌素的释放可维持相对恒定的速率。
II.插入物的制造
在某些实施方案中，本发明还涉及一种制造本文所公开的持续释放可生物降解泪小管内插入物的方法，所述插入物包含水凝胶和环孢菌素。在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a)制备含有水凝胶前体的前体混合物和分散于所述前体混合物中的环孢菌素颗粒，
b)使所述前体混合物成形，并使所述水凝胶前体交联形成聚合物网络并获得包含所述聚合物网络的成形水凝胶混合物，以及
c)干燥所述水凝胶混合物以提供所述插入物。
在一个实施方案中，可使用微粉化形式的环孢菌素颗粒来制备插入物，即，所述环孢菌素颗粒是以微粉化颗粒形式使用和分散以制备前体混合物，所述微粉化颗粒均匀分散于所述前体混合物中。在另一个实施方案中，可使用非微粉化形式的环孢菌素来制备插入物。关于活性成分环孢菌素的进一步详情已在上文详细公开，并且在所有方面均适用于所述制造中所使用的活性剂。
用于形成某些实施方案的水凝胶的前体已在上文关于插入物本身的部分中详细公开。
在某些实施方案中，在步骤a)中，通过在微粉化环孢菌素颗粒存在下在缓冲水溶液中混合含亲电子基团的多臂聚合物前体与含亲核基团的交联剂来制备前体混合物。
在某些实施方案中，在步骤a)中，通过将多臂聚合物前体溶解于水性缓冲溶液中来制备缓冲水性前体溶液，并且然后在例如60分钟内将其与包括含亲核基团的交联剂和微粉化环孢菌素颗粒的缓冲水性前体悬浮液混合。
在使用PEG前体制备交联PEG网络的情况下，在某些实施方案中，制造插入物的方法可包括在微粉化环孢菌素颗粒存在下，在缓冲水溶液中将含亲电子基团的多臂聚乙二醇如4a20kPEG-SG或4a20kPEG-SAP与含亲核基团的交联剂如三赖氨酸混合。
在某些实施方案中，PEG前体中亲电子基团与亲核基团的摩尔比为约1:1，但亲核基团(例如胺基团)也可在亲电子基团过量情况下使用，或反之亦然，例如摩尔比范围为约1:2至2:1。在某些实施方案中，所述方法包括使4a20kPEG-SG或4a20kPEG-SAP与荧光素缀合的三赖氨酸以在约30:1至约50:1范围内的重量比反应。
如实施例1.4中所示，通过真空脱气处理前体混合物对插入物质量有很大影响。特别是，可防止环孢菌素颗粒聚集。因此，在某些实施方案中，在步骤a)中，在混合含有环孢菌素颗粒的前体混合物的组分后，将其在真空下脱气。
在某些实施方案中，在如上文步骤a)所概述而制备出前体混合物后，可在步骤b)中，通过将所述混合物浇铸至合适的模具或管中，随后使其完全胶凝来使其成形，以便提供所需最终形状的水凝胶，即，在步骤b)中，前体混合物的成形由以下组成：在完全交联之前，将所述前体混合物填充至模具或管中，以便提供所需最终形状的水凝胶混合物并使水凝胶前体交联。
在插入物应具有纤维形状的情况下，可将反应混合物填充至细直径管如聚氨酯(PU)管中，以便提供延伸的圆柱形状。取决于所需的水凝胶纤维的最终横截面几何形状、其初始直径(所述直径也可通过拉伸减小)，并且也取决于反应混合物均匀填充管的能力，可使用不同几何形状和直径的管。
因此，管内部可具有圆形几何形状或非圆形几何形状，例如十字形几何形状。管可具有内径为例如约1mm至约3mm或约2.0mm的圆形几何形状。
在某些实施方案中，在水凝胶已形成并已固化而完成胶凝之后，水凝胶可在潮湿状态或干燥状态下纵向拉伸，如已在上文关于插入物在水合后的尺寸变化的部分中所详细公开。在某些实施方案中，拉伸因子可在约1至约4.5的范围内，或在如上文也公开的其他范围内。当在某些实施方案中执行干拉伸时，先干燥水凝胶并且然后拉伸。当在某些实施方案中执行湿拉伸时，水凝胶在潮湿(基本上未干燥)状态下拉伸，并且然后在张力下干燥。任选地，可在拉伸时施加热。此外任选地，纤维可另外经扭转。
在某些实施方案中，插入物可通过以下方式获得：制备含水凝胶前体和环孢菌素的前体混合物，将所述前体混合物填充至管中，使所述水凝胶前体在管中交联以提供呈纤维状的水凝胶混合物，并拉伸所述水凝胶混合物纤维以提供插入物。
在某些实施方案中，插入物即使在拉伸之后也维持其尺寸，只要其在室温或低于室温下保持干燥状态即可。
在某些实施方案中，插入物经单独包装和灭菌，例如借助于γ射线照射灭菌。
拉伸的形状记忆效应已于上文关于插入物的特性进行详细公开。在某些实施方案中，水合时收缩的程度尤其取决于上文已公开的拉伸因子。
在某些实施方案中，本发明还涉及一种通过在纵向方向上拉伸水凝胶混合物纤维来赋予水凝胶混合物纤维以形状记忆的方法，所述水凝胶混合物纤维包含分散于水凝胶中的环孢菌素颗粒。
用于本发明这些方法中的拉伸因子可如上文所公开那样使用。
III.疗法
在某些实施方案中，本发明进一步涉及一种治疗或预防有需要患者的眼部疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用如上文所公开的第一持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含水凝胶和环孢菌素。
在某些实施方案中，所述第一插入物留在泪小管中直至完全崩解，或在完全崩解之前被去除。在某些实施方案中，所述第一插入物可设计成在插入后在较长时段内，例如约1至约6个月内、约2至约4个月内、或约2至约3个月内、或约3至约4个月内在泪小管中崩解，但在一些情况下，其将需要更长时间崩解。在正常情况下，由于插入物的崩解不需要患者方采取任何行动，因此所述插入物可保留在泪小管中直至完全崩解。这是有利的，因为患者不需要咨询医师或配镜师以便去除插入物。另一方面，持续生物降解将软化插入物，如果发生例如过敏反应、佩戴不适或其他不良事件如刺激感等意外事件，则必要时，通过施加轻微压力将插入物经由泪点排出至外部或将插入物沿泪小管进一步向下移动以经由鼻泪管清除，由此促进过早去除。此外，第一插入物的柔软性允许插入第二插入物，而无需预先去除第一插入物。通过插入第二插入物，将第一插入物进一步推入泪小管中并保留在该处，而不会感到佩戴不适，直至完全崩解，或将第一插入物下推至泪液排出系统。例如，一旦第一插入物的预定治疗期已经过去，或者如果患者感觉治疗效果消失，就可插入第二插入物。
因此，在某些实施方案中，第二插入物可在至少1个月或至少2个月后，在未预先去除所述第一插入物的情况下插入。在其他实施方案中，所述第一插入物是在完全崩解之前去除并且施用第二插入物以替换去除的第一插入物。
本发明的一个方面是一种治疗受试者的干眼病的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将第一可生物降解插入物插入所述受试者的第一只眼的第一泪小管中，其中所述插入物包含：
(1)可生物降解水凝胶；
(2)约100μg至约800μg分散于所述水凝胶中的环孢菌素；
(3)其中所述环孢菌素从所述第一插入物插入所述受试者之日起经至少约2个月时段以每天约0.1μg至每天约10μg的平均速率从所述插入物释放；以及
(b)从插入所述第一插入物之日起至少约2个月后，将第二插入物插入所述受试者的第一只眼的第一泪小管中，其中所述第二插入物与所述第一插入物类似或基本上类似。
在某些实施方案中，所述第一插入物被设计成在插入后约2至约3个月内在泪小管中崩解并且所述第一插入物在施用后2个月内去除。
在某些实施方案中，在至少2个月的治疗期内一次施用每只眼的环孢菌素的剂量为约300μg至约400μg环孢菌素。其他适当的剂量于上文进一步公开。
在某些实施方案中，眼部疾病是泪膜和眼表的病症。
在某些实施方案中，眼部疾病是干眼病。在替代实施方案中，本发明的插入物和方法可用于治疗其他眼表疾病，例如睑炎、过敏性结膜炎，并且特别是异位性角膜结膜炎和春季角膜结膜炎。
在一些实施方案中，眼部疾病与一种或多种选自由以下组成的组的疾患相关：烧灼感、搔痒、发红、刺痛、疼痛、异物感、视觉障碍、泪腺炎症、眼表炎症、T细胞介导的炎症、泪液中存在结膜T细胞和泪液中炎性细胞因子水平升高。
在一些实施方案中，本发明的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物可用于预防有发展干眼病或任何相关疾患的风险的受试者，例如佩戴隐形眼镜的受试者的此类眼部疾患。
在一些实施方案中，治疗有效改善在施用前Schirmer评分小于10mm的患者的泪液产生，如通过Schirmer泪液测试所测量；和/或有效减少眼干症状，如通过一种或多种选自由以下组成的组的评定所确定：在视觉模拟量表上对眼干症状的严重程度进行评级；在视觉模拟量表上对眼干症状的频率进行评级；泪膜破裂时间的测定；角膜荧光素染色；结膜丽丝胺绿染色；最佳矫正视敏度；眼表疾病指数的测定；和标准患者眼干评估。
在一些实施方案中，治疗有效改善在施用前Schirmer评分小于10mm的患者的泪液产生，如通过Schirmer泪液测试所测量。
在某些实施方案中，在治疗期间一次施用每只眼的剂量包含在一个插入物或两个插入物中。
在某些实施方案中，在下泪小管中插入插入物，或在上泪小管中插入插入物，或在下泪小管和上泪小管中各插入一个插入物。插入物可插入泪小管的垂直部分中。
在治疗期间一次施用每只眼的环孢菌素可包含在一个或两个插入物中。
在某些实施方案中，在治疗期间一次施用每只眼的剂量包含在一个插入物中，例如包含在一个包含约250μg或约360μg剂量的环孢菌素的插入物中。
在某些实施方案中，插入物可借助于选自由钳子、镊子和施药器组成的组的抓握装置插入泪小管中。
在施用两个插入物的实施方案中，插入物是如上文所公开同时插入。同时插入的插入物可以相同或不同。
在某些实施方案中，治疗期为至少1个月、至少2个月或至少3个月。根据本发明的一个实施方案，“治疗期”意思指，本发明的插入物在插入后在所述时间段内维持或基本上维持治疗效果。换句话说，在某些实施方案中，仅需要一次插入(本发明插入物的插入)就可在本文称为“治疗期”的较长时段内维持治疗效果。与需要每天数次比较频繁地施用的当前用于治疗干眼病的滴眼液相比，这是一个相当大的优势，并且由此明显改善患者的生活质量。
本发明的一个方面是一种治疗有需要患者的干眼病的方法，所述方法包括向所述患者施用包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中眼中泪点闭塞和环孢菌素释放提供协同作用。
此类协同作用可能在于，当与施用含有环孢菌素并设计成提供相同每日释放量的环孢菌素的滴眼液相比时，环孢菌素具有较高的生物利用度，环孢菌素的每日释放量可例如通过基于环孢菌素泪液浓度随时间的变化所计算的释放至泪液中的环孢菌素的量确定。
在某些实施方案中，环孢菌素的全身浓度低于可量化的量。由于环孢菌素的全身浓度保持在最低水平，因此药物间相互作用或全身毒性的风险也保持在最低水平。因此，在一个实施方案中，患者服用的额外药物不会提供显著风险。这对于常常发生眼部疾病并且另外正在服用其他药物的老年患者尤其有益。
本发明的一个方面是如上文所公开的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物在制备用于治疗有需要患者的如上文所公开的眼部疾病，或用于治疗有需要患者的如上文所公开的干眼病/干燥性角膜结膜炎的药剂中的用途。
本发明的一个方面是用于治疗有需要患者的如上文所公开的眼部疾病，或用于治疗有需要患者的如上文所公开的干眼病/干燥性角膜结膜炎的如上文所公开的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物。
本发明的一个方面是一种增加在施用前Schirmer评分低于10mm的患者的泪液产生的方法，所述泪液产生是通过Schirmer泪液测试测量，所述方法包括向所述患者施用如上文所公开的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物。
在某些实施方案中，在此类方法中，Schirmer评分可在插入物插入后6周增加至少2mm或在12周增加至少3mm。
本发明的一个方面是一种减少眼干症状的方法，所述眼干症状的减少是通过一种或多种选自由以下组成的组的评定确定：在视觉模拟量表上对眼干症状的严重程度进行评级；在视觉模拟量表上对眼干症状的频率进行评级；泪膜破裂时间的测定；角膜荧光素染色；结膜丽丝胺绿染色；最佳矫正视敏度；眼表疾病指数OSDI的测定；和标准患者眼干评估SPEED，所述方法包括向所述患者施用如上文所公开的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物。
在某些实施方案中，在此类方法中，总角膜荧光素染色值tCFS可在插入物插入后6周时减小至少1.5或在12周时减小至少3。
在某些实施方案中，在此类方法中，在视觉模拟量表对眼干症状的严重程度进行的评级可在插入物插入后2周时降低至少10，或在6周时降低至少15。
实施例
包括以下实施例以展示如权利要求中所描述的本发明的某些方面和实施方案。然而，本领域技术人员应了解，以下描述仅为示例性的，而决不应视为对本发明的限制。
实施例1：环孢菌素插入物的制备
本申请的环孢菌素插入物基本上呈圆柱形(成形为纤维)，其中环孢菌素均匀地分散并截留在基于PEG的水凝胶基质中，基于所述水凝胶基质在泪液中的低溶解度提供环孢菌素的持续释放。
I.实施例1.1：药物浓度评估
为了评估药物浓度的影响，制备出具有低、中等和高剂量环孢菌素的三种不同制剂。三种制剂的组成示于下表1.1.1中。
表1.1.1：环孢菌素插入物制剂的组成
低、中等和高剂量的插入物基本上是根据关于研究产品插入物所概述的制造工艺制备(参见以下实施例1.5)。然而，没有使用tyloxapol，首先将含有环孢菌素的注射器与含有多臂PEG溶液的注射器混合，随后与含有乙酸三赖氨酸(TLA)/荧光素溶液的注射器混合，并且不进行真空脱气。
在浇铸后，水凝胶立即固化，即发生交联，并且然后拉伸管束并在培养箱中在氮气流下干燥。从柔韧性管取出干燥的管束并切成一定长度。尺寸和物理特性如下：
表1.1.2：低、中等和高剂量插入物的尺寸和物理特性
低剂量和高剂量制剂产生具有不希望的“吸管状”的纤维，即，这些纤维具有较大的干直径并且在纤维中间显示出中空孔。因此，吸管状纤维的密度较低。
为了测定纤维的“圆度”，测量粗端以及细端上的横截面直径，将较低的直径值标识为直径1，将较高的直径值标识为直径2，并且纵横比如下计算：
纵横比＝直径1/直径2
