KR20160066113A

KR20160066113A - 정자의 동결 스트레스 관련 단백질 바이오마커를 이용한 소 정자의 수태능 판별용 조성물 및 이를 이용한 소 정자의 수태능 판별 방법

Info

Publication number: KR20160066113A
Application number: KR1020140169853A
Authority: KR
Inventors: 방명걸; 윤성재; 권우성
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2014-12-01
Publication date: 2016-06-10
Also published as: KR101760466B1

Abstract

본 발명은 정자의 동결 스트레스 관련 단백질 바이오마커를 이용한 소 정자의 수태능 판별용 조성물 및 이를 이용한 정자의 수태능 판별 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소의 정소상체에서 채취한 정자의 동결 보존하는 과정을 동결 전의 상태, 동결 보존제를 첨가한 후 온도를 낮춘 상태 또는 동결 후 해동된 상태로 나누어 상기 3가지 상태 중 특이적으로 발현의 차이가 있는 정자의 단백질 마커를 발굴하고, 상기 마커를 포함하는 조성물 및 이를 이용하여 동결 과정 중 발생하는 스트레스에 따른 정자의 수태능 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 동결 스트레스 관련 바이오마커는 동결 스트레스 하에서 달리 발현되는 단백질의 분석을 통해 정자의 수태능을 확인하는 것으로, 정자의 수정능획득 양상을 예측하고, 높은 수태능을 가지는 개체의 정자를 쉽게 선별하여 우수 동물의 안정적 생산을 도모하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

정자의 동결 스트레스 관련 단백질 바이오마커를 이용한 소 정자의 수태능 판별용 조성물 및 이를 이용한 소 정자의 수태능 판별 방법{Composition for Discriminating Fertility of Bovine Spermatozoa Using Protein Biomarker Related with Cryo-Stress in Spermatozoa, and Method for Discriminating Fertility of Bovine Spermatozoa Using the Same}

본 발명은 정자의 동결 스트레스 관련 단백질 바이오마커를 이용한 소 정자의 수태능 판별용 조성물 및 이를 이용한 정자의 수태능 판별 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소의 정소상체에서 채취한 정자의 동결 보존하는 과정을 동결 전의 상태, 동결 보존제를 첨가한 후 온도를 낮춘 상태 또는 동결 후 해동된 상태로 나누어 상기 3가지 상태 중 특이적으로 발현의 차이가 있는 정자의 단백질 마커를 발굴하고, 상기 마커를 포함하는 조성물 및 이를 이용하여 동결 과정 중 발생하는 스트레스에 따른 정자의 수태능 판별 방법에 관한 것이다.

인공 수정(AI)은 가치 있는 유전자들의 빠른 공급과 동물 혈통의 유전적 질을 향상하기 위해 사용되어 왔다. 소의 경우에는 인공 수정 시 소 동결 정액을 주로 사용하는데, 이는 특정 유전자의 보급을 통해서 유전적으로 소의 생산능력을 향상시키는데 중요한 역할을 하고 있다.

그러나 인공수정에 의한 종자는 약 50% 정도의 성공률만 보이고 있다. 하나의 황소 동결 정액이 수천 마리의 소를 수태시키는데 사용되기 때문에 높은 수정 능력을 가진 황소의 생산은 임신율을 증가시키는데 매우 높은 경제적인 가치를 가지게 된다. 여러 실험들에 의해 정자 수, 운동성, 형태학적인 면(Bonde et al ., 1998), 정자 막의 손상 정도(Thundathil et al., 1990), 자궁경부 정액이나 난모세포의 침투력(Sharara et al ., 1995) 등이 동물의 수태능력을 결정하는 요소라고 연구되고 있어도, 상기의 요소들이 소의 수태 능력에도 영향을 미친다고 정확히 입증되지는 않았다. 더욱이, 생체 내에서는 높은 수태 능력을 가지고 있는 것으로 증명된 황소라도 시험관 내에서는 그 수태 능력이 달라질 수가 있다(Palma et al., 1994).

상기와 같은 이유로, 동물의 수태능력을 예측할 수 있는 효율적인 방법에 대한 연구는 필요하며 특히, 소에서 수태능력과 관련된 마커를 획득하는 것이 절실한 상황이다.

포유류 정자는 생리학적인 변화를 일으켜 수정 능력을 획득할 수 있는 상태가 되는 데까지 어느 정도의 시간이 요구된다. 이러한 변화를 수정능획득(capacitation)이라고 한다(Austin, 1952). 수정능 획득은 싸이클릭 AMP(cyclic AMP)에 의한 타이로신 인산화 효소(tyrosine kinase), 정자막의 지질, 단백질 변화, 이온의 이동, 정자의 운동성, 단백질 이동, 단백질 인산화(Zaneveld et al ., 1991; Chang, 1995)와 관련이 있다는 연구들이 보고되고 있다. 수정능획득 (capacitation)과 수태능력(fertility)은 깊은 관련성이 있기 때문에, 수정능획득 상태는 수태능력을 결정하는 데 매우 중요하다.

