CN116158403A - SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的肾纤维化模型的建立 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及SARS‑CoV‑2包膜蛋白诱导的肾纤维化模型的建立。具体包括一种SARS‑CoV‑2包膜蛋白诱导的小鼠肾纤维化模型的建立以及一种SARS‑CoV‑2包膜蛋白诱导的HK‑2细胞上皮间充质转化模型的建立。本发明首次公开了SARS‑CoV‑2包膜蛋白诱导的肾纤维化模型的建立方法，解决了现有的SARS‑CoV‑2直接感染模型建立方法中成本高、操作条件严苛等问题，为进一步深入研究SARS‑CoV‑2相关的肾脏病理机制以及筛选相关药物提供了新的实验途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的肾纤维化模型的建立，具体为一种SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的小鼠肾纤维化模型的建立以及一种SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的HK-2细胞上皮间充质转化模型的建立。
背景技术
新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)严重危害到了人类健康。SARS-CoV-2除了侵害呼吸系统，还会损害全身多种器官。其中，肾脏就是主要受损器官之一。SARS-CoV-2能够直接感染肾细胞，感染后的肾脏主要表现为肾小管损伤，并在患者尸检样本发现肾小管间质纤维化相关指标显著增加。临床上，SARS-CoV-2感染者的肾脏损害，不仅会增加治疗和护理的难度，还会增加患有潜在肾脏疾病的人的死亡率。一种SARS-CoV-2相关的肾纤维化模型对于SARS-CoV-2的深入研究有着重要的意义。然而，SARS-CoV-2直接感染模型的建立有着以下两个难点：(1)SARS-CoV-2无法感染啮齿类动物，需要用到人源化的小鼠，模型成本大幅增高；(2)SARS-CoV-2需要在生物安全3级的实验室操作，操作要求严苛，大部分实验室无法实现。于是，建立一种与SARS-CoV-2直接感染类似的肾纤维化动物模型意义重大。动物的脏器纤维化对应于细胞层面就是上皮间充质转化，上皮细胞由一系列病理因素导致的向间充质细胞的转化是纤维化发生的基础。所以，在细胞层面建立一种与SARS-CoV-2直接感染类似的上皮间充质转化模型同样具有重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的小鼠肾纤维化模型的建立以及一种SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的HK-2细胞上皮间充质转化模型的建立，解决了现有的SARS-CoV-2直接感染模型建立方法中成本高、操作条件严苛等问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了SARS-CoV-2包膜蛋白在诱导肾纤维化模型建立的应用。
其中，所述SARS-CoV-2包膜蛋白需通过pET28a-SARS-CoV-2-E-6×His质粒原核表达系统纯化提取。
优选地，所述原核表达系统为大肠杆菌E.coli BL21 DE3 pLysS表达体系。
具体地，22℃下用0.5mM异丙基-b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷诱导SARS-CoV-2蛋白质表达16-18小时，随后纯化获得SARS-CoV-2包膜蛋白。
优选地，所述纯化的具体方法为：使用Ni-NTA树脂分离6×His包膜蛋白并用内毒素去除琼脂糖树脂去除内毒素。
肾纤维化模型包括动物模型和细胞模型：
其中动物模型，使用啮齿类动物，如小鼠，将纯化的包膜蛋白通过尾静脉注射入小鼠体内(25mg·kg-1)，一次注射，期间收集尿液检测尿肌酐和尿蛋白水平，监测肾功能，约4周后出现明显肾纤维化，得到肾纤维化动物模型；
优选的，本发明中动物模型建立使用野生型小鼠即可。
优选的，本发明中动物模型建立只需要尾静脉注射一次。
优选的，本发明中动物模型建立只需要4周时间。
其中细胞模型，使用人肾小管上皮细胞——HK-2细胞系，HK-2细胞无血清饥饿12小时后，将纯化的包膜蛋白(2μg/mL)加入HK-2细胞培养基中继续培养24小时,HK-2细胞出现明显上皮间充质转化，得到肾纤维化细胞模型。
