CN110108817A - 一种基于gc-ms特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法 - Google Patents

一种基于gc-ms特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法 Download PDF

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曹鹏云
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Abstract

本发明提供一种基于GC‑MS特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法。该方法能够有效解决不稳定、易降解的活性挥发物的收集、鉴定及半定量检测问题，掌握植物有机挥发物分子时空动态信息，为研究植物有机挥发代谢物的变化、种类和机理提供理论基础，同时适合用于区分鉴别不同香韵突变体烤烟。因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种基于GC-MS特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分 析方法
技术领域
本发明属于烟草代谢组学分析技术领域，具体涉及一种基于GC-MS特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
烟草(Nicotiana tabacum L.)是世界上重要的经济作物，而香气是评价烟草的一个重要指标，在百分制的感官评吸中，6项指标中仅香气这一项就占了32分。我国的烟草品种普遍存在香气量不足、香气种类单一等问题。烟草香气受多种因素影响，包括品种，土壤、气候条件和烘烤工艺等，而烟草的品种在决定烟草代谢产物及其香气中起决定性作用，培育高香气烟草品种是改变我国烟叶原料香气质较差、香气量少的重要途径。目前，常见培育高香烟气烟草品种通常采用诱变育种和品质育种相结合的方法，如利用甲基磺酸乙酯(EMS)对常规烟草品种进行化学诱变，得到烟草突变体材料，并通过进一步的田间筛选、鉴定及烤后烟叶感官质量评价获得具有特征香韵的突变体材料。
诱变育种在改变烟草外在表现型的同时，其内在代谢机制也相应的发生了变化。代谢物是细胞调控的最终产物，代谢物种类和含量可认为是生物系统对基因或环境改变的最终响应。代谢物离生物的表现型或生理状态最近，更能够揭示基因、环境和表现型之间的关系。而代谢组学是研究生物体内源全部小分子代谢物成分及其动态变化的学科，利用代谢组学手段，研究不同香韵特征烟草代谢产物的差异，有利于揭示烟草品质和烟草代谢物质基础。近年来，基于GC-MS的烟草代谢谱分析方法逐渐建立与改进，并被应用于烟草抗性或品质相关的代谢组学研究中，目前关于植物挥发性物质代谢已经达到了在分子和生化水平的研究，很多代谢途径中相关通路的调控酶已经被克隆和进行功能表征。然而，发明人发现，目前基于GC-MS技术和代谢组学的相关方法对烟草生长时期挥发性代谢产物研究普遍存在如下问题：由于烟草挥发性代谢物具有易被氧化、降解和发生重排等特点，且受外界影响较大，而目前在植物挥发物原位采集中往往采用动态吸附方式，容易引起生物胁迫效应，无法反映烟草植株真实状态，从而导致代谢轮廓表征不准确。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种基于GC-MS特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法。该分析方法能够有效解决不稳定、易降解的活性挥发代谢物的收集、鉴定及半定量检测问题，掌握烟草挥发性代谢物分子时空动态信息，准确鉴别不同品系特别是不同香韵突变体烤烟的挥发性差异代谢标记物，从而为鉴别和研究不同品系特别是不同香韵突变体烤烟不同挥发性代谢物的变化、种类和机理以及为烟草突变体功能基因的挖掘、代谢途径及调控机制的研究提供理论基础，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供一种基于GC-MS特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法，所述分析方法包括：
