CN116165384A - 细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法，以细胞角蛋白19片段作为检测线上的包被抗体，以鸡IgY抗体作为质控线上的包被抗体，荧光微球标记的细胞角蛋白19片段抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液的混合液作为荧光微球标记抗体溶液，采用双抗体夹心法，利用了荧光免疫层析技术原理，与现有常见的细胞角蛋白19片段检测方法相比，具备灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作便捷以及准确性好的优点；本申请提供的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，通过进行产品性能分析实验，以及物料选择试验，确定了细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的制备的工艺条件，使得制备过程中，操作简便，材料利用率高，制造成本低。

Description

细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外诊断免疫层析领域，涉及细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒及其制备方法，具体地说是一种利用荧光免疫层析的技术原理实现定量检测人血清以及血浆样本中的细胞角蛋白19片段含量。
背景技术
细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)是一种肺癌相关的肿瘤标志物，属于中间丝蛋白家族，分子量约为40kD，主要存在于食管癌、肺癌等上皮细胞起源的肿瘤细胞的胞浆中，中间丝的主要亚单位为细胞角蛋白，因序列的不同而分为1到20亚型。其中角蛋白19的含量比较丰富，且裂解过程中会产生水溶性片段并释放到循环系统中，能反映病情的预后和治疗疗效，对恶性肿瘤的诊断具有重要价值，是非小细胞肺癌最有价值的血清肿瘤标志物。
现有细胞角蛋白19片段测定方法主要有胶体金免疫层析法、化学发光免疫分析法、胶乳比浊法、荧光免疫层析法等，其中由于胶体金产生的信号分辨率低，灵敏度与检测范围均较差，亟需性能更佳的标记物替代，化学发光法需大型的仪器配套，难以实现床旁检测，免疫比浊法所需的抗体量较多，因此一般使用多克隆抗体，并且检测系统中只有单株抗体对其特异性识别，相比双抗体夹心法特异性略低，荧光定量免疫层析法除了保留胶体金的优点外，还有以下优点：与胶体金法相比荧光定量免疫层析具有更高的检测灵敏度，现有荧光免疫层析技术灵敏度可达到0.05pg/mL；结果准确，抗基质干扰强，试剂稳定性好，检测结果可与ELISA相媲美；仪器实现定量计算，剔除人为因素对结果的影响；与传统定量检测技术相比，该技术具有快速、价格低廉等优点，更适于床旁及时定量快速检测；本申请首次提出一种利用荧光免疫层析的技术原理实现定量检测人血清以及血浆样本中的细胞角蛋白19片段含量的高效、便携、使用方便的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、检测时间短、特异性强、准确性好以及稳定性高的用于辅助评价血液样本中细胞角蛋白19片段含量的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒。
本申请采用如下方案，细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，包括细胞角蛋白19片段检测卡、稀释液以及芯片，所述细胞角蛋白19片段检测卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条包括PVC底板及依次设于所述PVC底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线，
检测线包被有CYFRA21-1包被抗体，包被浓度为0.8-1.2mg/mL；
质控线包被有鸡IgY抗体，包被浓度为0.8-1.2mg/mL；
所述结合垫上喷涂有荧光微球标记的标记抗体溶液，荧光微球标记的抗体溶液具体为：荧光微球CYFRA21-1-L标记抗体溶液和荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液的混合液。
优选的，所述标记抗体溶液喷量为3-5μL/cm。
优选的，所述CYFRA21-1包被抗体溶液的喷量为1μL/cm，所述鸡IgY溶液喷量为1μL/cm。
优选的，荧光微球CYFRA21-1-L标记抗体溶液，配制步骤如下：
A.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
D.加入CYFRA21-1-L标记抗体10μg，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
G.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀即得。
优选的，所述荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液，配制步骤如下：
A.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
D.加入羊抗鸡IgY抗体16μg，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
G.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀即得。
优选的，标记活化液配制方法为，将0.02g的EDC溶解与1mL纯化水内溶解，现配现用。