虽然中等剂量制剂没有显示出吸管状现象，但其产生具有极低纵横比的扁平纤维。纵横比为0.7，表明缺乏圆度。尽管低剂量和高剂量制剂形成的吸管状纤维较圆，但低密度产生的纤维比希望的要大得多。如下表1.1.3中所概述，药物浓度对插入物的水合特性也有影响：
表1.1.3：低、中等和高剂量插入物的水合特性
可以看出，水合直径均显著高于1.45mm的目标并且随着剂量的增加而减小，并且收缩因子也随着剂量的增加而减小。
II.实施例1.2：表面活性剂的评估
存在表面活性剂
为了评估插入物中存在表面活性剂的影响，制备出三种不同的制剂，其中一种制剂不含表面活性剂(对照，操作1)，一种含有0.05％
20(操作2)，并且第三种不含表面活性剂，但使用乙醇制备(操作3)。三种制剂的组成示于下表1.2.1中。
表1.2.1：含和不含表面活性剂的环孢菌素插入物制剂的组成
操作1至3的插入物基本上根据关于研究产品插入物所概述的制造工艺制备(参见以下实施例1.5)，即，通过制备一种在乙酸三赖氨酸(TLA)/荧光素水溶液中含有环孢菌素悬浮液的水凝胶悬浮液前体注射器(操作1：不含tyloxapol；操作2：含有
20代替tyloxapol；操作3：不含tyloxapol，但溶解于乙醇而非水中)和第二种含有多臂PEG水溶液的水凝胶溶液前体注射器，将这两个注射器混合，并且然后通过注射液体悬浮液将其浇铸至一组柔韧性管件中，随后使所述材料交联并凝固。不进行真空脱气。在浇铸后，水凝胶立即固化，即发生交联，并且然后拉伸管束并在培养箱中在氮气流下干燥。从柔韧性管取出干燥的管束并切成一定长度。尺寸和物理特性如下：
表1.2.2：含和不含表面活性剂的插入物的尺寸和物理特性
为了测定纤维的“圆度”，测量粗端以及细端上的横截面直径，将较低的直径值标识为直径1，将较高的直径值标识为直径2，并且纵横比如下计算：
纵横比＝直径1/直径2
可以看出，添加
20产生高纵横比，表明纤维呈圆形。其平均直径小于对照并且密度较高，这有利于容易地插入产品。操作1的对照纤维在干燥期间粘在管上并且具有低纵横比，表明纤维是扁平的(参见图1.2A)。
操作3研究乙醇的使用，遇到了重大问题。溶液在固化开始后1分钟内开始蒸发，在纤维中产生气泡。当从培养箱中取出时，纤维全部断裂和变形，如图1.2B中所示。
在表面活性剂存在下的药物浓度
为了评估在表面活性剂存在下药物浓度的影响，在0.05％
20存在下，用低、中等和高剂量环孢菌素制备三种不同的制剂。三种制剂的组成示于下表1.2.3中。
表1.2.3：包含表面活性剂的环孢菌素插入物制剂的组成
操作1至3的三个插入物是基本上根据关于研究产品插入物所概述的制造工艺制备(参见以下实施例1.5)，但使用
20代替tyloxapol。不进行真空脱气。在浇铸后，水凝胶立即固化，即发生交联，并且然后拉伸管束并在培养箱中在氮气流下干燥。从柔韧性管取出干燥的管束并切成一定长度。不进行灭菌。尺寸和物理特性如下：
表1.2.4：包含表面活性剂的插入物的尺寸和物理特性
纵横比均高于0.9，表明纤维呈圆形。干纤维直径随着剂量的增加而增加。然而，干纤维直径均略有增加，这可能与纤维密度有关，纤维密度随着剂量的增加而降低。
图1.2C显示了在此操作中制造的干插入物和水合插入物。可以看出，药物浓度越高，似乎发生的聚集就越多。
下表1.2.5显示在37℃下用PBS水合后10分钟和24小时水合插入物的特征。可以看出，水合直径和收缩因子都随着剂量的增加而减小。这表明，药物含量对再水合率有明显不利影响。
表1.2.5：低、中等和高剂量插入物的水合特性
表面活性剂类型
为了解决聚集的问题，确定各种表面活性剂对环孢菌素粒度的影响。根据FDA指南，在最大表面活性剂浓度下测试表面活性剂。
在玻璃小瓶中，通过将PBS添加至已知重量的表面活性剂中来制备含0.05％
20(PEG-20脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、4％
80(PEG-80脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、0.5％ Cremophor RH 40(PEG-40氢化蓖麻油)和0.3％Tyloxapol(乙氧基化4-叔辛基苯酚/甲醛缩聚物)的储备溶液。然后，对表面活性剂溶液进行涡旋和声波处理。在小瓶中，通过将约1mL表面活性剂/缓冲剂储备溶液添加至约100mg环孢菌素中来制备含有约9-10％(w/w)环孢菌素的溶液。对照是用蒸馏水(DIW)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)制备并且不含表面活性剂。然后，将这种溶液涡旋并使用基于光学模型“Fraunhofer.rf780z”的BeckmanCoulter LS 13 320通过激光衍射法测量粒度，其中遮光率值在7％至9％范围内。
表1.2.6显示溶液浓度和粒度。可以看出，使用表面活性剂使粒度明显减小，表明聚集减少。在测试的表面活性剂中，Tyloxapol显示出最大幅度的粒度减小。此外，使用tyloxapol测量的粒度与供应商提供的粒度最为接近，供应商指出D10、D50和D90分别为0.5、2.1和7.5μm。
表1.2.6：表面活性剂对环孢菌素粒度的影响
I.实施例1.3：真空脱气评估
为了评估真空脱气的作用，对于Tyloxapol用0.3％(w/w)浓度并且对于4a20kPEG-SG用9％(w/v)浓度的水凝胶前体混合物制备出600μg剂量的环孢菌素插入物。插入物制剂的组成如下表1.3.1中所示。
表1.3.1用于评估真空脱气的环孢菌素插入物制剂的组成
除了以下有关在混合各组分之后并且在与含PEG的水凝胶溶液前体进一步混合之前处理含有环孢菌素、tyloxapol和乙酸三赖氨酸/荧光素的水凝胶悬浮液前体注射器的详情外，使用相同的制造工艺制备出三组不同的插入物。
对于第一组插入物，包含在注射器中的水凝胶悬浮液是通过以下方式处理：(i)加注所述注射器(遵循所有制剂的惯例进行)，将悬浮液涡旋3分钟并手动脱气。手动脱气是通过后拉用盖封闭的注射器柱塞以产生真空，并且然后打开注射器，由此释放真空并使大气泡破裂来进行。作为下一步骤(ii)，将水凝胶悬浮液前体放入真空室中并脱气，然后与水凝胶溶液前体混合。用于第二组插入物的水凝胶悬浮液前体是基本上以相同的方式处理，不同之处在于所述水凝胶悬浮液前体在步骤(ii)之后的步骤(iii)中进一步进行声波处理。用于第三组插入物的水凝胶悬浮液前体是以与第二组相同的方式制备，但省略步骤(ii)在真空室中脱气。下表1.3.2中给出制备步骤的概述。
表1.3.2：真空脱气评估
仅通过真空脱气获得的第一组插入物几乎没有聚集体。通过真空脱气和声波处理获得的第二组插入物具有许多较大的聚集体并且无法装入切割装置中。通过声波处理但未真空脱气而获得的第三组插入物有一些聚集体，但看起来其他方面都很好(图1.3)。
II.实施例1.4：药物粒度的评估
已制备出其他插入物来评估和测定药物物质的最佳粒度。
筛分环孢菌素大颗粒的作用
为了评估筛分排除较大颗粒的作用，对于Tyloxapol用0.3％(w/w)浓度并且对于4a20k PEG-SG用9％(w/v)浓度的水凝胶前体混合物制备出400μg剂量的环孢菌素插入物。制剂的组成示于下表1.4.1中。
表1.4.1用于评估筛分作用的环孢菌素插入物制剂的组成
对所使用的环孢菌素进行筛分并使用下表1.4.1中所示的粒度级分。在制造期间，某些浇铸管束断裂并且无法使用，也概述于下表1.4.2中。每个插入物的干密度和载药量示于图1.4A中。
表1.4.2所用粒度级分和浇铸管束的断裂失败
*鉴定出断裂失败的其他原因，例如在浇铸期间凝胶中夹带有空气
由此可以得出结论，高粒度具有严重的负面影响。
环孢菌素粒度对水合作用、干密度和机械故障的影响
为了评估不同粒度的影响，使用具有五种不同粒度分布(PSD)的微粉化环孢菌素颗粒制备插入物。五种制剂的组成示于下表1.4.3中。
表1.4.3：环孢菌素插入物制剂的组成
所用环孢菌素的d10、d50和d90值示于下表1.4.4中。
表1.4.4：所用环孢菌素的粒度
| 小1 | 小2 | 中等-小 | 中等 | 大 | |
| d10[μm] | 1.0 | 1.1 | 1.3 | 1.5 | 1.8 |
| d50[μm] | 4.4 | 5.57 | 8.7 | 12.3 | 17.9 |
| d90[μm] | 28.9 | 37.6 | 34.8 | 38.4 | 43.2 |
在制造后观察到以下：用较大CSI颗粒制备的插入物往往具有较大的干直径(参见图1.4B)，而密度随CSI粒度增加而减小(参见图1.4C)。较小的CSI颗粒产生较光滑的插入物表面(参见图1.4D，显示在带相机的立体显微镜下拍摄的显微图像)。表面上具有小颗粒和小/中等颗粒的插入物看起来被PEG覆盖。在用中等和大颗粒制备的插入物上发现具有明显不规则性和变形的粗糙表面。中等颗粒在干燥期间引起的断裂率最高。较大的颗粒产生更好的水合行为和溶胀(参见图1.4E)。
总之，虽然较大的颗粒改善溶胀和回弹，但其也导致较多的管束断裂。此外，高剂量制剂展示的断裂率要高于低剂量和中等剂量制剂，并且经由筛分去除极大微粒(>45微米)使断裂率明显改善。
总而言之，介于“小粒度”与“中等粒度”之间的粒度平衡了小颗粒的密度增益和纤维光滑度以及中等颗粒的再水合率，由此实现管束断裂减少。
III.实施例1.5：支持临床试验的插入物的制备
在下文中，将描述用于人类临床研究(制剂1、2A、2B和3，参见实施例4)和高剂量比格犬研究(制剂4A和4B，参见实施例3.6)的研究产品插入物的制备工艺。研究产品插入物是基于：基于PEG-SG的中等耐久性环孢菌素/水凝胶制剂(制剂1和4A，设计成持续约2至3个月)；基于PEG-SAP的长耐久性环孢菌素/水凝胶制剂(制剂2A和4B，设计成持续约3至4个月)；以及两种不含环孢菌素的水凝胶媒介物(HV)制剂作为安慰剂，一种基于PEG-SAP的长耐久性制剂(制剂2B，设计成持续约3至4个月)和一种基于PEG-SS的短耐久性制剂(制剂3，设计成持续约1周)。
含环孢菌素的插入物的目标直径为0.55mm±0.03mm并且目标长度为2.72mm±0.08mm，而HV插入物的目标直径为0.41mm±0.05mm并且目标长度为2.72mm±0.08mm。所述制剂的组成示于下表1.5中。
表1.5环孢菌素研究产品插入物制剂的组成
I.制备工艺的简述
为了形成含环孢菌素的插入物的聚合物网络，制备出两个前体注射器：一个在tyloxapol和乙酸三赖氨酸(TLA)/荧光素溶液中含有环孢菌素悬浮液的水凝胶悬浮体前体注射器，以及第二个含有多臂PEG(基于季戊四醇核心结构的4臂20K PEG，含有胺反应性NHS基团)溶液的水凝胶溶液前体注射器。将两个注射器混合，并且然后通过注射液体悬浮液，将其浇铸至柔韧性管件子集中，然后使材料交联和凝固。在浇铸后，水凝胶立即固化，即发生交联。然后，拉伸含有截留在水凝胶网络内的环孢菌素的管束并在培养箱中在氮气流下干燥。从柔韧性管中取出干燥的管束，切成一定长度，并储存于小瓶中。然后，将药品包装在保护性发泡体载体中，所述载体在氮气环境下热封至层压箔袋中。对于含有环孢菌素的制剂使用电子束辐射并且对于HV制剂使用γ射线照射，对药品进行灭菌。
HV安慰剂插入物是以相同方式制备，不同之处在于所用赋形剂的量是根据表1的组成(多臂PEG变化)进行调整，并且特别是不使用环孢菌素。
II.水凝胶悬浮液前体注射器的制备
除了多臂PEG的类型和所用磷酸氢二钠的量之外，对制剂1和2A使用相同的程序和数量。对于制剂4和5，也根据上表1.5中给出的组成调整环孢菌素的量。
水凝胶悬浮液前体注射器由两个不同的额外前体注射器的混合物组成。
一个注射器含有悬浮于tyloxapol溶液中的微粉化环孢菌素，其通过称取704.8mg±5.0mg微粉化环孢菌素(d50：5～8μm；d100：≤45μm)并使其悬浮于2,775.0mg±20.0mg的0.8wt％tyloxapol于注射用水(WFI)中的溶液中来制备。对于HV制剂(制剂2B和3)，注射器仅含0.8wt％的tyloxapol溶液。
另一个注射器含有用磷酸氢二钠缓冲的三赖氨酸-荧光素缀合物溶液，其通过以下制备：(i)将25.0mg±0.5mg NHS-荧光素与8,025.0mg±5.0mg的在9,750.0±10.0mg WFI中包含97.5mg±2.5mg乙酸三赖氨酸和243.75mg±2.5mg(制剂1和3)或690mg±5.0mg(制剂2A和2B)磷酸氢二钠的溶液混合；(ii)使所得混合物在室温下反应1至24小时；(iii)过滤所述溶液；以及(iv)填充注射器，其中每个注射器填充所得溶液的1,575.0mg±10.0mg部分。步骤(ii)中反应的完成是通过反相(RP)HPLC方法使用UV检测来确认，所述方法允许通过保留时间(RT)区分未反应的组分与产物酰胺。在步骤(ii)后，没有RT与NHS-荧光素一致(RT≈6.6分钟)的可量化的峰保留，并且在较高RT(RT为约8.2分钟)处出现由产物酰胺的形成所产生的新峰。在最初的研究中，结果表明在1小时后转化为酰胺，并且显示反应产物在溶液中可稳定保持长达7天(图2)。
将两个额外的前体注射器用母螺纹对母螺纹鲁尔锁连接器(female-to-femaleluer lock connector)连接在一起，并且其内容物通过在每个注射器之间来回传递总共25次而混合在一起，由此形成水凝胶悬浮液前体注射器。将Tyloxapol USP添加至用于悬浮环孢菌素的溶液中，以帮助分散环孢菌素并减少任何聚集，因为环孢菌素极难溶于水并易于聚集，并且也帮助防止水凝胶混合物粘附至管内壁上，而水凝胶混合物粘附被认为是产生具有低纵横比的扁平形状插入物的原因。
III.水凝胶溶液前体注射器的制备
水凝胶溶液前体注射器含有PEG的缓冲溶液，所述缓冲溶液是通过将1,565.0mg±10.0mg的在7,985.0mg±50.0mg WFI中包含24.5mg±1.0mg磷酸二氢钠的溶液与542.0mg±5.0mg的4a20KPEG-SG(具有N-羟基琥珀酰亚胺戊二酸酯端基的4臂20kDa PEG，用于制剂1)或4a20K PEG-SAP(具有N-羟基琥珀酰亚胺己二酸酯端基的4臂20kDa PEG，用于制剂2A)组合来制备。
IV.浇铸、拉伸和干燥
