CN116144820A - 黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记及其应用 - Google Patents

黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记及其应用：所述InDel标记在黄瓜第3号染色体上，对于重根系显性纯合材料，其具有SEQ ID NO.1所示的特征序列，即在87bp处具有AAAATATGTCTT序列；对于轻根系隐性纯合材料，其具有SEQ ID NO.2所示的特征序列，即在87bp处缺失了AAAATATGTCTT序列；对于重根系显性杂合材料，其同时具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特征序列。采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行根系强弱的判断，具有高效、限制少的优点，为选育强根系黄瓜品种提高了效率，缩短了育种周期。

Description

黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术辅助育种技术，特别是涉及黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)是我国重要的保护地蔬菜，尤其在设施生产中占有举足轻重的地位，进一步提高产量是黄瓜育种的重要目标。根系改良对于提高产量具有重要意义，根系是固定植物生长和吸收水分及营养的重要器官，时刻与地上部分进行着物质交换。植物的根系构型、根际环境、根系对水分和养分的吸收活力及根系对不同外界环境所做出的响应等都会影响整个植株的生长发育。根系的生长既受遗传控制，又与各种环境因子有关，具有一定的可塑性。植物根系近年来以成为育种工作者重点改良的植物性状之一。
简而易行的根系观测方法是研究根系的基础。根系的研究方法处于不断优化创新的阶段，目前已有的方法各有优缺点。基质栽培法：采用蛭石、珍珠岩等结合营养液对根进行培养，这种方法简单方便，但在调查表型时需清洗根上的基质，属于一次性破坏试验，且会对根系在造成一定损害(春亮，2004)。水培法：以泡沫浮板为支撑，使植物根系在营养液中生长，可直接获得完整根系，但需要频繁更换营养液(吴伟明等，1998)。雾培法：利用机械将营养液雾化喷在植物根系上，无需频繁更换营养液，但需要具备相应的设备基础(赵旭等，2017)。同位素示踪法：利用放射性同位素观察根系生长状态(黄瑞冬，1991)。盆篮栽培法：植物在装有营养土的篮子中种植，随着植株的生长，根系可穿透篮子，利于观察根系在土壤中的生长方向(Oyanagi et al.,1993)。
对根系资源的评价与筛选是获得优良根系材料、种质资源创新及培育抗病抗逆优质高产植物新品种的基础。单云鹏等(2019)对235份小豆种质资源进行评价筛选，通过对根系形态等15项指标进行测定，结合主成分分析、隶属函数分析将总根表面积作为小豆苗期抗旱性评价的主要指标，最终筛选出15份小豆优良根系耐旱材料(单云鹏等，2019)。崔新卫(2007)对水稻核心种质的根系进行研究，以根系相关性状的平均隶属函数值作为评价指标，筛选出10份在供水或胁迫条件下均表现为优良强壮根系的材料。代云(2009)同样利用根系相关性状平均隶属函数值作为评价水稻抗旱能力的指标，结合两年表型鉴定共筛选出19个抗旱品种和13个敏感品种。宋占哲(2011)在低磷胁迫条件下，以根冠比，最长根长以及产量为评价指标，在524份玉米自交系中共筛选出118份根系优良、磷利用率高的优异材料。尹元萍等(2015)在不同磷水平下，以大豆的根干重、总根长和根冠比为指标，在186份大豆材料中筛选出26种磷吸收利用率高的种质资源。
探明性状遗传规律以及相关QTL是分子标记辅助育种的前提，有利于提高育种的准确性和预见性。研究表明植物根系相关性状大多为数量性状，受多个基因控制，且具有明显的相关性。余先驹等(2004)对15个玉米自交系进行遗传分析，结果表明，玉米的总根数、根干重、根鲜重等性状均具有较高的遗传力，以加性效应为主，且这些性状与粒重呈显著正相关。梁慧珍(2014)等对大豆根系进行分析，结果表明大豆主根长、根重、根体积、侧根数等根系相关性状都受2-4对主基因控制。张涵等(2018)以小麦重组自交系为材料，对根长等8个根系相关性状进行分析，结果表明各性状间表现出极显著的相关性，变异系数大，且受多对基因控制，具有较高的遗传力。
根系性状的遗传定位研究大多集中在大田作物上。水稻中已经检测到六600多个与根系性状相关的QTL(Courtois et al.,2009)。Uga等(2011)在水稻9号染色体上鉴定一个控制根长和根生长角度的主效QTL位点Dro1，方萍等(1999)在2号和5号染色体上检测7个与根体积、相对根粗和最大根长相关的QTLs。Han等(2005)在12℃冷水灌溉条件下，利用水稻F2:3家系，检测到与根系相关性状的17个QTLs，其中包括2个与最长根的直径相关的位点qCRD2和qCRD11，分别位于2号染色体和11号染色体上，2个与根干重相关QTLs位点qCT2和qCT11。梁慧珍等(2014)对大豆进行遗传分析，认为与根系相关的性状主要受主基因控制，并检测到24个与根相关性状相关的QTLs。张薇(2005)对苗期玉米的总根长、根表面积、根体积等进行研究，每个性状都检测到4-5个QTLs，并发现控制玉米和水稻根系的QTL具有同源性。但在黄瓜中未见相关报道。
发明内容
本发明基于上述领域的空白，提供了与黄瓜根重调控基因紧密连锁的Indel标记(insertion-deletion，插入缺失标记)，并提供该标记在筛选强根系和弱根系黄瓜种质资源上的应用。基于此，本发明保护如下技术方案：
