CN112472795B - 用于抑制细胞对炎性因子刺激的应答的生物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了用于抑制细胞对炎性因子刺激的应答的生物制剂，所述生物制剂包括PRD肽段和/或TAD肽段，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过分子生物学分析方法，找到了PRD肽段是YAP1蛋白中抑制炎性刺激应答的正向调控区域，TAD肽段是YAP1蛋白中抑制炎性刺激应答的负向调控区域；两者均可以抑制TNF‑α、IL‑1β、LPS的信号通路，该发现为PRD肽段和/或TAD肽段可用于由于细胞因子过量产生导致的疾病中，从而为免疫治疗提供了新的途径。

Description

用于抑制细胞对炎性因子刺激的应答的生物制剂
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及用于抑制细胞对炎性因子刺激的应答的生物制剂。
背景技术
人体细胞在受到微生物感染时，一些基因的转录增加，从而翻译出有助于清除病原体的蛋白。这些基因中，有些基因的产物为细胞因子或趋化因子，它们对于对抗病原体至关重要。来自革兰阴性菌的脂多糖LPS是目前已知可引起上述基因表达上调的最强刺激，被上调的基因包括TNFα和IL-1β，而它们又可以再诱导其他细胞因子和趋化因子的产生，因此TNF-α和IL-1β本身又可以加重感染导致的炎症。
然而，有些基因的过渡激活会损伤人体。败血症我们并不陌生，这是一种十分严重、可危及生命的急性全身性感染，它就是由于人体针对病原体感染产生了过多的细胞因子，如 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18、TNF-α等，这在临床中被称为“细胞因子风暴”。但是细胞因子风暴并不仅限于细菌感染，COVID-19新型冠状病毒肺炎是由于一种冠状病毒的感染，新冠病人的“细胞因子风暴”就与死亡率上升密切相关。
在T细胞免疫治疗中细胞因子风暴也可能发生，被称为细胞因子释放综合征。在慢性炎症疾病如类风湿性关节炎(RA)及炎症性肠炎(IBD)等疾病中，这类细胞因子会一直持续产生。
肿瘤坏死因子α是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，其主要功能是调节免疫细胞，作为一种内源性致热源，可以导致发热、引起细胞凋亡，组织肿瘤发生和病毒复制，其功能失调被认为和很多疾病相关，比如阿尔兹海默症，银屑病，癌症，重度抑郁，肠炎等；TNF的受体可以向细胞内传导生存和死亡的信号，对于细胞的繁殖、分化、凋亡以及免疫反应的调控和炎症的诱导等起着重要的作用，因此在许多疾病中，TNF-α已经被称为治疗靶点之一。
现有技术关于TNF-α的抑制剂种类较少，因此有必要开发新的以TNF-α为治疗靶点的药物，以满足治疗不同病症的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术缺乏抑制炎性刺激的药物的技术缺陷，在现有技术的理论基础上，首先提供了一种用于抑制细胞对炎性刺激应答的药物。
本发明的第二个目的是提供PRD肽段和/或TAD肽段在制备抑制细胞对炎性刺激应答的药物方面的应用。
本发明的第三个目的是提供PRD肽段和/或TAD肽段在制备治疗细胞因子风暴介导进程的疾病的药物的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于抑制细胞对炎性刺激应答的药物，所述药物包括PRD肽段和/或TAD肽段，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的研究构思：相关研究表明YAP1(yes关联蛋白1)是转录因子，激活与细胞增殖及抑制凋亡相关的基因的转录，目前对于YAP1的研究主要着重于它可以作为转录因子，已经发现其对于肿瘤坏死因子TNF-α的信号通路有抑制作用，但是具体的抑制机制还不是很明确，本发明则在现有研究的基础上发现：在人类的成纤维关节滑膜细胞(FLS)中，YAP1 也抑制了TNF-α诱导的基因表达。通过YAP1敲减实验发现：当YAP1蛋白含量下降时，TNF-α诱导的基因表达上调；在其他细胞系，例如上皮细胞HCT-8细胞，人单核细胞系THP-1以及人外周血单核细胞PBMC中，均发现了类似的现象，在此基础上，本发明通过YAP1敲除实验，发现YAP1敲除和YAP1敲减所导致的实验结果相似，且YAP1敲除细胞中YAP1蛋白表达水平与未敲除的细胞中表达水平并无明显差异，在后续的实验中，通过克隆分析信使RNA，找到PRD肽段是YAP1蛋白中抑制炎性刺激应答的关键作用区域。