为了形成水凝胶/环孢菌素悬浮液，首先通过将包含环孢菌素、tyloxapol和三赖氨酸-荧光素缀合物的水凝胶悬浮液前体注射器，以及包含4a20k PEG-SG、4a20k PEG-SAP或4a20k PEG-SS的水凝胶溶液前体注射器放入真空室中并暴露于程序化真空循环进行脱气，并且然后用母螺纹对母螺纹鲁尔锁连接器连接。通过在每个注射器之间来回传递总共25次，将前体注射器的内容物混合在一起，并将由此产生的水凝胶/环孢菌素悬浮液转移至单个注射器中。
然后，将水凝胶/环孢菌素悬浮液注射器连接至在内径为2.0mm并且外径为2.8mm的经高压釜灭菌的聚氨酯管上的倒钩配件，切割成适当的长度，并且经由所制备的管浇铸悬浮液，然后使材料交联并凝固。
在管装满后，就将管从注射器中去除，并封盖所述管上的倒钩配件。胶凝时间是通过执行凝胶轻敲测试来确认。对于凝胶轻敲测试，将少量残留的水凝胶/环孢菌素悬浮液放置在载玻片上并用移液器尖轻敲，直至悬浮液开始凝成股，表明当悬浮液胶凝时，聚合在约2-8分钟内开始(即，在完整轻敲循环期间保持连接至移液器尖)。
将填充有水凝胶/环孢菌素悬浮液的管子，在下文中称为“浇铸的管束(castedstrands)”，垂直放入并且储存于固化室(环境温度和湿度)，保持3至6小时，以使凝胶固化。
在固化时间结束后，将浇铸的管束放置在拉伸夹具中并用动态夹板固定于适当位置。将浇铸的管束拉伸至拉伸夹具的固定长度，所述长度为原始管长度的约2.7倍。然后，将拉伸夹具移动并垂直放置于设定为32.0±2.0℃并且氮气流速为53±3SCFH(标准立方英尺/小时)的培养箱内进行干燥。浇铸的管束在培养箱中保持数天以使其完全干燥。
V.切割、包装、灭菌和检查
从管中取出干燥的浇铸的管束并切成约2.7mm长度。使用Vision System在10倍放大率下对插入物进行100％工艺内目测和尺寸检查(验收标准：微粒状，圆柱形，无可见的表面缺陷，含环孢菌素的插入物的直径为0.55mm±0.03mm，HV插入物的直径为0.41mm±0.05mm，并且所有插入物的长度为2.72mm±0.08mm)。
符合所有工艺内规格的插入物以单个插入物包装于发泡体载体中，并密封于铝-LDPE箔袋中，使用者可以将其撕开。为了保持插入物，发泡体载体具有在底部处有开口的V形凹口，用钳子将插入物放入所述V形凹口中，其中所述插入物的一部分伸出以方便取出。将带有插入物的发泡体载体放入箔袋中。将未密封的箔袋转移至提供惰性氮气环境的手套箱中，以减少来自发泡体和袋材料的残余水分，在其中储存最少16小时但不超过96小时的持续时间，并且然后使用袋密封器在袋上形成完整、连续的密封，将其密封于手套箱内。检查袋封口并将包装在2-8℃下储存直至灭菌。
对包装好的插入物进行电子束或γ射线照射灭菌，并在2–8℃下储存，直至进行最终质量检查。
在袋装插入物灭菌后，就对药品执行最终质量检查。
实施例2：插入物规格
获得的插入物是借助于可见性测试、显微镜检查分析、HPLC分析以及储存稳定性测试表征。
I.可见性测试
对插入物进行目测检查，以确认在用蓝光照射时可经由替代测试模型目测观察插入物。
II.显微镜检查分析
使用Unitron Z850/NSZ-606显微镜，以显微镜检查插入物来确认呈干燥状态，以及在37℃下在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中水合10分钟(膨胀状态)和24小时(平衡状态)后呈水合状态的产品的尺寸(表2.1)。
表2.1不同制剂的显微镜检查分析的结果
III.其他产品规格测试
根据下表2.2对其他产品规格进行测试和报告。
表2.2其他产品规格测试的结果
*环孢菌素峰的RT(保留时间)对应于参考标准±0.5分钟
**杂质的目标规格如下：
-异环孢菌素A，≤1.0％
-环孢菌素C，≤1.0％
-环孢菌素B，≤1.0％
-二氢环孢菌素A/吉环孢素(Geclosporine)，≤1.4％
-环孢菌素D，≤1.0％
-任何个别杂质：≤1.0％
-总杂质：≤6.0％
IV.储存稳定性测试
根据制剂1和2A的含环孢菌素的插入物的稳定性已在冷藏条件(2-8℃)下经12个月进行评估。
储存稳定性测试的结果可见于表2.3.1和表2.3.2(制剂1)以及表2.3.3和表2.3.4(制剂2A)。
表2.3.1储存稳定性测试结果：外观、尺寸、测定和特性(制剂1)
表2.3.2储存稳定性测试结果：杂质和其他规格(制剂1)
1T＝0和T＝3数据是在说明书定案前报告；T＝3，4小时间隔和9天样品未提取*未获得数据，样品在6个月时无意地未进行测试
NMT：不超过NR：不可报告ND：未检测TBD：待测定
--：尚未测试
表2.3.3储存稳定性测试结果：外观、尺寸、测定和特性(制剂2A)
表2.3.4储存稳定性测试结果：杂质和其他规格(制剂2A)
1T＝0和T＝3数据是在说明书定案前报告；*未获得数据，样品在6个月时无意地未进行测试
NMT：不超过，NR：不可报告，ND：未检测，TBD：待测定，--：尚未测试
经过12个月获得的稳定性数据仍满足预定的稳定性规格。根据ICH Q1E，对于冷藏产品，如果长期数据显示随时间几乎没有改变并且显示几乎没有变化，则提出的储存期限可为至多两倍，但不应超过12个月，所述提议得到分析结果和相关支持数据的支持。实时长期稳定性数据遵循在95％置信区间(CI)下稳定性规格的上限和下限趋势。总体而言，在定量数据中观察到的趋势很少，甚至没有。统计分析展示，基于在23个月处显示可能截距的测定的降解分析，所述产品将满足23个月的储存期限。所有其他稳定性指示参数都显示超过36个月的可能截距。因此，可预期至少23个月的储存期限。
实施例3：在比格犬中进行的环孢菌素插入物的评估
为了研究含有环孢菌素的插入物的药物动力学，在比格犬药物动力学研究中测试不同的制剂。
进行六项不同的比格犬研究，其中测定在研究持续时间内从插入物释放的药物量和/或泪液中环孢菌素的浓度。研究和制剂的概述在表3中给出。
表3比格犬研究的概述
实施例3.1：概念验证PK研究
将含0.7mg标称剂量的环孢菌素的插入物施用于比格犬，如表3中所概述。
随时间评估从插入物释放的药物量，并在研究持续时间内测定泪液中环孢菌素的浓度。
在研究持续时间内环孢菌素的中值泪液浓度范围为1.1至1.9μg，参见下表3.1。在6周时取出插入物子集以测定与施用剂量相比的残余药物量。在6周内释放的环孢菌素的平均量为0.37mg。假设在所述给药期内每日的释放速率一致(如由泪液浓度保持相对恒定所证实)，由此计算出估计的每日递送剂量为每天8.8μg。
表3.1：比格犬眼中的环孢菌素泪液浓度
实施例3.2：概念验证PK研究
将含0.44mg标称剂量的环孢菌素的插入物施用于比格犬，如表3中所概述。
随时间评估从插入物释放的药物量，并在研究持续时间内测定泪液中环孢菌素的浓度。
在研究持续时间内环孢菌素的平均泪液浓度范围为1.1至2.8μg，参见下表3.2。在32天时取出插入物以测定与施用剂量相比的残余药物量。在32天内释放的环孢菌素的平均量为0.2mg。假设在所述给药期内每日释放速率一致，由此计算出估计的每日递送剂量为每天6.3μg。
表3.2：比格犬眼中的环孢菌素泪液浓度
实施例3.3：概念验证PK研究
对于n＝总计10份样品，施用前插入物中的初始环孢菌素剂量为671±13μg(平均值加标准差)。分别在28天和50天时取出四个和五个插入物，并分析环孢菌素含量。左眼和右眼提供类似的结果，由此计算出所有取出的插入物的平均值，得到释放量(初始量减去在取出的插入物中的剩余量，所述量分别为576±18μg和494±32μg)分别为3.4和3.5μg，如表3.3中所示。通过比较初始剂量与释放剂量来确定平均每日释放速率。研究结果表明，在28天和50天内的每日估计递送剂量为约每天3.5μg。研究期间插入物的药物释放量在低至每天2.7μg到高达每天4.4μg范围内。
3.3：比格犬中从插入物释放的环孢菌素
实施例3.4：干眼症模型研究
将含0.36mg标称剂量的环孢菌素并具有1.5mm水合直径和2.5mm水合长度的插入物施用于比格犬，如表3中所概述。
预先通过手术切除比格犬右眼的泪腺以建立人工干眼症模型。左眼未经处理，并由此用作健康对照。通过Schirmer泪液测试随时间跟踪泪液产生情况，并且测试显示，右眼的泪液产生量减少至接近于零，为干眼症模型提供概念证明(参见图3.1)。随时间评估从插入物释放的药物量，并在研究持续时间内测定泪液中环孢菌素的浓度。
环孢菌素的平均泪液浓度在健康眼中在0.8至1.4μg/mL范围内并且在干眼中在1.4至4.8μg/mL范围内，参见下表3.4。比格犬干眼症模型中较高的泪液环孢菌素浓度(与健康眼相比)表明，环孢菌素可成功地转运至泪液中并且在干眼症条件下很可能从插入物转运至眼表，并且当与在健康眼中观察到的环孢菌素浓度相比较时，由于泪液量减少(由泪液产生减少引起)并且由此药物稀释度较低，因此在干眼症条件下，眼表上的环孢菌素浓度可能较高。
表3.4：比格犬的干眼和健康眼中的环孢菌素泪液浓度
实施例3.5：药物动力学研究
如表3中所概述，将制剂1和2A的插入物(PEG-SG和PEG-SAP水凝胶，0.36mg环孢菌素)经两侧施用于24只比格犬。在给药后1小时、3小时和6小时、第1天和第3天、第1周、第2周、第4周、第6周、第8周、第10周和第12周，获取泪液样品。结果显示于下表3.5以及图3.2A和图3.2B中。对于制剂1(第1组)和制剂2A(第2组)，环孢菌素经12周从插入物释放至比格犬的泪液中。结果表明，所述两种制剂在约3小时出现的最大泪液浓度相当，为2.7μg/mL。在前六周内，所述两种制剂的药物释放曲线和泪液浓度看来相当(在95％置信区间内)。
在第8周至第12周之间，相对于SAP水凝胶制剂，利用SG水凝胶制剂，观察到比格犬的环孢菌素泪液浓度的潜在降低。这种差异可能由SG水凝胶比SAP水凝胶降解更快引起。
3.5比格犬的环孢菌素泪液浓度
实施例3.6：高剂量研究
如表3中所概述，在符合GLP的毒理学研究中，评定根据两种水凝胶制剂4A和4B(PEG-SG和PEG-SAP)的具有较高剂量(0.7mg环孢菌素)的插入物的药物动力学。
在给药前以及给药后1小时、2小时、4小时、24小时和第7天、第30天、第60天、第90天和第104天获取泪液样品。泪液中的环孢菌素浓度示于表3.6.1以及图3.3中。结果表明，在此比格犬研究中，在研究持续时间内所述两种制剂的泪液浓度相当(在95％置信区间内)，并且在恢复动物中药物水平低于定量下限(LLOQ＝30ng/mL)(在104天取样前两周取出测试物)。
所述两种制剂的药物动力学概况相当，并且在研究持续时间内展示持续的稳态剂量暴露。因为在研究持续时间内，泪液浓度在给药期间的一小时剂量暴露内达到明显稳态，所以真正的最大浓度并非显而易见的。
表3.6.1比格犬的环孢菌素泪液浓度
实施例4：随机化、多中心、双盲、媒介物对照的人类1/2期临床研究
设计了一项随机化、多中心、双盲、媒介物对照的1/2期临床研究以评估环孢菌素插入物用于泪小管内以治疗患有DED的受试者的安全性、耐受性和功效，所述研究包括145名受试者(290只眼)，分两个队列招募，即，队列1，一个由约5名用制剂2A水凝胶/环孢菌素插入物治疗的受试者(10只眼)组成的开放标签组；以及队列2，一个由约140名用2种不同的制剂1和2A水凝胶/环孢菌素插入物以及2种不同的制剂2B和3HV插入物治疗的受试者组成的随机化双盲组。
两只眼都用相同的治疗/制剂治疗。如果两只眼均符合干眼症的症状，则将具有较高总角膜荧光素染色评分的眼睛指定为研究眼，并且将另一只眼指定为非研究眼。如果两只眼的总角膜荧光素染色评分相同，则在分析之前，由生物统计学家确定研究眼。如果只有一只眼符合条件，则所述眼将为研究眼，但两只眼仍接受相同的治疗/制剂。
治疗概述于下表4中。
表4：治疗概述(HV＝水凝胶媒介物)
I.研究时程
两个队列组都遵循基本上相同的研究时程。在以下情况下，受试者入选：
·自报告的干眼病史或临床上由眼保健专业人员在双眼中确诊≥6个月的干眼病，
·在筛选访视期，如通过视觉模拟量表(VAS)眼干严重程度评分≥30所定义的研究眼中持续存在干眼病，和
·在同一只合格眼中或两只眼中，总角膜荧光素染色(tCFS)评分≥6且≤15(NEI量表，参见以下评定部分)并且Schirmer评分(未麻醉)>0mm且≤10mm润湿(在5分钟时)，其中
·其他纳入和排除标准适用。
受试者在插入前14天/第1天(第2次访视)经历筛选并且在第2次访视确认合格性。在第2次访视时，将队列2中的受试者以2:2:2:1比率随机分配至四个治疗组之一中。对于所有受试者，预定从第2周至第16周以规律间隔进行进一步治疗随访(第3次至第8次访视)，以便尤其确定插入物的存在，其中所述插入物的存在是通过用蓝光照射相应区域并使用黄光滤光片，以非侵入性方式评定。
对于两个队列，如果插入物在第16周(第8次访视)时可见，则受试者在30天(±10天；第9次访视)内返回诊所，并根据需要，每30天继续返回诊所，直至插入物不再可见并且医师已确定没有证据表明生物活性。如果在第16周(第8次访视)时无法看到插入物并且医师已确定没有证据表明生物活性，则受试者退出研究。
所述研究的一般示意图如图4A中所示。
每次访视均会进行各种评定。特别是，除TBUT评定(仅在第1次、第2次、第5次和第7次访视时发生)外，在以下第III点概述的所有眼科评定都是在全部第1次至第8次访视以及第9次访视(在个别患者进行第9次访视情况下)时进行。
根据以下第III点，任何不良事件的发生同样是在从插入日/第1天起的每次访视中进行评定(在第1天插入之前出现的任何病征、症状和状况都记录为病史)。
II.插入物放置
将眼科插入物放置于泪小管的垂直部分中(参见图5B)。在本文所公开的临床研究中，插入物被放置于下泪点中。
为了将插入物放置在泪小管中，施加侧向压力以使泪小管系统伸长，并暂时拉下泪点附近的皮肤(图5A)。使用泪点扩张器朝向鼻子扩张下泪点，确保所述系统伸长，并且泪小管较深地扩张穿过泪点达到一定深度和宽度，必要时，以旋转运动旋转扩张器以帮助扩张程序(图5B)。
使用眼科海绵使泪点开口周围的表面干燥(图5C)。
用钳子将水凝胶/环孢菌素或HV插入物朝向鼻子以较小角度插入(图5D)，旨在于第一次移动中插入70％，并使用钳子轻敲或推动插入物的其余部分进入，由此避免过度挤压插入物以防止变形。确认插入物定位于泪点开口偏下位置。
如果插入物在放置于泪点开口偏下位置之前发生水合(类似于喇叭形)，或在理想定位之前发生水合，或如果插入物的一部分伸出而无法插入，则丢弃插入物并使用新插入物。
眼科插入物的插入难易程度分级为“容易”(1)、“中等”(2)或“困难”(3)。
III.评定
所述研究采用以下评定：
