CN116183786A - 一种用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法 - Google Patents

一种用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法，以具有典型糯米香韵特色的烤烟烟叶为研究试材，首先通过感官导向的GCO技术定位到烟叶中糯米香关键气味组分，通过色谱信息和气味信息对其初步定性的基础上，利用多维色谱‑高分辨质谱分析可能目标物标准品，获取该靶向目标化合物的高准确度、高分辨质谱图，依据标准品一维和二维出峰时间、高分辨特征离子有无及特征离子丰度比等信息，成功在烟叶中检出糯米香特征成分信号响应，并将该痕量、高效的糯米香特征组分准确鉴定为2‑乙酰基‑1‑吡咯啉。糯米香特征关键未知组分的定性解决了“因缺少明确靶向分子，很难实现烟草‘糯米香’香气特征品质客观评价和精准调控”的技术难题。

Description

一种用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法
技术领域
本申请涉及烟草香气分析鉴定领域，具体涉及一种采用GCO技术以及多维色谱-高分辨质谱联用技术鉴定烟草中痕量、具有糯米香特征的关键香气组分的方法。
背景技术
烟草作为一种吸食性叶用经济作物，香气是衡量其吸食品质和可用性的重要因素，因此香气质量是烟叶质量的核心内容。我国烟叶的香气质量与国外的差距主要表现在香气量不足，浓度不够等方面。另外，随着低焦油卷烟产品市场的逐渐增加，降焦保香成为卷烟生产的追求和目标。因此，生产高香气特色烟叶作为中式卷烟的核心原料成了弥补卷烟降焦后香气不足的关键。解析烟叶风格物质基础，挖掘高香气质量烟叶材料的化学评价指标是助力育种工作者精准高效地筛选优质调香烤烟品种资源的重要途径。
烟草香气，主要指烟草直接散发或燃烧时产生的令人愉快的气味，它是决定烟叶吸食品质优劣的重要因素，香气品质是衡量卷烟质量品质最关键的指标之一，而香韵作为香气的重要特征，赋予了卷烟很高的感官价值。多年来研究人员对卷烟的香韵进行了大量研究，已发现了奶酪香、果香、坚果香、爆米花香、干草香、玫瑰香、泥土香、焦糖香、木香、花香、松针香、烤香、薄荷香、面包香、药草香、香兰素样甜香等丰富的香韵，近年来，烤烟中一种名为“糯米香”的独特香韵越来越受到广大消费者的青睐。但目前尚无研究清楚地指出烤烟中“糯米香”这一香韵的重要特征物质及其在烤烟中的生成、转化机理，因此，糯米香香韵物质基础不明成为了限制烤烟糯米香香韵品质客观准确评价方法开发和糯米香韵品质精准调控的技术瓶颈。
燃吸过程中烟叶原有香气成分的物理挥发迁移和烟叶中非挥发性前体物质的热化学转化是塑造主流烟气风格类型和香韵特色的重要途径。前者是卷烟加香实践的重要理论遵循，相比非挥发物的化学转化，烟叶所具有的天然香味物质对烟气香型风格类型塑造的作用更可知可控，更直接有效，因此，众多烟叶挥发物中关键香气物质构成的解析研究对于指导高香气烟叶品种培育和烟草产品风格校正实践均有重要的理论指导和数据支撑作用。
现有烟叶香气的相关研究多为基于GC-MS分析的烟叶中挥发物质定性定量分析，且报道中的致香物质清单多划分为叶绿素降解物、类胡萝卜素降解物、西柏烷降解物、苯丙氨酸降解物、美拉德反应产物五大类。这些化合物的选取，是基于它们确实是存在于烟叶中的挥发性组分，且在特定提取条件下其含量高于仪器检测限。然而，所有这些被列为“致香物质”的挥发性化合物是否均具有香气贡献，需要进一步验证。另外，烤烟为天然复杂基质的典型代表，很多关键香气组分往往是低阈值的痕量和超痕量组分，因此，在烟叶中存在普通分离检测手段能够检出的常量关键香气组分外，是否存在被其他不具有香气贡献掩盖常规检测手段中未被检出却非常关键的香气组分？该问题也需要进一步证实和解答。痕量关键香气物质未得以充分挖掘可能是很多基于目前已知烟叶挥发性致香物质清单开展不同香型烟叶风格差异物质基础研究未能得出明确差异标志物的关键原因。因此，亟需基于感官导向的现代分子感官科学技术和多维色谱-高分辨技术对复杂烤烟基质中的关键糯米香特征组分进行筛选鉴定。