虽然YAP1之前被广泛研究，其主要作用被定义为抑制肿瘤坏死因子TNF信号，但是YAP1抑制TNF信号的具体机制仍不完全明确，既有的可能机制也均与本发明研究发现的完全不同，在此之前，YAP1主要均作为共转录因子为人所知，尤其是在炎症刺激通路中，YAP1除转录因子之外的作用尚未被揭示。而且YAP1不同亚型的功能一直以来被认为是一样的，本发明首次通过实验以及研究数据揭示，YAP1作为非转录因子抑制炎症信号通路，YAP1的不同亚型由于不同区域的片段增减，可能行使完全相反的功能，并且表明了YAP1通过两个区域的肽段实现抑制。因此，若合成PRD和TAD肽，其均可模拟YAP1的功能，抑制炎性因子刺激引起的反应。
另外，在找到PRD肽段的基础上，本发明通过过表达YAP1以及对YAP1蛋白不同亚型的结构以及功能验证分析，发现YAP1蛋白上的反式激活区段(TAD)也可以抑制TNF-α、 IL-1β、LPS的信号通路。
优选地，上述药物中所述细胞包括成纤维细胞、单核细胞、上皮细胞；具体地，所述成纤维细胞为成纤维关节滑膜细胞FLS，所述单核细胞为人单核细胞系THP-1或者人外周血单核细胞PBMC，所述上皮细胞为HCT-8。
优选地，所述炎性刺激包括TNF-α刺激、IL-1β刺激和/或LPS刺激。
优选地，所述药物能够抑制炎性刺激诱导的基因表达；所述基因包括IL-6、IL-8、CXCL10、 IL-32、CCL2、CCL20、COX-2。
更优选地，所述PRD肽段或/和TAD肽段均能够抑制TNF-α刺激、IL-1β刺激或者LPS刺激诱导的基因IL-8的表达。
因此，本发明还提供PRD肽段和/或TAD肽段在制备抑制细胞对炎性刺激应答的药物方面的应用，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述细胞包括成纤维细胞、单核细胞、上皮细胞；所述炎性刺激包括TNF-α刺激、IL-1β刺激或者LPS刺激。
优选地，所述药物能够抑制炎性刺激诱导的基因表达；所述基因包括IL-6、IL-8、CXCL10、 IL-32、CCL2、CCL20、COX-2。
更优选地，所述PRD肽段或/和TAD肽段均能够抑制TNF-α刺激、IL-1β刺激或者LPS刺激诱导的基因IL-8的表达。
本领域技术人员知道，TNF-α刺激、IL-1β刺激或者LPS刺激会再诱导体内其他细胞因子和趋化因子的产生，这些细胞因子和趋化因子的而过渡激活导致“细胞因子风暴”，从而会损伤人体，由于本发明的能够抑制炎性刺激诱导的基因表达，因此也可以用于治疗细胞因子风暴介导进程的疾病。
因此，本发明还提供PRD肽段和/或TAD肽段在制备治疗细胞因子风暴介导进程的疾病的药物的应用，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述细胞因子风暴介导进程的疾病包括免疫性疾病、细菌或病毒感染、肿瘤免疫治疗引起的细胞因子释放综合征。
例如，在制备有关自身免疫疾病、在肿瘤免疫治疗和COVID-19中的细胞因子释放综合征的药物中的应用。
更优选地，所述疾病包括败血症、新型冠状病毒肺炎、炎症性肠病、类风湿性关节炎。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种用于抑制细胞对炎性刺激应答的药物，所述药物包括PRD肽段和/或 TAD肽段，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明通过分子生物学分析方法，找到了PRD肽段是YAP1蛋白中抑制炎性刺激应答的正向调控区域，TAD肽段是YAP1蛋白中抑制炎性刺激应答的负向调控区域；两者均可以可以抑制TNF-α、IL-1β、LPS的信号通路，该发现为PRD肽段和/或TAD肽段可用于由于细胞因子过量产生导致的疾病中，从而为免疫治疗提供了新的途径。
附图说明
图1为FLS细胞中，YAP敲低对TNF-α(1ng/ml)诱导的基因的表达的影响；其中，图1A显示，与对照组C相比，YAP敲低后YAP1的表达量显著下降，提示YAP敲低细胞构建成功；图1B和图1C显示，在用TNF-α刺激后，YAP敲低的细胞中COX-2和CCL-20的基因表达量显著上调；图1D显示TNF-α刺激24h后，YAP敲低的细胞中IL-8的表达量显著上调；
图2为HCT-8细胞中，YAP敲低对TNF-α(2ng/ml)诱导的基因的表达的影响；其中，图2A显示，与对照组C相比，在用TNF-α刺激前后，YAP敲低后YAP1的表达量均显著下降；图2B显示在用TNF-α刺激前后，YAP敲低后细胞中IL-8、CXCL10和CCL20的表达量均显著上调；