优选的，所述标记缓冲液配制方法为，在80ml纯化水中加入1.067g MES，溶解后用1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液调pH＝6.2±0.05，定容至100mL即得标记缓冲液。
优选的，所述标记保存液由20g牛血清白蛋白、20g蔗糖、5g干酪素钠、50g海藻糖、0.5mL的Proclin 300溶液、1000mL的PH为8.0的0.02M Tris缓冲液。
优选的，所述荧光微球为南京微测生物的Eu-荧光纳米微球300nm。
本发明的另一目的在于提供一种灵敏度高、检测时间短、特异性强、准确性好的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法；包括以下步骤：
步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将CYFRA21-1包被抗体、鸡IgY抗体都按0.8-1.2mg/mL的浓度配制包被工作液，都按1μL/cm的喷量将两者划到NC膜上的检测线和质控线上后干燥；
步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液按照3-5μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上后干燥；
步骤3：样品垫浸泡预处理好后干燥；
步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次粘贴在PVC板上，组装成试剂卡。
本试剂盒测定的原理：采用双抗体夹心法，利用荧光免疫层析的技术原理，测试时，样本与稀释液混匀，并滴加到试剂的加样孔中，在毛细效应下进行层析，样本中的CYFRA21-1抗原与荧光标记CYFRA21-1抗体结合，扩散至测试区，被检测线包被的CYFRA21-1单克隆抗体捕获，并形成“抗体-抗原-荧光抗体”复合物；样本中的CYFRA21-1浓度与复合物荧光强度成正比，通过免疫荧光检测仪及设定的标准曲线，将荧光信号值转换成样本中CYFRA21-1浓度。
本发明与现有技术相比，本申请有如下优点：
本申请提供的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，以细胞角蛋白19片段作为检测线上的包被抗体，以鸡IgY抗体作为质控线上的包被抗体，荧光微球标记的细胞角蛋白19片段抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液的混合液作为荧光微球标记抗体溶液，采用双抗体夹心法，利用了荧光免疫层析技术原理，与现有常见的细胞角蛋白19片段检测方法相比，具备灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作便捷以及准确性好的优点；
本申请提供的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，通过进行产品性能分析实验，以及物料选择试验，确定了细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的制备的工艺条件，使得制备过程中，操作简便，材料利用率高，制造成本低。
附图说明
图1是本申请批号1试剂盒线性范围检测结果图；
图2是本申请批号2试剂盒线性范围检测结果图；
图3是本申请批号3试剂盒线性范围检测结果图；
图4是本申请批号1试剂盒Hook效应检测结果图；
图5是本申请批号2试剂盒Hook效应检测结果图；
图6是本申请批号3试剂盒Hook效应检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例说明本发明的具体技术方案
实施例1：
细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，包括细胞角蛋白19片段检测卡、稀释液以及芯片，所述细胞角蛋白19片段检测卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条包括PVC底板及依次设于所述PVC底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线；检测线包被有CYFRA21-1包被抗体，包被浓度为1mg/mL；质控线包被有鸡IgY抗体，包被浓度为1mg/mL；
所述结合垫上喷涂有荧光微球标记的标记抗体溶液，荧光微球标记的抗体溶液具体为荧光微球CYFRA21-1-L标记抗体溶液和荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液的混合液。
优选的，所述荧光微球标记的标记抗体溶液具体为荧光微球CYFRA21-1-L标记抗体溶液和荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液的体积比1:1的混合液。
实施例2：
细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将CYFRA21-1包被抗体、鸡IgY抗体都按1mg/mL的浓度配制包被工作液，都按1μL/cm的喷量将两者划到NC膜上的检测线和质控线上后干燥；
步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液按照4μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上后干燥；
步骤3：样品垫浸泡预处理好后干燥；
步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次粘贴在PVC板上，组装成试剂卡。
其中，荧光微球CYFRA21-1-L标记抗体溶液，配制步骤如下：
A.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