Schirmer泪液测试
Schirmer测试确定所产生的泪液量并通过毛细管作用起作用，由此允许泪液沿纸质测试条的长度行进。沿测试条行进的速率与泪液产生的速率成正比。受试者被要求抬头并施加测试条的弯曲端，使其位于下眼睑的下睑结膜与眼睛的球结膜之间。五分钟后，患者被要求睁开双眼并向上看，并且取出测试条。Schirmer测试评分是由测试条湿润区域的长度决定。两只眼同时进行测试。在麻醉时，仅测量基础泪液分泌量。
Schirmer评分≥10mm润湿被认为是正常的，而评分<5mm表示泪液不足。
泪膜破裂时间(TBUT)和总角膜荧光素染色(tCFS)
眨眼后泪膜破裂所需的时间被称为TBUT。它是测量泪膜稳定性的定量测试。正常泪膜破裂时间超过15秒。为了评定TBUT，将荧光素条用盐水润湿并施加于下盲管。眨眼数次后，使用带有蓝光滤光片的宽束裂隙灯检查泪膜，以确定角膜上第一个干斑的出现。
小于5-10秒的TBUT值表明泪液不稳定并且在轻度至中度干眼病患者中观察到。
测量总角膜荧光素染色(tCFS)值以评定角膜状况。通过荧光素染料染色使可能例如由干眼病引起的损伤如角膜表面擦伤变得可见。
为了评定tCFS，将荧光素条用盐水溶液/洗眼剂润湿，受试者被要求抬头并将湿润的测试条施加于下眼睑结膜上，测试条不得接触球结膜。由于TBUT也通过应用荧光素来评定，如果tCFS测量是在TBUT之后立即进行，则不需要额外应用荧光素染料。受试者被要求眨眼数次以分配荧光素染料，并且在等待2至3分钟后，使用钴蓝照射和Wratten黄光滤光片，使用NEI(国家眼科研究所)0-3评分量表(0＝无染色，1＝轻微染色，2＝中等染色，3＝严重染色)评定角膜中央、下部、鼻、颞和上部5个区域中每个区域的角膜染色，其中CFS总分是五个区域的总和(0至15)。
tCFS评分越高，则角膜表面的损伤就越大。
结膜丽丝胺绿染色(LGS)
测量LGS值以评定结膜的状况。将丽丝胺条用盐水溶液/洗眼剂润湿，受试者被要求抬头并将湿润的测试条施加于下眼睑结膜上，测试条不得接触球结膜。受试者被要求眨眼数次以分配丽丝胺染料，并且在等待1至4分钟后，使用中等光照，使用NEI 0-3评分量表评定结膜6个区域，即颞、上颞、下颞以及上鼻、下鼻和鼻中每个区域的结膜染色情况，其中LGS总分是六个区域的总和(0至18)。
由升高的睑裂斑产生的染色可能无法改善。与睑裂斑相关的染色可能始终被排除在总丽丝胺评分之外。
LGS评分越高，则结膜表面的损伤程度越高。
最佳矫正视敏度BCVA
视敏度测试应在任何需要与眼接触或滴注研究染料的检查之前进行。LogMAR视敏度必须使用早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(Early Treatment Diabetic RetinopathyStudy，ETDRS)或改良ETDRS图表进行评定，所述图表每行由五个字母组成，每行代表0.1×在给定测试距离下最小分辨角度的对数单位(log unit of the minimum angle ofresolution，logMAR)。
视敏度测试是使用早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)或改良ETDRS图表执行，并使用受试者自身的矫正镜片(仅限眼镜)或针孔折射进行最佳矫正。ETDRS或改良ETDRS图表由每行五个字母组成，每行代表0.1×在给定测试距离下最小分辨角度的对数单位(logMAR)。
视敏度(VA)是以logMAR值评分，其中正确读出最后一行中的字母将视为基础logMAR读取，向其中加上N×0.02，其中N是错过字母总数并包括在最后一行读取中。此总和(基础logMAR+N×0.02)代表所述眼的BCVA。
BCVA评分越低，则视敏度越好。
眼干评分/视觉模拟量表VAS
为了评定眼干评分，受试者被要求根据放置于水平线上的垂直记号(代表0至100％的值)对眼干症状的严重程度和频率进行评级，以指示受试者双眼当前所经历的眼睛不适程度和所经历的眼干的频率，其中0％对应于“无不适”并且100％对应于“最大程度(最)不适”。
眼表疾病指数
OSDI允许基于12项问卷迅速地评定干眼症患者的眼部刺激症状，所述问卷评定干眼症的症状和其对受试者在过去一周生活中视力相关功能的影响(参见例如R.M.Schiffman等人,Arch Ophthalmol.2000；118(5):615-621，特此通过引用并入)。
最终评分越高，则能力丧失程度越高。
标准患者眼干评估(SPEED)的评估
SPEED问卷(参见Korb和Blackie,Ocular Surgery News Europe版,2012，特此通过引用并入)是另一种随时间监测干眼症的症状的评定，所述问卷由8个项目0至28分评定包括干燥、砂磨感、搔痒、刺激、灼痛、流泪、酸痛和眼疲劳在内的症状的频率和严重程度。
较高的评分指示较高的能力丧失程度。
IV.不良事件
不良事件(AE)是施用医药产品的患者或临床研究受试者的任何不幸医学事件，并且未必与这种治疗有因果关系。因此，AE可为在时间上与药物(研究)产品的使用相关的任何不利且非预期的病征(包括异常实验室发现)、症状或疾病，无论是否与药物(研究)产品相关。
严重不良事件(SAE)是在任何剂量下发生的任何不幸的医学事件：
·引起死亡
·危及生命(指受试者在事件发生时有死亡风险的事件，但并非假设情况更严重时可能导致死亡的事件)
·需要住院治疗或延长现有住院时间。(择期手术住院不构成SAE)
·引起持续或显著的能力丧失/无能力。
·先天异常/出生缺陷。
在每次访视期间，使用开放性问题向受试者询问不良事件，注意不要影响受试者的回答。
记录下受试者从第2次访视(插入/第1天)至第9次访视(30天的随访)中所经历的任何AE以及SAE，不管事件的严重程度或其与研究治疗的关系如何。
必要时，在先前评定中已记录并被指明持续发生的任何AE将在后续访视中进行审查，并且如果这些AE已解决，则将其记录在案。
AE强度或频率的变化作为独立事件记录(即，开始新记录)。
跟踪当受试者完成研究或中止研究时正在经历的任何SAE，直至事件解决、稳定或恢复成基线状态。
评定所有事件以确定事件是否符合SAE的标准、事件的严重程度以及事件与研究治疗的关系。
实施例4.1：队列1–开放标签、单中心1期研究
队列1是一项开放标签1期研究，旨在评估水凝胶/环孢菌素插入物的安全性、耐受性、耐久性和生物活性，并且申办者、研究者和受试者均了解治疗分配，并且研究时程如以上在I下所概述。遵循研究时程。队列1中的全部5名入选受试者(10只眼)在第2次访视时，根据以上在II下所概述的程序接受制剂2A插入物。在确认合格性后放置插入物。
I.安全性和耐受性
所有受试者都完成16周的研究期，没有受试者退出。没有报告严重不良反应。观察到插入物具有良好耐受性，并且没有报告或观察到刺痛、刺激、视力模糊或流泪的不良事件。不需要更换插入物。插入物的插入难易程度评级如下：
·8只眼：简单
·1只眼：中等
·1只眼：困难
中等和困难等级是针对同一受试者的右眼和左眼。这显示，为便于插入物的施用，插入物的整体尺寸和溶胀行为得到极佳调整。
II.耐久性
所有插入物在第8次访视时最后一次可见。
III.生物活性/功效
根据每次访视时进行的眼科评定来评估插入物治疗的功效。
通过Schirmer测试(未麻醉)测量的泪液产生量从基线时的平均值4.2mm增加至在第12周时的8.2mm，其中五名受试者中有一名(20％)在第12周时的Schirmer评分相对于基线增加≥10mm(参见图6A和图6B)。
如通过tCFS所测量，受试者展示干眼病(DED)的病征改善。tCFS从基线时的平均值6.7增加至第12周时的平均值2.7(参见图7A)，引起在第12周时-4.0的相对于基线的变化(CFB)(参见图7B)。
DED的症状也有所改善，如通过以下所测量：
(i)视觉模拟量表(VAS)眼干严重程度评分，所述评分从基线时的平均值51改善为第12周时的平均值33(参见图8A和图8B)；和
(ii)VAS干眼症频率评分，所述评分从基线时的平均值51改善为第12周时的平均值31(参见图9)。
对于DED的病征和症状，插入物早在两周时就开始发挥作用(如通过VAS眼干严重程度和频率评分来测量)，并持续16周的研究时段。
此外，在16周期间，眼表疾病指数(OSDI)和标准患者眼干评估(SPEED)评分都下降(参见图10和图11)。
实施例4.2：队列2–随机化、多中心、双盲、媒介物对照的2期研究
队列2是一项持续进行的随机化、双盲、媒介物对照的2期研究，旨在评估水凝胶/环孢菌素插入物的安全性、耐受性和功效，并且受试者以及研究者和其工作人员和申办人员对治疗分配不知情，并且研究时程如以上在I下所概述。遵循研究时程。
随机化时程是由独立于研究实施或计划团队的合格生物统计学家以电脑生成的，并且在双盲治疗期中随机化时施用于受试者的水凝胶/环孢菌素以及HV插入物在外观上是相同的。在最终数据库被锁定之前，研究受试者以及研究者和其工作人员对治疗身份不知情，并且参与研究实施和监测的申办人员在研究和数据库锁定完成之前保持不知情。
在第2次访视时，队列2中入选的140名受试者在确认资格后，根据第2次访视时的随机化时程接受一个插入物(制剂1、2A、2B和3)。程序如以上在II下所概述。插入物放置遵循插入物施用。
如果需要公开，则通过将公开资料的访问限制为不参与研究实施的两个人(申办者医疗监察员和申办者统计员)或在紧急情况下直接由研究者维护研究评定和目标的完整性。
IV.安全性和耐受性
持续评定包括发生刺痛、刺激、视力模糊或流泪的不良事件。
V.耐久性
通过监测插入物的存在来评定插入物的耐久性。
VI.生物活性/功效
根据每次访视时进行的眼科评定来评估插入物治疗的功效。功效终点确定如下：
主要终点
·在Schirmer测试(未麻醉)中，在第12周时相对于基线的变化(CFB)和绝对值
次要终点
病征：
·第12周Schirmer评分增加≥10mm的受试者的百分比
·在每次基线后研究访视时使用NEI量表得到的总角膜荧光素染色(tCFS)的CFB和绝对值
·在每次基线后访视时使用NEI量表得到的角膜荧光素染色分区的CFB和绝对值。
·在每次基线后访视时使用NEI量表得到的结膜丽丝胺绿染色的CFB和绝对值。
症状(受试者报告)：
·在每次基线后研究访视时眼干评分(VAS)的CFB和绝对值
·在每次基线后访视时眼表疾病指数(
总分，三个领域中的每一个和个别问题)的CFB和绝对值。
·在每次基线后访视时SPEED问卷的CFB(总体评分和个别问题)。
探索性：
·在第12周时的泪膜破裂时间(TBUT)的CFB
·在所有基线后访视时插入物的存在
·研究者评定的插入难易度
·研究者评定的可视化难易度
尽管已经描述了许多实施方案，但显而易见的是，可改变基本实施例以提供利用本公开的化合物和方法的其他实施方案。因此，应了解，本公开的范围由所附权利要求而非借助于实施例表示的具体实施方案限定。
在本申请通篇引用了各种参考文献。这些参考文献的公开内容特此通过引用并入本公开。
本发明特别涉及以下其他实施方案：
1.一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素是呈颗粒形式并且其中所述环孢菌素颗粒分散于所述水凝胶内。
2.如实施方案1所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素颗粒均匀地分散于所述水凝胶内。
3.如实施方案1或2所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素颗粒具有小于约50μm的d50值。
4.如实施方案3所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素颗粒具有在3至17μm范围内的d50值。
5.如实施方案4所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素颗粒具有在4至12μm范围内的d50值。
6.如实施方案5所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素颗粒具有在5至8μm范围内的d50值。
7.如实施方案1至6中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素颗粒具有小于43μm的d90值。
8.如实施方案1至7中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素颗粒具有小于45μm的d100值。
9.如实施方案1至8中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含在约100μg至约800μg范围内的量的所述环孢菌素。
10.如实施方案9所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含在100μg至300μg范围内的量的所述环孢菌素。
11.如实施方案9所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含在300μg至450μg范围内的量的所述环孢菌素。
12.如实施方案9所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含在约500μg至约800μg范围内的量的所述环孢菌素。
13.如实施方案9所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含约250μg的量的所述环孢菌素。
14.如实施方案9所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含约360μg的量的所述环孢菌素。
15.如实施方案9所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含约600μg的量的所述环孢菌素。
16.如实施方案9所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含约670μg的量的所述环孢菌素。
17.如实施方案1至16中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物是用于插入下泪小管和上泪小管中。