최근에 몇몇 보고된 연구에 의하면 효과적인 도구로서 단백질체학(proteomics)을 이용하게 되면 정자의 분자생물학적 현상을 이해하는 데 도움이 된다고 하였고, 실제로, 정자의 단백질체학에 대한 축적된 지식은 새로운 분자 마커를 발굴할 수 있게 해주었다(Corner JS et al., In The Sperm Cell, pp49-71, 2006; de Mateo S et al., Proteomics, 7(23):4264-4277, 2007). 그런 점에서 포괄적인 단백질체학 도구를 이용한 우수한 사이어(Sire, 예를 들면, 부수, 종마, 종돈 등) 유래 단백질 바이오마커의 발굴은 동물의 생식과 관련된 분야에 새로운 지평을 열어 줄 수 있을 것이다.

포유동물의 사정된 정자는 장시간 동안 암컷 생식로(female genital tract)에 존재하면서 수정능획득과 같은 필요로 하는 생리학적인 변형과정을 거친다(Zaneveld LJ et al., Human Reproduction, 6:1265-1274, 1991; Fraser LR et al., Journal of Reproduction and Fertility, 96:363-377, 2001; Kirichok Y et al., Nature, 439:737-740, 2006; Visconti PE, PNAS, 106:667-668, 2009, Kwon WS et al ., Fertil Steril , 99:354-61, 2013; Kwon WS et al., PLoS One , 8:e54192, 2013). 정자는 수정능획득 과정을 거쳐야 난자와 수정할 수 있기 때문에, 정자의 수태능력을 고려할 때 수정능획득 과정 전, 후의 변화가 매우 중요하다. 특히, 인공수정 시 소 동결 정액을 주로 사용하는데 현재까지는 동결 과정 중에 생길 수 있는 스트레스에 따른 정자의 수태능과 관련된 단백질 발현 양상의 차이를 수정능획득 상태와 비교한 연구는 없었다.

이에, 본 발명자들은 새로운 정자의 수태능 판별용 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, 동결 스트레스 관련 정자의 단백질 바이오마커 발현 변화를 확인하고 상기 단백질이 실제 정자의 수태능과 관련되어 있으며, 이를 이용하여 높은 수태능을 가지는 개체를 판별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 정자의 동결 스트레스 관련 단백질 바이오마커를 이용한 소 정자의 수태능 판별용 조성물 및 수태능 판별용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 정자의 동결 스트레스 관련 단백질 바이오마커를 이용한 소 정자의 수태능 판별 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 GSTM3(glutathione S-transferase mu 3), 트리오스포스페이트 아이소머라제(triosephosphate isomerase; TPI), 피브레이트 디하이드로제나즈 E1 콤포넨트 서브유닛 베타(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta; PDHB), F-악틴-케핑 프로테인 서브 유닛 베타(f-actin-capping protein subunit beta; CAPZB), 아우터 덴즈 파이버 프로테인2(outer dense fiber protein 2; ODF2) 및 NME7(nucleoside diphosphate kinase 7, NDK7)로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택된 정자의 동결 스트레스 판별용 마커를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질을 검출하는 물질을 포함하는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 정자의 동결 스트레스 판별용 조성물을 포함하는, PCR 키트, RT-PCR 키트 또는 DNA 칩으로 구성된 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 정자의 동결 스트레스 유무 판별에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상 시료로부터 GSTM3(glutathione S-transferase mu 3), 트리오스포스페이트 아이소머라제(triosephosphate isomerase; TPI), 피브레이트 디하이드로제나즈 E1 콤포넨트 서브유닛 베타(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta; PDHB), F-악틴-케핑 프로테인 서브 유닛 베타(f-actin-capping protein subunit beta; CAPZB), 아우터 덴즈 파이버 프로테인2(outer dense fiber protein 2; ODF2) 또는 NME7(nucleoside diphosphate kinase 7, NDK7) 마커를 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 상기 시료의 마커를 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 동결 전의 상태의 발현 수준보다 높거나 낮을 경우, 정자의 동결 스트레스가 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 동결 스트레스 관련 바이오마커는 동결 스트레스 하에서 달리 발현되는 단백질의 분석을 통해 정자의 수태능을 확인하는 것으로, 정자의 수정능획득 양상을 예측하고, 높은 수태능을 가지는 개체의 정자를 쉽게 선별하여 우수 동물의 안정적 생산을 도모하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 2차원 단백질 전기영동(2-DE)과 ESI-MS/MS를 이용하여 소의 정자 단백질 발현 양상을 분석하는 전개도를 나타낸 것이다.
도 2는 소 정자의 단백질들을 2차원 단백질 전기영동(2-DE)으로 분리한 결과를 나타낸 것으로, 2-DE 젤을 질산은으로 염색하고, PDQuest SW로 분석하여, (좌) 프레쉬 정자의 단백질 스팟, 및 (우) 애프터 TYB 정자의 단백질 스팟을 나타낸 것이다.
도 3은 동물의 정자의 단백질들을 2차원 단백질 전기영동(2-DE)으로 분리한 결과를 나타낸 것으로, 2-DE 젤을 질산은으로 염색하고, PDQuest SW로 분석하여, (좌) 프레쉬 정자의 단백질 스팟, 및 (우) 애프터 글리세롤 정자의 단백질 스팟을 나타낸 것이다.
도 4는 동물의 정자의 단백질들을 2차원 단백질 전기영동(2-DE)으로 분리한 결과를 나타낸 것으로, 2-DE 젤을 질산은으로 염색하고, PDQuest SW로 분석하여, (좌) 프레쉬 정자의 단백질 스팟, 및 (우) 애프터 해동 정자의 단백질 스팟을 나타낸 것이다.
도 5는 동물의 정자의 단백질들을 2차원 단백질 전기영동(2-DE)으로 분리한 결과를 나타낸 것으로, 2-DE 젤을 질산은으로 염색하고, PDQuest SW로 분석하여, (좌) 애프터 TYB 정자의 단백질 스팟, 및 (우) 애프터 글리세롤 정자의 단백질 스팟을 나타낸 것이다.
도 6은 동물의 정자의 단백질들을 2차원 단백질 전기영동(2-DE)으로 분리한 결과를 나타낸 것으로, 2-DE 젤을 질산은으로 염색하고, PDQuest SW로 분석하여, (좌) 애프터 TYB 정자의 단백질 스팟, 및 (우) 애프터 해동 정자의 단백질 스팟을 나타낸 것이다.
도 7은 동물의 정자의 단백질들을 2차원 단백질 전기영동(2-DE)으로 분리한 결과를 나타낸 것으로, 2-DE 젤을 질산은으로 염색하고, PDQuest SW로 분석하여, (좌) 애프터 글리세롤 정자의 단백질 스팟, 및 (우) 애프터 해동 정자의 단백질 스팟을 나타낸 것이다.
도 8은 액틴(actin) 세포골격(cytoskeleton) 조절 경로를 나타낸 것이다.
도 9는 포도당 대사 경로를 나타낸 것이다.
도 10은 글루타치온(Glutathione) 대사 경로를 나타낸 것이다.
도 11은 노치(Notch) 경로를 나타낸 것이다.
도 12는 피리미딘(Pyrimidine) 대사 경로를 나타낸 것이다.
도 13은 동결 스트레스에 따른 소 정자의 운동성(motility)을 나타낸 것이다(평균±SE, p<0.05, n=9; A-C: 유의적인 차이).
도 14는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 운동학 파라미터로, 속력이 >50μm/s(rapid)인 경우를 나타낸 것이다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-C: 유의적인 차이).
도 15는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 운동학 파라미터로, 속력이 25∼50μm/s(medium)인 경우를 나타낸 것이다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-B: 유의적인 차이).
도 16은 동결 스트레스에 따른 소 정자의 운동학 파라미터로, 속력이 <25μm/s(slow)인 경우를 나타낸 것이다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-C: 유의적인 차이).
도 17은 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수정능획득 상태를 CTC/H33258 염색으로 분석한 결과에서 AR 패턴을 나타낸 것이다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-C: 유의적인 차이).
도 18은 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수정능획득 상태를 CTC/H33258 염색으로 분석한 결과에서 F 패턴을 나타낸 것이다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-C: 유의적인 차이).
도 19는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수정능획득 상태를 CTC/H33258 염색으로 분석한 결과에서 B 패턴을 나타낸 것이다(평균±SEM).
도 20은 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수정능획득 상태를 CTC/H33258 염색으로 분석한 결과에서 D 패턴을 나타낸 것이다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-C: 유의적인 차이).
도 21은 동결 스트레스에 따른 소 정자의 미토콘드리아 활성(mitochondrial activity)을 로다민123 염색으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-C: 유의적인 차이).
도 22는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 생존력(viability)을 HOST로 분석한 결과를 나타낸 것이다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-C: 유의적인 차이).