D.加入CYFRA21-1-L标记抗体10μg，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
G.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀即得。
荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液，配制步骤如下：
A.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
D.加入羊抗鸡IgY抗体16μg，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
G.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀即得。
优选的，所述荧光微球和细胞角蛋白19片段抗体的投料比为25:2；所述荧光微球和羊抗鸡IgY抗体的投料比都为20:1。
制备得到批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒。
实施例3：
实施例1-2中制备得到的批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒使用方法如下：
步骤1.使用广州蓝勃AFS1000干式荧光免疫分析仪，在10～30℃室温，湿度10％-70％的条件下，试剂盒开封2个小时内进行使用；
步骤2.打开仪器，插入与试剂批号相同的芯片；
步骤3.用移液器吸取100μL样本，加入到稀释液中，上下颠倒混匀；
步骤4.打开铝箔袋，取出检测卡，水平放置于桌面上；
步骤5.用移液器吸取稀释后混匀的样本100μL，加入到检测卡的加样孔中；
步骤6.在配套仪器上选择样本类型“血浆、血清或全血”；
步骤7.即时测试：待室温反应15min后，将检测卡放入仪器卡槽中，选择“即时测试”模式，点击“测试”；标准测试：将检测卡放入仪器卡槽中，选择“标准测试”模式，点击“测试”，仪器自动计时，计时结束后，自动测试并显示结果；点击“打印”，可打印检测结果报告。
优选的，所述步骤3中样本和稀释液的比例为1:3,具体是指，使用移液器取100μL样本，加入到300μL稀释液中，上下颠倒混匀。
进一步地，标记保存液由20g牛血清白蛋白、20g蔗糖、5g干酪素钠、50g海藻糖、0.5mL的Proclin 300溶液、1000mL的PH为8.0的0.02M Tris缓冲液组成；标记保存液配方的选择过程如下：
(A)按如下表1配制4中不同的标记保存液，
表1标记保存液配方表
Figure BDA0004091369980000071
(B)使用由表1配方表制备得到的4种标记保存液按一下步骤标记抗体，
A.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
D.加入羊抗鸡IgY抗体16μg，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
G.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀即得。
(C)使用由表1配方表制备得标记保存液制备得到的荧光微球标记抗体溶液按照4μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上；干燥过夜24h，然后在将各种原料制备的实验材料组装成试剂卡后，用企业参考品进行评估。
评估结果如下：
表2不同配方标记保存液标记物观察结果
Figure BDA0004091369980000072
Figure BDA0004091369980000081
表3不同配方标记保存液标记物制备试剂卡检测结果(ng/mL)
参考品浓度 0.25 4 20 50 200 500
配方1T/C CV 0.25 4 20 50 200 500
配方2T/C CV 6.19％ 9.74％ 7.44％ 4.20％ 4.06％ 9.90％
配方3T/C CV 5.44％ 6.91％ 8.43％ 9.04％ 8.46％ 6.47％
配方4T/C CV 5.98％ 6.05％ 4.06％ 8.55％ 7.05％ 6.82％
由表2-3可知，Tris缓冲液比PBS缓冲液保存更稳定，PH8.0时荧光微球释放效果好，且T/C精密性均＜5％，因此选择配方4即20g牛血清白蛋白、20g蔗糖、5g干酪素钠、50g海藻糖、0.5mL的Proclin 300溶液、1000mL的PH为8.0的0.02M Tris缓冲液为标记保存液最终配方。
进一步地，样品垫处理液由10mg抗人RBC抗体、20mg阻断剂001、10g牛血清白蛋白、5mL的Tween-20、1000mL的0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液组成；样品垫处理液配方的选择过程如下：
(A)按如下表4配制4中不同的样品垫处理液
表4样品垫处理液1-4配方表
Figure BDA0004091369980000082
(B)制备样品垫，设置浸纸压垫机轮轴高度，分别倒入四种样品垫处理液，处理好的样品垫放置晾架上干燥过夜(16-24h)，干燥完成后，将各厂家原料制备的实验材料组装成试剂卡后与未添加过抗人RBC抗体和阻断剂001的试剂卡同时实验，用添加干扰物的健康人样本不假阳、全血样本不爬膜进行评估
评估结果如下：
表5四种样品垫处理液测试全血样本的效果
Figure BDA0004091369980000083
Figure BDA0004091369980000091
表6四种样品垫处理液测试添加干扰物的参考品的效果
Figure BDA0004091369980000092