发明内容
本申请的发明目的是：以经过专业卷烟感官质量评吸委员会鉴定过的具有典型糯米香韵特色的烤烟烟叶为研究试材，以解析烤烟糯米香特征的关键物质基础为目标，再利用感官组学结合色谱技术获取定位筛选到具有典型糯米香特征气味区域，但该关键香气组分非常痕量，通过常规GC-MS分析无法获取其质谱信息，依据气味信息和色谱信息只能对其进行初步定性，难以对其精确定性的情况下，进一步利用多维色谱-高分辨质谱技术，首先通过分析标准品获取该靶向目标化合物的高准确度、高分辨质谱图，通过高分辨提取离子色谱图，依据标准品一维和二维出峰时间、高分辨特征离子有无及特征离子丰度比等信息，成功在烟叶中检出糯米香特征成分信号响应，并将该痕量、高效的糯米香特征组分准确鉴定为2-乙酰基-1-吡咯啉。糯米香特征关键未知组分的定性解决了“因缺少明确靶向分子，很难实现烟草‘糯米香’特征香气品质客观评价和精准调控”的技术难题。
为实现上述发明目的，解决上述技术问题，本发明提供一种用于烟草中糯米香特征痕量香气化合物的鉴定方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
以具有典型糯米香韵特色的烤烟为原料，烟叶样品去除主脉后，剪成细片状，置于烘箱中30℃下进行干燥处理，直至可用手指捻碎，研磨后过40目筛，进行挥发性物质的顶空固相微萃取(HS-SPME-arrow)提取，利用能够提供挥发物气味属性、气味强度信息和质谱信息的气相色谱-嗅觉检测技术-质谱联用技术(GC-O-MS)，结合至少两根极性不同的色谱柱，对HS-SPME-arrow提取到的烟叶中的挥发性混合物中的糯米香特征香气贡献组分进行筛选定位，同时获取糯米香特征香气化合物的气味强度、检测频率、稀释因子和线性保留指数等色谱信息。糯米香特征香气化合物的定性可分两种情况：1)对于在GC-MS上有质谱信号响应的常量糯米香贡献组分，通过比对该组分在DB5和DBWAX上的保留指数，气味属性、质谱信息和数据库以及标准品的响应信息对其进行准确定性；2)对于在GC-MS没有质谱信号响应的痕量糯米香贡献组分，通过比对数据库中该组分的双柱保留指数和气味属性信息，对其进行初步定性，购买标准品，然后将样品和标准品分别进行全二维气相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(GC*GC-QTOF)分析，通过比对标准品和样品中目标物的一维和二维出峰时间(1DRt和2D Rt)、高分辨质谱图信息小数点后4位，即样品中目标物精确质量数的特征离子的有无、精确度以及高分辨特征离子碎片的相对丰度等信息对痕量糯米香特征香气组分进行精确定性。本研究案例中检出的糯米香特征组分为上述第2)类情况，通过上述技术方法，最终将烤烟中痕量糯米香特征组分精确鉴定为2-乙酰基-1-吡咯啉。
进一步的，所述烤烟样品为已经过专业卷烟感官质量评吸委员会鉴定过的具有典型糯米香韵特色的烤烟烟叶。
进一步的，所述HS-SPME-arrow提取方法为：准确称取烟末0.5g，置于20mL配有聚四氟乙烯垫密封盖的顶空瓶中，密封后置于40℃的固相微萃取加热台上平衡30min；将老化后的萃取头插入顶空瓶中，顶空采样30min后立即插入气相色谱仪进样口，在250℃下解吸10min。