S1、活体烟草挥发代谢物的固相微萃取：将待测烟叶倒扣至固相微萃取室中，进行顶空萃取；
其中，所述固相微萃取室可根据目标植物进行选择，本发明的一个具体实施方式中，所述固相微萃取室为经惰性化处理的带有SPME采样口的三角瓶；
所述经惰性化处理的带有SPME采样口的三角瓶制备方法为：
(1)配制含6％二甲基二氯硅烷的甲醇溶液(硅烷化试剂)；将玻璃器皿洗净(用重铬酸钾洗液浸泡清洗)、干燥；在通风橱内将硅烷化试剂倒入三角瓶内，使其充分接触三角瓶内表面并停留10sec以上，期间搅拌或震荡使硅烷化试剂与三角瓶反应更加完全和均匀；倒去硅烷化试剂，用甲醇洗去三角瓶表面的硅烷化试剂并将其自然晾干，然后100～110℃加热1～2h；
(2)三角瓶瓶底穿孔，底部配置聚四氟乙烯垫，并用带有螺纹的SPME进样口进行固定。
所述顶空萃取具体方法为：
田间选取现蕾期烟株上的2～3片顶芽或侧芽，调节固定三角瓶的支架高度，使目标叶片完全置于三角瓶内，且三角瓶内壁不挤压待测烟叶，静置5～10min后，将固相微萃取针插入位于三角瓶底部的SPME采样口，使采样针进入三角瓶内，推手柄杆使固相微萃取头伸出针管，固相微萃取头置于烟叶上部空间(萃取头不要碰触烟叶)，顶空方式萃取并保持30～50min(优选40min)。
优选的，固相微萃取头预先置于气相色谱仪的进样口在250℃老化15min。
优选的，SPME针选择使用50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，其对多种挥发性有机物有良好的检测能力。
优选的，所述三角瓶通过置于待测烟株旁的固定杆和固定架固定，从而减少三角瓶与待测烟株的接触，同时，本发明采用不塞口的三角瓶收集挥发性气体，通过静置一段时间后使得三角瓶内外气体达到平衡后进行采样避免改变植株正常生理环境条件，进一步避免产生生物胁迫效应。
本发明选用现蕾期烟株上的顶芽或侧芽进行检测，一方面是便于采样收集，另一方面是由于烟株在现蕾期挥发性气体值达到顶峰，且以顶芽和侧芽的香气最为显著。
S2、半定量分析：采用分流/不分流进样口的气相色谱-质谱联用仪，在全扫描模式下对烟株挥发性代谢物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果采用面积归一化法，对烟株挥发性代谢物含量进行半定量分析。
优选的，所述半定量分析包括：挥发性代谢物经GC-MS分析后，各色谱峰经NIST、W10N14.L标准普库检索，辅助保留指数对比和文献比对等人工解析，最终确定化合物；用峰面积百分比计算各烟叶挥发性代谢物的相对含量。
优选的，通过摸索试验条件，获得气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)，载气为高纯氦气，流速1mL/min。进样口温度250℃，采用不分流进样。柱温采用程序升温，从45℃开始保持2min，然后以5℃/min升至200℃，保持2min。最后以15℃/min升至300℃，保持5分钟。质谱条件：离子源为EI源，电离电压70eV，离子源温度230℃，传输线温度250℃，扫描范围33-500amu。
S3、数据处理和模式识别分析，获取挥发性代谢标志物：将待测组与对照组鉴别的代谢轮廓分析数据进行多元统计分析，获取差异挥发性代谢标志物，构成挥发性代谢标志物组；进一步进行代谢途径差异分析。
优选的，所述待测组为烟草香韵突变品系，进一步包括玫瑰香烟草品系，柠檬香烟草品系；所述对照组为中烟100。
优选的，所述代谢轮廓分析数据为烟叶挥发性代谢物的相对含量。
优选的，所述多元统计分析可采用主成分分析法、偏最小二乘判别分析。
优选的，将鉴别的挥发性成分进行主成分分析，采用非监督模式识别方法PCA来观察待测样品的自然聚集。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点和进步性：
(1)在传统的采集植物有机挥发性代谢物质时，采集样品时很难保证其器官活性，且前处理过程步骤多、时间长，目标分子容易降解、代谢，造成分析结果失真，而本方法可一步完成目标挥发物的采集和富集，是一种活体、原位、无损前处理技术，有助于掌握植物生长的真实情况；