由表5-6可以看出，10mg、20mg阻断剂001均有效拦截红细胞，20mg阻断剂001测试添加干扰物的参考品和未添加干扰物的参考品T/C无明显差异，抗干扰能力较强，样品垫处理液2、样品垫处理液3均符合要求，综合成本因素，最终选择样品垫处理液3即10mg抗人RBC抗体、20mg阻断剂001、10g牛血清白蛋白、5mL的Tween-20、1000mL的0.2M pH8.0硼酸硼砂缓冲液为样品垫处理液配方。
将实施例制备得到批号1-3细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的试剂盒进行如下性能测试：
1.实施例制备得到批号1-3细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒分析性能线性性能评估：
线性性能评估实验材料准备步骤如下：
(a)低浓度样本配制：收集浓度0.25ng/mL的人血清样本；
(b)将经过处理的阴性血清基质，添加适量的促甲状腺激素抗原配置成浓度约为650ng/mL作为高浓度样本；
(c)各浓度样本制备方法：将高、低浓度样本按照表7混合成11个浓度，用1-11表示每个浓度样本。
表7线性评价各浓度样本配制表
Figure BDA0004091369980000093
Figure BDA0004091369980000101
线性的建立如下：
取三批试剂分别对上述编号1-11的线性浓度样本进行测定，每份样本重复测定4次，按照以下公式(1)、(2)计算每份样本4次检测结果的平均值(M)与理论值之间的相对偏差(B)和线性相关系数(r)。
B＝(M-T)/ T×100％.................... (1)
式中：B——相对偏差；M——检测结果的平均值；T——理论值。
Figure BDA0004091369980000102
式中：
r——回归系数；Xi——理论浓度；Yi——理论浓度相对应的4次重复检测结果的均值；i——1，2，3，……n。
线性验证：取三批试剂分别对上述浓度点进行测定，每份样本重复测定3次，按照以下公式(2)计算每份样本3次检测结果的平均值(M)和线性相关系数(r)。
线性性能评估结果如下：
表8.批号1-3试剂盒线性范围建立检测结果表(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000103
Figure BDA0004091369980000111
表9批号1-3试剂盒线性验证数据表(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000112
Figure BDA0004091369980000121
由表8试验数据可知，线性样本10(585.03ng/mL)和线性样本11
(650.00ng/mL)的测试结果均值的相对偏差都超过15％，不符合要求，排除这两个浓度点；由图1-3可知，三批试剂呈线性关系，在[0.25，500]ng/mL线性范围内，相关系数r分别为0.9976、0.9978、0.9970；由此可知，线性样本1-9的测试结果同时满足上述接受条件，即本测定试剂线性范围确定为[0.25，500]ng/mL；
线性验证：通过表9试验数据可知，[0.25，500]ng/mL范围内，三个批次的CYFRA21-1试剂的相关系数(r)测试结果均大于0.9900，即确认CYFRA21-1线性范围为[0.25，500]ng/mL；
结论：由上述试验结果表明，线性建立和验证均满足上述设计要求，故以在[0.25，500]ng/mL范围内，线性回归的相关系数r≥0.9900，作为本产品的线性性能指标。
2.实施例制备得到批号1-3细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒分析性能准确度性能评估：
准确度性能评估方法如下：
对准确度参考品的检测
在低浓度的血清基质(或其他体液成分)中加入一定体积具有溯源性的细胞角蛋白19片段标准溶液或高浓度样本(标准溶液体积与人源样本体积比例为不大于1：9)，配制浓度约为4ng/mL、200ng/mL的准确度参考品，每个浓度重复检测3次，取平均值，根据公式(1)计算，其回收率应符合4的要求。
Figure BDA0004091369980000122
式中：
R：回收率；V：加入标准溶液的体积；V0：人源样本的体积；C：人源样本加入标准溶液后的检测浓度的平均值；C0：人源样本的检测浓度的平均值；Cs：标准溶液的浓度。
准确度性能评估结果如下
表10.批号1-3试剂盒准确度测试结果表(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000131
由表3试验数据可知，实施例制备得到的批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒准确度满足设计要求，故以回收率应在85％-115％，作为本产品的准确度性能指标。
3.试剂盒分析性能精密度性能评估
精密度性能评估方法如下：
使用实施例中制备得到的批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测取质检合格的三批本试剂盒，同一个操作者在同一台仪器上在相同条件下分别检测浓度为4.03ng/mL和200.38ng/mL的CYFRA21-1企业参考品，每个样本重复测定2次，共检测20天。评估结束时共有60对，即120个测试结果。从每批次测量中40次数据计算出批内精密度。从所有120个数据计算出批间精密度。
精确度性能评估结果如下：
表11批号1-3试剂盒低值样本精密度检测数据(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000132
Figure BDA0004091369980000141
表12批号1-3试剂盒高值样本精密度检测数据(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000142
Figure BDA0004091369980000151