18.如实施方案1至16中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物是用于插入所述下泪小管中。
19.如实施方案1至16中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物是用于插入所述上泪小管中。
20.如实施方案17至19中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物是用于插入所述泪小管的垂直部分中。
21.如实施方案1至20中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在插入之前呈干燥状态并且在插入眼中后变成水合的。
22.如实施方案1至21中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述水凝胶包含聚合物网络。
23.如实施方案22所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述水凝胶包含聚合物网络，所述聚合物网络包含一个或多个单元的聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、无规或嵌段共聚物或其中任一者的组合或混合物，或一个或多个单元的聚氨基酸、糖胺聚糖、多糖或蛋白质。
24.如实施方案22或23所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述水凝胶包含聚合物网络，所述聚合物网络包含相同或不同的交联聚合物单元。
25.如实施方案24所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述交联聚合物单元是一个或多个交联聚乙二醇单元。
26.如实施方案22至25中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络包含平均分子量在约2,000至约100,000道尔顿范围内的聚乙二醇单元。
27.如实施方案26所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚乙二醇单元的平均分子量在约10,000至约60,000道尔顿范围内。
28.如实施方案27所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚乙二醇单元的平均分子量在约20,000至约40,000道尔顿范围内。
29.如实施方案28所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚乙二醇单元的平均分子量是约20,000道尔顿。
30.如实施方案22至29中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络包含一个或多个交联多臂聚合物单元。
31.如实施方案30所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述多臂聚合物单元包含一个或多个2臂至10臂聚乙二醇单元。
32.如实施方案31所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述多臂聚合物单元包含一个或多个4臂至8臂聚乙二醇单元。
33.如实施方案32所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述多臂聚合物单元包含一个4臂聚乙二醇单元。
34.如实施方案33所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述4臂聚乙二醇单元的四个臂连接至核心季戊四醇分子。
35.如实施方案22至34中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络还包含一个或多个交联单元。
36.如实施方案22至35中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络是通过使含亲电子基团的多臂聚合物前体与含亲核基团的交联剂反应来形成。
37.如实施方案36所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述亲电子基团是活性酯基团。
38.如实施方案37所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述亲电子基团是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基团。
39.如实施方案38所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述亲电子基团选自由以下组成的组：琥珀酰亚胺丙二酸酯基团、琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)基团、琥珀酰亚胺马来酸酯基团、琥珀酰亚胺富马酸酯基团、琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG)基团、琥珀酰亚胺己二酸酯(SAP)基团、琥珀酰亚胺庚二酸酯基团、琥珀酰亚胺辛二酸酯基团和琥珀酰亚胺壬二酸酯(SAZ)基团。
40.如实施方案36至39中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是含亲核基团的多臂聚合物前体。
41.如实施方案36至39中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是胺。
42.如实施方案41所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是包含两个或更多个脂族伯胺基团的分子量低于1,000Da的小分子胺。
43.如实施方案42所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是选自由以下组成的组的小分子胺：二赖氨酸、三赖氨酸、四赖氨酸、乙二胺、1,3-二氨基丙烷、1,3-二氨基丙烷、二亚乙基三胺和三甲基六亚甲基二胺。
44.如实施方案43所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是三赖氨酸。
45.如实施方案44所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是乙酸三赖氨酸。
46.如实施方案44所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是经标记的三赖氨酸。
47.如实施方案46所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述三赖氨酸是用显色剂标记。
48.如实施方案47所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述三赖氨酸是用选自由以下组成的组的显色剂标记：荧光团如荧光素、罗丹明、香豆素和花青。
49.如实施方案48所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是荧光素缀合的三赖氨酸。
50.如实施方案49所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述荧光素缀合的三赖氨酸是通过使乙酸三赖氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-荧光素反应获得。
51.如实施方案46至50中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述三赖氨酸是通过与显色剂进行部分缀合来标记。
52.如实施方案51所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中约1％至约20％的三赖氨酸胺基团与显色剂缀合。
53.如实施方案52所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中5％至10％的所述三赖氨酸胺基团与显色剂缀合。
54.如实施方案53所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中8％的所述三赖氨酸胺基团与显色剂缀合。
55.如实施方案30至54中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述多臂聚合物单元包含4a20kPEG单元并且所述交联单元包含荧光素缀合的三赖氨酸酰胺单元。
56.如实施方案22至55中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络是通过使4a20kPEG-SG与荧光素缀合的三赖氨酸以在约1:2至约2:1范围内的摩尔比反应来获得。
57.如实施方案56所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络是通过使4a20kPEG-SG与荧光素缀合的三赖氨酸以约1:1的摩尔比反应来获得。
58.如实施方案22至55中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络是通过使4a20kPEG-SAP与荧光素缀合的三赖氨酸以在约1:2至约2:1范围内的摩尔比反应来获得。
59.如实施方案58所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络是通过使4a20kPEG-SAP与荧光素缀合的三赖氨酸以约1:1的摩尔比反应来获得。
60.如实施方案1至59中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下包含以所述插入物的总重量计约15重量％至约80重量％的所述环孢菌素和以所述插入物的总重量计约20重量％至约60重量％的聚合物单元。
61.如实施方案60所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下包含以所述插入物的总重量计30重量％至65重量％的所述环孢菌素和以所述插入物的总重量计25重量％至50重量％的聚合物单元。
62.如实施方案61所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下包含以所述插入物的总重量计45重量％至55重量％的所述环孢菌素和以所述插入物的总重量计37重量％至47重量％的聚合物单元。
63.一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计约40重量％至约80重量％的所述环孢菌素。
64.如实施方案1至63中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计45重量％至55重量％的所述环孢菌素。
65.如实施方案1至64中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计约20重量％至约60重量％的聚合物单元。
66.如实施方案65所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计25重量％至50重量％的聚合物单元。
67.如实施方案66所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计37重量％至47重量％的聚合物单元。
68.如实施方案1至67中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有表面活性剂。
69.一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有表面活性剂。
70.如实施方案68或69所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计约0.01重量％至约5重量％的表面活性剂。
71.如实施方案70所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计0.2重量％至2重量％的表面活性剂。
72.如实施方案68至71中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有非离子型表面活性剂。
73.如实施方案72所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有包含聚(乙二醇)链的非离子型表面活性剂。
74.如实施方案73所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有选自由以下组成的组的表面活性剂：聚(乙二醇)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、蓖麻油的聚(乙二醇)酯和乙氧基化4-叔辛基苯酚/甲醛缩聚物。
75.如实施方案74所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：聚(乙二醇)-20-脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚(乙二醇)-80-脱水山梨糖醇单月桂酸酯、蓖麻油的聚(乙二醇)-35酯和乙氧基化4-叔辛基苯酚/甲醛缩聚物。
76.如实施方案75所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有乙氧基化4-叔辛基苯酚/甲醛缩聚物。
77.如实施方案1至76中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有一种或多种磷酸盐、硼酸盐或碳酸盐。
78.如实施方案77所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有来源于在所述水凝胶制备期间使用的磷酸盐缓冲液的磷酸盐。
