CN116179477A - 人类蜕膜间充质干细胞的细胞培养上清液的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种人类蜕膜间充质干细胞培养上清液对于缺血性疾病的用途，例如糖尿病足溃疡。通过小鼠下肢缺血模型的建立，用人类蜕膜间充质干细胞上清液处理后可改善小鼠下肢血流供应，并在链脲佐菌素诱发的糖尿病小鼠模型中，用人类蜕膜间充质干细胞上清液处理后也可改善下肢血流供应。本发明可应用于糖尿病患者中，通过促进血管生成能力，降低截肢发生率。

Description

人类蜕膜间充质干细胞的细胞培养上清液的用途
技术领域
本发明公开一种人类蜕膜间充质干细胞的细胞培养上清液的用途。
背景技术
糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）是全球十大死亡原因之一。根据中国台湾有关健康部门的统计，中国台湾地区约有200万名DM患者，2016年有9,960名患者死于DM，相比去年增加了4.5％。
根据统计，15-25％的糖尿病患者在其一生中患有糖尿病足溃疡（Diabetic FootUlcer, DFU），DFU被认为是发病过程中最主要的问题，也是DM患者住院的主要原因。
迄今为止，由于糖尿病导致正常的血管新生能力受损，大量DM患者需要截肢，造成严重的并发症。
间充质干细胞（Mesenchymal stromal cells, MSCs）已被广泛研究为再生医学的理想细胞来源，能通过旁分泌作用（paracrine effect）促进血管新生。另外也有证据指出，MSC移植可以加速伤口闭合，改善临床症状，避免截肢。
健康人的血管内壁是光滑的，如果受到非特异性的伤害，如高血压、香烟的碳氢化合物、胆固醇、高血糖、发炎、受创等多项因素的伤害，会导致脂肪斑块堆积在受伤处，进而造成血管内皮细胞受损，使得脂质渗透到血管内皮中层，在脂质被过氧化后，会诱发巨噬细胞产生免疫反应、促使一连串细胞激素分泌，使得血管壁中层的平滑肌不当增生、脂肪斑块持续增厚，长久下来，血管中层会出现溃疡、出血或钙化，最后形成纤维斑块，使血管表面凹凸不平，进而与血小板作用形成血栓，导致血管阻塞。
阻塞部位以下的组织会因无法得到充足的养分与氧气，出现缺血或坏疽等病理变化，这些统称为周边动脉阻塞疾病。
其中，糖尿病患者如果长期血糖控制不佳，会加速动脉硬化及血管壁基底层增厚，造成组织血氧通透性变差、血液凝聚功能增强，易于血栓形成，进而引起管腔狭窄、阻塞，造成下肢缺血。
发明内容
本说明书中的术语“一”或“一种”是用来描述本发明的组分及成分，此术语仅为了描述方便和给予本发明的基本观念，进一步地，此描述应被理解为包括一种或至少一种，且除非明显地另有所指，表示单数时也包括复数。在申请专利范围中和“包含”一词一起使用时，该术语“一”可表示一个或超过一个。
一种用于预防或治疗缺血性疾病的医药组合物，其包含：有效量的人类蜕膜间充质干细胞的上清液；及医药上可接受的载体或赋形剂。
人类蜕膜间充质干细胞上清液由以下步骤所决定：提供无血清干细胞培养液进行干细胞的继代培养，其中该培养液包含：干细胞培养基；0.9%至1.1%胰岛素-转铁蛋白-硒；以及9 ng/ml至11 ng/ml表皮生长因子；在该无血清干细胞培养液进行4至12天的培养；收集并添加40 mg/ml至80 mg/ml海藻糖及10 mg/ml至30 mg/ml右旋糖酐至经培养的无血清干细胞培养液；以及过滤该无血清干细胞培养液。
有效量的人类蜕膜间充质干细胞的上清液可由上清液体冷冻干燥粉末重量界定，在本发明的实施例中，上清液体冷冻干燥粉末添加量为0.1879克重、0.22克重、0.247克重。
有效量的人类蜕膜间充质干细胞的上清液可由胞外囊泡的数量界定，在本发明的实施例中，人类蜕膜间充质干细胞的上清液胞外囊泡数量总量为每毫升1×106至1×1011颗粒。
