CN116157681A - 制备用于蛋白质组学分析的样品的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法。在示例性实施例中，所述方法包括(a)使包括蛋白质的血液样品与包括抗凝剂(AC)和醛释放剂(AR)的保护剂接触以获得混合物，任选地，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的血液收集管(BCT)中，以及(b)从所述混合物中分离包括蛋白质或蛋白质源的级分以产生蛋白质样品或蛋白质源样品，其中所述方法的步骤在不存在外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学和多肽组学分析。

Description

制备用于蛋白质组学分析的样品的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年7月1日提交的美国临时申请第63/047,143号的优先权的权益，所述美国临时申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。

背景技术

术语“蛋白质组”最早由Marc Wilkins创造，是指细胞、组织或生物体表达的整套蛋白质。因此，“蛋白质组学”是对在给定时间点细胞、器官或生物体中存在的蛋白质组的研究和表征。与基因组不同，蛋白质组由于时间和空间的变化而变得复杂。经常调节蛋白质活性的翻译后修饰进一步使蛋白质组的研究变得非常复杂。然而，这些蛋白质组的变化和改变对于鉴定分子标记非常有用，所述分子标记用作多种疾病的诊断工具。临床蛋白质组学领域致力于在疾病背景下鉴定和验证此类分子标记。Ahmad等人,《蛋白质组学与基因组学杂志(J Proteomics and Genomics)》1(1):103(2014)。临床蛋白质组学研究人员使用的技术数量不断增加，并且包含涉及电泳和免疫分析基本技术的方法到更复杂的方法，如质谱法或其版本，包含例如电子喷雾电离(ESI)、液相色谱法-质谱法联用(LC-MS)和表面增强激光解吸电离(SELDI)。定量蛋白质组学领域已经出现，用于对给定样品中的蛋白质进行绝对定量，并且包含如同位素编码亲和标签(ICAT)、利用am进行的稳定同位素标记(SILAC)和用于相对和绝对定量的同量异位标签(iTRAQ)等技术。Ahmad等人,2014,同上。

无论利用哪些技术，对于通过蛋白质组学分析产生的数据的质量、准确性和可靠性最重要的是样品的稳定性。“预分析技术，尤其是样品储存、运输和处理是有效和无偏结果的关键因素。已知重复冻融循环期间含量较低的蛋白质的损失或蛋白质修饰或不当储存会影响结果。”Ahmad等人,2014,同上。样品在室温下通常不稳定并且必须在-80℃下储存。除了避免重复的冻融循环外，还必须小心避免蛋白酶，并且在从原始血液或组织制备样品期间或之后，向样品中添加可商购获得的蛋白酶抑制剂是解决所述问题的传统做法。“总之，可以说，蛋白质组学中样品储存和稳定性的最大问题是温度和环境蛋白酶”。Ahmad等人,2014,同上。

通常情况下，在收集后不久将样品(例如，血液样品)储存在冷藏温度下是不可能或不方便的。另外，当蛋白质组学分析涉及大量样品时，可商购获得的蛋白酶抑制剂的成本会很高。因此，本领域需要制备用于蛋白质组学分析的样品的改进的方法。

发明内容

本文首次呈现的数据证明了在不存在另外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下在包括本文所述的保护剂的血液收集管(BCT)中收集全血，并且随后处理收集的血液样品进行蛋白质组学分析的可行性。在不受任何特定理论约束的情况下，如本文所述，保护剂的使用为用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的制备提供了许多益处。如本文进一步所述，保护剂使细胞(例如，红细胞、白细胞、血小板)稳定，从而减少或防止不需要的细胞裂解和随后细胞蛋白质释放到样品中。在某些情况下，此类细胞蛋白质被认为是用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的污染物，因为这些细胞蛋白质可以掩盖样品中低丰度蛋白质的存在，并且阻碍样品中蛋白质的鉴定和/或定量。在不受任何特定理论约束的情况下，保护剂还使样品中的蛋白水解酶失活，并且因此减少或消除对另外的蛋白水解酶抑制剂的需求。在目前公开的方法中使用保护剂减少了蛋白水解酶介导的降解的影响，并增加了收集的血液样品的稳定性。

因此，本公开提供了一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法。在一些实施例中，所述蛋白质组学分析是多肽组学分析。在示例性实施例中，所述方法包括(a)使包括蛋白质的血液样品与包括基于柠檬酸盐的抗凝剂(AC)和醛释放剂(AR)的保护剂接触以获得混合物，任选地，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的血液收集管(BCT)中，或者将所述血液样品直接从受试者抽取到包括所述保护剂的BCT中，以及(b)从所述混合物中分离包括蛋白质的级分以产生适合于蛋白质组学分析的蛋白质样品。在示例性方面，所述方法的步骤(a)和(b)在不存在另外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行(例如，所述方法的步骤(a)和(b)在不添加或使用所述保护剂之外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行)。在示例性方面，与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的所述蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0。在示例性方面，在储存至少48小时后存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集所述血液样品的约0小时至约4小时内存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％内。在示例性方面，所述方法进一步包括将密封容器中的所述混合物运输到实验室用于蛋白质组学分析，任选地，其中所述密封容器是包括所述保护剂的密封BCT。在示例性实施例中，所述方法包括(a)使包括蛋白质的血液样品与包括AC和AR的保护剂接触以获得混合物，任选地，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的BCT中，或者将所述血液样品直接从受试者抽取到包括所述保护剂的BCT中，(b)从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分，以及(c)任选地裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品。在示例性方面，所述蛋白质样品适合于蛋白质组学分析，并且其中所述方法的步骤(a)和(b)在不存在另外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行(例如，所述方法的步骤(a)和(b)在不添加或使用所述保护剂之外的外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行)。在示例性方面，与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的所述蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0。在示例性方面，在储存至少48小时后存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集所述血液样品的约0小时至约4小时内存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％内。在示例性方面，所述方法进一步包括将密封容器中的所述混合物运输到实验室用于蛋白质组学分析，任选地，其中所述密封容器是包括所述保护剂的密封BCT。如本文进一步所述，在一些方面，所述保护剂包括AC和AR，其中所述AC既起AC的作用又起蛋白水解酶抑制剂的作用，并且所述方法不添加或使用所述保护剂之外的任何外源性蛋白水解酶抑制剂。

在另一方面，本文描述了一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括(a)将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的血液收集管(BCT)中，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约1g/l至约20g/l茶碱、(iv)约1g/l至约20g/l腺苷和(v)约0.05g/l至约20g/l双嘧达莫组成；(b)任选地，在约20℃至约30℃下将所述血液样品储存在所述BCT中至少约48小时；(c)从混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；(d)裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析；以及(e)通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品；其中在不使用任何外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行所述方法的步骤。在一些实施例中，所述蛋白质组学分析是多肽组学分析。

在另一方面，本文描述了一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括(a)将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的血液收集管(BCT)中，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约1g/l至约20g/l茶碱、(iv)约1g/l至约20g/l腺苷、(v)约0.05g/l至约20g/l双嘧达莫和(vi)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成；(b)任选地，在约20℃至约30℃下将所述血液样品储存在所述BCT中至少约48小时；(c)从混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；(d)裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析；以及(e)通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品；其中在不使用任何外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行所述方法的步骤。在一些实施例中，所述蛋白质组学分析是多肽组学分析。

在另一方面，本文描述了一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括(a)将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的血液收集管(BCT)中，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(iv)(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤组成；(b)任选地，在约20℃至约30℃下将所述血液样品储存在所述BCT中至少约48小时；(c)从混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；(d)裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析；以及(e)通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品；其中在不使用任何外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行所述方法的步骤。在一些实施例中，所述蛋白质组学分析是多肽组学分析。

在另一方面，本文描述了一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括(a)将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的血液收集管(BCT)中，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(iv)(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤和(vii)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成；(b)任选地，在约20℃至约30℃下将所述血液样品储存在所述BCT中至少约48小时；(c)从混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；(d)裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析；以及(e)通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品；其中在不使用任何外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行所述方法的步骤。在一些实施例中，所述蛋白质组学分析是多肽组学分析。

还考虑包括本文所述的AC、AR和红细胞(RBC)稳定剂的组合物。在一些实施例中，所述组合物包括柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲和α-环糊精。在一些实施例中，所述组合物包括柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)和咪唑烷基脲。在一些实施例中，所述组合物包括柠檬酸盐-右旋糖-磷酸盐-腺嘌呤(CDPA)、咪唑烷基脲和α-环糊精。在一些实施例中，所述组合物包括柠檬酸盐-右旋糖-磷酸盐-腺嘌呤(CDPA)和咪唑烷基脲。

附图说明

图1A提供了管1全血浆样品(红色迹线)和管2全血浆样品(绿色迹线)的叠加总离子色谱图(TIC)绘图。

图1B和图1C是管2全血浆样品(图1B)和管1全血浆样品(图1C)的视图。

图2A提供了管1耗竭的血浆样品(红色迹线)和管2耗竭的样品(绿色迹线)的叠加TIC绘图。

图2B和2C是管2耗竭的样品(图2B)和管1耗竭的样品(图2C)的堆叠视图。

图3A是所绘制的从供体A获得的收集在CF BCT(管1)或E BCT(EDTA)中的样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的图。图3B是所绘制的从供体B获得的收集在CF BCT(管1)或E BCT(EDTA)中的样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的图。图3C是所绘制的从供体C获得的收集在CF BCT(管1)或E BCT(EDTA)中的样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的图。对于每个图，最佳拟合线示出为虚线。

图4A是所绘制的从供体A获得的收集在CF BCT(管1)或E BCT(EDTA)中的样品中的肽数量随储存时间而变化的图。图4B是所绘制的从供体B获得的收集在CF BCT(管1)或EBCT(EDTA)中的样品中的肽数量随储存时间而变化的图。图4C是所绘制的从供体C获得的收集在CF BCT(管1)或E BCT(EDTA)中的样品中的肽数量随储存时间而变化的图。对于每个图，最佳拟合线示出为虚线。

图5是从层次聚类分析中获得的树状图。

图6A-6E中的每一个图是针对从供体A-C收集在CF BCT(管1)或E BCT(EDTA)中的每个样品所绘制的蛋白质浓度随时间而变化的图。转酮醇酶(图6A)；Rho GDP解离抑制剂2(图6B)；磷酸甘油酸酯激酶1(图6C)；组装抑制蛋白(Profilin)(图6D)；血红蛋白亚基δ(图6E)。

图7是针对从供体A-C收集在CF BCT(管1)或E BCT(EDTA)中的样品，储存0小时至216小时的样品的一系列示例色谱图。这些线是用于对BCT中储存的样品中组装抑制蛋白-1(P07737)随时间而变化的水平进行定量的肽离子的提取离子色谱图。峰值强度(高度)的增加对应于组装抑制蛋白-1水平的增加。这些数据表明，与E管相比，收集在管1中的样品的降解被延迟(48小时时的强度没有增加)。

图8A-8D中的每一个图是针对从供体A-C收集在CF BCT(管1)或E BCT(EDTA)中的每个样品所绘制的蛋白质浓度随时间而变化的图。血小板因子4(图8A)；血小板碱性蛋白(图8B)；血管性血友病因子(von Willebrand factor)(图8C)；纤连蛋白(图8D)。插图更详细地示出了0-24小时，以证明两个管在T＝0时的水平等同。插图还示出，管1达到快速平衡，而EDTA随时间缓慢变化。

图9是针对从供体A-C收集在CF BCT(管1)或E BCT(EDTA)中的样品，储存0小时至216小时的样品的一系列示例色谱图。这些线是用于对BCT中储存的样品中血小板碱性蛋白随时间而变化的水平进行定量的肽离子的提取离子色谱图。峰值强度(高度)的增加对应于血小板碱性蛋白水平的增加。这些数据表明，与E管相比，收集在管1中的样品的降解被延迟(48小时时的强度没有增加)。

图10是未耗竭的血浆(PL)或耗竭的血浆样品(T12和T2)的SDS-PAGE凝胶，所述耗竭的血浆样品是使用本文所述的前12种或前2种蛋白质耗竭技术耗竭的。

图11是所绘制的收集在CF BCT(管1)中或用E管(EDTA)收集的样品的可定量蛋白质的平均数量随时间而变化的图。

图12A-12E是从供体A-C收集在CF BCT(A-管1，B-管，C-管1)中或从供体A-C收集在E管(A-EDTA，B-EDTA，C-EDTA)中的样品中所指示蛋白质的量随时间而变化的图。

图13A-13B是从供体A-C收集在CF BCT(A-管1，B-管，C-管1)中或从供体A-C收集在E管(A-EDTA，B-EDTA，C-EDTA)中的样品中所指示蛋白质的量随时间而变化的图。

图14A-14C是示出在室温下240小时后在三个不同的患者样品中，在非基于柠檬酸盐的试剂F-H中观察到溶血的图像。在测试的任何时间点，在任何试剂A-E中几乎没有观察到溶血。

图15是示出了如通过ELISA评估的随时间的推移在含有多柔比星(doxorubicin，DOX)、丁卡因(tetracaine，TC)、替罗非班(tirofiban，TirFb)或茶碱腺苷双嘧达莫(TAD)的收集管中的血小板因子-4抑制水平的图。

具体实施方式

本文提供了制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，其中血液样品中的血细胞裂解和蛋白酶活性降低。在不受任何特定理论约束的情况下，保护剂使细胞稳定并降低作为蛋白质组学分析的分析物的蛋白质的降解，使得包括蛋白质的血液样品可以在高于冷藏温度的温度下储存更长的时间段。

本公开提供了一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法。在示例性实施例中，所述方法包括(a)使包括蛋白质的血液样品与包括基于柠檬酸盐的AC和AR的保护剂接触以获得混合物。在示例性方面，通过将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的BCT中来使血液样品与保护剂接触。在示例性方面，将血液样品直接从受试者抽取到包括保护剂的BCT中。在替代性方面，通过将保护剂添加到血液样品中来使血液样品与保护剂接触。在示例性实施例中，保护剂包括既起AC的作用又起蛋白水解酶抑制剂的作用的AC，并且所述方法不包括使用任何另外的外源性蛋白水解酶抑制剂(在保护剂之外)。在示例性实施例中，所述方法进一步包括(b)从所述混合物中分离包括蛋白质的级分，从而产生适用于蛋白质组学分析的蛋白质样品。在示例性实施例中，所述方法进一步包括(b)从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分，以及(c)任选地裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析。