79.如实施方案1至78中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计不超过约1重量％的水。
80.如实施方案1至79中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物具有横截面基本上呈圆形的基本上呈圆柱形的形状。
81.如实施方案1至80中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少3个月后通过HPLC所测量，所述环孢菌素的含量为约300至约410μg。
82.如实施方案1至81中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少6个月后通过HPLC所测量，所述环孢菌素的含量为约300至约410μg。
83.如实施方案1至82中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少12个月后通过HPLC所测量，所述环孢菌素的含量为约300至约410μg。
84.如实施方案1至83中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少3个月后通过HPLC所测量，所述环孢菌素的含量为约90重量％至约110重量％。[已在说明书中保留更多的范围]
85.如实施方案1至84中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少6个月后通过HPLC所测量，所述环孢菌素的含量为约90重量％至约110重量％。
86.如实施方案1至85中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少12个月后通过HPLC所测量，所述环孢菌素的含量为约90重量％至约110重量％。
87.如实施方案1至86中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少3个月后通过HPLC所测量，杂质量不超过3.0％。
88.如实施方案1至87中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少6个月后通过HPLC所测量，所述杂质量不超过3.0％。
89.如实施方案1至88中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少12个月后通过HPLC所测量，所述杂质量不超过3.0％。
90.如实施方案1至89中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物呈纤维形式。
91.如实施方案90所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物呈平均长度为约1.5mm至约4.0mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.8mm的纤维形式。
92.如实施方案91所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物呈平均长度为2.0mm至2.5mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
93.如实施方案92所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物呈平均长度为2.5mm至2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
94.如实施方案1至93中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少3个月后，所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
95.如实施方案1至94中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少6个月后，所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
96.如实施方案1至95中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少12个月后，所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
97.如实施方案1至96中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在37℃下在体外于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中水合10分钟后，所述插入物呈在膨胀状态下平均直径为至少1.0mm的纤维形式。
98.如实施方案1至97中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在37℃下在体外于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中水合24小时后，所述插入物呈在平衡状态下平均直径为至少1.3mm的纤维形式。
99.如实施方案1至98中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在选自由钳子、镊子和施药器的抓握装置的帮助下插入所述泪小管中。
100.如实施方案1至99中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在体内于眼中或在体外水合时，所述插入物的直径增加，或在所述插入物的直径增加的同时，其长度减小。
101.如实施方案100所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中水合作用是在37℃下在体外于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中24小时后测量。
102.如实施方案1至101中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在插入后约1至约6个月内在所述泪小管中崩解。
103.如实施方案102所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在插入后2至4个月内在所述泪小管中崩解。
104.如实施方案103所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在插入后2至3个月内在所述泪小管中崩解。
105.如实施方案103所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在插入后3至4个月内在所述泪小管中崩解。
106.如实施方案1至105中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在插入至所述泪小管中后，所述插入物在插入后经至少约1个月时段释放治疗有效量的环孢菌素。
107.如实施方案106所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在插入至所述泪小管中后，所述插入物在插入后经至少2个月时段释放治疗有效量的环孢菌素。
108.如实施方案107所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在插入至所述泪小管中后，所述插入物在插入后经至少3个月时段释放治疗有效量的环孢菌素。
109.如实施方案1至108中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在所述插入物插入至人类受试者中后，环孢菌素以每天约0.1μg至每天约10μg的平均速率从所述插入物释放。
110.如实施方案1至108中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在所述插入物插入后，环孢菌素以每天约0.1μg至每天约10μg的平均速率从所述插入物释放。
111.如实施方案109或110所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在所述插入物插入后，环孢菌素以每天1μg至每天5μg的平均速率从所述插入物释放。
112.如实施方案111所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在所述插入物插入后，环孢菌素以每天2μg至每天4μg的平均速率从所述插入物释放。
113.如实施方案1至112中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在插入至人类受试者后，环孢菌素的泪液浓度在约0.1μg/mL至约10μg/mL范围内。
114.如实施方案1至112中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在所述插入物插入后，环孢菌素的泪液浓度在约0.1μg/mL至约10μg/mL范围内。
115.如实施方案113或114所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在所述插入物插入后，环孢菌素的泪液浓度在约1μg/mL至约5μg/mL范围内。
116.如实施方案1至115中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在所述插入物中所包含的环孢菌素颗粒完全溶解之前，所述插入物在所述泪小管中崩解。
117.如实施方案1至116中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物可通过以下方式获得：制备含水凝胶前体和环孢菌素的前体混合物，将所述前体混合物填充至管中，使所述水凝胶前体在所述管中交联以提供呈纤维状的水凝胶混合物，并拉伸所述水凝胶混合物纤维以提供所述插入物。
118.如实施方案1至117中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述纤维在干燥之前或之后已经拉伸。
119.如实施方案118所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述纤维在干燥之前已经拉伸。
120.一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物呈纤维形式，其中所述纤维经拉伸。
121.如实施方案118至120中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述纤维已在纵向方向上以约1.0至约4.0的拉伸因子拉伸。
122.如实施方案121所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述纤维已在纵向方向上以约1.5至约3.0的拉伸因子拉伸。
123.如实施方案122所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述纤维已在纵向方向上以约2.7的拉伸因子拉伸。
124.一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含水凝胶和分散于所述水凝胶内的约360μg的量的环孢菌素，其中所述水凝胶包括含聚乙二醇单元的聚合物网络，并且其中所述插入物在插入之前呈干燥状态。
125.一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含水凝胶和约360μg的量的环孢菌素，所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
126.一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含水凝胶和以所述插入物的总重量计约45重量％至约55重量％的环孢菌素，所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
127.一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含水凝胶和分散于所述水凝胶内的约360μg的量的环孢菌素，其中在插入泪小管后，所述插入物在插入后经至少约3个月时段释放治疗有效量的环孢菌素。
128.一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中
所述环孢菌素呈颗粒形式
所述环孢菌素颗粒分散于所述水凝胶内并且具有小于约50μm的d50值，并且其中
在所述插入物插入至人类受试者后，所述环孢菌素以每天约0.1μg至每天约10μg的平均速率从所述插入物中释放。
129.一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含：
包含聚合物网络的水凝胶，所述聚合物网络包含
一个或多个交联多臂聚合物单元，其包含约300μg 4a20K PEG单元，和
包含荧光素缀合的三赖氨酸酰胺单元的交联单元，以及
约360μg的量的环孢菌素，
所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
130.一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含：
包含聚合物网络的水凝胶，所述聚合物网络是通过使4a20kPEG-SG与荧光素缀合的三赖氨酸以约1:1的摩尔比反应获得，
和约360μg的量的环孢菌素，
所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
131.一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含：