图3为THP-1细胞中，YAP敲低对TNF-α(5ng/ml)或者LPS(200ng/ml)诱导的基因的表达的影响；其中，图3A显示，与对照组C相比，YAP敲低后细胞中YAP1的表达水平下降；图3B中，Unstim为非刺激组，与非刺激组相比，利用TNF-α或者LPS刺激，YAP敲低的细胞中IL-8的表达量均显著上调；
图4为PBMCs细胞中，YAP敲低对TNF-α(2ng/ml)、IL-1β(2ng/ml)或者LPS(200ng/ml) 诱导的基因的表达的影响；其中，图4A显示，无论是在单核细胞还是在T细胞中，与对照组C相比，YAP敲低后YAP1的表达量显著下降；图4B显示，与未刺激组相比，利用TNF-α、 IL-1β或者LPS刺激，YAP敲低的细胞中IL-8的表达量均显著上调；数据差异分析使用非配对T检验(*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，***：p<0.0001)；
图5为HCT-8细胞中，YAP敲除对TNF-α诱导的基因的表达的影响；其中，图5A显示，与对照组C相比，在用TNF-α(2ng/ml)刺激后，YAP敲除后细胞中IL-8、IL-32和CCL20 的表达量均上调；图5B显示，与对照组C相比，利用TNF-α或者IL-1β刺激，YAP敲低的细胞中IL-8的表达量均显著上调；
图6为HCT-8细胞中，YAP敲除或敲低对TNF-α(2ng/ml)诱导激活的信号通路的影响(收集不同刺激时长的全细胞裂解液，并用WB法测定不同蛋白的含量)；实验对照组C是control siRNA及control质粒空载；
图7为正调控作用关键区域的定位示意图；
图8为THP-1细胞中，YAP敲除或者YAP过表达对TNF-α(5ng/ml)或者LPS(200ng/ml)诱导的基因IL-8的表达的影响；实验对照组C是control质粒空载；
图9为HCT-8细胞中，YAP敲除、YAP敲低或者YAP过表达对TNF-α(2ng/ml)诱导的IL-8、IL-32和CXCL10的表达量的影响；实验对照组C是control siRNA及control质粒空载；
图10为YAP1蛋白不同亚型氨基酸结构对比示意图；
图11为YAP1蛋白不同亚型对TNFa诱导的IL-8表达的影响；
图12为HCT-8细胞中，分别转入PRD，或TAD，转染4小时后，用TNFα(2ng/ml) 刺激24小时后，IL-8表达量的变化；图中C指随机序列短肽(对照肽)；
图13为PBMCs细胞中，分别转入PRD(1μg)，或TAD(0.5μg)，转染4小时后，用 TNFα(2ng/ml)，LPS(50ng/ml)或IL-1β(2ng/ml)刺激24小时后，IL-8、IL-6、IL-1β和精氨酸酶的表达量的变化；本图Unstim指未添加TNFa或LPS这类刺激；C指加了随机短肽 (对照肽)；
图14为不含转染试剂的肽段与细胞共培养，并在TNFα(2ng/ml)和IL-1β(1ng/ml)刺激下，不同细胞中IL-18表达量的变化；图中C指随机序列短肽(对照肽)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
试剂：RPMI、DMEM及其他细胞培养基为Gibco；胎牛血清为BI(BiologicalIndustries)； RNAiMAX及Pierce蛋白转染试剂来自ThermoFisher；抗人YAP1 antibody-FITC来自Cell Signaling Technology。
细胞培养：人PBMC和THP-1细胞用RPMI-1640培养(内含10％FBS)，人FLS和HCT-8用DMEM(内含10％FBS)，均置于5％二氧化碳培养箱中。
人白介素-8ELISA：人白介素-8ELISA试剂盒购自ThermoFisher，根据提供的标准实验流程进行ELISA试验。
LegendPLEXTM多因子检测：为了同时量化可溶性细胞因子和趋化因子的浓度，按照标准实验流程，用LegendPLEXTM多因子检测试剂盒检测细胞培养上清。
实施例1YAP敲低(KD)增强TNF-α诱导基因的表达
用RNAiMAXTM转染试剂将对照或YAP1干扰RNA(siRNA)转入FLS细胞(或者HCT-8 细胞/THP-1细胞/PBMCs细胞；转染HCT-8细胞系时同样用到RNAiMAXTM转染试剂，转染THP-1细胞时使用电转染法将对照或YAP1 siRNA转入细胞，转染PBMC时则使用对照慢病毒或YAP1shRNA慢病毒感染细胞)，2天后，对照组(处理方式是control siRNA)不刺激，实验组细胞用TNF-α或者LPS刺激，提取RNA并用qPCR测量白介素-8(IL-8)mRNA 水平，取细胞培养上清液用ELISA法测量IL-8含量，具体操作如下：