表13批号1-3试剂盒低值及高值样品批内及批间指标汇总表(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000152
表14批号1-3试剂盒精密性评估重复性验证数据结果(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000153
Figure BDA0004091369980000161
通过表11-14试验数据可知，实施例中制备得到的批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的重复性(CV)检测结果均≤10％。批间差(CV)均≤15％；因此精密度均满足上述设计要求，故以批内变异系数(CV)应≤10％；批间变异系数(CV)应≤15％，作为本产品的精密度性能指标。
4.试剂盒分析性能钩状效应(Hook)性能评估
钩状效应(Hook)性能评估试验材料准备如下：
(a)低浓度样本配制：阴性血清基质；
(b)高浓度样本配制：取细胞角蛋白19片段抗原，用阴性血清基质配制的浓度约为2500ng/mL的细胞角蛋白19片段高浓度样本；
(c)将高浓度样本、低浓度样本按如下表15所示标号为1-8的不同浓度样本；经混匀处理后，分装，封口储存于-20℃。
表15Hook性能评估用低浓度样本及高浓度样本比例表
编号 1 2 3 4 5 6 7 8
低浓度体积(mL) 1.000 0.996 0.960 0.920 0.900 0.800 0.400 0.000
高浓度体积(mL) 0.000 0.004 0.040 0.080 0.100 0.200 0.600 1.000
预期值(ng/mL) 0.25 20 200 400 500 1000 2000 2500
钩状效应(Hook)性能评估试验方法如下：
使用实施例中制备得到的批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒分别对上述编号1-8的线性浓度样本进行测定，每份样本重复测定3次，按照如下公式(1)计算每份样本3次检测结果的平均值(M)与理论值之间的相对偏差(B)
B＝(M-T)/ T×100％.................... (1)
式中：B——相对偏差；M——检测结果的平均值；T——理论值。
并将样本浓度在2500nmol/L以下时不得出现HOOK效应作为本申请的可接受标准。
钩状效应(Hook)性能评估结果如下：
表16批号1-3试剂盒钩状(Hook)效应测试结果(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000171
由表16试验数据及图4-6可知，当CYFRA21-1浓度为[0.25-500]ng/mL时，实施例中制备得到的批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒检测浓度均值与理论浓度呈线性且相对偏差在±15％范围内；当CYFRA21-1浓度在(500-2000]ng/mL时，检测浓度均值与理论浓度呈正相关，但相对偏差超过了±15％范围；当CYFRA21-1浓度达到2500ng/mL时出现钩状效应且相对偏差超过了±15％范围；结论：当CYFRA21-1浓度不超过2000ng/mL时，未见明显HOOK效应。
5.试剂盒分析性能HAMA效应性能评估
HAMA效应性能评估试验材料如下：
如下表17所示，选取4份不同浓度的CYFRA21-1临床样本，每份样本分为四等份，一份通过加入15％体积的HAMA阳性样本(HAMA阳性样本本项目为阴性)，作为实验组1；一份通过加入10％体积的HAMA阳性样本(该HAMA阳性样本本项目为阴性)和5％体积的阴性血清，作为实验组2；一份通过加入5％体积的HAMA阳性样本(该HAMA阳性样本本项目为阴性)和10％体积的CYFRA21-1阴性血清，作为实验组3；一份通过加入15％体积的阴性血清，作为对照组。
表17HAMA效应性能评估样品表
组别 HAMA血清浓度(ng/mL)
实验组1 90
实验组2 60
实验组3 30
对照组 0
HAMA效应性能评估试验试验方法如下：
使用实施例中制备得到的批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒分别对实验组和对照组样本进行测试，各重复测定3次，按如下公式(2)计算干扰率。
B＝(M-T)/ T×100％.................... (2)
式中：B——相对偏差；M——实验组样本浓度均值；T——对照组样本浓度均值。
HAMA效应性能评估结果如下：
表18批号1-3试剂盒对样本1HAMA效应实验结果(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000181
表19批号1-3试剂盒对样本2HAMA效应实验结果(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000182
Figure BDA0004091369980000191
表20批号1-3试剂盒对样本3HAMA效应实验结果(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000192
表21批号1-3试剂盒对样本4HAMA效应实验结果(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000193
由表18-21试验数据可知，当HAMA血清浓度≤60ng/mL时，相对偏差均≤±15.0％；因此HAMA血清浓度≤60ng/mL对检测样本无明显干扰。
6.试剂盒分析性能空白限性能评估
空白限性能评估试验方法如下：
使用实施例制备得到的批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，用0mIU/L CYFRA21-1参考品重复测定20次，其相对T/C平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对的数值，将其带入线性方程中，得出相应浓度值，即为产品的空白限。