본 발명은 일 실시예에서, 수컷 소의 정자에 동결 과정에서의 서로 다른 처리로 준비된 정자 샘플을 가지고 2-DE를 수행한 다음, ESI-MS/MS를 이용하여 각각의 처리에 따른 정자의 상태를 비교하여 수태능에 따른 단백질 발현 양상을 분석하였다. 그 결과, 동결 과정에서의 각각의 단계 간에는 단백질 발현량에 차이가 있음을 확인하였다(도 2∼도 7). 발현량에 차이가 있는 상기 단백질들은, 표 1∼표 6에 나타난 바와 같이, GSTM3(glutathione S-transferase mu 3), 트리오스포스페이트 아이소머라제(triosephosphate isomerase; TPI), 피브레이트 디하이드로제나즈 E1 콤포넨트 서브유닛 베타(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta; PDHB), F-악틴-케핑 프로테인 서브 유닛 베타(f-actin-capping protein subunit beta; CAPZB), 아우터 덴즈 파이버 프로테인2(outer dense fiber protein 2; ODF2) 및 NME7(nucleoside diphosphate kinase 7, NDK7)인 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, GSTM3(glutathione S-transferase mu 3), 트리오스포스페이트 아이소머라제(triosephosphate isomerase; TPI), 피브레이트 디하이드로제나즈 E1 콤포넨트 서브유닛 베타(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta; PDHB), F-악틴-케핑 프로테인 서브 유닛 베타(f-actin-capping protein subunit beta; CAPZB), 아우터 덴즈 파이버 프로테인2(outer dense fiber protein 2; ODF2) 및 NME7(nucleoside diphosphate kinase 7, NDK7)로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택된 정자의 동결 스트레스 판별용 마커를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질을 검출하는 물질을 포함하는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "수태능 판별용 마커"란 정자의 수태능에 따라 달리 발현되는 유기 생체 분자를 의미하는 것으로, 상기 유기 생체 분자로는 이에 한정되지는 않으나, 예를 들면, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산(예, mRNA, DNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(예, 단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등을 포함한다.