(2)与用未经硅烷化处理的玻璃器具采样不同，经过硅烷化处理的玻璃器具，洁净，无挥发物释放，亦不会对挥发物进行吸附，对检测结果影响小；
(3)本方法在样品汽化过程中采用冷不分流模式，从低温开始设置梯度升温程序，促使吸附在萃取头上的代谢物在最低的进样口温度下解吸、汽化，从而使发生热裂解和分子结构重排的可能性降至最低，能最大程度的保证分析结果的准确性；
(4)本方法选取峰面积归一化法对目标代谢物进行半定量分析；同时，基于上述检测结果能够准确用于准确区分鉴别不同香韵突变体烤烟，进一步拓展其应用范围和领域。
综上，基于顶空-固相微萃取技术进行田间原位采集能真实地反映烟草植株挥发性物质的真实状态。基于GC-MS的代谢谱和多元数据分析相结合可作为鉴别不同品种、明确不同品种挥发性代谢物组成的有用工具，从而表征差异代谢标志物。本发明有助于从分子层面上揭示突变基因的功能及其与其他基因之间的相互作用关系，同时也可为烟草突变体功能基因的挖掘、代谢途径及调控机制的研究提供数据支持，具有较好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1的三角瓶图；其中，1-带有螺口的SPME采样口，2-三角瓶底部小孔，3-聚四氟密封硅橡胶垫，4-硅烷化处理的三角瓶瓶体。
图2为本发明实施例1采用三角瓶采样图；其中，1-带有螺口的SPME采样口，2-三角瓶底部小孔，3-聚四氟密封硅橡胶垫，4-硅烷化处理的三角瓶瓶体，5-三角瓶固定杆(固定杆下端插入待测植株一侧土中)，6-SPME针，7-固相微萃取纤维头，8-三角瓶固定架，9-植物叶片，10-待测植株。
图3为本发明实施例1不同香韵突变体烤烟的PCA统计结果图；其中图3(A)为PCA得分图，图3(B)为PCA载荷图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，目前基于GC-MS技术和代谢组学的相关方法对烟草生长时期挥发性代谢产物研究普遍存在如下问题：由于烟草挥发性代谢物具有易被氧化、降解和发生重排等特点，且受外界影响较大，而目前在植物挥发物原位采集中往往基于动态吸附原理，容易引起生物胁迫效应，无法反映烟草植株真实状态，从而导致代谢轮廓表征不准确。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种基于GC-MS特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法，所述分析方法包括：
S1、活体烟草挥发代谢物的固相微萃取：将待测烟叶倒扣至固相微萃取室中，进行顶空萃取；
S2、半定量分析：采用分流/不分流进样口的气相色谱-质谱联用仪，在全扫描模式下对烟株挥发性代谢物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果采用面积归一化法，对烟株挥发性代谢物含量进行半定量分析；
S3、数据处理和模式识别分析，获取挥发性代谢标志物：将待测组与对照组鉴别的代谢轮廓分析数据进行多元统计分析，获取差异挥发性代谢标志物，构成挥发性代谢标志物组；进一步进行代谢途径差异分析。
其中，所述固相微萃取室可根据目标植物进行选择，本发明的一个具体实施方式中，所述固相微萃取室为经惰性化处理的具孔三角瓶；
本发明的又一具体实施方式中，所述经惰性化处理的具孔三角瓶制备方法为：
(1)配制含6％二甲基二氯硅烷的甲醇溶液(硅烷化试剂)；将玻璃器皿洗净(用重铬酸钾洗液浸泡清洗)、干燥；在通风橱内将硅烷化试剂倒入三角瓶内，使其充分接触三角瓶内表面并停留10sec以上，期间搅拌或震荡使硅烷化试剂与三角瓶反应更加完全和均匀；倒去硅烷化试剂，用甲醇洗去三角瓶表面的硅烷化试剂并将其自然晾干，然后100～110℃加热1～2h；
(2)三角瓶瓶底穿孔，底部配置聚四氟乙烯垫，并用带有螺纹的SPME进样口进行固定。
本发明的又一具体实施方式中，所述顶空萃取具体方法为：