在示例性实施例中，所述方法包括(a)将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的BCT中以获得混合物，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约1g/l至约20g/l茶碱、(v)约1g/l至约20g/l腺苷、(vi)约0.05g/l至约20g/l双嘧达莫和(vii)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成；(b)任选地，在约20℃至约30℃下将所述血液样品储存在所述BCT中至少约48小时；(c)分离包括蛋白质的级分，从而产生适用于蛋白质组学分析的蛋白质样品，以及(d)通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品。

在示例性实施例中，所述方法包括(a)将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的BCT中以获得混合物，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约1g/l至约20g/l茶碱、(v)约1g/l至约20g/l腺苷和(vi)约0.05g/l至约20g/l双嘧达莫组成；(b)任选地，将所述混合物在约20℃至约30℃下储存至少约48小时；(c)从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；(d)裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析；以及(d)通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品。在示例性方面，将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的BCT中包括将所述血液样品直接从受试者抽取在包括保护剂的BCT中。

在示例性实施例中，所述方法包括(a)将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的BCT中以获得混合物，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(iv)(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤和(vii)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成；(b)任选地，将所述混合物在约20℃至约25℃下储存至少约48小时；(c)从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；(d)裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析；以及(d)通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品。在示例性方面，将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的BCT中包括将所述血液样品直接从受试者抽取在包括保护剂的BCT中。

在示例性实施例中，所述方法包括(a)将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的BCT中以获得混合物，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(iv)(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤组成；(b)任选地，将所述混合物在约20℃至约25℃下储存至少约48小时；(c)从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；(d)裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析；以及(d)通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品。在示例性方面，将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的BCT中包括将所述血液样品直接从受试者抽取在包括保护剂的BCT中。

保护剂

如本文所使用的，术语“保护剂”是指一种组合物，所述组合物包括的组分一起用于：(i)维持细胞形态、稳定细胞结构和/或防止或减少细胞降解，从而减少或防止细胞裂解和随后的细胞蛋白质释放，和(ii)防止或减少通过有害蛋白水解酶(例如凝血酶、纤溶酶)的作用引起的蛋白质降解。保护剂允许血液样品稳定。在一些方面，保护剂是固体、液体、凝胶或其它半固体。在一些方面，保护剂是液体。在示例性方面，保护剂包括抗凝剂(AC)和醛释放剂(AR)，任选地具有一种或多种另外的组分，如本文所述。在一些方面，包括AC和AR的保护剂呈溶液的形式。合适的溶剂包含水、盐水、二甲亚砜、醇或其混合物。保护剂可以包括另外的组分，例如重氮烷基脲(DU)和/或咪唑烷基脲(IDU)，所述另外的组分任选地在缓冲盐溶液中。保护剂可以以液体形式以小于BCT的约10体积％但大于约0.1体积％的量存在于BCT中。保护剂可以以液体形式以小于BCT的约5体积％但大于BCT的约0.1体积％的量存在于BCT中。保护剂可以以小于BCT的约3体积％但大于BCT的约0.1体积％的量存在于BCT中。

在一些实施例中，保护剂进一步包括抑制血小板活化的化合物。在一些实施例中，保护剂包括量在0.1mM至约50mM(或约1mM至约5mM、或约5mM至约10mM、或约5mM至约50mM、或约20mM至约40mM、或约5mM至约20mM)的范围内的抑制血小板活化的化合物。在一些实施例中，保护剂包括量为约0.1mM、或约0.5mM、或约1mM、或约2mM、或约3mM、或约4mM、或约5mM、或约6mM、或约7mM、或约8mM、或约9mM、或约10mM、或约15mM、或约20mM、或约25mM、或约30mM、或约35mM、或约40mM、约45mM或约50mM的抑制血小板活化的化合物。

在一些实施例中，保护剂包括量在0.1μg/mL至约10mg/mL(或约1μg/mL至约10mg/mL、或约5μg/mL至约10mg/mL、或约1mg/mL至约10mg/mL、或约5mg/mL至约10mg/mL)的范围内的抑制血小板活化的化合物。在一些实施例中，保护剂包括量为约0.1μg/mL、或约0.2μg/mL、或约0.3μg/mL、或约0.4μg/mL、或约0.5μg/mL、或约0.6μg/mL、或约0.7μg/mL、或约0.8μg/mL、或约0.9μg/mL、或约1mg/mL、或约2mg/mL、或约3mg/mL、或约4mg/mL、或约5mg/mL、或约6mg/mL、或约7mg/mL、或约8mg/mL、或约9mg/mL或约10mg/mL的抑制血小板活化的化合物。

在一些实施例中，抑制血小板活化的化合物是酯型局部麻醉剂。示例性酯型局部麻醉剂包含但不限于丁卡因(阿美索卡因(amethocaine))、利多卡因(lidocaine)、布比卡因(bupivacaine)和罗哌卡因(ropivacaine)。在一些实施例中，抑制血小板活化的化合物是钙通道阻滞剂。示例性钙通道阻滞剂包含但不限于氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、依拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、尼索地平(nisoldipine)、维拉帕米(verapamil)、地尔硫卓(diltiazem)和硝苯地平(nifedipine)。

在一些实施例中，抑制血小板活化的化合物是丁卡因、茶碱腺苷双嘧达莫(TAD)、利多卡因、布比卡因、罗哌卡因、氨氯地平、地尔硫卓、非洛地平、依拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼索地平、维拉帕米、多西环素(doxycycline)、替格瑞洛(ticagrelor)、西洛他唑(cilostazol)、普拉格雷(prasugrel)、西吡达莫(cipyridamole)、普拉格雷尔(prasugrel)、替罗非班(tirofiban)、依替非巴肽(eptifibatide)、埃洛匹格雷尔(elopidogrel)或KF38789或其组合。

在一些实施例中，保护剂包括量在0.1mM至约5mM(或约1mM至约5mM、或约1mM至约3mM、或约2mM至约4mM)的范围内的丁卡因。在一些实施例中，保护剂包括量为约0.1mM、或约0.2mM、或约0.3mM、或约0.4mM、或约0.5mM、或约0.6mM、或约0.7mM、或约0.8mM、或约0.9mM、或约1mM、或约2mM、或约3mM、或约4mM、或约5mM的丁卡因。在一些实施例中，保护剂包括量为约2mM的丁卡因。

在一些实施例中，保护剂进一步包括红细胞(RBC)稳定剂。在一些实施例中，RBC稳定剂是环糊精、多西环素、聚乙二醇、柳氮磺胺吡啶、聚乙烯吡咯烷酮、姜黄素、葡萄糖酸镁、同型半胱氨酸、甲基纤维素(MC)、6-氨基己酸、乙基纤维素、抑肽酶、羟乙基纤维素、多西环素、羟丙基纤维素、盐酸米诺环素(Minocycline HCl)、糊精、烟酰胺、葡聚糖、壳聚糖、聚环氧乙烷、赖氨酸、聚乙基噁唑啉、甘油醛、菲科尔(Ficolls)、植酸、α-环糊精、b-谷甾醇、β-环糊精、C-AMP、γ-环糊精、聚赖氨酸、明胶、鹰嘴豆芽素A、糖(例如蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖)、柳氮磺胺吡啶、羟丙基甲基纤维素、去甲金环素、羟乙基甲基纤维素、金霉素(Chlortetracycline)、土霉素(Oxytetracycline)、环己酰胺、利福平(Rifampicin)、豆浆、基于大豆的蛋白酶抑制剂、苏拉明(Suramin)、N-丁酸、青霉胺(Penicillamine)、N-乙酰半胱氨酸、苯甲脒、AEBSF、α-2巨球蛋白或其组合。经考虑，在本公开的组合物中，上述化合物中的一种或多种化合物可以取代环糊精。在一些实施例中，RBC稳定剂是环糊精。示例性环糊精包含但不限于α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精。

在示例性实施例中，保护剂对血液样品及其任何组分(例如细胞、蛋白质、核酸、外泌体等)基本上是无毒和/或化学惰性的。在各个方面，保护剂基本上不含甲醛、多聚甲醛、胍盐、十二烷基硫酸钠(SDS)或其任何组合。在一些方面，保护剂基本上不含甲醛。例如，保护剂包括的甲醛的量小于或为约50,000ppm。在一些方面，保护剂包括少于约百万分之20份(ppm)的甲醛。保护剂可以含有少于约百万分之15份(ppm)的甲醛。保护剂可以含有少于约百万分之10份(ppm)的甲醛。保护剂可以含有少于约百万分之5份(ppm)的甲醛。保护剂可以含有至少约百万分之0.1份(ppm)至约20ppm的甲醛。保护剂可以含有至少约百万分之0.5份(ppm)至约15ppm的甲醛。保护剂可以含有至少约百万分之1份(ppm)至约10ppm的甲醛。

如本文进一步所述，保护剂基本上不含也不起AC作用的蛋白水解酶抑制剂。如本文所使用的，术语“蛋白水解酶抑制剂”是指抑制蛋白酶(protease或proteinase)的任何化学(例如小分子)或生物、天然存在的或合成的药剂。蛋白酶按其作用机制分类，并且包含例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸(硫醇)蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、内切蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、胱天蛋白酶样蛋白酶、弹性蛋白酶样蛋白酶。在各个方面，蛋白水解酶抑制剂降低这些蛋白酶中的一种或多种蛋白酶的活性。蛋白水解酶抑制剂是本领域已知的，并且包含但不限于：α-2-巨球蛋白、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、氨基苯基甲磺酰氟盐酸盐(APMSF)、阿吗他定(amastatin)、抗蛋白酶(antipain)、抑肽酶、贝他定(bestatin)、胰凝乳蛋白酶抑制素(chymostatin)、抑二肽素A(diprotin A)、抑二肽素B、EDTA、E-64、蛋清胱抑素(egg white cystatin)、蛋清卵固蛋白(egg white ovostatin)、弹性酶抑制剂(elastatinal)、加拉定(galardin)、吲哚乙酸(IAA)、亮抑酶肽、胰蛋白酶抑制剂(例如大豆胰蛋白酶抑制剂)、甲磺酸奈非那韦(nelfinavir mesylate)、胃酶抑素(pepstatin)(例如胃酶抑素A)、苯基甲基磺酰氟(PMSF)、膦酰二肽、1,10-菲咯啉、胰蛋白酶抑制剂、4-甲苯磺酰基-L-赖氨酰基-氯甲烷盐酸盐(TLCK)、甲苯磺酰基苯基丙氨酰氯甲基酮(TPCK)、VdLP FFVdL和其任何组合。保护剂基本上不含这些抑制剂或其任何组合，包含由商业供应商出售并且称为“蛋白酶抑制混合液”的蛋白水解酶抑制剂的任何组合。蛋白酶抑制剂的混合物、组合或混合液也是本领域已知的，包含Roche cOmplete片剂、RochecOmplete ULTRA(不含EDTA)蛋白酶抑制剂混合液片剂、Calbiochem蛋白酶抑制剂混合液、Halt蛋白酶抑制剂混合液、G-Biosciences FOCUS^TMProteaseArrest^TM、RecomProteaseArrest^TM。

也起AC作用的蛋白水解酶抑制剂包含但不限于EDTA和EGTA。在示例性方面，此类组分用作保护剂的AC，但不在保护剂之外使用，例如，所述方法不包括使用在保护剂中已经存在的EDTA或EGTA之外的另外的EDTA或EGTA的步骤。

在示例性方面，保护剂包括咪唑烷基脲、EDTA和甘氨酸，并且基本上不含也不起AC作用的任何蛋白水解酶抑制剂。在示例性情况下，保护剂包括浓度为约300g/l至约700g/l的咪唑烷基脲。在示例性情况下，保护剂包括浓度为约60g/l至约100g/l EDTA的EDTA。在示例性情况下，保护剂包括浓度为约20g/l至约60g/l甘氨酸的甘氨酸。在各种情况下，保护剂基本上由(i)约300g/l至约700g/l咪唑烷基脲、(ii)约20g/l至约60g/l甘氨酸和(iii)约60g/l至约100g/l EDTA组成。在一些实施例中，保护剂进一步包括红细胞(RBC)稳定剂。在一些实施例中，RBC稳定剂是环糊精。示例性环糊精包含但不限于α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精。

在示例性实施例中，保护剂包括柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲和α-环糊精。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约100g/l至约400g/l的咪唑烷基脲。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/l至约50g/l柠檬酸的柠檬酸。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约1g/l至约20g/l的茶碱。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约1g/l至约20g/l的腺苷。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约0.05g/l至约20g/l的双嘧达莫。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/l至约50g/lα-环糊精的α-环糊精。在一些实施例中，保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约1g/l至约20g/l茶碱、(iv)约1g/l至约20g/l腺苷、(v)约0.05g/l至约20g/l双嘧达莫和(vi)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成。

在示例性实施例中，保护剂包括柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)和咪唑烷基脲。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约100g/l至约400g/l的咪唑烷基脲。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/l至约50g/l柠檬酸的柠檬酸。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约1g/l至约20g/l的茶碱。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约1g/l至约20g/l的腺苷。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约0.05g/l至约20g/l的双嘧达莫。在一些实施例中，保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约1g/l至约20g/l茶碱、(iv)约1g/l至约20g/l腺苷和(v)约0.05g/l至约20g/l双嘧达莫组成。

在示例性实施例中，保护剂包括保护剂是柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤(CPDA)、咪唑烷基脲和α-环糊精。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约100g/l至约400g/l的咪唑烷基脲。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/l至约50g/l柠檬酸的柠檬酸。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/L至约200g/L的柠檬酸三钠。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/l至约200g/l的磷酸二氢钠。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约50g/l至约300g/l的右旋糖。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约0.05g/l至约20g/l的腺嘌呤。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/l至约50g/lα-环糊精的α-环糊精。在一些实施例中，保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(iv)(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤和(vii)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成。