본 발명에 있어서, 소 정자의 수태능 판별용 마커인 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA를 검출하는 물질은, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하며, 상기 유전자의 단백질을 검출하는 물질은 압터머 또는 항체인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 정자의 동결 스트레스 판별용 조성물을 포함하는, PCR 키트, RT-PCR 키트 또는 DNA 칩으로 구성된 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별용 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 정자의 동결 스트레스 유무 판별에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상 시료로부터 GSTM3(glutathione S-transferase mu 3), 트리오스포스페이트 아이소머라제(triosephosphate isomerase; TPI), 피브레이트 디하이드로제나즈 E1 콤포넨트 서브유닛 베타(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta; PDHB), F-악틴-케핑 프로테인 서브 유닛 베타(f-actin-capping protein subunit beta; CAPZB), 아우터 덴즈 파이버 프로테인2(outer dense fiber protein 2; ODF2) 또는 NME7(nucleoside diphosphate kinase 7, NDK7) 마커를 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 상기 시료의 마커를 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 동결 전의 상태의 발현 수준보다 높거나 낮을 경우, 정자의 동결 스트레스가 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 대조군은 동결 전의 상태, 동결 보존제인 글리세롤 및/또는 TYB(Tris egg-Yolk Buffer)를 첨가한 후 4℃에서 2시간 이상 냉장한 상태 또는 질소가스에서 15분간 처리하고 동결 후 39℃에서 해동된 상태에 있는 정자를 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되어 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미한다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler et al ., Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al ., Nature, 352:624-628, 1991) 등에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

본 발명에서 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산 서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 말한다. "비특이적 증폭"이란 표적 서열 이외의 핵산 서열에 프라이머가 하이브리드되어, 프라이머 연장의 기질로서 작용함으로써 일어나는 표적 서열 이외의 핵산 증폭을 지칭하는 말이다.

본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 여부를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1: 재료의 준비 및 처리 방법

9마리의 소(대한민국 NACF(National Agriculture Cooperative Federation))에서 정소상체를 수집하여 정액을 채취하였다. 채취한 정액 내 정자의 최종농도가 50x10⁶개/mL가 되도록 TYB(Tris egg-Yolk Buffer)에 희석하고, 4℃에서 2시간 이상 냉장시켰다. 상기 냉장된 정자를 함유하는 TYB에 최종 글리세롤 농도가 6%가 되도록 동일한 부피의 10.8 내지 13.2% 글리세롤을 함유하는 TYB를 첨가시켜 혼합한 다음, 4℃에서 2시간 이상 냉장상태로 평형을 이루도록 하였다. 상기와 같이 평형을 마친 정자를 함유하는 TYB 정액 샘플을 0.5mL 용량의 동결용 스트로우(Straws)에 봉입하고, 액체 질소 증기 위에서 15분간 동결시킨 다음, -196℃ 액체 질소 컨테이너에 보관하였다.

소 정자의 수태능 판별용으로 사용된 정액 샘플은 하기와 같이 준비하였다. 프레쉬(Fresh) 샘플은 동결 전의 정자 샘플로 정소상체로부터 갖 수집한 것이다. 애프터 TYB(After TYB) 샘플은 TYB로 희석되고 2시간 동안 4℃에서 평형을 이루도록 한 것이고, 애프터 글리세롤(After Glycerol) 샘플은 TYB 대신 글리세롤을 사용하여 2시간 동안 4℃에서 평형을 이루도록 한 것이다. 애프터 해동(After Thawing) 샘플은 질소 가스에 동결된 샘플을 39℃에서 처리하여 해동된 상태로 준비한 것이다. 상기와 같이 준비된 정액 샘플들은 실시예 2∼9에서 서로 다른 조합으로 비교하여 분석하였다.

모든 동물은 실험동물 사용, 처치 및 관리에 대한 지침에 따른 중앙대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인된 프로토콜 하에서 사육되었다.

실시예 2: CASA( Computer - assisted sperm analysis )

정자의 운동성(%) 및 운동학(motion kinematics)은 정자분석기(CASA system; computer-assisted sperm analysis)(SAIS plus version 10.1, Medical Supply, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 구체적으로는, 상기 실시예 1에서 준비된 각 처리군의 정자 10μL를 가열 단계에 놓인 매클러 챔버(Makler chamber)(Makler, Israel)에 놓았다. 위상차 모드에서 10X 대물렌즈를 이용하여, 영상을 SAIS로 리레이하고, 디지털화하고 분석하였다. 각 시료에 대해 적어도 250개의 정자세포의 움직임을 적어도 5 랜덤 필드로부터 기록하였다. 사용자 정의 설정된 프로그램은 다음과 같다: 프레임 획득, 20; 프레임 비율, 30Hz; 최소 차(contrast), 7; 최소 사이즈, 5; 낮은/높은 사이즈 게이츠(gates), 0.4-1.5; 낮은/높은 채도 게이츠, 0.4-1.5; 비자동성 머리 크기, 16; 비자동성 밝기, 14. 운동성 세팅 파라미터와 관련해서 대상의 VCL(curvilinear velocity)가 10μm/s 이상일 경우 운동성이 있는 것으로 하였다. 운동성(%) 및 3가지 운동학 파라미터(즉, rapid(>50μm/s), medium(25∼50μm/s) 또는 slow(<25μm/s))를 분석하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 동결 스트레스에 따른 소 정자의 운동성(motility)은 프레쉬 또는 애프터 TYP 샘플에서 약 90% 정자 비율로 나타나 정자의 움직임이 매우 활발한 반면, 애프터 글리세롤 및 애프터 해동 샘플은 각각 약 70% 및 약 30% 정자 비율로 나타나 정자의 움직임이 둔화된 것으로 확인되었다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-C: 유의적인 차이).