1、人PBMC分离与培养
健康成年人外周血的取用得到广州医科大学伦理委员会批准，且抽取外周血得到每位参与者的书面同意。外周血采自健康成年人(25～45岁)，容器为肝素钠抗凝采血管(K2E Vacutainer，BD)。在采血后的2小时内开始PBMC分离，每位供血者两次抽血间隔为20～ 30天，所有参与者未有任何疾病或不适。
所有步骤均在室温进行，外周血与提前预温到室温的无钙镁PBS 1:1混合，在SepMateTM管中加入Lymphoprep外周血单核细胞分离液(Stem Cell Technologies)，再加入稀释后的外周血，1200rcf离心10min，上层为富集单核细胞的细胞悬液，将其倒入另一支离心管，用含 2％FBS的PBS洗2次，得到人PBMC。
2、干扰RNA转染
YAP1 siRNA正义链:5’-GACAUCUUCUGGUCAGAGATT-3’；
YAP1 siRNA反义链:5’-UCUCUGACCAGAAGAUGUC-3’。
用RNAiMAX(Life Technologies,Grand Island，NY)将干扰RNA分别转染入FLS细胞。在转染前一天，将细胞以4×105～5×105个/mL密度重悬于完全培养基中，铺在细胞培养板 (Corning)上。12孔培养板中每孔加入500μL细胞悬液，6孔培养板每孔加入1ml细胞悬液。第二天，细胞密度大约达到80％，根据标准实验流程进行转染。
3、YAP1敲减慢病毒的制备
YAP1 shRNA：
AAAAGACATCTTCTGGTCAGAGATTGGATCCAATCTCTGACCAGAAGATGTC。
上述YAP1 shRNA整合入慢病毒载体LV5，慢病毒制备方式见参考文献(Wang,X.andM. McManus,Lentivirus production.J Vis Exp,2009)。用慢病毒感染目标细胞，并同时加入聚凝胺(5μg/ml)，感染后用嘌呤霉素(5μg/ml)筛选细胞。
4、TNF-α刺激
将对照组和已完成感染RNA转染的FLS细胞分别与TNF-α共孵育。
5、荧光定量PCR(qPCR)
5.1、RNA提取和逆转录
使用Trizol分别提取细胞中RNA，提取出的RNA用无RNA酶但DNA酶处理水溶解，使用HiScript Q RT SuperMix(诺唯赞,中国)进行逆转录。逆转录所得cDNA存于-20℃备用。
5.2、实时荧光定量PCR
使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，中国)进行实时荧光定量PCR 反应，所用仪器为罗氏
Figure RE-GDA0002899549700000071
480。如果在无刺激控制组中扩增信号太弱则将循环加到 50个，qPCR所用的引物序列如表1所示。
表1
基因 正向引物 反向引物
CCL20 CAACTTTGACTGCTGTCTTGGATA TTGACTTTTTTACTGAGGAGACGC
IL-8 CTTGGCAGCCTTCCTGATTT TTCCTTGGGGTCCAGACAGA
GAPDH ATCACCATCTTCCAGGAGCGAG GGGCAGAGATGATGACCCTTTTG
CXCL10 GTGGCATTCAAGGAGTACCTC TGATGGCCTTCGATTCTGGATT
IL6 ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG
CCL3 CGGCAGATTCCACAGAATTTC AGGTCGCTGACATATTTCTGG
COX-2 TAAGTGCGATTGTACCCGGAC TTTGTAGCCATAGTCAGCATTGT
CCL2 GCAATCAATGCCCCAGTCAC TGCTTGTCCAGGTGGTCCAT
IL-32 GAAGGTCCTCTCTGATGACA AAGTAGAGGAGTGAGCTCTG
YAP CCCTCGTTTTGCCATGAAC GTTGCTGCTGGTTGGAGTTG
6、流式细胞术
为测量YAP1表达水平，用CytoFix/CytoPerm(BD Biosciences)根据标准实验流程对细胞固定、破膜，再用抗YAP1抗体(FITC)(Cell Signaling Technology)对细胞染色，之后用流式细胞术(FACSVerse，BD Biosciences)进行分析。对人PBMC固定、破膜前，先进行活细胞染色：抗人CD14-PE及抗人CD3-APC抗体。
7、结果
