CN116179743A - 用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的kasp标记引物组合及其应用 - Google Patents

用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的kasp标记引物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，提供了用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色的KASP标记引物组合及其应用。用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色的KASP标记引物组合包括如下三条引物：上游引物1、上游引物2和下游引物。本发明还提供了用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色的KASP标记引物组合的应用。采用本发明提供的引物组合进行西瓜果皮浅绿/墨绿色基因型的检测，操作流程简便，降低了人为误差，分析通量高；此方法应用于西瓜果皮浅绿/墨绿色基因的选育，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速西瓜果皮颜色性状的选育。

Description

用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合及 其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)标记引物组合及其应用。
背景技术
西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.et Nakai)是葫芦科西瓜属西瓜种一年生蔓生草本植物。随着人们消费水平的提高，学者们对园艺作物性状的研究不只是着力于园艺作物的产量与口感，而外观表现也在影响着消费者的选择。因此，园艺作物的外观品质成为了越来越多育种工作者的目标，其中园艺作物皮色也受到广泛关注，不同种类色素的组成与含量多少是决定西瓜果实颜色多样性的主要原因，而控制色素种类及含量的基因在西瓜果皮颜色中起着重要的作用。因此，通过分析控制皮色的基因来指导西瓜品种的选育具有重要的意义。目前常用的分子标记方法有CAPS、dCAPS、SSR、RFLP等，这些技术都需要进行酶切或者电泳验证，时间长、费用高、过程繁琐，造成这些标记在分子育种方面的应用具有一定的局限性。而KASP标记技术能够检测出1bp的差异，非常准确且简便，能够在短时间内完成大量检测，在应用上具有较高的优势。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合及其应用，并达到以下发明目的：通过KASP标记引物组合检测西瓜浅绿/墨绿色性状，大大缩短检测时间，并达到精准育种的目的。
为实现以上发明目的，采用的技术方案如下：
用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合，所述西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的控制基因为WSC基因，所述KASP标记核心引物组合包括如下三条引物：
上游引物1的核心序列：
5'-AAACGGAGAGCATTAGAGGAGATGG-3'；
上游引物2的核心序列：
5'-aaacggagagcattagaggagatgc-3'；
下游引物的序列；
5'-ctgaatgaccatgttaacaatcaagaagg-3'。
所述KASP标记引物组合包括如下三条引物：
上游引物1的序列：
5'-gaaggtgaccaagttcatgctaaacggagagcattagaggagatgg-3'；
上游引物2的序列：
5'-gaaggtcggagtcaacggattaaacggagagcattagaggagatgc-3'；
下游引物的序列：
5'-ctgaatgaccatgttaacaatcaagaagg-3'。
用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合的应用，所述应用：采用KASP标记引物组合进行检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状，包括以下几个步骤：
(1)提取待测西瓜品种基因组DNA；
(2)使用含有检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物对西瓜基因组DNA进行PCR扩增；
(3)根据PCR荧光信号的差异，利用软件进行分析，进而鉴别出每个待测西瓜的基因型，即鉴定出属于纯合GG、CC，杂合GC基因型的西瓜品种。
所述PCR扩增：采用的PCR反应体系为：20-100ng/μL西瓜基因组DNA 2.5μL，KASPMaster Mix 2.5μL，Primer mix0.075μL，共5.075μL。
所述Primer mix：将上游引物1、上游引物2、下游引物分别用ddH2O稀释到50μM后，再将上游引物1、上游引物2、下游引物按照1:1:3的摩尔浓度比例混合。
所述PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃15s，61℃45s，共10个循环，每个循环降0.6℃；95℃15s，55℃1min，共34个循环。
用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合的应用，所述应用：培育具有西瓜浅绿/墨绿色性状的新植株；包括以下步骤：