优选的，本发明中细胞模型建立只需要加诱导物一次，无其他特殊操作。
本发明所建立的细胞模型，上皮间充质转化相关指标显著上调。
与现有技术相比，本发明有如下优势：
本发明的技术方案表明了包膜(Envelope,E)蛋白作为SARS-CoV-2的主要结构蛋白之一，其能够作为一种独立的毒力因子引起炎症和多器官损伤。而且包膜蛋白所诱导的损伤类型与SARS-CoV-2直接感染引起的损伤高度相似，能够很好地代替研究SARS-CoV-2相关的病理过程。
本发明进一步提供了一种利用SARS-CoV-2的一个结构蛋白——包膜蛋白直接感染的肾纤维化动物及细胞模型建立方法。
附图说明
图1.包膜蛋白对小鼠肾功能和体重的影响：
(A)动物造模的示意图：Mock组(n＝6)，小鼠尾静脉注射与纯化蛋白等体积的TBS(纯化蛋白洗脱液)；E Protein组(n＝6)，小鼠尾静脉注射包膜蛋白(25mg·kg-1体重)；(B)肾功能评估(n＝6)，蛋白尿通过尿蛋白与肌酐的比值进行定量；(C)实验期间小鼠体重变化(n＝6)。
图2.包膜蛋白对小鼠肾脏病理结构的影响：
(A)代表性的肾脏病理损伤图；(B)代表性的肾脏苏木精-伊红染色(H&E)图像(比例尺＝50μm)。
图3.包膜蛋白诱导小鼠肾脏纤维化：
(A)包膜蛋白对肾脏纤维化指标(fibronectin(FN),vimentin,和α-smoothmuscle actin(α-SMA))蛋白表达的影响；(B)蛋白表达水平的定量分析；(C)包膜蛋白对纤维化指标(fibronectin(FN),vimentin,和α--smooth muscle actin(α-SMA))mRNA水平的影响；(D)代表性的肾脏Masson三色染色图像(比例尺＝50μm)。所有值均为平均值±SD；单向方差分析。**P＜0.01，***P＜0.001，(n＝6)。
图4.包膜蛋白诱导HK-2细胞上皮间充质转化：
(A)包膜蛋白对细胞上皮间充质转化指标(fibronectin(FN),vimentin,和α-smooth muscle actin(α-SMA))蛋白表达的影响；(B)蛋白表达水平的定量分析。所有值均为平均值±SD；单向方差分析。ns P＞0.05，*P＜0.05，***P＜0.001，(n＝5)。
图5.包膜蛋白通过刺激小鼠肾脏TGF-β1的分泌激活TGF-β1/Smad2/3通路：
(A)小鼠血清中TGF-β1的水平。(B)包膜蛋白对肾脏TGF-β1/Smad2/3通路的激活情况的影响。(C)蛋白表达水平的定量分析。所有值均为平均值±SD；单向方差分析。***P<0.001，(n＝6)。
图6.包膜蛋白通过刺激HK-2细胞TGF-β1的分泌激活TGF-β1/Smad2/3通路：
(A)HK-2细胞培养上清中TGF-β1的水平。(B)包膜蛋白对HK-2细胞TGF-β1/Smad2/3通路的激活情况的影响。(C)蛋白表达水平的定量分析。所有值均为平均值±SD；单向方差分析。***P<0.001，(n＝5)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的小鼠肾纤维化模型的建立方法，具体如下：
1、动物
C57BL/6小鼠，雄性，8周，购于上海灵畅实验动物有限公司，饲养于复旦大学药学院实验动物中心SPF级动物实验室。
2、实验材料
抗α-SMA(1:10000)和FN(1:1000)抗体购自Abcam。抗GAPDH(1:5000)、p-Smad23(1:10001)、Smad23和vimentin(1:1000)抗体购自Cell Signaling Technology(CST)。抗TGF-β1(1:1000)购自爱博泰克。
3、实验仪器
生物安全柜(Thermo Fisher)，CO2细胞培养箱(Thermo Fisher)、冷冻离心机(Thermo Fisher)、微量移液器(Eppendorf)、恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)、凝胶电泳装置(Bio Rad)、转印装置(Bio Rad)、凝胶图像处理系统(BioRad)、倒置显微镜(Carl Zeiss)、Q-RTPCR仪(Bio-Rad)、组织匀浆仪(上海净信科技)、酶标仪(Tecan SystemsInc.)。
4、实验方法
(1)蛋白质纯化