进一步的，所述GCO筛选方法为：选2名有经验的嗅闻人员，每个嗅闻人员重复嗅闻样品4次，记录气味物质出现的时间、气味强度、和气味属性。当且仅当在同一时间被两名嗅闻人员同时检测到的组分被认定为烟叶中的香气贡献组分。随后，通过梯度改变进样口分流比的方式，对挥发物混合物进行稀释嗅闻分析(AEDA)，将气味组能被嗅闻到的样品最大稀释倍数定义为该气味组分的稀释因子，气相色谱条件设置为：进样口温度240℃，DB5和DBWAX色谱柱的柱升温程序分别为：40℃(2min)-6℃/min-280℃(10min)和40℃(2min)-6℃/min-240℃(10min)，DB5和DBWAX色谱柱到嗅闻口传输线温度分别设为280℃和240℃。
更进一步的，所述GC-MS质谱参数为：EI源，轰击能量70eV，全扫描，扫描质量范围33-325amu，DB5和DBWAX色谱柱的气质接口温度分别为280℃和240℃，离子源温度：230℃，四级杆温度150℃。
更进一步的，所述GC*GC-QTOF色谱条件为：正向色谱柱系统1D-DB5,2D-DB-17H，进样口温度250℃，柱流速1.0mL/min,柱升温程序：60℃(2min)-6℃/min-270℃(10min)；热喷口(辅助加热区1)的升温程序:250℃-10℃/min-380℃，气质传输线(辅助加热区2)温度为270℃，N2碰撞气流量2.25mL/min；质谱参数：扫描模式：MS，扫描质量范围33-325amu，离子源温度280℃，轰击能量70eV，发射电流35μA。
本发明的有益效果：
1、在感官组学核心技术GCO的指导下，结合富集能力较强且具有保真性的顶空固相微萃取(HS-SPME-arrow)提取技术，筛选出了烟末样品中具有真正香气贡献的组分，克服了烤烟样品中挥发物提取方法SDE假组分的产生，突破了传统烤烟致香物质分析中“以量定效”筛选方法的不准确性，在具有较高香气贡献的化合物中，筛选到具有较高气味强度和稀释倍数但在GC-MS分析中没有信号响应的痕量高贡献度的糯米香特征未知化合物，结合该未知物的气味信息及其不同极性色谱柱上的色谱信息保留指数，初步将其定性为2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)。
2、进一步采用多维色谱-高分辨质谱技术，获取了一张2AP标准品的高精确度的高分辨质谱图，并成功在样品总离子流图(TIC)中无明显2AP信号响应的情况下，通过高分辨提取离子色谱图(HRSIC),在样品中定位到了2AP，通过比对样品与标品的一维和二维出峰时间、特征离子精确质量数、特征离子丰富比等信息，最终对样品中2AP的存在进行了确证。
3、烟草是复杂基质的典型代表，本申请提供了一种用于筛选并鉴定复杂基质中痕量/超痕量关键香气的方法流程(图5)，该流程同样可以借鉴到其他天然食品及芳香植物基质中高效痕量未知香气和挥发性异味物质的鉴定。
4、本申请具有糯米香味的痕量关键物质的准确鉴定，进一步丰富了烟草风味化学理论体系，对于进一步深入研究烟叶生长中2AP的代谢生物合成途径或烘烤过程中的转化累积途径，以及育种学家开展糯米香特色特征更加彰显的烟草新品种具有重要的数据指导和技术支撑。
附图说明
图1：不同极性色谱柱上(DB5和DBWAX)正构烷烃(A和B)和样品挥发物的GC-MS总离子流图和目标物提取离子色谱图(C和D)
图2：2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)标准品的GC*GC-QTOF/MS总离子流图(A)、特征离子(83和111)精确质量数提取色谱图(B和C)及高分辨质谱图(D)
图3：烤烟烟末挥发物的GC*GC-QTOF/MS的总离子流图(A)和2-乙酰基-1-吡咯啉的高分辨特征离子提取色谱图(B、C、D)
图4：样品中2-乙酰基-1-吡咯啉目标出峰时间的高分辨质谱图(A)及2-乙酰基-1-吡咯啉标准质谱图(B)
图5：烤烟中痕量关键香气成分筛选鉴定技术流程图
具体实施方式
在下文中更详细地描述了本发明以有助于对本发明的理解。