동결 스트레스에 따른 소 정자의 운동학 파라미터를 분석한 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 애프터 TYP 샘플은 속력이 50μm/s(rapid) 이상으로 나타나는 정자의 비율이 프레쉬 샘플과 비슷하게 약 80% 이상으로 높게 나타난 반면, 애프터 글리세롤 샘플은 약 70%, 애프터 해동 샘플은 약 30%로 나타난 것으로 확인되었다. 또한, 도 15 및 도 16에 나타난 바와 같이, 애프터 글리세롤 또는 애프터 해동 샘플에서는 속력이 25∼50μm/s(medium) 또는 25μm/s(slow) 이하로 나타난 정자의 비율이 프레쉬 또는 애프터 TYP 샘플에 비해 높게 나타난 것으로 확인되었다(평균±SEM, p<0.05, n=9; A-B: 유의적인 차이).

결국, 상기 운동성 및 운동학 파라미터의 실험 결과를 종합하면, 동결 후 해동된 정자는 높은 비율로 정자의 운동성을 상실하였다. 또한, 동결 보존제의 종류(TYB 또는 글리세롤)에 따라 서로 다른 정자 운동성을 나타내는바, TYB 용액으로 4℃에서 정자를 보관할 경우 정자의 활동성을 유지하는 효과가 큰 것으로 확인되었다.

실시예 3: 클로르테트라사이클린 염색법을 이용한 형광분석

수정능획득 상태를 확인하기 위하여 기존의 이중(Dual) 염색 방법을 약간 변형하여 사용하였다(Kwon WS et al ., Fertil Steril , 99:354-61, 2013; Kwon WS et al., PLoS One , e54192, 2013). 즉, 135μL의 한우의 수정능획득된 정자에 15μL의 Hoechst 33258 용액(150uM H33258을 함유하는 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline))을 첨가하고 혼합한 후 상온에서 10분 동안 처리하였다. 상기 혼합물은 DPBS에서 250μL의 2%(w/v)의 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 위에 층층이 두어 초과 염색액을 제거하였다. 400 X g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물(pellet)을 500μL의 DPBS 및 클로르테트라사이클린 용액(5μL 완충액 내 750mM CTC: 20mM Tris, 130mM NaCl 및 5mM 시스테인, pH7.4)으로 재부유하였다. H33258 및 CTC에 대한 수정능획득 상태를 에피형광(epifluorescence) 조명하에서 각각 UV BP 340-380/LP 425 및 BP 450-490/LP 515 자극/방사 필터(excitation/emission filters)를 이용하여 Nikon microphot-FXA 현미경(Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 정자를 살아있는 비-수정능획득(live non-capacitated; F 패턴, 수평 부분에 강한 형광선이 있거나 없는, 전체 정자 머리에 일률적으로 분산된 밝은 녹색 형광), 살아있는 수정능획득(live capacitated; B 패턴, 첨체 영역 및 어두운 후첨체에 녹색 형광) 및 살아있는 첨체반응(live acrosome reacted; AR 패턴, 첨체 영역에서 녹색 형광, 오로지 후첨체 영역에서 녹색 형광 또는 머리에 형광 없음)으로 분류하였다. 또한, 정자가 죽어있는 경우 D(Dead) 패턴(정자 두부 위에 핵이 밝은 파란 형광을 나타냄)으로 분류하였다(Kwon WS et al ., Fertil Steril , 99:354-61, 2013; Kwon WS et al., PLoS One , e54192, 2013). 각 슬라이드에 최소한 400개의 정자를 가진 두 슬라이드로 샘플을 평가하였다.

동결 스트레스에 따른 소 정자의 수정능획득 상태를 클로르테트라사이클린 염색법으로 분석한 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, AR 상태에 있는 정자의 비율이 프레시 샘플(약 10%)에 비해 애프터 해동 샘플(약 42%)에서 가장 높게 나타났고, 도 18에 나타난 바와 같이, F 상태에 있는 정자의 비율이 프레시 샘플은 약 55%, 애프터 해동 샘플은 약 25%로 나타났다. 또한, 도 19에 나타난 바와 같이, B 상태에 있는 정자의 비율은 모든 종류의 샘플에서 비슷하게 30-38% 범위에서 나타났고, 도 20에 나타난 바와 같이, D 상태에 있는 정자의 비율은 프레시 샘플에서 약 37%, 애프터 해동 샘플에서 약 78%로 나타났다.

상기 결과를 종합하면, 동결된 정자를 해동하게 되면 AR 및 D 패턴을 가지는 정자의 비율이 증가한 것으로 나타났는데, 이는 곧 첨체반응을 갖춘 정자와 죽은 정자가 혼합되어 있어 동결된 정자의 수정능획득 상태를 CTC 염색법만으로 대상 개체의 정자 수태능을 판별하기에는 부족함이 있는 것으로 나타났다.

실시예 4: 로다민 123을 이용한 미토콘드리아의 활성 측정

미토콘드리아 온정성 검사는 로다민123(Rhodamine123)(Sigma, Saint Louis, USA)을 이용하여 실시하였으며, 미토콘드리아 내막의 활성 정도를 검사하였다. 실시예 1의 방법으로 처리된 소 정액 샘플은 1×10⁶정자/mL 농도에 로다민123 시약의 최종 농도를 2.4μM로 희석하여 5분 동안 37℃에서 배양한 다음, 로다민의 정자 내 축적 정도는 485/20nm 자극(excitation) 및 530/25nm 방사(emission)에서 측정된 형광량으로 백분률하여 계산하였다.