数据显示当YAP1蛋白含量下降时，TNFα诱导的基因表达上调(图1)。在其他细胞系如人上皮细胞HCT-8(图2)，人单核细胞系THP-1(图3)及人外周血单核细胞(PBMC) (图4)中均可观察到相似现象。在所有细胞系中，YAP1水平的下降均导致TNFα诱导的基因表达上调。
实施例2YAP1敲除增强TNF-α诱导基因的表达
1、CRISPR/Cas9基因编辑技术
用CRISPR/Cas9法敲除人YAP1基因，guideRNA序列如下：
sgRNA#1：CCCTGCGGGGGCTGCGAAGG
sgRNA#2：ACCCGGGCAACCGGCACCCG。
2条sgRNA均被整合进载体pGE-4(pU6gRNA1UgRNA2Cas9puro)，采用标准实验流程将构建的YAP1 KO质粒转染进入细胞，转染后用2μg/ml嘌呤霉素筛选。
2、蛋白印迹法(WB)：按照标准实验流程操作，所用的抗体均购自Cell SignalingTechnology。
3、结果
本发明使用CRISPR/Cas9在HCT-8细胞中敲除了YAP1的脯氨酸富集区段(PRD)，结果如图5所示，图5A显示，与对照组C(control质粒空载)相比，在用TNF-α刺激后，YAP-1 KO的细胞中由TNF-α诱导的基因CCL2、IL-32、IL-8的表达量均显著上调；图5B显示分别用TNF-α和IL-1β刺激后，与对照组C相比，YAP-1KO的细胞中IL-8的表达量均显著上调。
由此可以看出：YAP1敲除和YAP1敲减导致的实验结果相似。
实施例3YAP1对TNF-α信号通路的影响
TNF-α作用于细胞，会迅速激活多条通路，导致包括细胞因子和趋化因子在内的许多基因开始转录。在这些信号通路中，ΝF-κB和MAP激酶通路至关重要。
本实施例通过考察YAP1敲除和YAP1敲减对ΝF-κB和MAP激酶通路的影响(采用蛋白印迹法)，来研究YAP1对TNF-α信号通路的影响。
结果如图6所示，YAP1敲减(KD)和敲除(KO)均显著增强p65磷酸化水平(磷酸化p65即p-p65，是ΝF-κB通路的元件之一)，以及p38和ERK的磷酸化水平(磷酸化p38即 p-p38和磷酸化ERK即p-ERK，均是MAP激酶家族的元件)；说明YAP1的敲低或者敲除能够增强TNF-α信号通路。
实施例4正调控作用区域的定位
从图6中还可以看出，在YAP KO细胞中YAP1蛋白的水平与对照组细胞并无明显差异，目前已知YAP1有至少8种不同的亚型(isoform)，因此从YAP1 KO细胞中克隆了几种信使RNA(mRNA)。
信使RNA的克隆过程为：用YAPmRNA克隆引物(该引物可以扩增所有亚型的YAP序列)逆转录，再将逆转录获得的产物做TA克隆，克隆至载体后DNA测序，得到mRNA片段序列。
测序结果揭示了在8种mRNA中，7种都在脯氨酸富集区域(PRD)中有不同大小片段的缺失，但是其余一种(M5)却由于片段缺失导致翻译提前终止。其他的7条突变蛋白均可被翻译成YAP-1蛋白(图7)，这说明在YAP1 KO细胞中，YAP1蛋白仍然存在，但是根据实验结果合理推测，缺失的这一段是抑制作用能够行使的关键区段，因此，可以推断：PRD 肽段是YAP1蛋白中抑制炎性刺激应答的关键作用区域(正调控)；该实验结果也首次揭示： YAP1蛋白的不同亚型可以具有完全相反的功能。
实施例5负调控作用区域的定位
实施例1已经证实YAP1敲减增强TNFα、IL-1β或LPS诱导的炎症因子基因的表达，本实施例则考察YAP1过表达(OE)的影响，过表达细胞的构建按照标准实验流程操作。
实验结果如图8和图9所示，图8显示，在THP-1细胞中，YAP-1OK和YAP-1OE细胞在与LPS或者TNF-α的刺激下，其诱导的IL-8的表达量均显著上调；图9显示，在HCT-8 细胞中，YAP-1OE和YAP-1KO以及YAP-1KD细胞一样，在TNF-α的刺激下，其诱导的 IL-8、CXCL10、IL-32的基因表达量的变化趋势一致。
已知在不同细胞系中，YAP1至少有8个不同的亚型，其中最大的亚型9号有508个氨基酸，而本发明中所用的是YAP1的2号亚型，已知2号亚型有488个氨基酸，并且是在反式激活区段(TAD)，2号亚型比9号少了20个氨基酸，因此，可以推断：相比于9号亚型， 2号亚型所缺少的这一段氨基酸(TAD肽段)是YAP1蛋白中抑制炎性刺激应答的关键作用区域(负调控，如图10所示)。
另外，YAP9包含全长的PRD及TAD，可以看到YAP9抑制TNFa诱导的IL-8表达，但是YAP2促进IL-8表达，这组数据首次揭示不同亚型的YAP有完全相反的功能(图11所示)。
实施例6PRD肽段和TAD肽段的功能验证