以经过专业卷烟感官质量评吸委员会鉴定过的具有典型糯米香韵特色的烤烟烟叶为研究试材，烟叶样品去除主脉后，剪成细片状，置于烘箱中30℃下干燥直至可用手指捻碎，研磨后过425μm(40目)筛，进行挥发物质的HS-SPME-arrow提取，对SPME-arrow提取出的烟叶中的挥发性混合物中的香气贡献组分进行GCO筛选，进行GC-MS鉴定分析，在GC-MS上有质谱信号响应的气味贡献组分，通过比对该组分在DB5和DBWAX上的保留指数，气味属性、质谱信息和数据库以及标准品的响应信息进行准确定性；对于在GC-MS没有质谱信号响应的气味组分，通过比对数据库中该组分双柱保留指数和气味属性信息，进行初步定性，购买标准品，然后将样品和标准品分别进行GC*GC-QTOF/MS分析，通过比对标准品和样品中目标物的一维和二维出峰时间、以及特征离子随便的精确质量质谱图进行精确定性为2-乙酰基-1-吡咯啉(CAS号：85213-22-5)。
所述HS-SPME-arrow提取方法为：准确称取烟末0.5g，置于20mL配有聚四氟乙烯垫密封盖的顶空瓶中，密封后置于40℃的固相微萃取加热台上平衡30min；将老化后的萃取头插入顶空瓶中，顶空采样30min后立即插入气相色谱仪进样口，在250℃下解吸10min。
所述GCO筛选方法为：选2名有经验的嗅闻人员，每个嗅闻人员重复嗅闻样品4次，记录气味物质出现的时间、气味强度、和气味属性。当且仅当在同一时间被两名嗅闻人员同时检测到的组分被认定为烟叶中的香气贡献组分。随后，通过梯度改变进样口分流比的方式，对挥发物混合物进行稀释嗅闻分析(AEDA)，将气味组能被嗅闻到的样品最大稀释倍数定义为该气味组分的稀释因子，气相色谱条件设置为：进样口温度240℃，DB5和DBWAX色谱柱的柱升温程序分别为：40℃(2min)-6℃/min-280℃(10min)和40℃(2min)-6℃/min-240℃(10min)，DB5和DBWAX色谱柱到嗅闻口传输线温度分别设为280℃和240℃。
所述GC-MS质谱参数为：EI源，轰击能量70eV，全扫描，扫描质量范围33-325amu，DB5和DBWAX色谱柱的气质接口温度分别为280℃和240℃，离子源温度：230℃，四级杆温度150℃。
所述GC*GC-QTOF/MS色谱条件为：正向色谱柱系统1D-DB5,2D-DB-17H，进样口温度250℃，柱流速1.0mL/min,柱升温程序：60℃(2min)-6℃/min-270℃(10min)；热喷口(辅助加热区1)的升温程序:250℃-10℃/min-380℃，气质传输线(辅助加热区2)温度为270℃，N2碰撞气流量2.25mL/min；质谱参数：扫描模式：MS，扫描质量范围33-325amu，离子源温度280℃，轰击能量70eV，发射电流35μA。
基于GC-O分析的烤烟烟叶香气贡献组分构成结果如下：基于GC-O筛选和GC-MS定性，最终从烤烟样品中共检出70个香气贡献组分，其中64个组分根据保留指数、气味属性、质谱信息被准确定性，6个组分因在GC-MS中没有仪器信号，无法得以准确定性。这些物质化学种类构成丰富，包括脂肪醇、脂肪醛、脂肪酯、脂肪酮、脂肪酸、芳香族化合物、呋喃酮、糠醛、吡咯等含氮、含氧杂环化合物、含硫化合物、萜烯类化合物及其氧化物、内酯类化合物等共10大类。这些香气化合物的气味构成丰富，包括果甜香、焦甜香、坚果香、金属味、脂肪味、木香、花香、烟草香、烘焙香、酸香、柑橘香、奶甜香等等。依据香气强度≥2.5,检测频率(DF)≥6，稀释因子(FD)≥27，共筛选出31种关键香气化合物(表1)，包括苯乙醇、二氢猕猴桃内酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香叶基丙酮、苯甲醛、2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、1-戊烯-3-酮、反式-β-紫罗兰酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛、茄酮、壬醛、巨豆三烯酮-3、β-大马士酮、β-5,6-环氧-紫罗兰酮、巨豆三烯酮-2、4-氧代异佛尔酮等以及四种重要未知香气化合物——未知物1(大米香味)、未知物2(陈旧、樟脑味)、未知物3(蘑菇味)和未知物4(金属味)。