一种黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记，所述InDel标记在黄瓜第3号染色体上，对于重根系显性纯合材料，其具有SEQ ID NO.1所示的特征序列，即在87bp处具有AAAATATGTCTT序列；对于轻根系隐性纯合材料，其具有SEQ ID NO.2所示的特征序列，即在87bp处缺失了AAAATATGTCTT序列；对于重根系显性杂合材料，其同时具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特征序列。
一种用于检测上述的InDel标记的特异性引物对，包括引物Indel3-6-F、Indel3-6-R，所述引物的核酸序列如下：
Indel3-6-F:5'-GGTCGGTTAAGGCATATTTG-3'，
Indel3-6-R:5'-GCCACAATGGATCGAAAA-3'。
一种用于检测上述的InDel标记的试剂盒，包含上述的特异性引物对。
优选地，所述试剂盒，还包含黄瓜基因组DNA提取试剂、PCR扩增反应试剂，进一步优选还包括PCR扩增产物测序试剂或凝胶电泳试剂，优选聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂。
上述的Indel标记或上述的引物对或者上述的试剂盒在以下任一中的应用：
(1)鉴定区别轻根系黄瓜材料和重根系黄瓜材料；
(2)鉴定待测黄瓜材料的黄瓜根重调控基因的基因表型；
(3)鉴定或辅助鉴定待测黄瓜材料的根重田间表型；
(4)筛选具有重根系调控基因的黄瓜种质资源；
(5)筛选或者辅助筛选重根黄瓜品种；
(6)培育或者辅助培育重根黄瓜品种；
(7)黄瓜育种。
所述应用包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用上述的Indel标记的扩增引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行分析，判断待测样品的黄瓜根重调控基因的基因型。
在上述应用技术方案中，所述Indel标记的扩增引物如下：
Indel3-6-F:5'-GGTCGGTTAAGGCATATTTG-3'，
Indel3-6-R:5'-GCCACAATGGATCGAAAA-3'。
在上述应用技术方案中，对PCR扩增产物进行测序分析，如果待分析序列与SEQ IDNO.1所示的序列同源对比，得到的序列与SEQ ID NO.1所示序列的87bp处相对应的位置具有AAAATATGTCTT序列的黄瓜材料，判断待测样品为重根系显性纯合材料；反之在该处对应位置上缺失“AAAATATGTCTT”序列的黄瓜材料，判断待测样品为轻根系隐性纯合材料；如果待分析序列同时具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特征序列，则判断待测样品为重根系显性杂合材料。
在上述应用技术方案中，对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺或者琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果判断如下：
如果PCR扩增产物为一条199bp的特征条带，则待测样品为轻根系隐性纯合材料；
如果PCR扩增产物为一条199bp的特征条带和一条211bp的特征条带，则待测样品为重根系显性杂合材料；
如果PCR扩增产物为一条211bp的特征条带，则待测样品为重根系显性纯合材料；
如果不出现199bp或者211bp的特征条带，则待测样品为不带有根重调控基因的黄瓜材料；
优选所述凝胶电泳检测，指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。
在上述应用技术方案中，PCR扩增的反应体系为:7.5ng DNA模板，正向引物和反向引物各50ng，5μL Go
Figure BDA0003885600850000041
Green Master Mix，加双蒸水补至总体积10μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
本发明的有益效果是：
本发明不仅为黄瓜根重调控基因的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有强根系黄瓜新品种提供了高效途径。本发明基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选强根系黄瓜新品种的方法，该方法中，采用Indel标记引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条199bp条带，这种为隐性纯合材料(轻根系)；第二种是199bp条带和211bp条带都出现，这种是显性杂合材料(重根系)；第三种是仅仅出现211bp条带，这种为显性纯合材料(重根系)。
采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行根重的鉴定和筛选，对其进行根系强、弱的判断，具有高效、限制少、准确的优点，为选育强根系黄瓜品种提高了效率，缩短了育种周期。
附图说明
图1是Indel标记的引物Indel3-6对黄瓜亲本材料CG27(P1)，CG59(P2)及F2群体随机单株的检测结果，泳道1：DNA Marker，2：CG27，3：CG59单株，4-62：59份F2群体材料。
图2是50份黄瓜自然群体材料检测结果，泳道1：DNA Marker，2-26：25份轻根系自然群体材料，27-51：25份重根系自然群体材料。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。
生物材料
本研究所用的黄瓜试验材料为CG27和CG59，59份F2群体材料，25份轻根系自然群体材料，25份重根系自然群体材料。
CG27为华南型黄瓜，植株长势弱，轻根系。
CG59为华南型黄瓜，植株长势强，重根系。
CG27和CG59在中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