田间选取现蕾期烟株上的2～3片顶芽或侧芽，调节烟株旁固定三角瓶的支架高度，使目标叶片完全置于三角瓶内，且三角瓶内壁不挤压待测烟叶，静置5～10min后，将固相微萃取针插入位于三角瓶底部的SPME采样口内，使采样针进入三角瓶内推手柄杆使固相微萃取头伸出针管，固相微萃取头置于烟叶上部空间(注意萃取头不要碰触烟叶)，顶空方式萃取并保持30～50min(优选40min)。
本发明的又一具体实施方式中，固相微萃取头预先置于气相色谱仪的进样口在250℃老化15min。
本发明的又一具体实施方式中，SPME针选择使用50/30μm
DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，其对多种挥发性有机物有良好的检测能力。
本发明的又一具体实施方式中，所述三角瓶可通过置于待测烟株旁的固定杆和固定架固定，具体的，所述固定杆下端插入待测植株一侧泥土中起到固定支撑作用，所述固定架一端与固定杆可拆卸连接，另一端可夹持三角瓶，通过上述固定装置从而减少三角瓶与待测烟株的接触，同时，本发明采用不塞口的三角瓶收集挥发性气体，通过静置一段时间后使得三角瓶内外气体达到平衡后进行采样避免改变植株正常生理环境条件，进一步避免产生生物胁迫效应。
本发明选用现蕾期烟株上的顶芽或侧芽进行检测，一方面是便于采样收集，另一方面是由于烟株在现蕾期挥发性气体值达到顶峰，且以顶芽和侧芽的香气最为显著。
本发明的又一具体实施方式中，所述半定量分析包括：挥发性代谢物经GC-MS分析后，各色谱峰经NIST、W10N14.L标准普库检索，辅助保留指数对比和文献比对等人工解析，最终确定化合物。用峰面积百分比计算出各烟叶挥发性代谢物的相对含量。
本发明的又一具体实施方式中，通过摸索试验条件，获得气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)，载气为高纯氦气，流速1mL/min。进样口温度250℃，采用不分流进样。柱温采用程序升温，从45℃开始保持2min，然后以5℃/min升至200℃，保持2min。最后以15℃/min升至300℃，保持5分钟。质谱条件：离子源为EI源，电离电压70eV，离子源温度230℃，传输线温度250℃，扫描范围33-500amu。
本发明的又一具体实施方式中，所述待测组为烟草香韵突变品系，进一步包括玫瑰香烟草品系，柠檬香烟草品系；所述对照组为中烟100。
本发明的又一具体实施方式中，所述代谢轮廓分析数据为烟叶挥发性代谢物的相对含量；
本发明的又一具体实施方式中，所述多元统计分析可采用主成分分析法、偏最小二乘判别分析。
本发明的又一具体实施方式中，将鉴别的挥发性成分进行主成分分析，采用非监督模式识别方法PCA来观察待测样品的自然聚集为凸显本发明提出的植物挥发物的收集检测方法的技术优势，下面结合具体实施例对其进行说明。
实施例1
1材料和方法
1.1实验材料
本实施例材料为具有柠檬香、玫瑰香的特征香韵突变体材料及其对照中烟100。供试材料田间试验在山东省诸城洛庄试验站进行。在烟株现蕾期(7月中期)，每个材料选取6株生长正常，长势一致的植株，采用顶空-固相微萃取法对其2-3片顶芽或侧芽的挥发性物质进行田间原位采集。
1.2仪器与试剂
仪器：气相色谱-质谱联用仪Agilent 7890GC/5975MSD(美国安捷伦科技有限公司)；定制顶空瓶(经惰性化处理的带有SPME采样口的三角瓶)；冷冻干燥机(德国CHRIST公司)；固相微萃取装置(手动SPME进样器及50/70μm DVB/CAR/PDMS萃取头)；电热恒温干燥器(德国BINDER公司)；台式离心机(上海力申科学仪器公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)；超声仪(湖北鼎泰生化科技公司)；
试剂：甲醇(色谱纯，纯度>99.9％，德国)；三氯甲烷(色谱纯，纯度>99.8％，上海泰坦科技股份有限公司)；吡啶(分析纯，纯度>99.5％，上海国药集团)；甲氧基胺盐酸盐(纯度>98％，上海泰坦科技股份有限公司)；MSTFA(纯度>98.5％，sigma公司)。
1.3实验方法
1.3.1挥发性成分的采集