其中具有典型大米香味的未知物1在所有检出的香气物质中具有最高的稀释因子、最高的检测频率和最高的气味强度，因此被认为是糯米香韵特色烤烟中极为重要的香气化合物，在DB5和DBWXA色谱柱上均被嗅闻到，但在两根极性不同的色谱柱的GC-MS总离子流图中，均无任何信号响应(图1A和B)，被定义为痕量高效香气化合物。依据正构烷烃(图1C和D)和该气味组分该气味组分的出峰时间计算出的保留指数(LRI-DB5＝923和LRI-DBWAX＝1331)以及气味属性，初步推断其为2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)，但是否是2AP，非常有必要采用其他手段，对其进行精确定性。
表1基于GC-O和GC-MS的烤烟中关键香气组分(部分)
Figure SMS_1
/>
Figure SMS_2
基于GC*GC-QTOF/MS对痕量高效未知物香气化合物1进行结构解析。基于LRI和气味属性的初步定性，购入2AP标准品(CAS号：85213-22-5)，通过GC*GC-QTOF/MS分析，通过谱库检索、特征离子提取获取了2AP在分析条件下的一维和二维保留时间(1D Rt和2D Rt)(图2A、B、C)，以及2AP标品的高分辨质谱图(图2D)，通过质谱检索，标准品与标准谱库中的2AP标准质谱图匹配度较高(正向及反向匹配度均高于85％)。在此基础上，对其碎片离子的分子式进行了推断，且实际碎片离子质量数和理论值的吻合度较高(<10ppm)(表2)，由此可见，我们获取的2AP的高分辨质谱图具有非常高的准确度。
表2 2-乙酰基-1-吡咯啉(2AP)标品及样品中目标物的高分辨质谱图特征离子质量精确度
Figure SMS_3
Figure SMS_4
然而，在样品GC*GC-QTOF/MS的总离子流图的2AP理论出峰时间处(DB5:13.90，DBWAX:17.41)并未观察到明显的信号响应(图3A)。我们通过提取2AP特征离子(83.0730和111.0679)，在高分辨提取离子色谱图中成功在2AP的理论出峰时间找到了2个目标离子(图3B和C)，且样品中的特征离子比例与标品的两离子的丰度比相吻合(表2)，同时，样品中SIC中2AP理论出峰时间质谱图中的其他特征离子，如43,68，82均与理论值接近(表2)。因此，高分辨特征离子的一维及二维出峰时间、特征离子质量数精确度、不同特征离子的丰富比(ratio 83to 111＝8.7)均与标品(ratio 83to 111＝9.2)吻合度非常高(图4)，因此可以确证烤烟样品中大米香味的痕量关键组分为2AP，该物质具有极低的香气阈值(水中阈值为0.05μg/L，空气中阈值为0.02μg/L)，因此ppb级的痕量浓度即可产生很强的糯米特征香气。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (6)

1.一种用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：以具有典型糯米香韵特色的烤烟为原料，烟叶样品去除主脉后，剪成细片状，置于烘箱中30℃下进行干燥处理，直至可用手指捻碎，研磨后过40目筛，利用顶空固相微萃取(HS-SPME-arrow)技术对挥发性物质进行无损提取，在此基础上，以感官为导向，利用能够提供挥发物气味属性、气味强度信息和质谱信息的气相色谱-嗅觉检测技术-质谱联用技术(GC-O-MS)，结合至少两根极性不同的色谱柱，对HS-SPME-arrow提取到的烟叶中的挥发性混合物中的糯米香特征香气贡献组分进行筛选定位，同时获取糯米香特征香气化合物的气味强度、检测频率、稀释因子和线性保留指数色谱信息；