Indel引物是本实验室基于115份核心种质重测序的基因组信息、利用primer 3.0软件开发而来。重测序的基因组信息详见Qi等在《Nature Genetics》杂志2013年发表的论文《A genomic variation map provides insights into the genetic basis ofcucumber domestication and diversity》。
主要试剂
PCR实验使用PromeGa公司(美国)的试剂
Figure BDA0003885600850000051
Green Master Mix；凝胶电泳使用盈信阳光公司(中国)的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。
实施例1.黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记的获得
黄瓜根重调控基因是发明人所在研究课题组在前期研究中发现的与黄瓜的根系性状密切相关的基因，黄瓜的根系性状表现为轻根或重根，而根的轻重则体现了根系的强弱，通常，根重大则根系较强，根重小则根系较弱。由该基因控制的根重性状，当基因为杂合基因或者显性纯合时，植株的根系重量表现为重根；当基因为隐性纯合时，植株的根系重量表现为轻根。
前期研究中我们以轻根系黄瓜自交系CG27和重根系黄瓜自交系CG59为亲本构建F1、F2群体，对黄瓜根重调控基因进行了遗传规律分析。以F2群体为作图材料，利用图位克隆技术，实现基因的染色体定位，并获得紧密连锁的Indel标记Indel3-6。
我们利用1个SSR标记和15个Indel标记，将黄瓜根重调控基因定位在3号染色体上标记Indel3-6和Indel3-12之间，该区段的物理距离为1.25Mb。
基于以上结果，我们开展了本研究。
针对初定位的染色体区段，利用本实验室之前重测序的数据寻找黄瓜根重调控基因的Indel位点，利用primer 3.0软件在这些Indel位点上设计引物，对连锁群进行分析标记加密。在目标区段(约1.25Mb)用双亲筛选出有多态性的有5对标记。结合表型，最终获得与根重调控基因连锁最紧密的Indel标记Indel3-6。其中正向和反向引物分别为：Indel3-6-F(SEQ ID NO.3):5'-GGTCGGTTAAGGCATATTTG-3'，Indel3-6-R(SEQ ID NO.4):5'-GCCACAATGGATCGAAAA-3'。
通过上述引物(Indel3-6-F/Indel3-6-R)对双亲材料进行PCR扩增，获得特异性条带，其中在材料CG27(轻根系)中，获得一个199bp的条带，在材料CG59(重根系)中，获得一个211bp的条带。
具体操作方法：
步骤1.DNA提取和PCR扩增
取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本CG27(P1)，CG59(P2)及F1的基因组DNA。
PCR扩增的反应体系为:7.5ng DNA模板，所述正向引物和反向引物各50ng，5μL Go
Figure BDA0003885600850000061
Green Master Mix，加双蒸水补至10μL。
PCR扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
步骤2.结果判定
PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h 30min，电泳后银染显色，统计带型。
CG27(轻根系)得到一个199bp的片段，条带带型记为a；CG59(重根系)得到一个211bp的片段条带带型记为b；F1中两个条带同时检测到，条带带型记为h。59份F2群体材料中，检测到h带型的材料为33份，检测到a带型的材料为9份，检测到b带型的材料为17份。
实施例2.基因侧翼标记的验证
利用本实验室保存的50份自然群体材料，对实施例1获得的与基因连锁的标记Indel3-6进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性，田间鉴定和分子验证结果如表1中所示：
表1. 50份黄瓜自然群体材料根重性状田间表型和分子验证结果
材料名称 田间表型 分子验证表型 材料名称 田间表型 分子验证表型
CG86 轻根系 a CG113 重根系 b
CG49 轻根系 a CG40 重根系 b
CG70 轻根系 a CG13 重根系 b
CG14 轻根系 a CG58 重根系 b
CG98 轻根系 a CG45 重根系 b
CG35 轻根系 b CG99 重根系 u
CG77 轻根系 a CG69 重根系 u
CG84 轻根系 a CG117 重根系 b
CG56 轻根系 a CG10 重根系 b
CG107 轻根系 a CG6 重根系 b
CG100 轻根系 a CG97 重根系 u
CG90 轻根系 a CG31 重根系 b
CG32 轻根系 b CG96 重根系 b
CG29 轻根系 a CG106 重根系 a
CG62 轻根系 a CG78 重根系 a
CG85 轻根系 a CG118 重根系 b
CG55 轻根系 a CG23 重根系 b
CG108 轻根系 a CG21 重根系 b
CG30 轻根系 a CG95 重根系 b
CG71 轻根系 a CG36 重根系 b
CG114 轻根系 a CG25 重根系 b
CG63 轻根系 a CG19 重根系 b
CG88 轻根系 a CG16 重根系 b
CG26 轻根系 a CG104 重根系 b
CG28 轻根系 a CG11 重根系 b
*注：田间表型利用根重表示，根据实施例1中的F2群体根重的分布情况，将根鲜重小于0.5g，根干重小于0.04g的判断为轻根；将根鲜重大于0.5g，根干重大于0.04g的判断为重根。表1中分子验证表型为u的表示未扩增出条带。