本实验结合国内外已有研究以及活体烟叶采样的实际情况，以硅烷化处理后的三角瓶作为顶空采样装置，采用静态顶空采样法对烟株挥发性物质进行采集。具体操作如下：实验前预先将固相微萃取头置于气相色谱仪的进样口在250℃老化15min，并将定制三角瓶进行硅烷化惰性处理。田间选取现蕾期目标突变体烟株上的2-3片顶芽或侧芽，调节三角瓶固定架，使目标叶片完全处于三角瓶内，注意不要挤压叶片，将固相微萃取针管插入SPME针取样口，进入到瓶中，推手柄杆使纤维头伸出针管，纤维头置于烟叶上部空间(注意萃取头不要碰触烟叶)，顶空方式萃取并保持40min。待采样结束后，收回纤维头，然后将针管退出采样瓶；进行GC/MS测定。
1.3.2GC-MS条件
烟叶挥发性成分的GC-MS进样条件：色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)，载气为高纯氦气，流速1mL/min。进样口温度250℃，采用不分流进样。柱温采用程序升温，从45℃开始保持2min，然后以5℃/min升至200℃，保持2min。最后以15℃/min升至300℃，保持5分钟。质谱条件：离子源为EI源，电离电压70eV，离子源温度230℃，传输线温度250℃，扫描范围33-500amu。
1.4数据分析
挥发性成分经GC-MS分析后，各色谱峰经NIST、W10N14.L标准普库检索，辅助保留指数对比和文献比对等人工解析，最终确定化合物。用峰面积百分比计算出各烟叶代谢物的相对含量。挥发性成分分析中，主要针对在DB-5MS色谱柱中RI>1700的挥发性成分，扣除萃取头和色谱柱流失、组内差异较大成分以及空白对照中检出的环境中苯系类化合物等，最终确定27种挥发性成分。
2结果
2.1挥发性成分分析
2.1.1挥发性成分组成
3个供试材料中共检测出27种挥发性成分(表1)，包括醇类8种，醛类2种，酮类3种，烯烃类11种，其他类3种，其中17种物质为3个材料所共有。玫瑰香烤烟材料中含有反式-β-罗勒烯(77.33％)、顺式-β-罗勒烯(3.14％)等25种挥发性成分，柠檬香烤烟材料中含有芳樟醇(76.01％)等22种挥发性成分，对照中烟100中含有茄酮(34.75％)、降茄二酮(18.10％)、芳樟醇(13.96％)等19种挥发性成分。挥发性成分种类最多的材料为玫瑰香，其次为柠檬香，对照组中烟100所含的挥发性成分种类最少。
表1烟芽挥发性成分组成、保留指数和相对含量方差分析结果
2.1.2挥发性物质的主成分分析(PCA)
将18个样品(每个品种6个重复)烟芽挥发性成分相对含量导入SIMCA-P13.0软件进行PCA分析，选取27个色谱峰的相对含量作为变量，采用非监督模式识别方法PCA来观察样品的自然聚集状态。拟合为3个主成分，各成分总计贡献率为0.947，说明3个主成分代表了27个指标94.7％的综合信息。18个样品的得分图见图3A，显示样品间具有显著的差异，18个样品自然聚集为3组，其自然聚集结果与试验材料的分类结果一致。
PCA载荷图(3B)为进一步确定各材料的差异提供了帮助，从PCA载荷图中可以明显看出：玫瑰香材料中反式-β-罗勒烯含量显著高于对照中烟100。柠檬香材料中芳樟醇含量显著高于中烟100。结合方差分析结果(表1)可以看出，与对照材料中烟100相比，玫瑰香材料中大多数单萜类物质(顺式-β-罗勒烯、反式-β-罗勒烯、γ-松油烯、玫瑰呋喃、对薄荷-1,3,8-三烯、波斯菊萜)、倍半萜(金合欢烯、(4R,4aS,6S)-4,4a-二甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢萘)的相对含量显著上调；而绿叶类挥发物(3-己醛、己醛、(Z)-3-己烯-1-醇)、双萜降解产物(茄酮，降茄二酮)、单萜类(芳樟醇，柠檬烯2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇)、倍半萜(氧化石竹烯、石竹烯二醇)以及烟碱含量显著下调。柠檬香材料中单萜类物质(芳樟醇，β-月桂烯、2,6-二甲基-1,7-辛二烯-3,6-二醇)，倍半萜类物质(β-榄香烯、氧化石竹烯)的相对含量较中烟100显著上调，而绿叶类挥发物(3-己醛、己醛、(Z)-3-己烯-1-醇)、双萜降解产物(茄酮，降茄二酮)、单萜类(柠檬烯)、倍半萜(石竹烯二醇)含量显著下调。