동결 스트레스에 따른 소 정자의 미토콘드리아 활성(mitochondrial activity)을 로다민123 염색으로 분석한 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, 프레쉬 및 애프터 TYB 샘플에서는 정자의 비율이 약 75%를 넘기는 반면, 애프터 해동 샘플에서는 정자의 비율이 약 30%로 나타났다. 즉, 동결 후 해동 시 정자의 미토콘드리아의 활성이 감소한 것을 확인할 수 있었고, 이는 곧 실시예 2에서 나타난 정자의 운동성 감소로 이어진 결과라고 보인다.

실시예 5: 저장액팽창검사 ( hypoosmotic swelling test : HOST ) 및 정자 핵의 전처리

정자의 배지 pH 조건에 따른 생존율을 측정하기 위하여 저장액팽창검사를 실시하였다. 저장성 용액의 용적의 절반은 milli-Q water를 포함하고, 용적의 다른 절반은 기본 배지로 조성하였다. 최종 삼투압농도가 140mosmol/kg가 될 수 있도록 제조하였다. 1mL 37℃ 저장성 용액에 정액을 떨어뜨린 후, 37℃ 챔버에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에 정자 및 저장성 용액 혼합물을 원심분리하고, 원심분리에 따른 침전물은 100-200mL 저장성 용액 안에서 다시 희석되었다. 상기 서스펜션을 깨끗한 슬라이드 상에 도말한 후 공기 중에 건조시키고, 접착액으로 고정화시켰다. 건조된 슬라이드는 37℃에서 45분간 2mmol/L 디티오트레이톨 (dithiothreitol) 안에서 인큐베이션시킨 후 실내에서 건조하였다. 상기 건조된 슬라이드는 70% formamide/2XSSC 용액에 5분 동안 변성화시켰다. 형광 현미경 하에서 정자 꼬리 팽창 패턴을 평가하기 위하여, 변성된 견본(표본)을 Diff Quick (Baxter, Deerfield,IL)를 사용하여 염색하고, 50%, 70%, 95%의 에탄올로 실내 온도에서 3분 동안 탈수한 후, 공기 건조하였다.

동결 스트레스에 따른 소 정자의 생존력(viability)을 HOST로 분석한 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 프레쉬 및 애프터 TYB 샘플에서는 정자의 비율이 약 80%를 넘기지만, 애프터 해동 샘플에서는 정자의 비율이 30% 이하로 낮게 나타났다. 즉, 동결 후 해동 시 정자의 생존력이 크게 감소한 것을 확인할 수 있었고, 이는 곧 실시예 2에서 나타난 정자의 운동성 감소와 합치된다.

실시예 6: 2- DE 및 젤 이미지 분석

도 1의 전개도에 나타난 바와 같이, 2차원 단백질 전기영동(2-DE)과 ESI-MS/MS를 이용하여 소 정자의 단백질 발현 양상을 분석하였다.

정자 내에서 단백질을 추출하기 위하여, 50 X 10⁶/mL 정자 샘플들은 7M 요소 (urea)(Sigma), 2M 티오요소(thiourea)(Sigma), 4%(w/v) CHAPS, 0.05%(v/v) Triton X-100(Sigma), 1%(w/v) 옥틸 베타-디-글루코피로사이드(octyl β-D-glucopyroside), 24μM 페닐메티설포닐플루오라이드 (phenylmethysulfonylfluoride, PMSF), 1%(w/v) DTT, 0.5%(v/v) IPG 완충용액 및 0.002%(w/v) BPB(bromophenol blue)를 포함한 재수화된 완충액에 1시간 동안 4℃에서 가용되게 하였다.

그다음, 정자 유래 단백질의 250μg 부분 표본을 24cm 길이의 NL Immobiline DryStrips(pH 3-11; Amersham) 재수화 트레이 내 450μL의 재수화 완충액에 4℃에서 12시간 동안 두었다.

1차원 전기영동을 IPGphor isoelectric focusing apparatus를 이용하여 스트립(strip)을 100V(1시간), 200V(1시간), 500V(1시간), 1000V(1시간), 5000V(1.5시간), 8000V(1.5 시간) 및 8000-90000Vhr로 초점화(focusing)하였다. 초점화가 종료한 후 스트립(strip)은 15분 동안 상온에서 6M 유레아(urea), 75mM Tris-HCl(pH8.8), 30%(v/v) 글리세롤(glycerol), 2%(w/v) 소디움 도데실 황산염(Sodium dodecyl sulfate), 0.002%(w/v) BPB(bromophenol blue) 및 2%(w/v) DTT가 포함된 평형 완충액 A로 평형상태가 되도록 하였다. 그다음, 스트립을 상온에서 15분 동안 평형 완충액 B(DDT가 없고 2.5%(w/v) 아이오도아세트아마이드(iodoacetamide; Sigma)를 함유하는 평형 완충액 A)로 두 번째 평형상태가 되도록 하였다.