诱导表达：将pET28a-SARS-CoV-2-E-6×His质粒转染到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS(TransGen Biotech)中以表达融合蛋白。在50μg·mL-1卡那霉素的50mL LB培养基中开始扩增单个菌落，并在37℃下以220rpm振荡培养细胞。起始培养物接种至1LLB培养基中(含50μg·mL-1卡那霉素)，37℃，220rpm振荡培养，直到600nm处的光密度(OD600)达到0.6-0.8。然后加入0.5mM IPTG(异丙基-b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷；Yeasen)，22℃，220rpm，诱导蛋白质表达16-18小时。
制备蛋白悬液：4℃，8000rpm离心20分钟收集细菌，并将其重新悬浮在结合缓冲液(150mMNaCl,20mM Tris-base,1mM DTT,1％PMSF,1×cocktail,pH 8.0)中。将重新悬浮的细菌在4℃下用超声仪裂解60分钟。通过在4℃下以10000g离心30分钟将细胞裂解物的可溶性部分与细胞碎片分离，并通过0.22μM过滤器过滤上清液以去除颗粒。
分离纯化：用TBS缓冲液(150mM NaCl，20mM Tris-base，pH 8.0)预平衡Ni-NTA树脂(Yeasen)。将澄清的上清液加载在5mLNi-NTA上4小时，以从大肠杆菌蛋白中分离E-6×His融合蛋白。分别用含20mM、30mM、50mM的咪唑浓度的TBS洗脱液，以10倍柱体积洗涤柱。洗涤后，用含300mM咪唑的TBS洗脱液洗脱E-6×His融合蛋白。然后使用用TBS预平衡的Superdex 75Increase 10/300凝胶过滤色谱(GE Healthcare)纯化E-6×His融合蛋白。最后，用内毒素去除琼脂糖树脂(Yeasen)去除内毒素。
浓缩：TBS平衡琼脂糖树脂后，将纯化的蛋白以0.25mL·min-1的速度加载到树脂上。使用离心过滤装置(Amicon@Ultra)收集洗脱液进行浓缩。
(2)SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的小鼠肾纤维化模型的建立
将12只8周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为2组：对照组(n＝6)，尾静脉注射与纯化蛋白等体积的TBS(纯化蛋白洗脱液)；包膜蛋白组(n＝6)，尾静脉注射纯化包膜蛋白(25mg·kg-1体重)
(3)肾功能评估
造模期间收集尿液样本，通过尿蛋白与肌酐的比值评估肾功能。通过尿蛋白检测试剂盒(中国南京建城生物工程研究所)测量尿蛋白含量。用肌酐测定试剂盒(中国南京建城生物工程研究所)测定肌酐含量。
(4)肾脏病理检测
将分离的小鼠肾脏组织并在室温下在10％福尔马林中固定48小时。固定组织包埋在石蜡中，并切成4μm厚的切片，进行苏木精-伊红染色(H&E)和Masson三色染色。
(5)细胞因子TGF-β1的检测
将小鼠血清在4℃下以1500g离心10min，收集上清液。小鼠血清中的细胞因子按照说明书使用ELISA试剂盒(Multi Science Biotech)进行测定。
(6)蛋白质表达检测
通过Western blotting分析肾脏中的蛋白质。用补充有1％混合蛋白酶抑制剂(Beyotime)的RIPA缓冲液在冰上裂解肾脏组织30分钟。通过12000g离心15分钟除去不溶性物质，并收集上清液。
使用BSA作为标准，用BCA蛋白质测定法(Beyotime)给蛋白定量。在样品蛋白中加入SDS-PAGE样品加载缓冲液(Beyotime)，于95℃变性5～10分钟。通过SDS-PAGE分离各个分子量的蛋白，转膜至PVDF膜(Millipore)，在室温下用TBST缓冲液(0.1％Tween-20和0.1MNaCl，0.1M Tris-HCl，pH 7.5)中的5％无脂牛奶封闭1小时，然后在4℃下与一抗孵育过夜。用TBST洗涤三次(每次10分钟)后，加入辣根过氧化物酶结合的二抗(1:5000；SantaCruz Biotechnology)，并在室温下孵育1小时。通过使用图像分析系统(Quantity One软件；BioRad ChemidDoc，BioRad，USA)定量分析蛋白质带。
(7)mRNA检测
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从肾脏中提取总RNA，并使用primeScriptRTMaster Mix(Takara)合成互补DNA。根据说明书，使用TB Green预混物Ex Taq(Takara)进行qRT PCR扩增。以GAPDH基因为内参，将结果归一化，并使用2-(ΔΔCt)公式计算变化倍数。