萜类代谢途径起始于五碳化合物异戊二烯(IPP)，又被划分为：甲羟戊酸途径(MVApathway)，催化生成倍半萜、三萜及甾体等物质，位于细胞质；非甲羟戊酸途径(MEPpathway)生成单萜、二萜等物质，位于质体。本实施例中，突变体材料中绝大多数单萜类物质相对含量明显上调，尤其是玫瑰香中的单萜类物质含量上调十分明显，单萜中γ-松油烯、玫瑰呋喃、对薄荷-1,3,8-三烯还是玫瑰香材料的特有成分。所以可能突变体的萜类合成在MEP途径中比较活跃。另外，大多数的单萜只需前体的一步反应就能合成，因此这为通过导入外源基因或阻断其他相关代谢途径来对烟草进行遗传改良提供了很大可能。
罗勒烯是由香叶基二磷酸在β-罗勒烯合成酶下，脱掉二磷酸盐而形成，属于无环单萜类化合物，自然界中存在顺式(Z,cis)和反式(E,trans)两种构型异构体。本实验中玫瑰香中两种构型的罗勒烯分别占3.14％，77.33％，显著高于对照中烟100。β-罗勒烯是一种与植物防御启动密切相关的信号分子，罗勒烯能促进植物抗虫能力提高。本实施例中，研究人员发现，田间种植的玫瑰香材料，对烟青虫等害虫具有明显的抗性，而对蜜蜂却具有明显的诱导性。
芳樟醇是一种重要的单链状萜类化合物，有α和β两种异构体。芳樟醇具有芳香性、抗菌作用以及驱避有害昆虫等方面的功效，合成香料、医药、调香及食品和饲料等工业领域已有广泛应用。芳樟醇是由芳樟醇合酶(LIS)将犍牛儿焦磷酸(GPP)一步催化成的，没有其他副产物，芳樟醇合酶被认为是单一产物酶。在本实施例中，柠檬香材料中芳樟醇及其氧化物相对含量达到76.58％，显著高于对照中烟100。在柠檬香材料中，芳樟醇合成酶的代谢效率可能更为旺盛，更多的催化了萜类共同前体化合物(GPP)来合成芳樟醇。因此，可以利用芳樟醇合酶是单一产物酶的特点，通过导入单一芳樟醇合酶基因达到烟草挥发性物质定向遗传改良的目的。
茄酮和降茄二酮在中烟100中相对含量分别为34.75％和18.10％，但在玫瑰香和柠檬香烤烟中含量较低，这可能与烟叶表面分泌物西柏三烯二醇含量和降解能力有关，西柏三烯二醇为叶面分泌物中主要的香味前体物质，在叶面化合物对烟叶香味的贡献中起决定性作用，但是烟草生长时期对西柏三烯二醇的含量有显著影响，茄酮是其主要降解产物，茄酮的进一步降解生成降茄二酮，茄酮及其降解产物均可赋予烟气类似胡萝卜的香味、甘草香和茶芳香，在提高卷烟香气质、香气量等方面发挥着十分重要的作用。
由此可知，两种突变体的萜类代谢途径发生了明显改变，尤其是主导单萜类物质合成的非甲羟戊酸途径(MEP pathway)发生了显著上调。不同香韵突变体材料的整体香味是由多种挥发性物质相互作用产生的，明确不同香韵特征材料的挥发性物质差异性及其调控机制，将有可能实现烟草品种的定向遗传改良，对烟草育种具有重要意义。
实验例1
本实验例的烤烟植物有机挥发物收集检测方法与实施例1的不同之处在于，取选取大田长势良好没有虫害的烟株作为研究对象，选取花始开期2-3片顶芽，其他步骤与实施例1相同，结果表明，3种烤烟品种共检测出18种挥发性成分，且未检测出柠檬香和玫瑰香烤烟品种中的β-榄香烯，同时也未检测出玫瑰香品种中的特有成分(4R,4aS,6S)-4,4a-二甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢萘和金合欢烯，对检测得到的挥发性物质进行主成分分析，结果结果显示三种烤烟品种中柠檬香烤烟与中烟100聚集为一类，不能进行有效区分。
实验例2
本实验例的烤烟植物有机挥发物收集检测方法与实施例1的不同之处在于，取选取大田长势良好没有虫害的烟株作为研究对象，选取现蕾期2-3片顶芽，摘下后带回实验室置于经硅烷化处理过的三角瓶内，其他步骤与实施例1相同，3种烤烟品种共检测出20种挥发性成分，同时本实验例中未检测出玫瑰香香烤烟品种中的特有物质γ-松油烯和(4R,4aS,6S)-4,4a-二甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢萘，对检测得到的挥发性物质进行主成分分析，结果显示三种烤烟品种中柠檬香烤烟与中烟100聚集为一类，不能进行有效区分。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种基于GC-MS特征香韵突变体烟草挥发性代谢标志物的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括：