在示例性实施例中，保护剂包括保护剂是柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤(CPDA)和咪唑烷基脲。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约100g/l至约400g/l的咪唑烷基脲。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/l至约50g/l柠檬酸的柠檬酸。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/L至约200g/L的柠檬酸三钠。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约10g/l至约200g/l的磷酸二氢钠。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约50g/l至约300g/l的右旋糖。在一些实施例中，保护剂包括浓度为约0.05g/l至约20g/l的腺嘌呤。在一些实施例中，保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤组成。

还考虑包括本文所述的AC、AR和红细胞(RBC)稳定剂的组合物。在一些实施例中，所述组合物包括柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲和α-环糊精。在一些实施例中，所述组合物包括柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)和咪唑烷基脲。在一些实施例中，所述组合物包括柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤(CPDA)、咪唑烷基脲和α-环糊精。在一些实施例中，所述组合物包括柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤(CPDA)和咪唑烷基脲。

抗凝剂

目前公开的BCT的保护剂包括抗凝剂(AC)(即，抑制血液凝结的药剂)。在示例性方面，AC是乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐、乙二醇四乙酸(EGTA)或其盐、水蛭素、肝素、柠檬酸、柠檬酸盐、草酸、草酸盐、酸柠檬酸盐右旋糖(ACD；也称为抗凝剂柠檬酸盐右旋糖)、柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、柠檬酸盐-吡哆醛磷酸盐-tris、肝素-1,3-羟基-乙基-茶碱、聚茴香脑磺酸酯、聚茴香脑磺酸钠、氟化钠、肝素钠、凝血酶和PPACK(D-苯基丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸氯甲基酮)或其组合。在示例性方面，抗凝剂是EDTA。任选地，EDTA是保护剂中存在的唯一AC。

在一些实施例中，AC是基于柠檬酸盐的AC。示例性的基于柠檬酸盐的AC包含但不限于酸柠檬酸盐右旋糖(ACD)、柠檬酸盐、柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、柠檬酸盐-吡哆醛磷酸盐-tris、柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤(CPDA)或其组合。

在示例性方面，基于柠檬酸盐的AC以约10g/L至约500g/L、约10g/L至约450g/L、约10g/L至约400g/L、约10g/L至约350g/L、约10g/L至约300g/L、约10g/L至约250g/L、约10g/L至约200g/L、约10g/L至约150g/L、约10g/L至约100g/L、约10g/L至约75g/L、约10g/L至约50g/L、约50g/L至约500g/L、约75g/L至约500g/L、约100g/L至约500g/L、约150g/L至约500g/L、约200g/L至约500g/L、约250g/L至约500g/L、约300g/L至约500g/L、约350g/L至约500g/L、约400g/L至约500g/L、约450g/L至约500g/L、约20g/L至约400g/L、约30g/L至约300g/L、约40g/L至约250g/L或约50g/L至约200g/L的量存在于保护剂中。在某些情况下，抗凝剂以约50g/L至约150g/L或约60g/L至约100g/L的量存在于保护剂中。在一些方面，保护剂中存在约50g/L、约60g/L、约70g/L、约80g/L、约90g/L或约100g/L抗凝剂。

在示例性情况下，保护剂包括浓度为约60g/l至约100g/l EDTA的EDTA。在示例性方面中，保护剂包括约30g/L至约100g/L抗凝剂，任选地，约30g/L至约100g/L抗凝剂、约40g/L至约100g/L抗凝剂、约50g/L至约100g/L抗凝剂、约60g/L至约100g/L抗凝剂、约70g/L至约100g/L抗凝剂、约80g/L至约100g/L抗凝剂、约90g/L至约100g/L抗凝剂、约30g/L至约90g/L抗凝剂、约30g/L至约80g/L抗凝剂、约30g/L至约70g/L抗凝剂、约30g/L至约60g/L抗凝剂、约30g/L至约50g/L抗凝剂或约30g/L至约40g/L抗凝剂。

醛释放剂

保护剂包括醛释放剂(AR)(即，反应形成醛产物，例如甲醛产物的药剂)。在示例性方面，AR反应以提供醛产物随时间的缓慢释放，并且在不受特定理论约束的情况下，由AR产生的醛产物的缓慢释放赋予血液样品(例如，血液样品的细胞组分)稳定性。在示例性实施例中，醛释放剂是重氮烷基脲、咪唑烷基脲、1,3,5-三(羟乙基)-s-三嗪、噁唑烷、1,3-双(羟甲基)-5,5-二甲基咪唑烷-2,4-二酮、季铵盐-15、DMDM乙内酰脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、三(羟甲基)硝基甲烷、羟甲基甘氨酸盐、聚季铵盐或其组合。在示例性方面，醛释放剂是咪唑烷基脲。任选地，咪唑烷基脲是保护剂中的唯一AR。

在示例性方面，醛释放剂以约100g/L至约1000g/L、约200g/L至约1000g/L、或约300g/l至约1000g/l、约500g/L至约1000g/L、约600g/L至约1000g/L、约700g/L至约1000g/L、约800g/L至约1000g/L、约900g/L至约1000g/L、约100g/L至约900g/L、约100g/L至约800g/L、约100g/L至约700g/L、约100g/L至约600g/L、约100g/L至约500g/L、约100g/L至约400g/L、约100g/L至约300g/L、约100g/L至约200g/L(例如，约300g/l、约400g/l、约500g/l、约600g/l或约700g/l)的量存在于保护剂中。在示例性方面，醛释放剂以约100g/L、约200g/L、约300g/L、约400g/L、约500g/L、约600g/L、约700g/L、约800g/L、约900g/L或约1000g/L±10％g/L的量存在于保护剂中。在示例性情况下，保护剂包括浓度为约100g/l至约400g/l或约300g/l至约700g/l的咪唑烷基脲。

在示例性方面，保护剂包括AC与AR的比率为约1:1至约1:2、或约1:2至约1:1、或约1:2至约1:6的AR和AC。在一些方面，保护剂包括AC与AR的比率为约1:3至约1:5的AR和AC。任选地，保护剂包括AC与AR的比率为约1:4的AR和AC。在一些实施例中，保护剂包括AC与AR的比率为约1:1.2的AR和AC。

保护剂的另外的组分

在一些方面，保护剂包括除抗凝剂和醛释放剂之外的组分。在示例性方面，保护剂进一步包括胺。在一些方面，所述胺是伯胺或仲胺。在一些方面，所述胺是叔胺。在各种情况下，所述胺是烷基胺、芳基胺或烷基芳基胺。在示例性方面，所述胺是氨基酸、生物胺、三甲胺或苯胺。在一些方面，所述氨基酸是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、鸟氨酸和S-腺苷蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或其组合。在示例性方面，保护剂包括甘氨酸。任选地，甘氨酸是保护剂中存在的唯一胺。

在示例性方面，保护剂包括约20g/l至约60g/l、约20g/L至约50g/L、约20g/L至约40g/L、约20g/L至约30g/L、约20g/L至约25g/L、约25g/L至约50g/L、约30g/L至约50g/L或约40g/L至约50g/L的胺。在示例性方面，醛释放剂的量相对于胺的量为约10重量份醛释放剂比约1重量份胺。任选地，醛释放剂的量相对于胺的量为约15重量份比约1重量份，或约20重量份比约1重量份。在各个方面，醛释放剂的量相对于胺的量为约7.5重量份比约1重量份，或约5重量份比约1重量份。在示例性方面，BCT包括咪唑烷基脲(IDU)和甘氨酸，咪唑烷基脲(IDU)与甘氨酸的比率可以为约10:1。

在示例性方面，保护剂进一步包括一种或多种防腐剂、酶抑制剂、代谢抑制剂或其组合。在一些方面，一种或多种酶抑制剂是焦碳酸二乙酯、乙醇、金精三羧酸(ATA)、甘油醛、氟化钠、甲酰胺、氧钒核糖核苷复合物、硅藻土、肝素、羟胺-氧-铜离子、膨润土、硫酸铵、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、二价阳离子(例如，Mg⁺²、Mn⁺²、Zn⁺²、Fe^+2、Ca⁺²、Cu⁺²)或其任何组合。在示例性情况下，保护剂包括一种或多种核酸酶抑制剂，例如DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂。在某些方面，一种或多种代谢抑制剂是甘油醛、磷酸二羟基丙酮、3-磷酸甘油醛、1,3-二磷酸甘油酸酯、3-磷酸甘油酸酯、2-磷酸甘油酸酯、磷酸烯醇丙酮酸盐、丙酮酸盐或二羟基乙酸甘油酯、氟化钠、K₂C₂O₄或其组合。在示例性方面，保护剂不包括上述防腐剂、酶抑制剂、代谢抑制剂。

血液收集管(BCT)

将示例性方面中的保护剂添加到血液样品中。在其它方面，保护剂存在于BCT中，并且将血液样品添加到包括保护剂的BCT中。合适的BCT在本领域中是已知的，并且包含国际专利公开第WO 2018145005号和美国专利第9,657,227号中所述的BCT。在目前公开的方法中使用的BCT可以由任何合适的无毒化学惰性材料，如塑料、玻璃、二氧化硅、碳或其组合制成。在示例性方面，BCT由最小化细胞或蛋白质或血液样品的其它组分的粘附或附着的材料制成。在一些方面，所述管由透明材料制成。在各种情况下，所述管由包括聚丙烯、聚苯乙烯或玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃、燧石玻璃、铝硅酸盐玻璃、钠钙玻璃、铅或石英玻璃)的材料构成。在示例性情况下，所述管由包括环状聚烯烃，例如环状聚烯烃共聚物或环状聚烯烃聚合物的材料构成。在示例性方面，所述材料在约-100℃至约50℃(例如，2℃至约30℃)的温度下可以是稳定的，并且因此可以适用于将样品储存在冷冻箱、冰箱、加热器、加热温育器、加热水浴中或储存在室温下。

BCT可以具有任何几何形状或适用于容纳和储存液体的形状。在示例性方面，所述管的形状基本上为圆柱形，具有一个封闭端部和一个开放端部。在示例性方面，所述管包括封闭的基部、共同延伸的细长侧壁，所述侧壁从基部延伸并终止于开放端部，使得限定具有内壁的中空腔室。在某些方面，中空腔室被配置成收集血液样品。在各个方面，至少所述管的细长侧壁由包含热塑性聚合物材料的材料制成，所述热塑性聚合物材料具有高阻湿性和低吸湿率，以及使得能够观察所述管内的样品的光学透明度和耐化学性。在一些方面，封闭端部或封闭基部为圆底或U形、圆锥形或V形的。在各种情况下，开放端部包括一系列螺纹，所述螺纹适用于配合用于临时关闭的螺盖。在替代性方面，开放端部不包括一系列螺纹。在各种情况下，开放端部可以装配有塞子或盖。在示例性方面，所述管的封闭端部或封闭基部是平坦的。在各种情况下，所述管的细长侧壁的至少一部分逐渐变细至位于封闭基部或封闭端部处或其内的点。在一些方面，BCT的外径(如在邻近开放端部的共同延伸的细长侧壁处测量的)与长度(D×L)尺寸为约13mm×75mm。在一些方面，BCT的外径(如在邻近开放端部的共同延伸的细长侧壁处测量的)与长度(D×L)尺寸为约16mm×100mm。管的细长侧壁不逐渐变细。在替代性情况下，所述管的细长侧壁不逐渐变细至某一点。

在各个方面，所述管的体积容量为至少或约0.5mL、至少或约1mL、至少或约1.5mL、至少或约2mL、至少或约2.5mL、至少或约3mL、至少或约3.5mL、至少或约4mL、至少或约4.5mL、或至少或约5mL，并且任选地至多约350mL、至多约300mL、至多约250mL、至多约200mL、至多约150mL或至多约100mL。在一些情况下，所述管可以容纳约1mL至约45mL、约1mL至约40mL、约1mL至约35mL、约1mL至约30mL、约1mL至约25mL、约1mL至约20mL、约1mL至约15mL、约1mL至约10mL。在各个方面，体积容量为约5mL至约40mL、约5mL至约30mL、约5mL至约20mL、约5mL至约15mL，任选地约5mL、约6mL、约7mL、约8mL、约9mL、约10mL、约11mL、约12mL、约13mL、约15mL、约16mL、约17mL、约18mL、约19mL、约20mL。

在一些方面，BCT包含约54μl至约66μl的试剂填充容限体积。在某些情况下，BCT包含约60μl的试剂填充容限体积。在各个方面，BCT包括约162μl至约198μl，任选地约180μl的试剂填充容限体积。BCT可以包含按重量计0.0708g的正或负10％的试剂填充。BCT可以包含按重量计0.224g的正或负10％的试剂填充。在一些方面，BCT包含约3ml至约5ml的抽取容限。所述管可以包含约4ml的抽取容限。在某些情况下，BCT包含约7ml至约13ml的抽取容限。在一些方面，BCT包含约9ml的抽取容限。在示例性方面，BCT的试剂体积为约50μL至约500μL，例如约50μL至约400μL、约50μL至约300μL、约50μL至约200μL、约50μL至约100μL、约100μL至约500μL、约200μL至约500μL、约300μL至约500μL、约400μL至约500μL。在各种情况下，BCT的试剂体积为约100μL至约300μL、或约150μL至约250μL、或约175μL至约225μL，例如约200μL。在各个方面，BCT的填充体积为约1mL至约100mL、约1mL至约75mL、约1mL至约50mL、约1mL至约25mL、约1mL至约15mL、约1mL至约10mL、约10mL至约100mL、约15mL至约100mL、约25mL至约100mL、约50mL至约100mL、约75mL至约100mL。在示例性方面，BCT的试剂体积为约200μL，并且填充体积为约10mL。

在示例性情况下，BCT包括开放端部，所述开放端部可以装配有盖，以至少暂时密封所述端部。在示例性方面，BCT包括螺纹，所述螺纹与螺盖一起作用以至少暂时密封管的开放端部。在一些方面，BCT不包括任何螺纹。相反，可以在BCT上安装阻塞物或类似的盖，以密封开放端部。盖可以由无毒的化学惰性材料，如塑料或橡胶构成。盖可以是溴丁基橡胶阻塞物。在一些方面，BCT的阻塞物可以在其接触BCT内壁的外表面的至少一部分上包含硅酮油涂层。基部可以包含凹陷的浅凹。在一些方面，基部不具有浅凹。