空白限的建立过程如下：
对选取的3份空白阴性基质样本进行重复4次测试，连续测试5天，可获得60个测试数据，对测试数据进行正态性检验及空白限计算。
空白限性能评估试验结果如下：
表22空白限建立数据表(ng/mL)
Figure BDA0004091369980000201
Figure BDA0004091369980000211
由上表22试验数据可知，实施例制备得到的批号1-3的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的空白限分别为：0.09ng/mL、0.09ng/mL、0.09ng/mL；因此，空白限均满足上述设计要求，故以不大于0.1ng/mL，作为本产品的空白限性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，包括细胞角蛋白19片段检测卡、稀释液以及芯片，所述细胞角蛋白19片段检测卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条包括PVC底板及依次设于所述PVC底板上的样品垫、结合垫、NC膜和吸水纸，所述NC膜上设有检测线和质控线，其特征在于，
检测线包被有CYFRA21-1包被抗体，包被浓度为0.8-1.2mg/mL；
质控线包被有鸡IgY抗体，包被浓度为0.8-1.2mg/mL；
所述结合垫上喷涂有荧光微球标记的标记抗体溶液，荧光微球标记的抗体溶液具体为：荧光微球CYFRA21-1-L标记抗体溶液和荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液的混合液。
2.根据权利要求1所述的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述标记抗体溶液喷量为3-5μL/cm。
3.根据权利要求1所述的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述CYFRA21-1包被抗体溶液的喷量为1μL/cm，所述鸡IgY溶液喷量为1μL/cm。
4.根据权利要求1所述的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，荧光微球CYFRA21-1-L标记抗体溶液，配制步骤如下：
A.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
D.加入CYFRA21-1-L标记抗体10μg，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
G.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀即得。
5.根据权利要求1所述的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体溶液，配制步骤如下：
A.取2mL离心管加入标记缓冲液MES 1mL；取混匀固含量为1％的荧光微球20μL于标记缓冲液中，再次涡旋混匀；
B.加入标记活化液100μL混匀，旋转混匀反应30min；
C.在离心转速为10000rpm下，进行离心30min；弃去上清液，加入标记缓冲液1000μL，超声；
D.加入羊抗鸡IgY抗体16μg，旋转混匀反应30min；
E.加入标记封闭液100μL后超声，旋转混匀反应2h；
F.离心30min；弃去上清液，加入标记保存液1mL超声；
G.将标记物移入新的10mL离心管中，吸取标记保存液4mL清洗标记所用2mL离心管，清洗后将其移入10mL离心管中，涡旋混匀即得。
6.根据权利要求5所述的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，标记活化液配制方法为，将0.02g的EDC溶解与1mL纯化水内溶解。
7.根据权利要求5所述的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述标记缓冲液配制方法为，在80ml纯化水中加入1.067g MES，溶解后用1mol/L HCl溶液或1mol/L NaOH溶液调pH＝6.2±0.05，定容至100mL即得标记缓冲液。
8.根据权利要求5所述的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述标记保存液由20g牛血清白蛋白、20g蔗糖、5g干酪素钠、50g海藻糖、0.5mL的Proclin300溶液、1000mL的PH为8.0的0.02M Tris缓冲液组成。
9.根据权利要求1所述的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒，其特征在于，所述荧光微球为南京微测生物的Eu-荧光纳米微球300nm。
10.根据权利要求1-9任一项所述的细胞角蛋白19片段荧光免疫层析法测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：在NC膜上设置检测线和质控线，将CYFRA21-1包被抗体、鸡IgY抗体都按0.8-1.2mg/mL的浓度配制包被工作液，都按1μL/cm的喷量将两者划到NC膜上的检测线和质控线上后干燥；
步骤2：将荧光微球标记的抗体溶液按照3-5μL/cm喷量，将其喷到剪裁后的结合垫上后干燥；
步骤3：样品垫浸泡预处理好后干燥；
步骤4：将上述已处理的样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸按顺序依次粘贴在PVC板上，组装成试剂卡。
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