S1、活体烟草挥发代谢物的固相微萃取：将待测烟叶倒扣至固相微萃取室中，进行顶空萃取；
S2、半定量分析：采用分流/不分流进样口的气相色谱-质谱联用仪，在全扫描模式下对烟株挥发性代谢物进行鉴定，根据化合物分子鉴定结果采用面积归一化法，对烟株挥发性代谢物含量进行半定量分析；
S3、数据处理和模式识别分析，获取挥发性代谢标志物：将待测组与对照组鉴别的代谢轮廓分析数据进行多元统计分析，获取差异挥发性代谢标志物，构成挥发性代谢标志物组；进一步进行代谢途径差异分析。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述固相微萃取室可根据目标植物进行选择，优选的，所述固相微萃取室为经惰性化处理的带有SPME针采样口的三角瓶；
进一步优选的，所述经惰性化处理的带有SPME针采样口的三角瓶制备方法为：
(1)配制含6％二甲基二氯硅烷的甲醇溶液(硅烷化试剂)；将玻璃器皿洗净(用重铬酸钾洗液浸泡清洗)、干燥；在通风橱内将硅烷化试剂倒入三角瓶内，使其充分接触三角瓶内表面并停留10sec以上，期间搅拌或震荡使硅烷化试剂与三角瓶反应更加完全和均匀；倒去硅烷化试剂，用甲醇洗去三角瓶表面的硅烷化试剂并将其自然晾干，然后100～110℃加热1～2h；
(2)三角瓶瓶底穿孔，底部配置聚四氟乙烯垫，并用带有螺纹的SPME进样口进行固定。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述顶空萃取具体方法为：
田间选取现蕾期烟株上的2～3片顶芽或侧芽，调节固定三角瓶的支架高度，使选取的烟叶完全处于三角瓶内，且三角瓶瓶身不挤压烟叶，静置5～10min后，将固相微萃取针插入位于三角瓶底部的SPME采样口内，使采样针进入三角瓶内，推手柄杆使固相微萃取头伸出针管，固相微萃取头置于烟叶上部空间(避免使萃取头碰触烟叶)，顶空方式萃取并保持30～50min(优选40min)。
4.如权利要求3所述的分析方法，其特征在于，固相微萃取头预先置于气相色谱仪的进样口在250℃老化15min。
5.如权利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述三角瓶通过置于待测烟株旁的固定杆和固定架固定。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述半定量分析包括：挥发性代谢物经GC-MS分析后，各色谱峰经NIST、W10N14.L标准普库检索，辅助保留指数对比和文献比对，最终确定化合物；用峰面积百分比计算出各烟叶挥发性代谢物的相对含量。
7.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)，载气为高纯氦气，流速1mL/min；进样口温度250℃，采用不分流进样；柱温采用程序升温，从45℃开始保持2min，然后以5℃/min升至200℃，保持2min；最后以15℃/min升至300℃，保持5分钟；质谱条件：离子源为EI源，电离电压70eV，离子源温度230℃，传输线温度250℃，扫描范围33-500amu。
8.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述待测组为烟草香韵突变品系，进一步优选包括玫瑰香烟草品系，柠檬香烟草品系；所述对照组为中烟100；
优选的，所述代谢轮廓分析数据为烟叶挥发性代谢物的相对含量。
9.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述多元统计分析采用主成分分析法或偏最小二乘判别分析，优选为主成分分析法。
10.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，将鉴别的挥发性成分进行主成分分析，采用非监督模式识别方法PCA来观察待测样品的自然聚集。
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