在示例性实施例中，对所述管的内壁进行涂覆或其它处理，以改变其表面特性，如使其在整个或部分表面上更疏水和/或更亲水。在一些方面，所述管的内壁进行了火焰喷涂、经受电晕放电、等离子体处理、涂覆或其它处理。在各种情况下，通过使内壁与物质接触来处理所述管，使得所关注的蛋白质不会粘附到管壁上。在一些方面，将所述管的表面改性以提供多功能性，所述多功能性同时提供期望的亲水性和疏水性的适当平衡，以允许血液的收集、本文中的防腐剂的分散以及核酸对血液收集管内壁的粘附阻力。

在一些方面，涂层是硅酮涂层。在各种情况下，涂层包括官能化聚合物，所述官能化聚合物包含第一聚合物和一种或多种与第一聚合物不同(例如，在化学上不同)的第二单体和/或聚合物官能团。在一些情况下，涂层包含一种或多种共聚物(例如嵌段共聚物、接枝共聚物或其它共聚物)。例如，涂层可以包含包括第一疏水聚合物部分和第二亲水聚合物部分的共聚物。涂层可以是基于水的涂层。涂层可以任选地包含粘附促进剂。涂层可以以任何合适的方式施加，其可以被喷涂、浸渍、擦拭或以其它方式施加到血液收集管的部分或全部内部上。涂层也可以在存在热的情况下施加。优选地，施加到血液收集管内壁的任何涂层将与管的玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃)或其它材料(例如，聚合物材料)形成足够牢固的结合，使得其不会侵蚀或以其它方式从内壁移除。合适的聚合物涂层的实例可以包含含硅聚合物(例如，硅烷、硅氧烷或其它含硅聚合物)；聚烯烃(如聚乙烯或聚丙烯)；聚对苯二甲酸乙二醇酯；氟化聚合物(例如，聚四氟乙烯)；聚氯乙烯、聚苯乙烯或其任何组合。可以在以下中找到可以用于涂覆血液收集管的内部的教导的实例：美国专利第6,551,267号；第6,077,235号；第5,257,633号和第5,213,765号，所述美国专利全部通过引用并入。

分离级分和级分类型

在示例性实施例中，目前公开的方法包括分离包括蛋白质的级分的步骤。在示例性方面，所述级分包括血液样品的血浆。在示例性方面，所述级分是血浆级分。在各方面，所述方法包括从血液样品中分离血浆级分以产生适用于蛋白质组学分析的蛋白质样品。在各个方面，血浆级分基本上不含细胞，例如基本上不含红细胞、白细胞、血小板。

在各个方面，所述级分包括血液样品的细胞。在某些情况下，所述级分是血液样品的细胞级分。在示例性情况下，细胞级分基本上由稀有血细胞，任选地循环肿瘤细胞(CTC)、胎儿循环细胞或其它循环核细胞组成。任选地，细胞级分不含红细胞、白细胞、血小板或其组合。在一些情况下，细胞级分不含血浆蛋白。在一些方面，所述方法包括裂解细胞级分的细胞以获得适用于蛋白质组学分析的蛋白质样品。

在一些方面，目前公开的方法的分离步骤包括离心步骤。例如，离心步骤可以使得离心步骤产生细胞团粒和无细胞上清液。在示例性实施例中，分离步骤包括通过例如以约2000g离心血液样品约15分钟来分离血浆。任选地，进一步离心分离的血浆以获得澄清的血浆。因此，分离步骤可以包括以约2000g离心血液样品约15分钟(任选地在室温下)以获得包括分离的血浆的上清液，随后以约16,000g离心包括分离的血浆的上清液约10分钟(任选地在室温下)以获得包括澄清的血浆的上清液。在示例性实施例中，可以进一步处理血浆(例如，澄清的血浆)。例如，澄清的血浆可能耗竭了以相对高浓度存在于血浆中的蛋白质。在示例性情况下，澄清的血浆耗竭了免疫球蛋白、白蛋白或两者的组合。耗竭方法是本领域已知的，并且包含使用旋转捕获柱(spin trap column)。例如，参见实例1。

在替代性或另外的实施例中，目前公开的方法的分离步骤包括一个或多个色谱法步骤、电泳分离步骤、免疫沉淀步骤或其组合。用于从血液样品中分离包括蛋白质的级分的合适技术是本领域已知的。

在一些方面，分离步骤包括细胞分选步骤，例如荧光活化细胞分选(FACS)步骤。在一些方面，细胞分选步骤基于一些细胞上细胞表面蛋白的表达，或一些细胞上缺乏细胞表面蛋白表达。

在示例性实施例中，分离步骤产生蛋白质样品，所述蛋白质样品包括与收集到BCT中时血液样品中的蛋白质量基本上相同的量的蛋白质(例如，完整蛋白质)。在示例性实施例中，分离步骤产生蛋白质样品，所述蛋白质样品包括与收集到BCT中时血液样品中的蛋白质类型基本上相同的类型的蛋白质。换句话说，就样品中存在的蛋白质和每种蛋白质的量而言，蛋白质样品与原始血液样品基本上相同。而且，在一些实施例中，蛋白质样品的通过蛋白质降解或蛋白质聚集引起的蛋白质损失很少或基本上没有。在各个方面，蛋白质样品的污染物蛋白质产物很少或基本上没有。在示例性实施例中，分离步骤产生蛋白质样品，如通过高效液相色谱法-质谱法(HPLC-MS)测量的，所述蛋白质样品包括的污染物蛋白质产物小于约25％。如本文所使用的，术语“污染物蛋白质产物”是指不需要的蛋白质产物，包含但不限于蛋白质片段、完整的细胞内蛋白质、全蛋白质和/或蛋白质片段的聚集体等，所述蛋白质产物由降解、聚集(任选地通过蛋白质-蛋白质分子内缔合力)、蛋白质自缔合反应等产生。色谱技术，如HPLC可以检测给定样品中污染物蛋白质的量。在示例性方面，如通过HPLC-MS测量的，蛋白质样品包括小于约20％的污染物蛋白质产物、小于约15％的污染物蛋白质产物、小于约10％的污染物蛋白质产物或小于约5％的污染物蛋白质产物。在一些方面，如通过HPLC-MS测量的，蛋白质样品包括小于约4％的污染物蛋白质产物、小于约3％的污染物蛋白质产物或小于约2％的污染物蛋白质产物。

另外的制备和分析步骤

目前公开的方法可以单独或与其它步骤组合包括上述添加步骤和上述分离步骤。所述方法可以包括重复上述步骤中的任何一个步骤和/或可以包括除上述步骤之外的另外的步骤。例如，目前公开的方法可以进一步包括在分离包括蛋白质的级分以产生蛋白质样品之前进一步处理样品的步骤。在各种情况下，所述方法包括一个或多个离心步骤以分离血浆和/或获得澄清的血浆，如上所述。在各个方面，所述方法包括一个或多个蛋白质分离步骤，例如色谱、电泳或免疫沉淀步骤。在示例性方面，所述方法包括使样品中不需要的高浓度蛋白质，例如白蛋白和/或免疫球蛋白耗竭。在一些方面，所述方法包括以下中的一者或多者：(a)向样品中添加消化酶、还原剂、烷化剂；(b)鉴定样品中存在的蛋白质；(c)对样品或其等分试样的总蛋白质浓度和单独的蛋白质浓度进行定量；和/或(d)用标签标记蛋白质或其子集。任选地，消化酶是胰蛋白酶。在一些方面，还原剂包括脲或二硫苏糖醇(DTT)或两者。在某些情况下，烷化剂包括碘乙酰胺(IAA)或其组合。

在各个方面，所述方法进一步包括将密封容器中的混合物运输到实验室进行蛋白质组学分析或多肽组学分析。任选地，密封容器是包括保护剂的密封BCT。在一些方面，运输到实验室需要将混合物在密封容器中储存至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时、至少72小时、约84小时、至少96小时或更长时间。在一些方面，运输步骤需要将混合物在密封容器中储存至少约5天、至少约6天、至少7天或更长时间的储存时间段。在各个方面，运输步骤需要在冷藏温度下(例如，约2℃至约8℃)或在高于这些温度的温度下(例如，约2℃至约30℃、约10℃至约15℃)或在环境温度下(例如，约15℃至约30℃、约20℃至约25℃、约20℃至约30℃)将混合物在密封容器中储存一定储存时间段。在各个方面，在运输步骤之后，如通过以下所证明的，所述混合物适用于蛋白质组学分析：与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0；和/或在储存至少48小时后存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集血液样品的约0小时至约4小时内存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％(例如，约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或更少)内。在一些实施例中，在储存至少48小时后存在于蛋白质样品中的血浆蛋白和/或肽的数量为从受试者收集血液样品的约0小时至约4小时内存在于蛋白质样品中的血浆蛋白和/或肽的数量的≥90％。

在示例性方面，所述方法制备用于蛋白质组学(或多肽组学)分析的蛋白质样品，并进一步包括进行蛋白质组学(或多肽组学)分析。就此而言，所述方法可以包括使用一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析蛋白质的步骤。蛋白质组学分析的合适方法是本领域已知的，包含但不限于浊度测定、电泳(例如，毛细管电泳、一维或二维凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、差异凝胶电泳(DIGE))、基于免疫亲和性的技术(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心ELISA、竞争ELISA、免疫沉淀、免疫电泳、放射免疫测定)、质谱法(例如，电喷雾电离(ESI)-MS/MS、基质辅助激光解离光谱法(MALDI)-TOF MS、激光显微切割(LMD)/MS、液相色谱-质谱法联用(LC-MS/MS))、高效液相色谱法(HPLC)以及其它定量蛋白质组学技术(例如iTRAQ、ICAT、SILAC)、多维蛋白质鉴定技术(MudPIT)、反相蛋白质阵列、SOMAmers技术、SELDI、SCX等。参见例如，Ahmed等人,2014,同上。在一些方面，基于质谱法的蛋白质组学方法是靶向质谱法。在一些方面，质谱法实验利用平行反应监测(PRM)、选择反应监测(SRM)、选择离子监测(SIM)或多反应监测(MRM)。在替代性方面，质谱法是非靶向质谱法。任选地，质谱法实验利用数据依赖性采集(DDA)、数据非依赖性采集(DIA)或标记定量(例如串联质谱标签(TMT))质谱法。多肽组学分析采用了许多蛋白质组学技术，但目标不同。多肽组学不是检查存在完整蛋白质的样品(蛋白质组学)，而是检查存在哪些内源性蛋白质片段。

在示例性方面，所述方法制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品，并进一步包括进行蛋白质组学分析和基因组分析。分析样品的基因组含量的合适技术是本领域已知的。例如，参见染色体微阵列(CMA)、连锁分析、全外显子组测序(WES)、下一代DNA测序(NGS)等。

储存稳定性

在不受特定理论约束的情况下，保护剂允许血液样品稳定，从而减少或防止细胞裂解和随后细胞蛋白释放到样品中。有利地，如本文进一步描述的，从血液样品分离的蛋白质样品的特征在于污染物蛋白质产物的水平被最小化。由于保护剂赋予了血液样品增强的稳定性，血液样品能够在冷藏温度和较高温度(例如4℃以上的温度)下储存更长的时间段。令人惊讶的是，与保护剂接触的血液样品可以储存超过48小时并且至多7天或甚至更长时间。所述稳定性允许与保护剂接触的血液样品在例如20℃下储存至少48小时，并且血液样品的稳定性可以通过在储存时间段后低量的污染物蛋白质产物来证明。

因此，在一些方面，在分离级分或细胞级分的步骤之前，混合物已储存至少48小时、至少48小时但少于7天或至少48小时但少于14天。任选地，在分离级分或细胞级分的步骤之前，混合物已在大于4℃的温度下，任选地在约20℃至约25℃的温度下储存至少48小时。

而且因此，在各种情况下，所述方法包括在分离级分或细胞级分的步骤之前储存混合物。在一些方面，所述方法包括在分离级分或细胞级分的步骤之前将混合物在BCT中储存至少48小时、至少48小时但少于7天、或至少48小时但少于14天。

由保护剂赋予混合物的储存稳定性有利地允许在收集(例如，从受试者抽取)血液样品之后的更晚时间对蛋白质样品进行蛋白质组学分析。这种储存稳定性避免了与在蛋白质组学分析之前冷冻和解冻蛋白质样品相关的问题。

储存时减少细胞裂解和污染性细胞蛋白质

保护剂允许血液样品稳定，从而减少或防止细胞裂解和随后细胞蛋白释放到样品中。由目前公开的方法产生的蛋白质样品有利地以减少或降低的细胞裂解为特征。尽管由于例如从受试者收集血液的剪切而发生最小或基本水平的细胞裂解，但细胞裂解的量例如在冷藏温度或更高温度下储存时随时间的推移而增加。作为保护剂赋予稳定性的结果，由于细胞裂解水平降低，在所述方法中产生的蛋白质样品适用于蛋白质组学分析。在一些方面，细胞裂解水平的降低是相对于对照蛋白质样品的细胞裂解水平降低至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。在一些方面，细胞裂解水平的降低是在分离所述级分或细胞级分的步骤之前将混合物储存至少48小时(任选地，在分离步骤之前储存至少48小时但少于7天，或者任选地，在分离步骤之前储存至少48小时但少于14天，其中在大于4℃的温度下，任选地在约20℃至约25℃的温度下进行储存)之后，相对于对照蛋白质样品的细胞裂解水平降低至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。测量细胞裂解的方法是本领域已知的，并且包含例如通过光散射(Valenzeno和Trank,《光化学和光生物学(Photochemistry and Photobiology)》42(3):335-339(1985))进行的细胞裂解测量和使用细胞染料如台盼蓝进行的测量。