步骤1、以受体亲本P1，与供体亲本P2配制F1代杂交组合；再以受体亲本P1作为轮回亲本进行回交，获得BC1F1代回交分离群体；
步骤2、对所述BC1F1代回交分离群体，采用KASP标记引物组合进行检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的方法进行基因型检测，选取基因型为CC的单株继续回交，获得BC2F1代回交分离群体；
步骤3、对所述BC2F1代回交分离群体，采用KASP标记引物组合进行检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的方法进行基因型检测，选取基因型为CC的单株，继续回交n代，获得BCnF1代回交分离群体，所述n为3-8的整数，优选为4。
步骤4、对BCnF1代回交分离群体，采用KASP标记引物组合进行检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的方法进行基因型检测，选取基因型为CC的单株自交。
本发明的有益效果如下：
1、应用本发明提供的用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色的KASP标记引物组合，进行西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的检测，操作流程简便、用时短，降低了人为误差，分析通量高，非常适合大量样品同时检测。能够检测出1bp的差异，非常准确且简便，能够在短时间内完成大量检测，具有较高的优势。采用传统的分子检测方法需要五六个小时，而通过本发明方法仅需要一个半小时。
2、本发明提供的用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合应用于西瓜果皮浅绿/墨绿色新品种的转育，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速西瓜育种的进程。
附图说明
附图1实施例2中的等位基因判别图；图中，蓝色圆点代表该位点是纯合基因型GG；红色圆点代表该位点是纯合基因型CC；绿色圆点代表该位点是杂合基因型GC。
附图2.实验1中检测结果为蓝色圆点代表的西瓜样本DNA测序结果；
附图3.实验1中检测结果为绿色圆点代表的西瓜样本DNA测序结果；
附图4.实验1中检测结果为红色圆点代表的西瓜样本DNA测序结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的实施方式作进一步地详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1、用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合
设计与西瓜果皮浅绿/墨绿色性状有关的分子标记WSC，具体采用下述方法获得：
1)比较果皮浅绿色西瓜植株和果皮墨绿色西瓜植株中的基因组序列，鉴定到两者WSC基因在基因组水平上有1bp变异，通过序列分析发现这1bp的突变发生在外显子区域，即此1bp的变异会导致氨基酸的改变，从而导致性状上的差异。
2)基于果皮浅绿、墨绿色西瓜中WSC基因1bp的变异，在此变异附近区域设计一组引物(3条)；
引物组合的具体序列如下：
FAM标记的上游引物1：
5'-gaaggtgaccaagttcatgctaaacggagagcattagaggagatgg-3'；
VIC标记的上游引物2：
5'-gaaggtcggagtcaacggattaaacggagagcattagaggagatgc-3'；
共同序列下游引物：
5'-ctgaatgaccatgttaacaatcaagaagg-3'。
上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司(青岛)合成。
即用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合为上游引物1、上游引物2、下游引物的组合。
3)采用CTAB法提取亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA，具体步骤如下：
①取0.5g幼嫩叶片于2mL离心管中，每管加600μL CTAB提取缓冲液，放入2粒钢珠，用Tissuelyser-192破碎仪进行破碎，设置频率为60.00HZ、时间为240s。
②破碎完毕后置于65℃水浴60min，每隔15min颠倒混匀一次。
③水浴后加入3M乙酸铵200μL，置于冰上冷却10min，加入600mL的氯仿、异戊醇混合液(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。
④取600μL上清液，加入预先加好的600μL预冷的异丙醇中(于96孔深孔板)，轻轻混匀，-20℃放置30min。
⑤于12000rpm离心10min，弃上清，用70％的乙醇洗沉淀1次，室温下风干至无乙醇味。
⑥加入200μL ddH2O 65℃水浴20min。所述ddH2O：含10mg/mL的RNase 1μL。
⑦取1μL样品在
Figure SMS_1
N50上检测样品浓度，将样品浓度调为一致。
采用上述方法分别提取浅绿色果皮的植株和墨绿色果皮的植株的基因组DNA；扩增浅绿色果皮的植株和墨绿色果皮的植株的WSC基因序列，并将PCR扩增产物提交生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
所述PCR扩增的方法：采用提取的基因组DNA为模板，采用引物F、引物R进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。