在另一本发明的实施例中，人类蜕膜间充质干细胞的上清液胞外囊泡数量总量为每毫升1×107至1×1010颗粒。
在本发明的一个实施例中，该缺血性疾病为糖尿病足溃疡。
“医药上可接受的载体”或“赋形剂”或“医药上可接受的载体或赋形剂”或“生物可利用的（bioavailable）载体”或“生物可利用的载体或赋形剂”包括但不限于为了保存的溶剂、分散剂、涂料、抗微生物剂、抗真菌剂或为了制备配方的延迟吸收剂及任何其他已知的化合物。一般而言，这些载体或赋形剂本身不具有治疗疾病的活性。通过使用本发明中公开的新颖化合物或其衍生物，结合医药上可接受的载体或赋形剂而制备的医药组合物或配方不会引起动物或人类的副作用、过敏或其他不适当的反应。因此，本发明中公开的新颖化合物或其衍生物与医药上可接受的载体或赋形剂的组合可应用于人类临床。包含本发明的新颖化合物或其衍生物的医药组合物或配方可通过静脉注射、口服、吸入或通过鼻、直肠、阴道或舌下的局部施用来达到治疗效果。
另一方面，本发明提供一种用于预防或治疗缺血性疾病的药物的用途。
附图说明
图1为小鼠下肢缺血模型的多普勒血流成像仪分析图。
图2为人类蜕膜间充质干细胞的细胞培养上清液的胞外囊泡数量分析图。
图3为糖尿病小鼠下肢缺血模型接受人类蜕膜间充质干细胞上清液治疗图。
具体实施方式
人类蜕膜间充质干细胞的细胞培养
在无尘环境空间内实施本发明步骤，以无菌操作细胞增殖培养方式，使用未混合任何血清的干细胞培养溶液进行细胞的继代培养，培养期间每三日更换新鲜的干细胞培养溶液，其中该溶液包含有MCDB201配方培养基、浓度介于0.9%至1.1%的胰岛素-转铁蛋白-硒（insulin transferrin selenium, ITS）及浓度介于9 ng/ml至11 ng/ml的表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF），进行4至12天的培养。
其中本细胞培养溶液配方各项添加物质需选择非动物来源，为无血清、非动物来源且无酚红组成的限定化学成分培养基（chemical defined medium），因此无需考虑动物或血清物质对人体产生感染或引发过敏反应，并可以直接在细胞达到最佳状态时直接收取上清液进行本发明后续应用。
在干细胞培养以1×104/cm2接种的T175 Flask中，细胞密度达90%以上，即可收取总蛋白质浓度达200~300 μg/ml的上清液，并执行冷冻干燥程序。
冷冻干燥制备
为保持上清液中活性因子的稳定性，向其中加入海藻糖（Trehalose）60 mg/ml及右旋糖酐（Dextran）20 mg/ml，混合均匀后以孔径0.22 μＭ以下的滤膜过滤。在可耐低温容器中充填2 ml过滤完成的上清液。
冷冻干燥机需先预冷至-30℃（需一至二小时），将制备完成的样本放入真空箱中，箱体降温至-50℃二至三分钟后（急速冻结为固态），启动负压将箱体内抽至200托，并维持此负压60小时，使冰升华为水蒸气，从而除去被干燥物中的水分。完成后，将箱体温度升至10℃，收取冻干粉样本封罐，置于-20℃至-80℃保存。
人类蜕膜间充质干细胞的细胞培养上清液的胞外囊泡数量
在本发明的实施例中，人类蜕膜间充质干细胞的上清液的胞外囊泡数量的总量为9.7x107、8.6x108、1.1x109、1.5x109、2.3x109、1.45×109。
链脲佐菌素糖尿病小鼠模型
以2.5%的异氟醚（isoflurane）气体麻醉C57BL/6J小鼠以进行股动脉结扎手术，术后给予0.75%、100 μL的布比卡因（bupivacaine）腹腔注射三天缓解疼痛，进行多普勒血流成像仪分析记录小鼠下肢血流数据。小鼠在完成股动脉结扎手术后尚未缝合皮肤时，将上清液冷冻干燥粉以400 μL PBS回溶，通过肌肉注射或腹腔注射该回溶的人类蜕膜间充质干细胞的细胞培养上清液。