实验结果如图1、2、3、5所示：包膜蛋白能够损伤肾小管细胞，造成体重下降、蛋白尿以及明显肾纤维化，且诱导肾纤维化的相关机制可能是通过促进TGF-β1的分泌，从而激活了TGF-β1/Smad2/3通路。
实施例2
本实施例公开了一种SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的HK-2细胞上皮间充质转化模型建立的方法。
实验方法如下：
(1)SARS-CoV-2包膜蛋白诱导的HK-2细胞上皮间充质转化模型的建立
HK-2(人肾近端小管上皮细胞)在RPMI1640培养基(Thermo Fisher Scientific)中培养，培养基中含有10％血清(Gibco)和100U·mL-1青霉素/链霉素(Gibco)。
将5×105HK-2细胞接种在具有完整培养基的6孔板中12小时。然后，在无血清的培养基中饥饿12-16小时。饥饿后，用纯化的包膜蛋白以一系列浓度(0.5、1、2μg/mL)刺激细胞24小时。
(2)细胞因子TGF-β1的检测
将细胞培养上清在4℃下以1500g离心10min，收集上清液。细胞因子按照说明书使用ELISA试剂盒(Multi Science Biotech)进行测定。
(6)蛋白质表达检测
通过Western blotting分析细胞中的蛋白质。用补充有1％混合蛋白酶抑制剂(Beyotime)的RIPA缓冲液在冰上裂解肾脏组织30分钟。通过12000g离心15分钟除去不溶性物质，并收集上清液。
使用BSA作为标准，用BCA蛋白质测定法(Beyotime)给蛋白定量。在样品蛋白中加入SDS-PAGE样品加载缓冲液(Beyotime)，于95℃变性5～10分钟。通过SDS-PAGE分离各个分子量的蛋白，转膜至PVDF膜(Millipore)，在室温下用TBST缓冲液(0.1％Tween-20和0.1MNaCl，0.1M Tris-HCl，pH 7.5)中的5％无脂牛奶封闭1小时，然后在4℃下与一抗孵育过夜。用TBST洗涤三次(每次10分钟)后，加入辣根过氧化物酶结合的二抗(1:5000；SantaCruz Biotechnology)，并在室温下孵育1小时。通过使用图像分析系统(Quantity One软件；BioRad ChemidDoc，BioRad，USA)定量分析蛋白质带。
(7)mRNA检测
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞中提取总RNA，并使用primeScriptRTMaster Mix(Takara)合成互补DNA。根据说明书，使用TB Green预混物Ex Taq(Takara)进行qRT PCR扩增。以GAPDH基因为内参，将结果归一化，并使用2-(ΔΔCt)公式计算变化倍数。
实验结果如图4、6所示：包膜蛋白能够诱导HK-2细胞发生明显的上皮间充质转化，且诱导上皮间充质转化的相关机制可能是通过促进TGF-β1的分泌，从而激活了TGF-β1/Smad2/3通路。相关机制与动物模型相似。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.SARS-CoV-2包膜蛋白在诱导肾纤维化模型建立的应用。
2.如权利要求1所述的SARS-CoV-2包膜蛋白的提取方法，其特征在于，所述SARS-CoV-2包膜蛋白需通过pET28a-SARS-CoV-2-E-6×His质粒原核表达系统纯化提取。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述原核表达系统为大肠杆菌E.coliBL21DE3 pLysS表达体系。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，22℃下用0.5mM异丙基-b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷诱导SARS-CoV-2蛋白质表达16-18小时，随后纯化获得SARS-CoV-2包膜蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纯化的具体方法为：使用Ni-NTA树脂分离6×His包膜蛋白并用内毒素去除琼脂糖树脂去除内毒素。
6.如权利要求1所述的肾纤维化模型，其特征在于，包括动物模型和细胞模型。
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