细胞裂解降低也可以通过细胞裂解时从细胞释放的污染性细胞蛋白质的减少来证明。在一些方面，污染性细胞蛋白质是来自白细胞、红细胞和/或血小板的细胞蛋白质(当蛋白质组学分析的分析物不是白细胞、血细胞和/或血小板的蛋白质时)。在一些方面，保护剂减少了白细胞、红细胞和/或血小板的细胞裂解，使得减少了来自这些细胞的污染性细胞蛋白质的水平。尽管由于例如从受试者收集血液的剪切而可能存在最小或基本水平的污染性细胞蛋白质，但污染性细胞蛋白质的量例如在冷藏温度或更高温度下储存时随时间的推移而增加。作为保护剂赋予稳定性的结果，由于污染性细胞蛋白质水平降低，在所述方法中产生的蛋白质样品适用于蛋白质组学分析。在一些方面，污染性细胞蛋白质水平的降低是相对于对照蛋白质样品的污染性细胞蛋白质水平降低至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。在一些方面，污染性细胞蛋白质水平的降低是在分离所述级分或细胞级分的步骤之前将混合物储存至少48小时(任选地，在分离步骤之前储存至少48小时但少于7天，或任选地，在分离步骤之前储存至少48小时但少于14天，其中在大于4℃的温度下，任选地在约20℃至约25℃的温度下进行储存)之后，相对于对照蛋白质样品的污染性细胞蛋白质水平降低至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。测量污染性细胞蛋白质的方法在本领域中是已知的并且包含例如代表性污染性细胞蛋白质的测量。在一些方面，代表性污染性细胞蛋白质是红细胞蛋白质组的蛋白质，如Pasini等人,《血液(Blood)》108(3):791-801(2006)或Bryk和Wisniewski,《蛋白质组研究杂志(J ProteomeRes)》16:2752-2761(2017)中所述。在一些方面，代表性污染性细胞蛋白质是血红蛋白或其亚基(HbA、HbB、HbD、HbG、HbZ)、或碳酸酐酶(CA1)、或过氧化物酶(peroxiredoxin)(例如，PRDZ1、PRDX12、PRDX16)、胆绿素还原酶B(BLVRB)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD1)、双磷酸甘油酸变位酶(BPGM)。在一些方面，代表性污染性细胞蛋白质是白细胞蛋白质组的蛋白质，例如白细胞特异性蛋白1(LSP1)、T细胞受体的亚基、B细胞受体的亚基。在一些方面，代表性污染性细胞蛋白质是血小板蛋白质组的蛋白质，如Senzel等人,《血液学新见(Curr Opin Hematol)》16(5):329-333(2009)和Doyle等人,《血液杂志(Blood J)》55(1):82-84中所述的那些。在一些方面，代表性污染性细胞蛋白质是β-血小板球蛋白和血小板因子4。

细胞裂解的水平也可以通过使用液滴数字PCT(ddPCR)测量如通过游离DNA表示的细胞稳定性来测量。例如，参见Norton等人,《临床生物化学(Clin Biochem)》46:1561-1565(2013)。

在各个方面，根据所绘制的由步骤(b)产生的蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率，低细胞裂解水平可以是显而易见的。在示例性方面，与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的所述蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0。

在各个方面，根据所绘制的由步骤(b)产生的蛋白质样品中肽的数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率，低细胞裂解水平是显而易见的。在示例性方面，与未与保护剂接触的对照血液样品中的肽的数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的蛋白质样品中肽的数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0。

血浆级分和储存时鉴定的低丰度血浆蛋白质或每种蛋白质的独特肽或独特蛋白质的水平增加

在一些方面，从混合物中分离的级分是血浆级分，并且由于低丰度血浆蛋白质的水平增加，所述方法中产生的蛋白质样品适用于蛋白质组学分析。在一些方面，低丰度血浆蛋白质水平的增加是相对于存在于对照蛋白质样品中的低丰度血浆蛋白质的水平增加至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。在一些方面，低丰度血浆蛋白质水平的增加是在分离所述级分或细胞级分的步骤之前将混合物储存至少48小时(任选地，在分离步骤之前储存至少48小时但少于7天，或者任选地，在分离步骤之前储存至少48小时但少于14天，其中在大于4℃的温度下，任选地在约20℃至约25℃的温度下进行储存)之后，相对于存在于对照蛋白质样品中的低丰度血浆蛋白质的水平增加至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。本领域已知测量低丰度血浆蛋白质的水平的方法。例如，参见Liu等人,《公共科学图书馆·综合(PLOS One)》DOI:10.1371/journal.pone.0166306(2016)，其还描述了超过125种低丰度血浆蛋白质。

在一些情况下，从混合物中分离出的级分是血浆级分，并且由于每种蛋白质鉴定的独特肽的水平增加，所述方法中产生的蛋白质样品适用于蛋白质组学分析。在示例性情况下，通过无发现标记数据依赖性采集(DDA)LC-MS/MS确定每种蛋白质鉴定的独特肽。在一些方面，每种蛋白质鉴定的独特肽水平的增加是相对于存在于对照蛋白质样品中的每种蛋白质鉴定的独特肽的水平增加至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。在一些方面，每种蛋白质鉴定的独特肽水平的增加是在分离所述级分或细胞级分的步骤之前将混合物储存至少2小时(任选地，在分离步骤之前储存至少2小时但少于4小时，或者任选地，在分离步骤之前储存至少2小时但少于8小时，其中在大于4℃的温度下，任选地在约20℃至约25℃的温度下进行储存)之后，相对于存在于对照蛋白质样品中的每种蛋白质鉴定的独特肽的水平增加至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。可以通过如以下中大体上描述的DDA LC-MS/MS进行测量每种蛋白质鉴定的独特肽的水平的方法：Almazi等人,《蛋白质组学的临床应用(Proteomics Clin Applications)》12:1700121(2018)；doi:10.1002/prca.201700121。

在一些情况下，从混合物中分离的级分是血浆级分，并且由于如通过LC-MS/MS确定的，鉴定的独特蛋白质的水平增加，所述方法中产生的蛋白质样品适用于蛋白质组学分析，任选地其中独特蛋白质是分泌性蛋白质。在一些方面，鉴定的独特蛋白质水平的增加是相对于存在于对照蛋白质样品中的鉴定的独特蛋白质的水平增加至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。在一些方面，鉴定的独特蛋白质水平的增加是在分离所述级分或细胞级分的步骤之前将混合物储存至少2小时(任选地，在分离步骤之前储存至少2小时但少于4小时，或者任选地，在分离步骤之前储存至少2小时但少于8小时，其中在大于4℃的温度下，任选地在约20℃至约25℃的温度下进行储存)之后，相对于存在于对照蛋白质样品中的鉴定的独特蛋白质的水平增加至少约10％(例如，至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多)，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。可以通过如以下中大体上描述的LC-MS/MS进行测量鉴定的独特蛋白质的水平的方法：Tsung-Heng Tsai等人,《蛋白质组学(Proteomics)》15(13):2369-2381(2015)和Geyer等人,《细胞系统(Cell Systems)》2:185-195(2016)。

与新鲜分离的血液样品的相似性

在一些方面，所述方法中产生的蛋白质样品适用于蛋白质组学分析，因为所述蛋白质样品在完整蛋白质含量方面与新鲜分离的血液样品相似，即使在储存蛋白质样品后也是如此。如本文所使用的，“新鲜分离的血液样品”中的术语“新鲜分离”是指从受试者中分离、收集或抽取血液样品的时间开始经过不超过26小时的血液样品。在各种情况下，所述方法中产生的蛋白质样品适用于蛋白质组学分析，因为所述蛋白质样品包括新鲜分离的血液样品中存在的大于约50％、大于约60％(例如，大于约70％、大于约80％、大于约90％或更多)的完整蛋白质。在各种情况下，所述方法中产生的蛋白质样品适用于蛋白质组学分析，因为所述蛋白质样品包括新鲜分离的血液样品中存在的大于约50％、大于约60％(例如，大于约70％、大于约80％、大于约90％或更多)的完整蛋白质，甚至在分离所述级分或细胞级分的步骤之前将所述蛋白质样品储存至少48小时(任选地，在分离步骤之前储存至少48小时但少于7天，或者任选地，在分离步骤之前储存至少48小时但少于14天，其中在大于4℃的温度下，任选地在约20℃至约25℃的温度下进行储存)之后也是如此。测量完整蛋白质含量的方法是本领域已知的并且包含例如SDS-PAGE和质谱法。

而且，在各种情况下，根据在储存至少48小时后存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量与在从受试者收集血液样品的约0小时至约4小时内存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量非常相似，与新鲜分离的血液样品的相似性可以是显而易见的。在各种情况下，在储存至少48小时后存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集血液样品的约0小时至约4小时内存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约20％或约25％内。在各种情况下，在储存至少48小时后存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集血液样品的约0小时至约4小时内存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％内。在各种情况下，在储存至少48小时后存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集血液样品的约0小时至约4小时内存在于蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约7.5％或约5％内。

污染性蛋白质产物减少

在一些方面，在分离所述级分或细胞级分的步骤之前将蛋白质样品或对照样品所来源于的血液样品储存至少2小时(任选地在分离步骤之前储存至少2小时但少于4小时，或者任选地，在分离步骤之前储存至少2小时但少于8小时，其中在大于4℃的温度下，任选地在约20℃至约25℃的温度下进行储存)之后，所述方法中产生的蛋白质样品由于其污染性蛋白质产物的水平相对于对照蛋白质样品中的污染性蛋白质产物的水平降低而适用于蛋白质组学分析，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如，仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。在示例性情况下，在分离所述级分或细胞级分的步骤之前将蛋白质样品或对照样品所来源于的血液样品储存至少2小时(任选地，在分离步骤之前储存至少2小时但少于4小时，或者任选地，在分离步骤之前储存至少2小时但少于8小时，其中在大于4℃的温度下，任选地在约20℃至约25℃的温度下进行储存)之后，相对于对照蛋白质样品中的污染性蛋白质产物的水平，所述方法中产生的蛋白质样品包括小于约40％(例如，小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％)的污染性蛋白产物，所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。如本文所使用的，“污染性蛋白质产物”是指氧化、还原、酰胺化、脱酰胺化、裂解、降解、聚集和/或沉淀的蛋白质产物。测量污染性蛋白质产物的方法是本领域已知的并且包含例如HPLC和MS。

以下实例仅仅是为了说明本发明及其优点而给出的，而不以任何方式限制本发明的范围。

实例

实例1

本实例描述了对来自收集在两种不同类型的血液收集管(BCT)中的全血样品的血浆和耗竭的血浆的蛋白质组学分析。

本测定的目的是使用不同的血液收集管(BCT)处理人全血样品以获得血浆，并且然后通过LC-MS/MS进行分析。管1是缺少保护剂的对照EDTA血液收集管。管1含有液体添加剂EDTA(K3)15％溶液；并且管2是包括保护剂的BCT，所述保护剂基本上由(i)约300g/l至约700g/l咪唑烷基脲、(ii)约20g/l至约60g/l甘氨酸和(iii)约60g/l至约100g/l EDTA组成。

通过LC-MS对来源于收集在不同BCT中的人全血的全血浆和耗竭的血浆样品进行蛋白质组学分析，以获得总离子色谱图(TIC)绘图。LC-MS运行的细节在表3中提供。图1A-1C示出了全血浆样品的TIC，并且图2A-2C示出了耗竭的血浆样品的TIC。图1A提供了管1全血浆样品(红色迹线)和管2全血浆样品(绿色迹线)的叠加TIC绘图。图1B和图1C是管1全血浆样品(图1B)和管2全血浆样品(图1C)的堆叠视图。图2A提供了管1耗竭的血浆样品(红色迹线)和管2耗竭的样品(绿色迹线)的叠加TIC绘图。图2B和2C是管1耗竭的样品(图2B)和管2耗竭的样品(图2C)的堆叠视图。

如图2A-2C所示，来源于收集在管1和管2中的人全血的耗竭的血浆样品的色谱图大致相同。血浆中总共鉴定出153种蛋白质。七种蛋白质在管之间的变化倍数>2，管2中这些蛋白质的蛋白质丰度更大。管2中丰度较高的蛋白质都是已知的血浆蛋白质。

Progenesis报告

Progenesis鉴定样品中的蛋白质，并比较样品中蛋白质的相对丰度。

结果在表A和B中提供，其中表A提供了来自全血浆的信息，并且表B提供了来自耗竭的血浆样品的信息。在每个表中，以下描述适用：

肽：从蛋白质中检测到的肽总数。括号中的数字是从蛋白质中检测到的独特肽的数量。实验中检测到的一些胰蛋白酶肽是多种蛋白质共同的。具有高度同源性的蛋白质可以具有共享的胰蛋白酶肽。

评分：评分Progenesis用于对蛋白质鉴定的优良性和可靠性进行定量。评分越高，鉴定越可靠。

倍数：这是样品之间蛋白质的相对丰度的最大差异的度量。这应被视为估计值。注意，将酵母ADH以相等的量掺入到每个样品中，并且获得的最大差异倍数为1.55。

平均归一化丰度：针对每个样品计算的蛋白质水平Progenesis。这是由Proggenesis基于针对每种蛋白质发现的3种最丰富的肽的信号强度以及相对于掺入的酵母ADH的水平来计算的。

讨论：在全血浆样品中，正如预期的那样，白蛋白和免疫球蛋白是样品中最丰富的蛋白质。在耗竭的血浆样品中，白蛋白和免疫球蛋白仍然以低得多的水平被检测到，因此表明白蛋白和免疫球蛋白耗竭成功。在分析的所有样品中，耗竭也似乎一致。

在全血浆样品中，大多数蛋白质处于相似的相对水平。在列表中的148种蛋白质中，有7种蛋白质的“倍数”>2。收集管之间的蛋白质谱看起来非常相似。

在耗竭的血浆样品中，大多数蛋白质处于相似的相对水平。在列表中的153种蛋白质中，只有7种蛋白质的“倍数”>2。考虑到所进行的耗竭处理步骤，收集管之间的蛋白质谱看起来非常相似。

此实例表明，在此分析中，收集管样品之间的蛋白质谱非常相似，并且稳定试剂适用于蛋白质组学分析。

实例2

本实例描述了在实例1的分析中使用的材料和方法。

将样品在冰上运输到分析实验室并在4℃下储存，直到进一步分析。通过离心从全血样品中提取血浆。将分离的血浆中的一部分用白蛋白和IgG耗竭SpinTrap柱(通用电气医疗(GE Health Care))处理，从而耗竭血浆中的白蛋白和IgG。通过降低的胰蛋白酶消化来处理全血浆和耗竭的血浆。以下是这些步骤的完整描述。