引物F序列为：5’-ccaacgttccctctccaact-3’；
引物R序列为：5’-gcccgcctgttgaaaattcc-3’；
上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
采用的PCR反应体系为：100ng·μL-1西瓜基因组DNA 2μL，10μM的引物F、10μM的引物R各2μL，2×TaqMasterMix 25μL，ddH2O 19μL，总体积50μL。
PCR扩增反应的反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min。
4)经测序发现WSC基因1bp的变异与西瓜果皮浅绿色、果皮墨绿色性状完全吻合，因此，设计的KASP标记引物组合可以用来鉴定西瓜的果皮浅绿/墨绿色性状。
实施例2、采用KASP标记引物组合进行PCR检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的方法
一、基因组DNA的提取
按照实施例1的CTAB方法提取西瓜材料基因组DNA。
二、PCR扩增
以步骤一提取的基因组DNA为模板，采用实施例1的用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合(上游引物1、上游引物2、下游引物)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应体系为：50ng/μL西瓜基因组DNA 2.5μL，KASP Master Mix 2.5μL，Primermix 0.075μL，共5.075μL；
所述KASP MasterMix为广州固德生物技术有限公司产品，目录号为GBS-1016-002。
所述Primer mix：将上游引物1、上游引物2、下游引物分别用ddH2O稀释到50μM后，再将上游引物1、上游引物2、下游引物按照1:1:3的摩尔浓度比例混合。
PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃15s，61℃45s，共10个循环，每个循环降0.6℃；95℃15s，55℃1min，共34个循环。
同时设置反应体系中不添加模板DNA的作为空白对照，每个PCR板上设置4个空白对照。
三、PCR扩增产物的荧光扫描
在QuantStudio 6Flex仪器上进行PCR反应，用QantstudioTM Real-Time PCRSoftware软件查看分型情况，从而直接获得分析结果，软件自动将检测样品按照不同的基因型分成纯合GG、CC基因型和杂合GC基因型，获得等位基因判别图。
当软件分析出现的点分布在左上角和右下角时，对应的材料为纯合，其中蓝色圆点代表该位点是纯合基因型“GG”，红色圆点表示该位点是纯合基因型“CC”；当出现在居中(绿色)圆点时，表示该位点是杂合基因型“GC”；黑色×标记表示NTC，即为水对照。当没有杂合型出现时中间位置不出现圆点，左上角的蓝色圆点变为绿色圆点，但显示材料均为纯合子。由于2个上游引物(上游引物1、上游引物2)前分别设置有不同的荧光接头，分别为FAM和VIC。如果检测的材料是纯合基因型，则扩增时会有对应的一个引物扩增，根据荧光的差异分辨所测的材料是GG还是CC；如果检测的材料是杂合型的，扩增时2个引物都会扩增，产生的荧光不同于纯合基因型的材料，从而实现区分杂合的基因型的目的。
试验1、将80份不同植株的西瓜按照实施例2所述方法进行检测，检测获得等位基因判别图，如附图1所示；统计所有样本的检测结果如表1所示；
表1 80份西瓜样本的检测结果统计表
Figure SMS_2
/>
Figure SMS_3
/>
Figure SMS_4
在表1中，结果为GG的西瓜果实从皮色上可看出均为浅绿色品种，结果为GC、CC的西瓜果实从皮色上可看出均为墨绿色品种。因此，可以证明本发明用于选择西瓜果皮浅绿/墨绿色品种的准确率非常高。
试验2、选择不同荧光点的材料进行测序
选取试验1中检测结果为红色、蓝色、绿色的样本，进行DNA片段扩增后提交生工生物工程(上海)股份有限公司(青岛)测序，测序样品进行DNA图谱分析结果如附图2-4所示；
附图2.实验1中检测结果为蓝色圆点代表的西瓜样本DNA测序结果；
附图3.实验1中检测结果为绿色圆点代表的西瓜样本DNA测序结果；
附图4.实验1中检测结果为红色圆点代表的西瓜样本DNA测序结果。
通过测序结果可以看出蓝色圆点和红色圆点代表的样本DNA均为纯合，绿色圆点代表的样本DNA均为杂合，且蓝色圆点代表的西瓜果实皮色为浅绿色，红色圆点代表的西瓜果实皮色为墨绿色，测序结果与表现型结果一致。因此，可以证明本发明的分子标记可用于辅助选择西瓜果皮浅绿/墨绿色品种，且准确率高。
实施例3一种培育具有西瓜果皮墨绿色性状的新植株的方法
步骤如下：
步骤1、以受体亲本P1，与供体亲本P2配制F1代杂交组合；再以受体亲本P1作为轮回亲本进行回交，获得BC1F1代回交分离群体；
所述亲本P1：品质优良的西瓜品种X19-09，具有浅绿色果皮性状的植株；
所述亲本P2：品质一般的西瓜品种X19-02，具有墨绿色果皮性状的植株。
步骤2、对所述BC1F1代回交分离群体，采用实施例1所述的用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合，通过实施例2的方法，选取基因型为CC的单株继续回交，获得BC2F1代回交分离群体。
步骤3、对所述BC2F1代回交分离群体，采用实施例1所述的用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合，通过实施例2的方法，选取基因型为CC的单株，继续回交n代，获得BCnF1代回交分离群体。所述n为4。