2차원 전기영동을 12.5%(w/v) SDS-PAGE 젤을 이용하여 BPB(bromophenol blue)가 겔의 낮은 쪽 끝으로 이동하기 시작할 때까지 100V 1h 및 500V에서 수행하였다. 이미지 분석을 위해서 젤을 실버 염색하였다. 그다음, 상기 젤을 GS-800 (Bio-rad)의 높은 해상도로 스캔하였다. 각각의 젤의 단백질 스팟(spot)들은 PDQuest 8.0 소프트웨어(Bio-rad)를 이용하여 매칭시키면서 정자의 동결 보존하는 과정에 따라 달리 처리된 샘플의 단백질 젤을 비교하면서 분석하였다. 최종적으로, 상기와 같이 처리된 단백질 젤의 비율로 스팟의 밀도를 계산하였다.

실시예 7: 단백질 동정

4-1: 단백질을 겔-내 트립신 단리(in-gel trypsin digestion)하였다. 절제된 젤 스팟을 5분간 쉐이킹하면서 100μL의 탈염색 용액(destaining solution; 30mM 페리시안화 칼륨 및 100mM 티오황산염)으로 탈염색하였다. 상기 탈염색 용액을 제거한 후, 젤 스팟을 20분 동안 200mM의 탄화수소암모늄으로 처리하였다. 젤 조각을 100μL의 아세토나이트릴로 탈수시키고 진공 원심분리기 내에서 건조시켰다. 상기 과정을 3회 반복하였다. 건조된 젤 조각을 0.2μg의 변형된 트립신(Promega)를 함유한 20μL의 50mM 탄화수소암모늄으로 45분 동안 얼음 상에서 재수화시켰다. 상기 용액을 제거한 후, 30μL의 50mM 탄화수소암모늄을 첨가하였다. 단리는 37℃에서 밤새 수행되었다. 상기 펩타이드 용액을 C18 나노기둥(nano column)을 이용하여 탈염하였다.

4-2: 주문제작한 크로마토그래피 칼럼을 질량분석 이전에 펩타이드 혼합액을 탈염하고 농축시키기 위하여 사용하였다. 100-300nL의 Poros reverse phase R2 material로 구성된 칼럼(20-30μm 비드 사이즈, Perseptive Biosystems)을 구축된 GELoader tip(Eppendorf) 내에 채워넣었다. 약한 기압으로 액체를 칼럼에 통과시키기 위하여 10mL의 시린지를 사용하였다. 30μL의 단리 상청액 유래 펩타이드 혼합액을 30μL의 5% 포름산으로 희석시키고, 칼럼에 적재한 후, 30μL의 5% 포름산으로 세척하였다. MS/MS 분석을 위해, 펩타이드를 프리-코팅된 붕규산염 나노-전기분사 침(pre-coated borosilicate nano-electrospray needle; EconoTipTM)에 직접 1.5μL의 50% 메탄올/49% 물/1% 포름산으로 용출하였다.

4-3 : EIS-MS/MS 분석

겔-내 단리에 의해 생성된 펩타이드의 MS/MS를 Q-TOF2 질량분석계 상 나노-ESI를 이용하여 수행하였다(AB Sciex Instruments). 소스 온도는 실온이었다. 이온 소스 내 프리-코팅된 붕규산염 나노-전기분사 침에 안정된 10-30nL/min의 유속을 만들기 위하여 0-5psi 질소 배압과 함께, 1kV 포텐셜을 적용하였다. 원뿔체 전압(cone voltage)은 40V이었다. 헥사폴 충돌 세포 내 분열에 대한 전구체 이온을 선택하기 위하여 사중극자 분석기를 사용하였다. 충돌 가스는 6^-7x10^-5mbar 압력의 아르곤이었고 충돌에너지는 25-40V이었다. 생성물 이온은 마이크로-채널 플레이트 검출기인 반사장치에 적합한 직교 TOP 분석기 및 시간 수치 변환기(time-to-digital converter)를 이용하여 분석하였다. 펩타이드 서열 시스템을 이용하여 데이터를 처리하였다.

4-4 : 데이터베이스 검색

MASCOT 소프트웨어(Matrix Science) 내 이온 검색 옵션으로 MS/MS 이온 검색을 지정하였다. ESI-MS/MS에 의한 ESI-MS 내 펩타이드 피크로부터 펩타이드 단편 파일을 얻었다. 잠재적으로 손실된 분절 부위를 가지는 효소로써 트립신을 선택하였다. 기구 타입으로 ESI-QTIF를 선택하였다. 펩타이드 단편 파일을 MASCOT 검색 엔진을 이용한 데이터베이스를 근거로 찾아내고 Sus scrofa 분류에 따라 한정하였다. 산화된 메티오닌을 가변적 변형으로 하고, 카르브아마이도메틸레이티드 시스테인(carbamidomethylated cysteine)을 고정적 변형으로 하였다. 질량 오차(mass tolerance)는 펩타이드의 경우 ±1Da, 단편의 경우 ±0.6Da으로 하였다. 높은 수치 펩타이드는 MASCOT 내 디폴트 유효 임계수준(default significance threshold) 이상의 것과 일치하였다(p<0.05, 펩타이드 수치>35).