材料

在所测试的以下类型的血液收集管(BCT)之一中收集人全血：管1是缺少保护剂的对照EDTA血液收集管。管1含有液体添加剂EDTA(K3)15％溶液；并且管2是包括保护剂的BCT，所述保护剂基本上由(i)约300g/l至约700g/l咪唑烷基脲、(ii)约20g/l至约60g/l甘氨酸和(iii)约60g/l至约100g/l EDTA组成。蛋白水解酶抑制剂未用于血液收集或本研究的任何方面。

从人全血中分离血浆

通过进行以下步骤从人全血中分离血浆：(1)每个样品。将1mL全血添加到1.5mL蛋白质LoBind管中。将样品在室温下在Eppendorf离心机5415D中以2000g离心15分钟。将血浆上清液去除并添加到新的1.5mL蛋白质LoBind管中。(2)将血浆在室温下在Eppendorf离心机5415D中以16000g再次离心10分钟。将血浆上清液去除并添加到新的1.5mL蛋白质LoBind管中。(3)将澄清的血浆储存在冰上。在处理后，将耗竭的血浆储存在-80℃下，直到进一步分析。

使用白蛋白和IgG耗竭旋转捕获柱预处理分离的血浆

通过进行以下步骤来从分离的血浆中耗竭白蛋白和IgG：(1)每个样品，制备250μL的澄清血浆于20mM磷酸钠、0.15M氯化钠，pH 7.4中的1:1稀释液。将125μL澄清血浆和125μL20mM磷酸钠、0.15M氯化钠，pH 7.4合并在0.5mL蛋白质LoBind管中，并使用Vortex Genie 1轻轻涡旋混合。(2)重复地倒置六个白蛋白和IgG耗竭SpinTrap柱以使培养基悬浮。(3)将SpinTrap柱的底盖移除，并且顶盖转动了四分之一圈。将SpinTrap柱放置于1.5mL蛋白质LoBind管中，并在室温下在Eppendorf离心机5415D中以800g离心30秒。弃置溢流物。弃置顶盖，并且将SpinTrap柱放回1.5mL蛋白质LoBind管中。(4)向培养基中添加400μL的20mM磷酸钠、0.15M氯化钠，pH 7.4(结合缓冲液)。将SpinTrap柱在室温下在Eppendorf离心机5415D中以800g离心30秒。弃置溢流物。将步骤重复。(5)将SpinTrap柱放置于新的1.5mL蛋白质LoBind管中。对于每个样品，向两个平衡的SpinTrap培养基中添加100μL稀释的澄清血浆。将样品在室温下温育5分钟。(6)将SpinTrap柱在室温下在Eppendorf离心机5415D中以800g离心30秒，收集洗脱液。向SpinTrap培养基中添加100μL结合缓冲液。将SpinTrap柱在室温下在Eppendorf离心机5415D中以800g离心30秒，收集洗脱液。将步骤重复。注意：所有洗脱液均收集在相同的1.5mL蛋白质LoBind管中。(7)将样品洗脱液合并到一个1.5mL蛋白质LoBind管中，并对IgG和白蛋白耗竭的血清进行OD280nm分析。(8)在处理后，将耗竭的血浆储存在-80℃下，直到进一步分析。

IgG和白蛋白耗竭的血清的OD280nm分析

通过进行以下步骤测定IgG和白蛋白耗竭的血浆的蛋白质浓度：(1)通过OD280nm，使用Beckman Coulter Du520通用UV/VIS分光光度计和分光光度计Cell UV Micro黑壁石英比色皿(VWR，目录号58016-505)、10mm光程来测定耗竭的血浆和澄清血浆的蛋白质浓度。(2)在A280nm分析之前，通过读取20mM磷酸钠、0.15M氯化钠，pH 7.4的空白读数，将仪器调零。将400μL的20mM磷酸钠、0.15M氯化钠，pH 7.4添加到石英比色皿中，所述石英比色皿的体积足以覆盖光束通过的孔口。(3)通过用400μL的10X稀释液填充比色皿在280nm下测量耗竭的血浆的吸光度，其中将50μL样品稀释到450μL 20mM磷酸钠、0.15M氯化钠，pH 7.4中。(4)通过用400μL的100X稀释液填充比色皿在280nm下测量澄清血浆的吸光度，其中将10μL样品稀释到990μL 20mM磷酸钠、0.15M氯化钠，pH 7.4中。(5)在样品读数之间，将比色皿用甲醇冲洗3次并风干。(6)选择1.0(mg/mL)^-1(cm)^-1的消光系数用于此测定。(7)使用比尔-朗伯定律(Beer-Lambert Law)确定蛋白质浓度c：A(280nm)＝εc l，其中ε＝1.0(mg/mL)^-1(cm)^-1的消光系数，并且l＝光程长度，在以cm为单位的情况下，其相当于1cm。

还原、烷化、DTT淬灭和胰蛋白酶消化，pH 7.8

在胰蛋白酶消化前，将澄清血浆在HPLC级水中稀释至10mg/mL的浓度。用5mM二硫苏糖醇、50mM碳酸氢铵，pH 7.8在60℃下将300皮摩尔的每个样品还原1小时。在还原后，在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺、50mM碳酸氢铵，pH 7.8将样品烷化30分钟。在烷化后，用5mM DTT、50mM碳酸氢铵，pH 7.8将样品淬灭，并在室温下温育30分钟。在37℃下，用胰蛋白酶以1:50的酶与底物比率消化样品18小时。将消化物淬灭至0.5％甲酸的最终浓度，并在-80℃下储存，直到进一步分析。

液相色谱法-质谱法(LC-MS)分析

将Waters MassPrep烯醇化酶(ENOL)和ADH消化物掺入样品中，如表1中详述：

表1

将消化物设置在室温下的水浴中解冻，并且然后在台式离心机中离心约10秒以沉降。将ENOL稀释液制成Axygen lo结合(lo-binding)微管。将每个样品添加到DionexPolypro 300uL LC小瓶中，并且然后添加所需量的MassPrep消化物。表2提供了关于所使用的柱、溶剂和梯度程序的细节，并且表3提供了LC-MS运行的细节。

表2

表3

数据分析

在UniProt人类蛋白质组数据库中搜索原始数据。此数据库仅含有来自UniProt的经审查的蛋白质。手动添加酵母ADH和酵母烯醇化酶。在Progenesis QI(Waters)和PLGS(Waters)中搜索数据；这两个程序都具有相同的MS-E数据基础搜索引擎。

实例3

本实例展示了从包括保护剂并具有或不具有蛋白水解酶抑制剂的BCT中收集的全血中获得的血浆和耗竭的血浆的蛋白质组学分析。

将全血样品收集在以下两种BCT之一中：具有保护剂的BCT或不具有保护剂的BCT。通过离心从全血样品中提取血浆。对于一个系列，将分离的血浆用白蛋白和IgG耗竭SpinTrap柱(通用电气医疗)处理，从而耗竭血浆中的白蛋白和IgG。对于另一系列，不进行耗竭。将所有血浆样品(耗竭或未耗竭)通过减少的胰蛋白酶消化进行进一步处理，随后进行LC/MS蛋白质组学分析。在一半的测试样品中添加包括cOmplete^TM迷你型无EDTA的蛋白酶抑制剂混合液(PIC)片剂(Roche品牌，可商购自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))的溶液。基本上如上文所描述的那样通过LC-MS对所有样品(耗竭和未耗竭的血浆样品；具有或不具有PIC)进行蛋白质组学分析。基本上如实例2中所述的那样进行这些程序。

预期不具有PIC的样品和具有PIC的样品的TIC叠加大致相同，这表明在制备用于蛋白质组学分析的样品的方法中不需要使用PIC和类似的蛋白水解酶抑制剂。

实例4

本实例证明了在室温下储存延长的时间段后，来源于具有或不具有保护剂并不具有蛋白水解酶抑制剂的BCT中收集的全血的样品的稳定性和蛋白质组学分析的适用性。

如以上所讨论的，减少的细胞裂解可以作为细胞稳定性来测量，所述细胞稳定性进而可以通过借助于液滴数字PCR来对游离DNA的量进行定量来间接测量。将全血样品收集在以下两种BCT之一中：具有保护剂的BCT或不具有保护剂的BCT。在第一组实验中，添加包括cOmplete^TM迷你型无EDTA的蛋白酶抑制剂混合液(PIC)片剂(Roche品牌，可商购自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)的溶液。在第二组实验中，不使用包括PIC片剂的溶液。将样品在室温下储存不同时间：1小时、12小时、24小时、48小时、72小时、120小时、240小时、336小时(2周)、1个月、2个月、4个月和6个月。通过DD-PCR测量每个样品中存在的游离DNA，如在Norton等人,2013,同上中大体上描述的。对每个样品进行另外的测量和观察，包含例如通过UV-VIS测定的总蛋白质浓度和通过SDS-PAGE测定的完整蛋白质含量的估计。使每个样品经受如实例2中大体上所述的处理步骤，并按照实例2中或Almazi等人,2018,同上中所述的程序进行基于质谱法的蛋白质组学分析。

预期与在来自不具有保护剂的BCT中收集的全血样品的样品中存在的游离DNA的水平相比，在来源于具有保护剂的BCT中收集的全血样品的样品中，游离DNA的水平较低并且完整蛋白质含量较高。在来源于具有保护剂的BCT中收集的全血样品的样品中，预期游离DNA和完整蛋白质含量的水平大致相同，这表明在制备蛋白质样品中不需要使用PIC片剂。

此外，预期如通过Almazi等人,2018,同上的LC/MS方法测定的每种蛋白质鉴定的独特蛋白质的水平在来源于具有保护剂的BCT中收集的全血样品的样品之间大致相同，无论是否添加了含有PIC片剂的溶液，这表明在制备蛋白质样品中不需要使用PIC片剂。

实例5

本实例展示了制备蛋白质样品以使用一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法进行蛋白质组学分析的示例性方法，其中基于质谱法的蛋白质组学方法的质谱法是靶向质谱法。本实例证明了，使用包括保护剂的CF BCT收集血液成功地提供了即使在储存长达216小时后仍稳定的蛋白质样品。

使用两种血液收集管(BCT)之一收集人血浆样品。“E BCT”是缺乏保护剂并且含有液体添加剂EDTA(K3)15％溶液的对照EDTA BCT。“CF BCT”是包括保护剂的BCT，所述保护剂基本上由(i)约300g/l至约700g/l咪唑烷基脲、(ii)约20g/l至约60g/l甘氨酸和(iii)约60g/l至约100g/l EDTA组成。

根据CLSI批准的标准“通过静脉穿刺收集诊断性血液样本的程序(Proceduresfor the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture)”，CLSI文件GP41，通过静脉穿刺从供体直接抽取血液样品到BCT中。在对应于三个个体的生物学重复中收集样品。将样品在环境温度，例如约15℃至约25℃温度(约20℃至约25℃)下储存0小时至216小时。

通过还原和烷化蛋白质并用胰蛋白酶消化来制备用于质谱法的样品。如以下中所描述的那样进行肽的C18纯化和最终肽浓度的定量：“样品制备试剂盒Pro：高通量质谱法蛋白质组学(Sample Preparation Kit Pro:For High-Throughput Mass SpectrometryProteomics)”手册,第一版,1.04版(2017年11月)，瑞士Biognosys AG，https:// www.biognosys.com/media/5c169d9c-50fe-4d7b-84a4-a1dec78f6a63.pdf。向最终肽制剂中掺入稳定同位素标准(SIS)肽的PQ500^TM面板。

对蛋白质谱进行HRM LC-MS/MS，并记录HRM图。使用PQ500^TM面板提取数据并且通过多种方法分析数据，所述方法包含QC度量、主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。计算肽和蛋白质的绝对量。所有数据均经统计学检验。

跨所有样品对238个蛋白质进行定量，并由324个肽表示所述蛋白质。尽管与E BCT相比，对于在CF BCT中收集的样品，针对每个样品定量的蛋白质数量(在储存时间0)更多，但每个样品中平均定量的蛋白质为160个。而且如图3A-3C所示，与E BCT(EDTA)相比，CFBCT(管1)的最佳拟合线斜率更接近于零，这表明与E BCT中收集的样品相比，在CF BCT中收集的样品中定量的蛋白质数量受储存时间的影响较小。

跨所有样品对324个肽进行定量。尽管与E BCT相比，对于在CF BCT中收集的样品，针对每个样品定量的肽数量(在储存时间0)更多，但每个样品中平均定量的肽为232个。而且如图4A-4C所示，与E BCT(EDTA)相比，CF BCT(管1)的最佳拟合线斜率更接近于零，这表明与E BCT中收集的样品相比，在CF BCT中收集的样品中定量的肽数量受储存时间的影响较小。

进行层次聚类分析。图5示出了样品树状图，并且根据供体显示出强烈的分离。而且，根据BCT，存在强烈的二次分离。

通过检查按对偏最小二乘判别分析的组分1的贡献排序的前25个候选蛋白质来选择用于进一步评估的蛋白质。评估基于在E BCT对CF BCT中储存表现出差异的那些蛋白质。还选择在CF BCT对E BCT中收集的血浆之间具有丰度差异的蛋白质用于进一步评估。与上面检查的前25个候选蛋白质存在显著重叠。

通过表4中列出的蛋白质的检查水平证明了细胞裂解和污染性蛋白质的水平降低：

表4

蛋白质名称	细胞位置
		组装抑制蛋白-1	细胞骨架
硫氧还蛋白	细胞核、细胞质
		Rho GDP解离抑制剂2	胞质溶胶
巨噬细胞迁移抑制因子	细胞质
		磷酸甘油酸酯激酶1	细胞质
黄素还原酶(NADPH)	细胞质
		过氧化物还原酶-6	溶酶体、细胞质
谷胱甘肽S-转移酶ω-1	胞质溶胶
		热休克同源物71lDa蛋白	细胞核、质膜、细胞质
碳酸酐酶1	细胞质
		碳酸酐酶2	细胞膜、细胞质
血红蛋白亚基β	胞质溶胶
		血红蛋白亚基δ	胞质溶胶
血红蛋白亚基α	胞质溶胶
		SH3结构域结合的富含谷氨酸样蛋白3	细胞核
转酮醇酶	胞质溶胶、细胞核、过氧化物酶体