1)对于在GC-MS上有质谱信号响应的常量糯米香贡献组分，通过比对该组分在DB5和DBWAX上的保留指数，气味属性、质谱信息和数据库以及标准品的响应信息对其进行准确定性；2)对于在GC-MS没有质谱信号响应的痕量糯米香贡献组分，通过比对数据库中该组分的双柱保留指数和气味属性信息，对其进行初步定性，购买标准品，然后将样品和标准品分别进行全二维气相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(GC*GC-QTOF)分析，通过比对标准品和样品中目标物的一维和二维出峰时间、高分辨质谱图信息小数点后4位，即样品中目标物精确质量数的特征离子的有无、精确度以及高分辨特征离子碎片的相对丰度等信息对痕量糯米香特征香气组分进行精确定性，最终将烤烟中痕量糯米香特征组分精确鉴定为2-乙酰基-1-吡咯啉。
2.如权利要求1所述的一种用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法，其特征在于，所述烤烟样品为已经过专业卷烟感官质量评吸委员会鉴定过的具有典型糯米香韵特色的烤烟烟叶。
3.如权利要求1所述的一种用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法，其特征在于，所述HS-SPME-arrow提取方法为：准确称取烟末0.5g，置于20mL配有聚四氟乙烯垫密封盖的顶空瓶中，密封后置于40℃的固相微萃取加热台上平衡30min；将老化后的萃取头插入顶空瓶中，顶空采样30min后立即插入气相色谱仪进样口，在250℃下解吸10min。
4.如权利要求1所述的一种用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法，其特征在于，所述GCO筛选方法为：选2名有经验的嗅闻人员，每个嗅闻人员重复嗅闻样品4次，记录气味物质出现的时间、气味强度、和气味属性。当且仅当在同一时间被两名嗅闻人员同时检测到的组分被认定为烟叶中的香气贡献组分。随后，通过梯度改变进样口分流比的方式，对挥发物混合物进行稀释嗅闻分析，将气味组能被嗅闻到的样品最大稀释倍数定义为该气味组分的稀释因子，气相色谱条件设置为：进样口温度240℃，DB5和DBWAX色谱柱的柱升温程序分别为：40℃保持2min-6℃/min-280℃，保持10min和40℃保持2min-6℃/min-240℃保持10min，DB5和DBWAX色谱柱到嗅闻口传输线温度分别设为280℃和240℃。
5.如权利要求1所述的一种用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法，其特征在于，所述GC-MS质谱参数为：EI源，轰击能量70eV，全扫描，扫描质量范围33-325amu，DB5和DBWAX色谱柱的气质接口温度分别为280℃和240℃，离子源温度：230℃，四级杆温度150℃。
6.如权利要求1所述的一种用于烟草中痕量糯米香特征关键香气化合物的鉴定方法，其特征在于，所述GC*GC-QTOF色谱条件为：正向色谱柱系统1D-DB5,2D-DB-17H，进样口温度250℃，柱流速1.0mL/min，柱升温程序：60℃保持2min-6℃/min-270℃，保持10min；热喷口即辅助加热区1的升温程序：250℃-10℃/min-380℃，气质传输线即辅助加热区2温度为270℃，N2碰撞气流量2.25mL/min；质谱参数：扫描模式：MS，扫描质量范围33-325amu，离子源温度280℃，轰击能量70eV，发射电流35μA。
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