链脲佐菌素糖尿病小鼠模型是将40 mg/kg的链脲佐菌素，在实验的第1天开始连续腹腔注射5天，在实验的第14天使小鼠空腹并通过罗氏（Diastix）检测尿糖值，当该尿糖值连续两天高于3后，测量禁食6小时后的血糖，当测试结果大于300 mg/dl即诱导成功。
多普勒血流成像仪分析
以2.5%的异氟醚（isoflurane）气体麻醉小鼠以进行股动脉结扎手术，术后给予0.75%、100 μL的布比卡因（bupivacaine）腹腔注射三天缓解疼痛，进行多普勒血流成像仪分析记录小鼠下肢血流数据。
小鼠在完成股动脉结扎手术后尚未缝合皮肤时，将上清液冷冻干燥粉以400 μLPBS回溶、通过肌肉注射分别在小腿及大腿的内、外侧肌肉上各注射60 μL，共180 μL上清液回溶液体；腹腔注射组则于手术后一次注射180 μL上清液回溶液体至实验动物腹腔，进行试验。
根据图1的影像结果图，发现小鼠手术后其右足血流减少，但在接受治疗后于第7天、第14天均可观察到治疗组右足血流比对照组恢复程度高。
根据图2的人类蜕膜间充质干细胞的细胞培养上清液的胞外囊泡数量分析结果图，上清液通过纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA），分析显示上清液中含有7.25×108/ml胞外囊泡（extracellular vesicles），由于冻干粉由2 ml上清液干燥而成，故每份上清液含有1.45×109胞外囊泡。
根据图3的糖尿病小鼠下肢缺血模型接受人类蜕膜间充质干细胞的上清液治疗结果图，以链脲佐菌素诱导C57BL/6J小鼠的糖尿病症状，然后进行下肢缺血手术并给予肌肉注射和腹腔注射处理。
手术后连续14天使用多普勒血流成像仪收集影像数据并量化，结果显示肌肉注射或腹腔注射上清液都可观察到比对照组高的血流数据。
整体而言，糖尿病小鼠相比健康小鼠其血流自然恢复能力较差，在此状态下，施用人类蜕膜间充质干细胞上清液则可有效改善血流供应的效果。数据表示平均值±标准偏差。DM：糖尿病小鼠；IM：肌肉注射；IP：腹腔注射；EX：上清液。

Claims (8)

1.一种人类蜕膜间充质干细胞上清液，其中所述人类蜕膜间充质干细胞上清液由以下步骤决定：
（a）提供无血清干细胞培养液进行干细胞的继代培养，其中所述无血清干细胞培养液包含 :
干细胞培养基；
0.9%至1.1%胰岛素-转铁蛋白-硒；以及
9 ng/ml至11 ng/ml表皮生长因子；
（b）用所述无血清干细胞培养液进行4至12天的培养；
（c）收集并添加40 mg/ml至80 mg/ml海藻糖及10 mg/ml至30 mg/ml右旋糖酐至经培养的无血清干细胞培养液；以及
（d）过滤所述经培养的无血清干细胞培养液。
2.如权利要求1所述的人类蜕膜间充质干细胞上清液，其中产生的胞外囊泡数量为每毫升1×106至1×1011颗粒。
3.如权利要求2所述的人类蜕膜间充质干细胞上清液，其中所述产生的胞外囊泡数量为每毫升1×107至1×1010颗粒。
4.如权利要求1所述的人类蜕膜间充质干细胞上清液，其中所述无血清干细胞培养液为MCDB201配方培养基。
5.如权利要求1所述的人类蜕膜间充质干细胞上清液，其中所述人类蜕膜间充质干细胞上清液以冷冻干燥法保存。
6.一种医药组合物用于制备治疗或预防缺血性疾病的药物的用途，其中所述医药组合物如权利要求1所述的步骤决定，其进一步包含医药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述缺血性疾病为糖尿病足溃疡。
8.如权利要求6所述的用途，其中给药途径为肌肉注射或腹腔注射。
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