这些蛋白质最初处于低水平，并且然后由于储存时间，这些蛋白质的水平增加。在CF BCT中收集的样品中，所述增加被延迟和/或不显著。如图6A-6E所示，与EBCT中收集的样品相比，CF BCT中收集的每个样品的蛋白质(转酮醇酶(图6A)；Rho GDP解离抑制剂2(图6B)；磷酸甘油酸酯激酶1(图6C)；组装抑制蛋白(图6D)；血红蛋白亚基δ(图6E))的水平随时间的推移更低。图7提供了色谱实例，其中示出了组装抑制蛋白-1的提取离子色谱图。在48小时时，与E BCT中收集的样品相比，CF BCT(A管)中收集的每个样品的谱水平更低。

为了确定样品随时间的稳定性，检查了低丰度和分泌性蛋白质的水平。表5列出了为此目的分析的示例性蛋白质。如图8A-8D所示，与在E BCT(EDTA)中收集的样品相比，在CFBCT(管1)中收集样品的低丰度和分泌性蛋白质(血小板因子4(图8A)；血小板碱性蛋白(图8B)；血管性血友病因子(图8C)；纤连蛋白(图8D))的水平增加。而且，对于在CF BCT中收集的样品，与在E BCT中收集的样品相比，蛋白质水平在更短的时间内(在4小时内)达到稳定。进一步地，对于在CF BCT中收集的样品，与在E BCT中收集的那些样品相比，蛋白质不易降解(如通过浓度的降低所示)。图9提供了色谱实例，其中示出了血小板碱性蛋白的提取离子色谱图。跨4小时至216小时的时间段，与在E BCT(EDTA)中收集的样品相比，在CF BCT(管1)中收集的样品的蛋白质水平更高。

表5

蛋白质名称	细胞位置
		血小板碱性蛋白	细胞外/分泌
血管性血友病因子	细胞外/分泌
		血小板反应蛋白-1	细胞外/分泌、ER
血小板因子4	细胞外/分泌
		SPARC	细胞外/分泌
纤连蛋白	细胞外/分泌
		凝血因子IX	细胞外/分泌

数据支持在CF BCT中收集和储存血液成功地为样品提供了改进的稳定性特性。与EDTA相比，CF BCT中分泌的血浆蛋白质不易降解(参见P04275/P02751)和/或达到快速平衡(P02776/P02775)。样品中的细胞(污染性)蛋白质释放被延迟48至216小时(或更长时间)。这些效应使样品能够在延长的时间段内保持一致，从而改善分析结果。此外，这种稳定性将使样品能够运送或运输到实验室进行蛋白质组学分析。

实例6

本实例描述了在实例5的研究中使用的材料和方法。

血浆样品及其制备

Streck(内布拉斯加州拉维斯塔(La Vista,NE))总共提供了48个人血浆样品，并且Biognosys AG(瑞士施利伦(Schlieren,Switzerland))提供了一个对照样品。在提供的样品中，将42个个体样品收集在CF BCT或E BCT中。在对应于三个个体的三个生物学重复中收集这些个体样品中的每一个个体样品。将样品在0小时至216小时范围内的7个时间点之一时储存。

化学品和试剂

所有溶剂均为来自的西格玛奥德里奇公司的HPLC级，并且所有未另行说明的化学品均获自西格玛奥德里奇公司。在本研究的步骤中的任何步骤期间均未使用蛋白水解酶抑制剂。

样品制备

血浆样品由Streck冷冻运送。Biognosys提供了一份用于质量控制的另外的血浆。将样品使用Biognosys的变性缓冲液变性，在60℃下使用Biognosys的还原溶液还原60分钟，并在黑暗中使用Biognosys的烷化溶液在室温下烷化30分钟。随后，使用每个样品1μg胰蛋白酶(普洛麦格公司(Promega))在37℃下进行肽消化过夜。

纯化以用于质谱法

根据制造商的说明，使用BioPureSPE Midi板(The Nest Group)对肽进行脱盐，并使用SpeedVac系统进行干燥。将肽重新悬浮在17μL LC溶剂A(1％乙腈，0.1％甲酸(FA))中，并掺入Biognosys的iRT试剂盒校准肽。使用UV/VIS光谱仪(SPECTROstar Nano，BMGLabtech)测定肽浓度。

掺入

将肽稀释至1μg/μL，并掺入1μL含有1个注射当量(IE)的PQ500TM(Biognosys)。

HRM质谱采集

对于DIA LC-MS/MS测量，将每个样品含有1IE PQ500的1μg肽注射到ThermoScientificTM Easy nLC 1200纳米液相色谱系统上的内部填充的C18柱(Waters CSH C18，1.7μm粒度，

孔隙大小；75μm内径，60cm长，PicoFrit 10μm尖端，New Objective)中，所述纳米液相色谱系统连接到配备有nanoFlex电喷雾源的Thermo Scientific OrbitrapFusionTM TribridTM质谱仪。LC溶剂为A：含0.1％ FA的水；B：含20％水和0.1％ FA的乙腈。非线性LC梯度为：在54分钟48秒内，1％-59％溶剂B；随后在10秒内，59％-90％ B；90％ B持续7分钟52秒；和在10秒内，90％-1％B；以及1％ B持续4分钟。

HRM数据分析

使用SpectronautTM软件(Biognosys)和PQ500TM测定面板分析HRM质谱数据。将肽水平上的错误发现率设置为1％，使用基于行的提取过滤数据。使用局部回归归一化(Callister等人,《蛋白质组研究杂志》2006,5(2),277-86)对用Spectronaut分析的HRM测量值进行归一化。

数据分析

根据SIS肽与内源性肽的比率计算绝对蛋白质量，并根据原始血浆样品的注射比例进行调整。为了测试不同的蛋白质丰度，使用双样品型样品学生t检验(Student's t-test)分析每种蛋白质的蛋白质浓度。热图中的距离是使用“曼哈顿”方法(“manhattan”method)计算的，对于两个轴，聚类使用“ward.D”。使用用于标绘的prcomp和修改的ggbiplot函数在R中进行主成分分析，并使用mixOMICS软件包进行偏最小二乘判别分析。使用ggplot2软件包在R中进行一般标绘。

实例7

本实例描述了制备蛋白质样品以使用一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法进行蛋白质组学分析的示例性方法，其中基于质谱法的蛋白质组学方法的质谱法是非靶向质谱法。

血液样品收集和储存：根据CLSI批准的标准“通过静脉穿刺收集诊断性血液样本的程序”，CLSI文件GP41，通过静脉穿刺从供体直接抽取血液样品到BCT(CF BCT或E管)中。在对应于三个个体的生物学重复中收集样品。在1、4、24、48、120、168或216小时时使用在Streck游离DNA BCT IFU中描述的双旋转方案分离血浆。将分离的血浆在-80℃下储存，直到处理。

质谱分析样品制备：制备样品以用于质谱分析。简言之，将血浆解冻，并且然后使用Pierce^TM前12种丰富蛋白质耗竭旋转柱(Pierce^TMTop 12Abundant Protein DepletionSpin Column)(目录号85164，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific,Waltham,MA))耗竭。使用Pierce^TM3K分子量截留(MWCO)过滤器(目录号88512，赛默飞世尔公司(ThermoFisher))对样品进行脱盐和浓缩。使用Biognosys样品制备试剂盒，使血浆经受蛋白质变性、还原和烷化。在60℃下进行还原。使用胰蛋白酶/Lys-C混合物(目录号V5071；威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))进行消化步骤。如实例6中所述的那样用C18纯化样品，并且然后掺入酵母醇脱氢酶(UniProt P00330)以进行定量测量。

非靶向分析：使用如上所述制备的样品进行DIA LC-MS/MS。参见质谱分析样品制备。将样品注射到连接到配备有ESI源的Waters Synapt G2-Si的Waters H-Class UHPLC系统上的C18柱(Waters T3，1.0×150mm，1.7μm粒度)上。在HDMSe模式(启用离子迁移)下收集数据。LC溶剂为A：含0.1％甲酸的水，B：含0.1％甲酸的乙腈。

数据分析：使用蛋白质组学软件Proggenesis QI(马萨诸塞州米尔福德市的沃特世公司(Waters,Milford,MA))分析质谱数据。使用Uniprot人类参考蛋白质组确定阳性命中。搜索利用胰蛋白酶消化，其中2个允许缺失的切割，并且最大蛋白质质量为300kDa。固定的修饰是脲甲基半胱氨酸。可变修饰是蛋氨酸的氧化、n-末端乙酰化、谷氨酰胺的脱酰胺和精氨酸的脱酰胺。针对肽和片段质量容差，将搜索容差参数设置为自动，并且将错误发现率设置为1％。将离子匹配要求设置为3个片段/肽、7个片段/蛋白质和1个肽/蛋白质。通过将前3个确定的肽与由酵母醇脱氢酶产生的前3个肽进行比较来进行蛋白质定量。

结果

蛋白质耗竭：Pierce^TM前2种或前12种丰富蛋白质耗竭旋转柱用于从血浆中去除丰富的血浆蛋白质。指定蛋白质的抗体用于去除蛋白质：

蛋白质耗竭使得能够在质谱法或凝胶电泳研究中检测较低丰度的蛋白质。在图10中示出了耗竭后血浆蛋白质的示例性SDS-PAGE。PL泳道示出了未耗竭的血浆，T12泳道示出了前12种蛋白质耗竭的血浆，并且T2泳道示出了前2种蛋白质耗竭的血浆。在质谱分析中，检测到的血清白蛋白在管1中占所有定量蛋白质的1.65％，并且在EDTA中占所有定量蛋白质的1.67％。这从血液中大约55％的理论浓度降低。管1的结果与EDTA和声称去除>95％的制造商的IFU一致。

总蛋白质：跨所有样品鉴定出353种蛋白质。在353种蛋白质中，337种是可定量的蛋白质。每个样品中平均鉴定出165种蛋白质。图11是针对用CF BCT(管1)或E管(EDTA)收集的样品所绘制的可定量蛋白质的平均数量随时间而变化的图。在t＝0小时时，使用CF BCT获得的样品中定量的蛋白质数量大约等于E管。在CF BCT中收集的样品中定量的蛋白质数量受储存时间的影响小于在E管中收集的样品。

单独蛋白质评估：通过检查储存不同时间段的血浆之间具有丰度差异的候选蛋白质来选择用于进一步评估的蛋白质。选择在储存时间段内显示出大于或等于1.5的变化差异倍数的那些蛋白质。通过以下蛋白质的检查水平证明了细胞裂解和污染性蛋白质的水平的降低：

如图12A-12E所示，蛋白质(蛋白质S100-A9(图12A)；蛋白质S100-A12(图12B)；血红蛋白亚基β(图12C)；硫氧还蛋白(图13D)；毛状蛋白样蛋白质(图13E))的水平最初较低，并且由于储存时间而增加。这些蛋白质预计在血浆中发现，但来源于细胞裂解。实例是由于RBC的裂解而增加的血红蛋白。

通过检查血小板碱性蛋白(图13A)和血小板因子4(图13B)的水平证明了低丰度和分泌性蛋白质的水平增加。与EDTA相比，这些蛋白质在管1(CF DNA BCT)中的浓度相当或更高。管1(CF DNA BCT)中的蛋白质比EDTA中的蛋白质更快(即在4小时内)达到稳定水平。与EDTA相比，管1(CF DNA BCT)中的蛋白质不易降解(即浓度降低)。

此实例证明，在CF DNA BCT中收集和储存血液成功地为样品提供了改进的稳定性特性。如由P02776/P02775所示，与EDTA相比，CF DNA BCT中的分泌的血浆蛋白质达到快速平衡。样品中的细胞(污染性)蛋白质释放被控告48至216小时(或更长时间)。这些效应使样品能够在延长的时间段内保持一致，从而提供了改善的分析结果。这种改善的样品稳定性将进一步使样品能够运送或运输到实验室以用于随后的蛋白质组学分析。

实例8

本实例证明，BCT中的基于柠檬酸盐的保护剂减少了RBC和WBC的降解，最小化了血小板活化，并防止了血浆蛋白质随时间的降解。

通过直接抽取到以下8种试剂中的每一种试剂中来从三个健康供体收集血液样品：

试剂	组分
		A	ACD+IDU
B	CTAD+IDU
		C	CTAD+IDU+αCD
D	CPDA+IDU
		E	CPDA+IDU+αCD
F	非基于柠檬酸盐的试剂
		G	非基于柠檬酸盐的试剂
H	非基于柠檬酸盐的试剂

制备试剂A-E：制得试剂A-E如下：

将试剂A-E中的每种试剂的组分用水稀释至10mL。接下来，将每种A-E试剂(500μl)添加至10mL无添加剂的血液收集管(BCT)中，并且然后在真空下加盖。

试剂F-H是用于血液收集的可商购获得的非基于柠檬酸盐的试剂。

在0、4、24、48、96、168、240和336小时时将血浆分离。将分离的血浆在-80℃下储存，直到处理。

样品分析：制备样品以用于质谱分析。使用Biognosys样品制备试剂盒，使血浆经受蛋白质变性、还原和烷化。在37℃下进行还原。使用胰蛋白酶/Lys-C混合物(目录号V5071；威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)进行消化步骤。

目测和使用Nanodrop One分析溶血。在所测试样品中的每个样品中，在室温下168小时后在所有患者样品中，在BCT F-H中的非基于柠檬酸盐的试剂中观察到溶血增加。在测试的任何时间点，在任何BCT A-E中几乎没有观察到溶血(图14A-14C)。

实例9–血小板失活

以下实例被设计成确定多西环素、丁卡因、替罗非班或茶碱腺苷双嘧达莫(TAD)在将血液抽取到BCT管中后抑制血小板活化的能力。使用EDTA和酸柠檬酸盐右旋糖(ACD)-A管作为对照。