步骤4、对BCnF1代回交分离群体，继续采用实施例1所述的用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合，通过实施例2的方法，选取基因型为CC的单株自交，获得纯合西瓜品种X19-09的果皮墨绿色株系。
除特殊说明外，本发明中所述的百分数均为质量百分数，比例均为质量比。
最后，还需要说明的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以衍生出许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或者联想到所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合，其特征在于：所述西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的控制基因为WSC基因，所述KASP标记核心引物组合包括如下三条引物：
上游引物1的核心序列：
5'-aaacggagagcattagaggagatgg-3'；
上游引物2的核心序列：
5'-aaacggagagcattagaggagatgc-3'；
下游引物的序列；
5'-ctgaatgaccatgttaacaatcaagaagg-3'。
2.用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合，其特征在于：所述西瓜果皮浅绿/墨绿色基因为WSC基因，所述KASP标记引物组合包括如下三条引物：
上游引物1的序列：
5'-gaaggtgaccaagttcatgctaaacggagagcattagaggagatgg-3'；
上游引物2的序列：
5'-gaaggtcggagtcaacggattaaacggagagcattagaggagatgc-3'；
下游引物的序列：
5'-ctgaatgaccatgttaacaatcaagaagg-3'。
3.用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合的应用，其特征在于：所述应用：用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状，包括以下几个步骤：
(1)提取待测西瓜品种基因组DNA；
(2)使用含有检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物对西瓜基因组DNA进行PCR扩增；
(3)根据PCR荧光信号的差异，利用软件进行分析，进而鉴别出每个待测西瓜的基因型，即鉴定出属于纯合GG、CC，杂合GC基因型的西瓜品种。
4.根据权利要求3所述用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合的应用，其特征在于：
所述PCR扩增：采用的PCR反应体系为：20-100ng/μL西瓜基因组DNA 2.5μL，KASPMaster Mix 2.5μL，Primer mix0.075μL，共5.075μL。
5.根据权利要求3所述用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合的应用，其特征在于：
所述Primer mix：将上游引物1、上游引物2、下游引物分别用ddH2O稀释到50μM后，再将上游引物1、上游引物2、下游引物按照1:1:3的摩尔浓度比例混合。
6.根据权利要求3所述用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合的应用，其特征在于：
所述PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性10min；95℃15s，61℃45s，共10个循环，每个循环降0.6℃；95℃15s，55℃1min，共34个循环。
7.用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合的应用，其特征在于：所述应用：培育具有西瓜浅绿/墨绿色性状的新植株。
8.根据权利要求书7所述的用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合的应用，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1、以受体亲本P1，与供体亲本P2配制F1代杂交组合；再以受体亲本P1作为轮回亲本进行回交，获得BC1F1代回交分离群体；
步骤2、对所述BC1F1代回交分离群体，采用KASP标记引物组合进行检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的方法进行基因型检测，选取基因型为CC的单株继续回交，获得BC2F1代回交分离群体；
步骤3、对所述BC2F1代回交分离群体，采用KASP标记引物组合进行检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的方法进行基因型检测，选取基因型为CC的单株，继续回交n代，获得BCnF1代回交分离群体，所述n为3-8；
步骤4、对BCnF1代回交分离群体，采用KASP标记引物组合进行检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的方法进行基因型检测，选取基因型为CC的单株自交。
9.根据权利要求书8所述的用于检测西瓜果皮浅绿/墨绿色性状的KASP标记引物组合的应用，其特征在于：所述n为4。
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