包含聚合物网络的水凝胶，所述聚合物网络是通过使4a20kPEG-SAP与荧光素缀合的三赖氨酸以约1:1的摩尔比反应获得，
和约360μg的量的环孢菌素，
所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
132.如实施方案1至131中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述水凝胶包含聚合物网络，所述聚合物网络在室温或低于室温下在干燥状态下为半结晶的，而在潮湿状态下为非晶形的。
133.如实施方案1至132中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在制造期间经历湿拉伸或干拉伸，并且其中当在室温或低于室温下处于干燥状态时，呈拉伸形式的所述插入物在尺寸上稳定。
134.一种治疗或预防有需要的受试者的眼部疾病的方法，所述方法包括将第一个根据实施方案1至132中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物插入所述受试者的泪小管中。
135.如实施方案134所述的方法，其中所述第一插入物留在所述泪小管中直至完全崩解。
136.如实施方案134或135所述的方法，其中所述第一插入物被设计成在插入后约3至约4个月内在所述泪小管中崩解。
137.如实施方案134至136中任一项所述的方法，其中第二插入物是在至少2个月后，在不预先去除所述第一插入物情况下插入。
138.一种治疗受试者的干眼病的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将第一可生物降解插入物插入所述受试者的第一只眼的第一泪小管中，其中所述插入物包含：
(1)水凝胶；
(2)约100μg至约800μg分散于所述水凝胶中的环孢菌素；
(3)其中所述环孢菌素从所述第一插入物插入所述受试者之日起经至少约2个月时段以每天约0.1μg至每天约10μg的平均速率从所述插入物释放；以及
(b)自插入所述第一插入物之日起至少约2个月后，将第二插入物插入所述受试者的所述第一只眼的所述第一泪小管中，其中所述第二插入物与所述第一插入物基本上类似。
139.如实施方案138所述的方法，其中将所述第一插入物在完全崩解之前去除。
140.如实施方案139所述的方法，其中所述第一插入物是在完全崩解之前去除并且将第二插入物插入以替换去除的第一插入物。
141.如实施方案138至140中任一项所述的方法，其中所述第一插入物被设计成在插入后约2至约3个月内在所述泪小管中崩解。
142.如实施方案134至141中任一项所述的方法，其中所述第一插入物留在所述泪小管中直至完全崩解。
143.如实施方案134至142中任一项所述的方法，其中第二插入物是在至少2个月后，在不预先去除所述第一插入物情况下插入。
144.如实施方案134至142中任一项所述的方法，其中所述第一插入物是在完全崩解之前去除并且将第二插入物插入以替换去除的第一插入物。
145.如实施方案134至142中任一项所述的方法，其中所述第一插入物被设计成在插入后约2至约3个月内在所述泪小管中崩解，并且其中所述第一插入物是在插入后2个月内去除。
146.如实施方案134至145中任一项所述的方法，其中在至少2个月的治疗期内一次施用每只眼的剂量为约300μg至约400μg的所述环孢菌素。
147.如实施方案134至146中任一项所述的方法，其中所述眼部疾病是泪膜和眼表的病症。
148.如实施方案134至146中任一项所述的方法，其中所述眼部疾病是干眼病。
149.如实施方案134至146中任一项所述的方法，其中所述眼部疾病与一种或多种选自由以下组成的组的疾患相关：烧灼感、搔痒、发红、刺痛、疼痛、异物感、视觉障碍、泪腺炎症、眼表炎症、T细胞介导的炎症、泪液中存在结膜T细胞和泪液中炎性细胞因子水平升高。
150.如实施方案134至149中任一项所述的方法，其中如通过Schirmer泪液测试所测量，所述治疗有效改善在所述插入物插入之前Schirmer评分小于10mm的受试者的泪液产生。
151.如实施方案134至150中任一项所述的方法，其中如通过一种或多种选自由以下组成的组的评定所测定，所述治疗有效减少眼干症状：在视觉模拟量表上对眼干症状的严重程度进行评级；在视觉模拟量表上对眼干症状的频率进行评级；泪膜破裂时间的测定；角膜荧光素染色；结膜丽丝胺绿染色；最佳矫正视敏度；眼表疾病指数的测定；和标准患者眼干评估。
152.如实施方案134至151中任一项所述的方法，其中在所述治疗期内一次施用每只眼的剂量包含在一个插入物中。
153.如实施方案134至151中任一项所述的方法，其中在所述治疗期内一次施用每只眼的剂量包含在两个插入物中。
154.如实施方案134至153中任一项所述的方法，其中所述插入物被插入下泪小管中。
155.如实施方案134至154中任一项所述的方法，其中所述治疗期是至少1个月、至少2个月或至少3个月。
156.一种治疗有需要受试者的干眼病的方法，所述方法包括将包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物插入受试者的泪小管中，其中眼中泪点闭塞和环孢菌素释放提供协同作用。
157.如实施方案156所述的方法，其中所述协同作用在于当与施用设计成提供相同的环孢菌素日释放量的含有环孢菌素的滴眼液相比较时，所述环孢菌素具有较高的生物利用度。
158.如实施方案157所述的方法，其中所述较高的生物利用度是由随时间以环孢菌素泪液浓度计算的释放至所述泪液中的环孢菌素的量测定。
159.一种制造根据实施方案1至133中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备含有水凝胶前体的前体混合物和分散于所述前体混合物中的环孢菌素颗粒，
b)使所述前体混合物成形，并使所述水凝胶前体交联形成聚合物网络并获得包含所述聚合物网络的成形水凝胶混合物，以及
c)干燥所述水凝胶混合物以提供所述插入物。
160.如实施方案159所述的方法，其中所述环孢菌素颗粒是均匀分散于所述前体混合物中的微粉化颗粒。
161.如实施方案159或160所述的方法，其中在步骤a)中，所述前体混合物是通过在微粉化环孢菌素颗粒存在下在缓冲水溶液中混合含亲电子基团的多臂聚合物前体与含亲核基团的交联剂来制备。
162.如实施方案161所述的方法，其中在步骤a)中，所述含亲电子基团的多臂聚合物前体是提供于缓冲水性前体溶液中并且所述含亲核基团的交联剂是提供于包含所述微粉化环孢菌素颗粒的缓冲水性前体悬浮液中。
163.如实施方案161或162所述的方法，其中在步骤a)中，所述缓冲水性前体溶液是通过将所述多臂聚合物前体溶解于水性缓冲溶液中来制备，并且然后在60分钟内，将其与包含所述含亲核基团的交联剂和所述微粉化环孢菌素颗粒的缓冲水性前体悬浮液混合。
164.如实施方案159至163中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，在混合所述含有环孢菌素颗粒的前体混合物的组分之后，将其在真空下脱气。
165.如实施方案159至164中任一项所述的方法，所述方法包括使4a20kPEG-SAP与荧光素缀合的三赖氨酸以在约30:1至约50:1范围内的重量比反应。
166.如实施方案159至164中任一项所述的方法，所述方法包括使4a20kPEG-SG与荧光素缀合的三赖氨酸以在约30:1至约50:1范围内的重量比反应。
167.如实施方案159至166中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，使所述前体混合物成形由以下组成：在完全交联之前，将所述前体混合物填充至模具或管中以提供所述水凝胶混合物的所需最终形状并使所述水凝胶前体交联。
168.如实施方案159至167中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，将所述前体混合物填充至细直径管中以制备水凝胶混合物纤维。
169.如实施方案168所述的方法，其中所述管的内部具有圆形几何形状。
170.如实施方案169所述的方法，其中所述管的内部具有内径为约2.0mm的圆形几何形状。
171.如实施方案169所述的方法，其中所述管的内部具有非圆形几何形状。
172.如实施方案159至171中任一项所述的方法，其中所述方法还包括拉伸所述水凝胶混合物纤维。
173.如实施方案172所述的方法，其中所述拉伸是在干燥所述水凝胶混合物之前或之后执行。
174.如实施方案172或173所述的方法，其中所述纤维是以约1至约4.5的拉伸因子拉伸。
175.一种可通过如实施方案159至174中任一项所述的方法获得的持续释放可生物降解泪小管内插入物。
176.一种通过在纵向方向上拉伸水凝胶混合物纤维来赋予所述水凝胶混合物纤维以形状记忆的方法，所述水凝胶混合物纤维包含分散于水凝胶中的环孢菌素颗粒。
177.一种根据实施方案1至133中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物在制备用于根据实施方案134至158中任一项治疗有需要受试者的眼部疾病的药剂中的用途。
178.根据实施方案1至133中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其用于根据实施方案134至158中任一项治疗有需要受试者的眼部疾病。
179.一种增加在插入泪小管内插入物之前Schirmer评分小于10mm的受试者的泪液产生的方法，所述泪液产生是通过Schirmer泪液测试测量，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案1至133中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物。
180.如实施方案179所述的方法，其中所述Schirmer评分在插入后6周增加至少2mm。
181.如实施方案180所述的方法，其中所述Schirmer评分在插入后12周增加至少3mm。
182.一种减少眼干症状的方法，所述眼干症状的减少是通过一种或多种选自由以下组成的组的评定测定：在视觉模拟量表上对眼干症状的严重程度进行评级；在视觉模拟量表上对眼干症状的频率进行评级；泪膜破裂时间的测定；角膜荧光素染色；结膜丽丝胺绿染色；最佳矫正视敏度；眼表疾病指数OSDI的测定；和标准患者眼干评估SPEED，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案1至133中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物。
183.如权利要求182所述的方法，其中总角膜荧光素染色值tCFS在插入后6周减小至少1.5。
184.如权利要求183所述的方法，其中所述总角膜荧光素染色值tCFS在插入后12周减小至少3。
185.如权利要求182至184中任一项所述的方法，其中所述在视觉模拟量表上对眼干症状的严重程度的评级在插入后2周降低至少10。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述在视觉模拟量表上对眼干症状的严重程度的评级在插入后6周降低至少15。
Claims (50)
1.一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素是呈颗粒形式并且其中所述环孢菌素颗粒分散于所述水凝胶内。
2.如权利要求1所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素颗粒具有小于约50μm的d50值。
3.如权利要求2所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述环孢菌素颗粒具有在3至17μm范围内，优选在4至12μm范围内并且更优选在5至8μm范围内的d50值。
4.如权利要求1至3中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述水凝胶包含聚合物网络，其中优选所述聚合物网络包含相同或不同的交联聚合物单元，并且所述交联聚合物单元更优选为一个或多个交联聚乙二醇单元。
5.如权利要求4所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络包含平均分子量范围为约2,000至约100,000道尔顿，优选为约10,000至约60,000道尔顿并且更优选为约20,000至约40,000道尔顿的聚乙二醇单元。
6.如权利要求4或5所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络包含一个或多个交联多臂聚合物单元，其中优选所述多臂聚合物单元包含一个或多个2臂至10臂聚乙二醇单元，更优选包含一个或多个4臂至8臂聚乙二醇单元并且最优选包含一个4臂聚乙二醇单元。
7.如权利要求6所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述4臂聚乙二醇单元的四个臂连接至核心季戊四醇分子。
8.如权利要求6或7所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络是通过使含亲电子基团的多臂聚合物前体与含亲核基团的交联剂反应来形成。
9.如权利要求8所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述亲电子基团是活性酯基团，并且更优选为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基团，并且更优选选自由以下组成的组：琥珀酰亚胺丙二酸酯基团、琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)基团、琥珀酰亚胺马来酸酯基团、琥珀酰亚胺富马酸酯基团、琥珀酰亚胺戊二酸酯(SG)基团、琥珀酰亚胺己二酸酯(SAP)基团、琥珀酰亚胺庚二酸酯基团、琥珀酰亚胺辛二酸酯基团和琥珀酰亚胺壬二酸酯(SAZ)基团。