根据PRD肽段和TAD肽段的氨基酸序列，分别人工合成这两段肽段，并用蛋白转染试剂转入HCT-8细胞中，结果如图12显示，肽段本身并未引起IL-8表达水平的上升，但是，在TNF-α的刺激下，且随着肽段用量的增加，均可以抑制TNF-α诱导的IL-8的表达量，且 TAD肽段的抑制作用比PRD肽段的抑制作用明显更强。
图13显示了：两种肽均可抑制TNF-α，IL-1β及LPS诱导的IL-6，IL-8，IL-1β及精氨酸酶的表达。
由于这两种肽都十分疏水，我们测试了是否它们可以不靠蛋白转染试剂就穿透细胞膜。具体操作为：直接将PRD或TAD肽加入细胞培养上清中，用TNFα(2ng/ml)和IL-1β(1ng/ml) 刺激HCT-8细胞24小时。或者用不同量的PRD和TAD加入人PBMC细胞培养上清中，再加TNFα(2ng/ml)或IL-1β(1ng/ml)刺激24小时。取细胞培养上清用ELISA法测其中IL-8 含量。
实验结果表明，无论使用蛋白转染试剂与否，在HCT-8细胞中，它们均可抑制TNFα或 IL-1β诱导的IL-8表达，但在无转染试剂情况下，需要更多的肽来达到相同的抑制效果(图 14，左侧)，在PBMC中我们得到了相同的实验结果(图14，右侧)。
综上所述，本发明的实验结果为PRD肽段和TAD肽段在不同细胞中均可抑制TNF-α，IL-1β或LPS诱导的基因表达提供了有力的证据。
序列表
<110> 广州医科大学
<120> 用于抑制细胞对炎性因子刺激的应答的生物制剂
<130> ZM201370ZL
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> Mankind
<400> 1
Gly Gln Pro Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gly Gln Gly Pro Pro Ser Gly
1 5 10 15
Pro Gly Gln Pro Ala Pro Ala Ala Thr Gln Ala Ala Pro Gln
20 25 30
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Mankind
<400> 2
Arg Gln Ala Met Arg Ile Asn Ile Asn Pro Ser Thr Ala Asn Ser Pro
1 5 10 15
Lys Cys Gln Glu
20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Mankind
<400> 3
gacaucuucu ggucagagat t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> Mankind
<400> 4
ucucugacca gaagauguc 19
<210> 5
<211> 52
<212> DNA/RNA
<213> Mankind
<400> 5
aaaagacatc ttctggtcag agattggatc caatctctga ccagaagatg tc 52
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 6
caactttgac tgctgtcttg gata 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 7
ttgacttttt tactgaggag acgc 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 8
cttggcagcc ttcctgattt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 9
ttccttgggg tccagacaga 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 10
atcaccatct tccaggagcg ag 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 11
gggcagagat gatgaccctt ttg 23
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 12
gtggcattca aggagtacct c 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 13