수태능 관련 단백질을 찾기 위해서 정자의 동결 보존하는 과정을 동결 전의 상태, 동결 보존제를 첨가한 후 온도를 낮춘 상태 또는 동결 후 해동된 상태로 나누어 준비된 소 정자 샘플(실시예 1 참조)을 가지고 2-DE 및 실버 염색한 다음, 이미지 분석을 한 결과, 동결 과정에서의 각각의 단계 간에는 단백질 발현량에 차이가 있음을 확인하였다(도 2∼도 7). 상기 확인된 스팟의 단백질을 MASCOT SW를 이용하여 MS/MS 이온 검색한 결과, 발현량에 차이가 있는 상기 단백질들은, 표 1∼표 6에 나타난 바와 같이, GSTM3(glutathione S-transferase mu 3), 트리오스포스페이트 아이소머라제(triosephosphate isomerase; TPI), 피브레이트 디하이드로제나즈 E1 콤포넨트 서브유닛 베타(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta; PDHB), F-악틴-케핑 프로테인 서브 유닛 베타(f-actin-capping protein subunit beta; CAPZB), 아우터 덴즈 파이버 프로테인2(outer dense fiber protein 2; ODF2) 및 NME7(nucleoside diphosphate kinase 7, NDK7)인 것으로 확인되었다.

하기 표 1은 프레쉬 정자에서 차별적으로 발현되는 단백질의 수준을 애프터 TYB 정자의 단백질과 비교한 결과를 나타낸 것이다.

하기 표 2는 프레쉬 정자에서 차별적으로 발현되는 단백질의 수준을 애프터 글리세롤 정자의 단백질과 비교한 결과를 나타낸 것이다.

하기 표 3은 프레쉬 정자에서 차별적으로 발현되는 단백질의 수준을 애프터 해동 정자의 단백질과 비교한 결과를 나타낸 것이다.

하기 표 4는 애프터 TYB 정자에서 차별적으로 발현되는 단백질의 수준을 애프터 글리세롤 정자의 단백질과 비교한 결과를 나타낸 것이다.

하기 표 5는 애프터 TYB 정자에서 차별적으로 발현되는 단백질의 수준을 애프터 해동 정자의 단백질과 비교한 결과를 나타낸 것이다.

하기 표 6은 애프터 글리세롤 정자에서 차별적으로 발현되는 단백질의 수준을 애프터 해동 정자의 단백질과 비교한 결과를 나타낸 것이다.

실시예 8: 신호기전( signaling pathway )

정자의 동결 보존하는 과정에 따라 달리 발현된 단백질의 생물학적 기능 및 신호 기전을 시각화하기 위하여, Pathway Studio (v 9.0, Aridane Genomics)를 사용하였다.

Pathway Studio로 분석한 결과, 도 8∼도 12에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 7에서 확인된 단백질들(표 1∼표 6)은 신호기전에서 상호작용을 하는 것으로 나타났다. 특히, CAPZB 및 ODF2는 액틴(actin)을 기반으로 하는 세포골격(cytoskeleton) 어셈블리와 액틴 조절 경로에 관련되어 있고, GSTM3은 글루타치온(Glutathione) 대사에 관련되어 있고, TPI 및 PDHB는 포도당 대사에 관련되어 있고, CAPZB, TPI, PDHB 및 ODF2는 노치(Notch) 경로에 관련되어 있고, NME7은 피리미딘(Pyrimidine) 대사와 관련되어 있는 것으로 분석되었다.

실시예 9: 통계학적 분석

Student's two-tailed t-test를 이용하여 정자의 동결 보존하는 과정에 따라 달리 처리된 샘플의 통계적 유의도를 계산하였다. P값이 0.05 이하인 경우 유효한 차이로 간주하였다. 모든 데이터는 평균(Mean)±측정표준오차(SEM)로 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

GSTM3(glutathione S-transferase mu 3), 트리오스포스페이트 아이소머라제(triosephosphate isomerase; TPI), 피브레이트 디하이드로제나즈 E1 콤포넨트 서브유닛 베타(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta; PDHB), F-악틴-케핑 프로테인 서브 유닛 베타(f-actin-capping protein subunit beta; CAPZB), 아우터 덴즈 파이버 프로테인2(outer dense fiber protein 2; ODF2) 및 NME7(nucleoside diphosphate kinase 7, NDK7)로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택된 정자의 동결 스트레스 판별용 마커를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질을 검출하는 물질을 포함하는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA를 검출하는 물질은, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하며, 상기 유전자의 단백질을 검출하는 물질은 압터머 또는 항체인 것을 특징으로 하는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별용 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는, PCR 키트, RT-PCR 키트 또는 DNA 칩으로 구성된 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별용 키트.
정자의 동결 스트레스 유무 판별에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상 시료로부터 GSTM3(glutathione S-transferase mu 3), 트리오스포스페이트 아이소머라제(triosephosphate isomerase; TPI), 피브레이트 디하이드로제나즈 E1 콤포넨트 서브유닛 베타(pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta; PDHB), F-악틴-케핑 프로테인 서브 유닛 베타(f-actin-capping protein subunit beta; CAPZB), 아우터 덴즈 파이버 프로테인2(outer dense fiber protein 2; ODF2) 또는 NME7(nucleoside diphosphate kinase 7, NDK7) 마커를 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 대조군의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 상기 시료의 마커를 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 동결 전의 상태의 발현 수준보다 높거나 낮을 경우, 정자의 동결 스트레스가 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별 방법.
제4항에 있어서, 상기 대조군은 동결 전의 상태, 동결 보존제인 글리세롤 및/또는 TYB(Tris egg-Yolk Buffer)를 첨가한 후 4℃에서 2시간 이상 냉장한 상태 또는 질소가스에서 15분간 처리하고 동결 후 39℃에서 해동된 상태에 있는 정자를 특징으로 하는 동결 스트레스에 따른 소 정자의 수태능 판별 방법.