10.如权利要求8或9所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是胺，优选是包含两个或更多个脂族伯胺基团的分子量低于1,000Da的小分子胺，更优选是选自由以下组成的组的小分子胺：二赖氨酸、三赖氨酸、四赖氨酸、乙二胺、1,3-二氨基丙烷、1,3-二氨基丙烷、二亚乙基三胺和三甲基六亚甲基二胺，甚至更优选是三赖氨酸并且最优选是乙酸三赖氨酸。
11.如权利要求10所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述含亲核基团的交联剂是经标记的三赖氨酸，优选用显色剂标记，更优选用选自由以下组成的组的显色剂标记：荧光团如荧光素、罗丹明、香豆素和花青，并且甚至更优选是荧光素缀合的三赖氨酸，并且最优选是通过使乙酸三赖氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-荧光素反应获得的荧光素缀合的三赖氨酸。
12.如权利要求6至11中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述多臂聚合物单元包含4a20kPEG单元并且所述交联单元包含荧光素缀合的三赖氨酸酰胺单元。
13.如权利要求4至12中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述聚合物网络是通过使4a20kPEG-SG或4a20kPEG-SAP与荧光素缀合的三赖氨酸以在约1:2至约2:1范围内的摩尔比，优选以约1:1的摩尔比反应而获得。
14.如权利要求1至13中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计约15重量％至约80重量％的所述环孢菌素和以所述插入物的总重量计约20重量％至约60重量％的聚合物单元，优选含有以所述插入物的总重量计30重量％至65重量％的所述环孢菌素和以所述插入物的总重量计25重量％至50重量％的聚合物单元，并且更优选含有以所述插入物的总重量计45重量％至55重量％的所述环孢菌素和以所述插入物的总重量计37重量％至47重量％的聚合物单元。
15.一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计约40重量％至约80重量％的所述环孢菌素。
16.如权利要求1至15中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计45重量％至55重量％的所述环孢菌素。
17.如权利要求1至16中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有表面活性剂。
18.一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有表面活性剂。
19.如权利要求17或18所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在干燥状态下含有以所述插入物的总重量计约0.01重量％至约5重量％、优选0.2重量％至2重量％的表面活性剂。
20.如权利要求17至19中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物含有非离子型表面活性剂，优选包含聚(乙二醇)链的非离子型表面活性剂，其中所述表面活性剂更优选选自由以下组成的组：聚(乙二醇)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、蓖麻油的聚(乙二醇)酯和乙氧基化4-叔辛基苯酚/甲醛缩聚物，并且甚至更优选选自由以下组成的组：聚(乙二醇)-20-脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚(乙二醇)-80-脱水山梨糖醇单月桂酸酯、蓖麻油的聚(乙二醇)-35酯和乙氧基化4-叔辛基苯酚/甲醛缩聚物，并且最优选是乙氧基化4-叔辛基苯酚/甲醛缩聚物。
21.如权利要求1至20中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少3个月、优选至少6个月并且更优选至少12个月后通过HPLC所测量，所述环孢菌素的含量为约300至约410μg或约90重量％至约110重量％。
22.如权利要求1至21中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少3个月、优选至少6个月并且更优选至少12个月后通过HPLC所测量，杂质的量不超过3.0％。
23.如权利要求1至22中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物呈纤维形式，其中所述纤维优选具有约1.5mm至约4.0mm的平均长度和在其干燥状态下不超过0.8mm的平均直径，更优选具有2.0mm至2.5mm的平均长度和在其干燥状态下不超过0.62mm的平均直径，并且甚至更优选具有2.5mm至2.9mm的平均长度和在其干燥状态下不超过0.62mm的平均直径。
24.如权利要求1至23中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在2至8℃的温度下储存至少3个月、优选至少6个月并且更优选至少12个月后，所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
25.如权利要求1至24中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物是呈在37℃下在体外于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中水合10分钟后在膨胀状态下平均直径为至少1.0mm或在水合24小时后在平衡状态下平均直径为至少1.3mm的纤维形式。
26.如权利要求1至25中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述插入物在插入后约1至约6个月内、优选在2至4个月内、更优选在2至3个月内或在3至4个月内在所述泪小管中崩解。
27.如权利要求1至26中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在插入至所述泪小管后，所述插入物在插入后经至少约1个月、优选至少2个月并且更优选至少3个月的时段释放治疗有效量的环孢菌素。
28.如权利要求1至27中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在所述插入物插入至人类受试者后，环孢菌素是以每天约0.1μg至每天约10μg的平均速率，优选以每天1μg至每天5μg的平均速率并且更优选以每天2μg至每天4μg的平均速率从所述插入物释放。
29.如权利要求1至28中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在插入至人类受试者后，环孢菌素的泪液浓度在约0.1μg/mL至约10μg/mL范围内，并且优选在约1μg/mL至约5μg/mL范围内。
30.如权利要求1至29中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中在所述插入物中所包含的所述环孢菌素颗粒完全溶解之前，所述插入物在所述泪小管中崩解。
31.如权利要求1至30中任一项所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述纤维在干燥之前或之后已经拉伸，并且优选在干燥之前已经拉伸。
32.一种包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物呈纤维形式，其中所述纤维已经拉伸。
33.如权利要求31或32所述的持续释放可生物降解泪小管内插入物，其中所述纤维已在纵向上以约1.0至约4.0、优选约1.5至约3.0、更优选约2.7的拉伸因子拉伸。
34.一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含：
包含聚合物网络的水凝胶，所述聚合物网络是通过使4a20kPEG-SG与荧光素缀合的三赖氨酸以约1:1的摩尔比反应获得，
和约360μg的量的环孢菌素，
所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
35.一种持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物包含：
包含聚合物网络的水凝胶，所述聚合物网络是通过使4a20kPEG-SAP与荧光素缀合的三赖氨酸以约1:1的摩尔比反应获得，
和约360μg的量的环孢菌素，
所述插入物呈平均长度为约2.5mm至约2.9mm并且在其干燥状态下平均直径不超过0.62mm的纤维形式。
36.一种治疗或预防有需要的人类受试者的眼部疾病的方法，所述方法包括将第一个根据权利要求1至35中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物插入所述人类受试者的泪小管中。
37.如权利要求36所述的方法，其中
所述第一插入物留在所述泪小管中直至完全崩解和/或
所述第一插入物被设计成在插入后约3至约4个月内在所述泪小管中崩解。
38.一种治疗受试者的干眼病的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将第一可生物降解插入物插入所述受试者的第一只眼的第一泪小管中，其中所述插入物包含：
(1)水凝胶；
(2)约100μg至约800μg分散于所述水凝胶中的环孢菌素；
(3)其中所述环孢菌素从所述第一插入物插入所述受试者之日起经至少约2个月时段以每天约0.1μg至每天约10μg的平均速率从所述插入物释放；以及
(b)自插入所述第一插入物之日起至少约2个月后，将第二插入物插入所述受试者的所述第一只眼的所述第一泪小管中，其中所述第二插入物与所述第一插入物基本上类似。
39.如权利要求38所述的方法，其中
所述第一插入物是在完全崩解之前去除并且优选将第二插入物插入以替换去除的第一插入物，和/或
所述第一插入物被设计成在插入后约2至约3个月内在所述泪小管中崩解，和/或
所述第一插入物留在所述泪小管中直至完全崩解。
40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，其中第二插入物是在至少2个月之后，在没有预先去除所述第一插入物的情况下插入，或其中所述第一插入物是在完全崩解之前去除并且将第二插入物插入以替换去除的第一插入物，其中优选所述第一插入物被设计成在插入后约2至约3个月内在所述泪小管中崩解并且所述第一插入物是在插入后2个月内去除。
41.如权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述眼部疾病是泪膜和眼表的病症，优选是干眼病，其中更优选所述眼部疾病与一种或多种选自由以下组成的组的疾患相关：灼烧感、搔痒、发红、刺痛、疼痛、异物感、视觉障碍、泪腺炎症、眼表炎症、T细胞介导的炎症、泪液中存在结膜T细胞和泪液中炎性细胞因子水平升高。
42.如权利要求36至41中任一项所述的方法，其中如通过Schirmer泪液测试所测量，所述治疗有效改善在所述插入物插入之前Schirmer评分小于10mm的受试者中的泪液产生，并且其中优选所述Schirmer评分在插入后6周增加至少2mm和/或在插入后12周增加至少3mm，和/或
其中如通过一种或多种选自由以下组成的组的评定所测定，所述治疗有效减少眼干症状：在视觉模拟量表上对眼干症状的严重程度进行评级；在视觉模拟量表上对眼干症状的频率进行评级；泪膜破裂时间的测定；角膜荧光素染色；结膜丽丝胺绿染色；最佳矫正视敏度；眼表疾病指数的测定；和标准患者眼干评估，其中优选总角膜荧光素染色值tCFS在插入后6周减小至少1.5和/或在插入后12周减小至少3，并且其中优选所述在视觉模拟量表上对眼干症状的严重程度的评级在插入后2周降低至少10和/或在插入后6周降低至少15。
43.如权利要求36至42中任一项所述的方法，其中治疗期为至少1个月、至少2个月或至少3个月。
44.一种制造根据权利要求1至35中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备含有水凝胶前体的前体混合物和分散于所述前体混合物中的环孢菌素颗粒，
b)使所述前体混合物成形，并使所述水凝胶前体交联形成聚合物网络并获得包含所述聚合物网络的成形水凝胶混合物，以及
c)干燥所述水凝胶混合物以提供所述插入物。
45.如权利要求44所述的方法，其中在步骤a)中，所述前体混合物是通过在微粉化环孢菌素颗粒存在下在缓冲水溶液中混合含亲电子基团的多臂聚合物前体与含亲核基团的交联剂来制备，其中优选所述含亲电子基团的多臂聚合物前体是提供于缓冲水性前体溶液中并且所述含亲核基团的交联剂是提供于包含所述微粉化环孢菌素颗粒的缓冲水性前体悬浮液中。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中在步骤a)中，在混合含有环孢菌素颗粒的所述前体混合物的组分之后，将其在真空下脱气。
47.如权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述方法还包括拉伸水凝胶混合物纤维，并且所述拉伸是在干燥所述水凝胶混合物之前或之后执行，其中优选所述纤维是以约1至约4.5的拉伸因子拉伸。
48.一种通过在纵向方向上拉伸水凝胶混合物纤维来赋予所述水凝胶混合物纤维以形状记忆的方法，所述水凝胶混合物纤维包含分散于水凝胶中的环孢菌素颗粒。
49.一种根据权利要求1至35中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物在制备用于根据权利要求36至43中任一项治疗有需要的人类受试者的眼部疾病的药剂中的用途。
50.根据权利要求1至35中任一项所述的包含水凝胶和环孢菌素的持续释放可生物降解泪小管内插入物，所述插入物用于根据权利要求36至43中任一项治疗有需要的人类受试者的眼部疾病。
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