将来自3个自称健康的供体的血液抽取到含有丁卡因(2mM)、多西环素(10mM)、替罗非班(1μg/mL)或TAD(茶碱(15mM)、腺苷(3.7mM)、双嘧达莫(0.2mM))的BCT管中。接下来，使用双旋转离心方案分离血浆(以1800g初始旋转持续15分钟，并且以2800g二次澄清旋转持续15分钟)。将血浆立即在-80℃下冷冻。接下来，在多个时间点(抽取时间，4、24和72小时)测定血浆样品的血小板活化(通过对血小板因子-4(PF-4)进行测量)。为了测量血小板因子-4的浓度，使用可商购获得的基于量热夹心的ELISA。(艾博抗公司(AbCam)，人PF4ELISA试剂盒(CXCL4)(ab189573))。血浆稀释度在1:2000至1:4000的范围内的所有样品均遵循制造商的建议。

还评估了血浆样品的核酸稳定性。根据制造商的建议，使用QIAamp循环核酸分离试剂盒从血浆样品中分离出循环游离DNA(cfDNA)。然后使用荧光测定法(Qubit DNA高灵敏度测定法)和使用液滴数字PCR测定游离DNA浓度。在血液储存五天后，cfDNA的浓度保持在抽取时间水平，因此表明添加丁卡因(或TAD[茶碱腺苷双嘧达莫调配物])不会损害活性成分保存。溶血包含目视观察和使用分光光度计筛查血浆(血红蛋白在414nm下强烈吸收)。注意到含有丁卡因或TAD的调配物的溶血没有增加。

如图15所示，包括丁卡因的制剂展现出最稳健的血小板失活。当血液被抽取到BCT管时，替罗非班或多西环素均未展现出对血小板活化的阻断作用。TAD的添加展现出血小板中度失活，并且可能与供体相关。

总之，向RNA完整BCT(RNA Complete BCT)中添加丁卡因(以及程度稍低的TAD)可在72小时内有效地抑制“血小板活化”(图15)，而不会导致红细胞溶血或对目前RNA完整BCT提供的核酸稳定性产生负面影响。

本文引用的所有参考文献(包含出版物、专利申请和专利)均通过引用特此并入，其程度如同每篇参考文献被单独并且具体地指出通过引用并入并且在本文中被整体阐述。

除非本文中另外指明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本公开的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代词应被解释为涵盖单数和复数两者。除非另有说明，否则术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包含但不限于”)。

除非在本文中另外指示，否则对本文中值范围的叙述仅旨在充当个别提及属于所述范围的每一单独值和每个端点的速记方法，并且每一单独值和端点并入到本说明书中，如同在本文中单独地叙述一般。

除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，而不对本公开的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为将任何未要求保护的元素指示为实践本公开所必须的。

本文中描述了本公开的优选实施例，包含诸位发明人已知的用于实施本公开的最佳模式。在阅读前文描述后，对本领域的普通技术人员而言，那些优选实施例的变化可能变得显而易见。诸位发明人预期技术人员可以在适当时采用此类变型，并且诸位发明人旨在使本公开以与本文具体描述的方式不同的其它方式来进行实践。因此，在适用法律允许的情况下，本公开包含所附权利要求中叙述的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有指示或明显与上下文相矛盾，否则本公开涵盖上述要素在其所有可能变型中的任何组合。

Claims (58)

1.一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括

a.使包括蛋白质的血液样品与包括基于柠檬酸盐的抗凝剂(AC)和醛释放剂(AR)的保护剂接触以获得混合物，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的血液收集管(BCT)中，或者将所述血液样品直接从受试者抽取到包括所述保护剂的BCT中，以及

b.从所述混合物中分离包括蛋白质的级分以产生适合于蛋白质组学分析的蛋白质样品，

其中：

(I)步骤(a)和(b)在不存在外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行；

(II)与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的所述蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0；

(III)在储存至少48小时后存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集所述血液样品的约0小时至约4小时内存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％内；

(IV)所述方法进一步包括将密封容器中的所述混合物运输到实验室用于蛋白质组学分析，任选地，其中所述密封容器是包括所述保护剂的密封BCT；或者

(V)其任何组合。

2.一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括

a.使包括蛋白质的血液样品与包括基于柠檬酸盐的抗凝剂(AC)和醛释放剂(AR)的保护剂接触以获得混合物，其中将所述血液样品添加到包括所述保护剂的血液收集管(BCT)中，或者将所述血液样品直接从受试者抽取到包括所述保护剂的BCT中，

b.从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分，以及

c.裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析，

其中：

(I)步骤(a)和(b)在不存在外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行；

(II)与未与保护剂接触的对照血液样品中的蛋白质数量的线图的最佳拟合线的斜率相比，所绘制的由步骤(b)产生的所述蛋白质样品中的蛋白质数量随储存时间而变化的线图的最佳拟合线的斜率更接近于0；

(III)在储存至少48小时后存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量处于在从受试者收集所述血液样品的约0小时至约4小时内存在于所述蛋白质样品中的血浆蛋白质和/或肽的数量的约10％内；

(IV)所述方法进一步包括将密封容器中的所述混合物运输到实验室用于蛋白质组学分析，任选地，其中所述密封容器是包括所述保护剂的密封BCT；或者

(V)其任何组合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质组学分析是多肽组学分析。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述保护剂包括AC与AR的比率为约1:1至约1:6的所述AR和所述AC。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述保护剂包括AC与AR的比率为约1:1至约1:5的所述AR和所述AC。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述保护剂包括AC与AR的比率为约1:1.2的所述AR和所述AC。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述基于柠檬酸盐的AC包括酸柠檬酸盐右旋糖(ACD)、柠檬酸盐、柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、柠檬酸盐-吡哆醛磷酸盐-tris、柠檬酸盐-右旋糖-磷酸盐-腺嘌呤(CDPA)、柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤(CPDA)或其组合。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述保护剂进一步包括红细胞(RBC)稳定剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述RBC稳定剂包括环糊精。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述环糊精是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。

11.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述保护剂包括约50g/l至约100g/lAC。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AR是重氮烷基脲、咪唑烷基脲、1,3,5-三(羟乙基)-s-三嗪、噁唑烷、1,3-双(羟甲基)-5,5-二甲基咪唑烷-2,4-二酮、季铵盐-15、DMDM乙内酰脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、三(羟甲基)硝基甲烷、羟甲基甘氨酸盐、聚季铵盐或其组合。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述AR包括咪唑烷基脲，任选地，其中咪唑烷基脲是所述保护剂中的唯一AR。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述保护剂包括约0.1g/ml至约3g/ml AR。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述保护剂进一步包括胺。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述胺是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、鸟氨酸和S-腺苷蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或其组合。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述胺是甘氨酸，任选地，其中甘氨酸是所述保护剂中的唯一胺。

18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述保护剂包括约20g/l至约60g/l胺。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中胺的量相对于的量为约1重量份胺比约10重量份AR。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述保护剂包括不超过约50,000ppm甲醛。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述保护剂包括(a)柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲和α-环糊精；

(b)柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲；

(c)柠檬酸盐-右旋糖-磷酸盐-腺嘌呤(CDPA)、咪唑烷基脲和α-环糊精；或者

(d)柠檬酸盐-右旋糖-磷酸盐-腺嘌呤(CDPA)、咪唑烷基脲。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述保护剂是柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲和α-环糊精。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(iv)(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤和(vii)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述保护剂是柠檬酸盐-茶碱-腺苷-双嘧达莫(CTAD)、咪唑烷基脲。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(iv)(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤组成。

26.根据权利要求21所述的方法，其中所述保护剂是柠檬酸盐-右旋糖-磷酸盐-腺嘌呤(CDPA)、咪唑烷基脲和α-环糊精。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤和(vii)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成。

28.根据权利要求21所述的方法，其中所述保护剂是柠檬酸盐-右旋糖-磷酸盐-腺嘌呤(CDPA)和咪唑烷基脲。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤组成。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括从所述血液样品中分离血浆级分以产生适用于蛋白质组学分析的蛋白质样品。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述级分是从所述混合物中分离的细胞级分。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞级分基本上由稀有血细胞组成，任选地，其中所述稀有血细胞是循环肿瘤细胞(CTC)、胎儿循环细胞或其它循环核细胞。

33.根据权利要求32所述的方法，其中将所述血液样品的稀有血细胞与所述血液样品中的其它细胞分离，任选地，其中将所述血液样品的稀有血细胞与红细胞、白细胞、血小板或其组合分离。

34.根据权利要求32或33中任一项所述的方法，其中将所述血液样品的稀有血细胞与血浆蛋白质分离。

35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其包括裂解所述细胞级分的细胞以获得适用于蛋白质组学分析的蛋白质样品。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合物在步骤(b)之前已储存至少48小时，在步骤(b)之前已储存至少48小时但少于7天，或者在步骤(b)之前已储存至少48小时但少于14天。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述混合物已在大于或约4℃的温度下储存，任选地在约20℃至约25℃的温度下储存。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括在步骤(b)之前将所述混合物储存在所述BCT中至少48小时，在步骤(b)之前储存至少48小时但少于7天，或者在步骤(b)之前储存至少48小时但少于14天。

39.根据权利要求38所述的方法，其包括在大于或约2℃的温度下，任选地在约20℃至约30℃的温度下将所述混合物储存在所述BCT中。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包括：

a.从所述样品中耗竭一种或多种蛋白质；

b.向所述样品中添加消化酶、还原剂、烷化剂；

c.鉴定所述样品中存在的蛋白质；

d.对所述样品或其等分试样的总蛋白质浓度和单独蛋白质浓度进行定量；

e.用标签标记蛋白质；或者

f.其组合。

41.根据权利要求40所述的方法，其包括从所述样品中耗竭免疫球蛋白、白蛋白或两者。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中(i)所述消化酶是胰蛋白酶，(ii)所述还原剂包括脲或二硫苏糖醇(DTT)或两者，(iii)所述烷化剂包括碘乙酰胺(IAA)，或者(iv)其组合。

43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中适用于蛋白质组学分析的所述蛋白质样品的特征在于：在所述分离步骤之前在大于或约4℃的温度下，任选地在约20℃至约30℃的温度下储存至少48小时、至少48小时但少于7天或至少48小时但少于14天之后，与对照蛋白质样品的量相比，

(a)细胞裂解的水平降低；

(b)污染物蛋白质的水平降低；

(c)低丰度血浆蛋白质的水平增加；

(d)每种蛋白质鉴定的独特肽的水平增加；

(e)如通过LC-MS/MS确定的，鉴定的独特蛋白质的水平增加，任选地，其中

所述独特蛋白质是分泌性蛋白质；或者

(f)其组合；

所述对照蛋白质样品从收集在不具有保护剂(例如，仅包括EDTA)的血液收集管中的血液样品的分离级分获得。

44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白质样品包括存在于新鲜分离的血液样品中的大于约70％的完整蛋白质。

45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白质样品包括存在于在不具有所述保护剂的情况下在约4℃的温度下储存超过48小时的血液样品中的少于约40％的污染物蛋白质产物。

46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括使用一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品中的所述蛋白质。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述基于质谱法的蛋白质组学方法的所述质谱法包括靶向质谱法。

48.根据权利要求47所述的方法，其中质谱法实验利用平行反应监测(PRM)、选择反应监测(SRM)、选择离子监测(SIM)或多反应监测(MRM)。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述基于质谱法的蛋白质组学方法的所述质谱法是非靶向质谱法。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述质谱法实验利用数据依赖性采集(DDA)、数据非依赖性采集(DIA)或标记定量(例如，串联质谱标签(TMT))质谱法。

51.一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括

a.将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的血液收集管(BCT)中，所述保护剂基本上由(i)咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约1g/l至约20g/l茶碱、(iv)约1g/l至约20g/l腺苷、(v)约0.05g/l至约20g/l双嘧达莫和(vi)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成；

b.任选地，在约20℃至约30℃下将所述血液样品储存在所述BCT中至少约48小时；

c.分离包括蛋白质的级分，从而产生适用于蛋白质组学分析的蛋白质样品；以及

d.通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品，

其中所述方法的步骤在不使用任何外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行。

52.一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括

a.将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的血液收集管(BCT)中，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约1g/l至约20g/l茶碱、(iv)约1g/l至约20g/l腺苷和(v)约0.05g/l至约20g/l双嘧达莫组成；

b.任选地，在约20℃至约30℃下将所述血液样品储存在所述BCT中至少约48小时；

c.从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；

d.裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析，以及

e.通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品；

其中所述方法的步骤在不使用任何外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行。

53.一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括

a.将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的血液收集管(BCT)中，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、

(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠、(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤和(vii)约10g/l至约50g/lα-环糊精组成；

b.任选地，在约20℃至约30℃下将所述血液样品储存在所述BCT中至少约48小时；

c.从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；

d.裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析，以及

e.通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品；

其中所述方法的步骤在不使用任何外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行。

54.一种制备用于蛋白质组学分析的蛋白质样品的方法，所述方法包括

a.将包括蛋白质的血液样品添加到包括保护剂的血液收集管(BCT)中，所述保护剂基本上由(i)约100g/l至约400g/l咪唑烷基脲、(ii)约10g/l至约50g/l柠檬酸、(iii)约10g/l至约200g/l柠檬酸三钠、(iv)约50g/l至约300g/l右旋糖、

(v)10g/l至约200g/l约磷酸二氢钠和(vi)约0.05g/l至约20g/l腺嘌呤组成；

b.任选地，在约20℃至约30℃下将所述血液样品储存在所述BCT中至少约48小时；

c.从所述混合物中分离包括细胞蛋白质源的细胞级分；

d.裂解所述细胞级分的细胞以产生包括细胞蛋白质的蛋白质样品，其中所述蛋白质样品适用于蛋白质组学分析，以及

e.通过一种或多种基于质谱法的蛋白质组学方法分析所述蛋白质样品；

其中所述方法的步骤在不使用任何外源性蛋白水解酶抑制剂的情况下进行。

55.根据权利要求51至54中任一项所述的方法，其中所述蛋白质组学分析是多肽组学分析。

56.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中所述保护剂进一步包括抑制血小板活化的化合物。

57.根据权利要求55所述的方法，其中所述化合物包括丁卡因(tetracaine)、茶碱腺苷双嘧达莫(TAD)、利多卡因(lidocaine)、布比卡因(bupivacaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、氨氯地平(amlodipine)、地尔硫卓(diltiazem)、非洛地平(felopdipine)、依拉地平(israsipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼索地平(nisoldipine)、维拉帕米(verapamil)或其组合。

58.根据权利要求1至56中任一项所述的方法，其中制剂进一步包括丁卡因。

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