tgatggcctt cgattctgga tt 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 14
actcacctct tcagaacgaa ttg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 15
ccatctttgg aaggttcagg ttg 23
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 16
cggcagattc cacagaattt c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 17
aggtcgctga catatttctg g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 18
taagtgcgat tgtacccgga c 21
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 19
tttgtagcca tagtcagcat tgt 23
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 20
gcaatcaatg ccccagtcac 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 21
tgcttgtcca ggtggtccat 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 22
gaaggtcctc tctgatgaca 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 23
aagtagagga gtgagctctg 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 24
ccctcgtttt gccatgaac 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 25
gttgctgctg gttggagttg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 26
ccctgcgggg gctgcgaagg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 27
acccgggcaa ccggcacccg 20
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 28
gggggaggca gaagccat 18
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Mankind
<400> 29
gaagatgctg agctgtgggt 20

Claims (6)

1.PRD肽段和/或TAD肽段在制备抑制细胞对炎性刺激应答的药物方面的应用，其特征在于，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述TAD肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞包括成纤维细胞、单核细胞、上皮细胞；所述炎性刺激包括TNF-α刺激、IL-1β刺激或者LPS刺激。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物能够抑制炎性刺激诱导的基因表达；所述基因包括IL-6、IL-8、CXCL10、IL-32、CCL2、CCL20、COX-2。
4.PRD肽段和/或TAD肽段在制备治疗细胞因子风暴介导进程的疾病的药物的应用，其特征在于，所述PRD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述TAD肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞因子风暴介导进程的疾病包括免疫性疾病、细菌或病毒感染、肿瘤免疫治疗引起的细胞因子释放综合征。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疾病包括败血症、新型冠状病毒肺炎、炎症性肠病、类风湿性关节炎。
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