按照实施例1中的方法进行Indel标记的检测，结果显示经和所选材料的田间表现型相比，标记在50份自然群体材料带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算正确率为86.0％，其中轻根系材料分子标记辅助选择的正确率达到92.0％。PCR扩增条带见图2。
Figure BDA0003885600850000091
/>

Claims (10)

1.一种黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记，其特征在于：所述InDel标记在黄瓜第3号染色体上，对于重根系显性纯合材料，其具有SEQ ID NO.1所示的特征序列，即在87bp处具有AAAATATGTCTT序列；对于轻根系隐性纯合材料，其具有SEQ ID NO.2所示的特征序列，即在87bp处缺失了AAAATATGTCTT序列；对于重根系显性杂合材料，其同时具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特征序列。
2.一种用于检测权利要求1所述的InDel标记的特异性引物对，其特征在于：包括引物
Indel3-6-F、Indel3-6-R，所述引物的核酸序列如下：
Indel3-6-F:5'-GGTCGGTTAAGGCATATTTG-3'，
Indel3-6-R:5'-GCCACAATGGATCGAAAA-3'。
3.一种用于检测权利要求1所述的InDel标记的试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述的特异性引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包含黄瓜基因组DNA提取试剂、PCR扩增反应试剂，进一步优选还包括PCR扩增产物测序试剂或凝胶电泳试剂，优选聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂。
5.权利要求1所述的Indel标记或权利要求2所述的引物对或者权利要求3或4所述的试剂盒在以下任一中的应用：
(1)鉴定区别轻根系黄瓜材料和重根系黄瓜材料；
(2)鉴定待测黄瓜材料的黄瓜根重调控基因的基因表型；
(3)鉴定或辅助鉴定待测黄瓜材料的根重田间表型；
(4)筛选具有重根系调控基因的黄瓜种质资源；
(5)筛选或者辅助筛选重根黄瓜品种；
(6)培育或者辅助培育重根黄瓜品种；
(7)黄瓜育种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的Indel标记的扩增引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行分析，判断待测样品的黄瓜根重调控基因的基因型。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述Indel标记的扩增引物如下：
Indel3-6-F:5'-GGTCGGTTAAGGCATATTTG-3'，
Indel3-6-R:5'-GCCACAATGGATCGAAAA-3'。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：对PCR扩增产物进行测序分析，如果待分析序列与SEQ ID NO.1所示的序列同源对比，得到的序列与SEQ ID NO.1所示序列的87bp处相对应的位置具有AAAATATGTCTT序列的黄瓜材料，判断待测样品为重根系显性纯合材料；反之在该处对应位置上缺失“AAAATATGTCTT”序列的黄瓜材料，判断待测样品为轻根系隐性纯合材料；如果待分析序列同时具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特征序列，则判断待测样品为重根系显性杂合材料。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺或者琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果判断如下：
如果PCR扩增产物为一条199bp的特征条带，则待测样品为轻根系隐性纯合材料；
如果PCR扩增产物为一条199bp的特征条带和一条211bp的特征条带，则待测样品为重根系显性杂合材料；
如果PCR扩增产物为一条211bp的特征条带，则待测样品为重根系显性纯合材料；
如果不出现199bp或者211bp的特征条带，则待测样品为不带有根重调控基因的黄瓜材料；
优选所述凝胶电泳检测，指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。
10.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：
PCR扩增的反应体系为:7.5ng DNA模板，正向引物和反向引物各50ng，5μL Go
Figure FDA0003885600840000021
Green Master Mix，加双蒸水补至总体积10μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
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CN104004749A (zh) * 2013-02-27 2014-08-27 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 黄瓜黑色果刺基因b连锁的ssr标记引物及其应用
CN109762921A (zh) * 2019-01-28 2019-05-17 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 用于检测黄瓜果肉颜色的snp标记及其应用

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