CN116144567A - 一种重组大肠杆菌及其在连续分泌产人表皮生长因子中的应用 - Google Patents
一种重组大肠杆菌及其在连续分泌产人表皮生长因子中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组大肠杆菌及其在连续分泌产人表皮生长因子中的应用，以分泌生产hEGF的大肠杆菌BL21‑hEGF为宿主，对大肠杆菌BL21‑hEGF采用以下方式继续进行改造：强化dgcC基因、csgD基因、bcsA基因、bcsB基因中的任意一个基因的表达，提高了菌株形成生物被膜的能力。将改造后的重组大肠杆菌于培养基中进行发酵，有效提高了大肠杆菌连续分泌生产人表皮生长因子的能力，使得大肠杆菌在固定化连续发酵中产人表皮生长因子的效率得到了显著的提高，分泌生产过程更加稳定，实现了人表皮生长因子的连续化高效稳定的生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术和发酵工程领域，具体涉及一种重组大肠杆菌及其在连续分泌产人表皮生长因子中的应用。
背景技术
随着医药蛋白需求的不断增加，医药蛋白的生物合成受到人们更多的关注，开发高效的蛋白质生物生产工艺可为蛋白生产提供强大助力。在诸多蛋白生产宿主中，大肠杆菌具有发酵周期短，容易控制等优势被广泛使用。然而，由于大肠杆菌分泌蛋白质的能力很差，大肠杆菌商业化生产重组蛋白仍然是一个挑战。为了提高大肠杆菌的蛋白质分泌效率，人们尝试了很多方法，如选择高效的信号肽(如OmpA和PelB的信号序列)引导蛋白质向分泌通路的转移；对参与跨膜运输的关键转运蛋白或辅助蛋白进行修饰也被应用于提高蛋白质的分泌效率；此外，融合蛋白和分子伴侣的共表达也被证明可以增加蛋白质的表达和胞外分泌。
重组人表皮生长因子(rhEGF)可以促进细胞增殖，广泛应用于临床及美容行业。据文献报道，基于PelB信号肽已成功实现hEGF在大肠杆菌BL21(DE3)中的细胞外表达(中国专利号CN111471636A)。根据已有研究，目前对hEGF产量的提高主要是通过优化密码子(中国专利号CN1360022A)、优化信号肽(中国专利号CN1854294A)、温度诱导(中国专利号CN102952817A)等方式实现。但对于hEGF的生产通常是以传统的游离发酵方式进行，剪切力等的作用使得细胞活力下降，影响蛋白生产。
随着固定化细胞技术的蓬勃发展，这项技术在微生物发酵工艺中得到了广泛的应用，基于生物被膜的固定化连续发酵体系已成功生产了乙醇、丁醇、柠檬酸等大宗产品，在保证细胞活性的同时，又能够循环使用，缩短了发酵周期，提高了发酵产率。本研究从大肠杆菌生物被膜等生理过程相关的角度，考察了大肠杆菌生物被膜形成相关基因(如dgcC、csgD、bcsA、bcsB)对hEGF分泌和生产的影响，并进一步建立基于生物被膜的连续发酵体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种重组大肠杆菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌在连续分泌产人表皮生长因子中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种重组大肠杆菌，以分泌生产hEGF大肠杆菌为BL21-hEGF为宿主，对大肠杆菌BL21-hEGF采用以下方式继续进行改造：强化dgcC基因、csgD基因、bcsA基因、bcsB基因中的任意一个基因的表达。
其中，所述的dgcC基因、csgD基因、bcsA基因、bcsB基因，其核苷酸序列分别如SEQID No.1-SEQ ID No.4所示。
具体的，所述的dgcC基因、bcsA基因和bcsB基因参与纤维素合成，所述的csgD基因参与卷曲菌毛的合成。
其中，所述的大肠杆菌BL21-hEGF宿主是大肠杆菌BL21(DE3)的改造菌株，即在出发菌株大肠杆菌BL21(DE3)的基因组上整合表达了人表皮生长因子基因。
上述重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)在大肠杆菌BL21(DE3)基因组中插入人表皮生长因子基因构建得到产人表皮生长因子的大肠杆菌BL21-hEGF；
(2)将dgcC基因、csgD基因、bcsA基因和bcsB基因中的任意一个基因导入质粒中，获得重组质粒；
(3)将步骤(2)获得的重组质粒热转至步骤(1)构建的大肠杆菌BL21-hEGF感受态中，在含有50μg/mL硫酸卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性转化子，得到重组菌株BL21-dgcC+，BL21-csgD+，BL21-bcsA+或BL21-bcsB+。
其中，步骤(2)中，所述的质粒为pBbE1a、pET28a、pETDuet等常见基因表达质粒中的任意一种，优选的质粒为pET28a。
其中，步骤(2)中，所述的重组质粒优选为pET28a-dgcC，pET28a-csgD，pET28a-bcsA或pET28a-bcsB中的任意一种。
上述重组大肠杆菌在发酵制备人表皮生长因子中的应用也在本发明所包含的范围之内。
其中，所述的重组大肠杆菌在发酵制备人表皮生长因子中的应用，包括如下步骤：
(a)将权利要求1-3任意一项所述的重组大肠杆菌于37℃下活化后，接种到LB培养基中进行培养，得到活化后的重组大肠杆菌；
(b)将步骤(1)中活化后的重组大肠杆菌以0.5-2％v/v的接种量接种于发酵培养基进行固定化连续发酵。
其中，步骤(a)中，所述的LB培养基含有胰蛋白胨5-15g/L，酵母粉提取物2-8g/L，氯化钠5-15g/L，重组菌株另加入50μg/L硫酸卡那霉素抗性。
其中，步骤(b)中，所述的发酵培养基为TB培养基，含有胰蛋白胨5-15g/L，酵母粉提取物20-30g/L，磷酸氢二钾5-12g/L，磷酸二氢钾0-5g/L，甘油0-10mL/L。
其中，步骤(b)中，所述的固定化反复批次发酵，其发酵条件为：发酵的温度为20-37℃。
优选的发酵条件为：发酵的温度为20℃。
其中，步骤(b)中，所述的固定化反复批次发酵，其发酵过程中，当OD600＝0.6-0.8时，加入0.01-1.5mM的IPTG于20℃诱导发酵6-10个批次。
优选的，当OD600＝0.6-0.8时，加入0.5mM的IPTG于20℃诱导发酵7个批次。
其中，步骤(b)中，所述的固定化反复批次发酵，是固定化连续发酵的特殊方式之一。
具体的，在发酵培养基中加入40g/L棉纤维载体，当发酵一个周期结束后，将发酵液全部放出，保留载体，然后加入新的发酵培养基继续进行下一批次的发酵，如此反复进行。
有益效果：
(1)本发明以分泌生产hEGF的大肠杆菌BL21-hEGF为宿主，对大肠杆菌BL21-hEGF采用以下方式继续进行改造：强化dgcC基因、csgD基因、bcsA基因、bcsB基因中的任意一个基因的表达，提高了菌株形成生物被膜的能力。
(2)本发明通过对菌株成膜能力的改造，有效提高了大肠杆菌细胞在固定化反复批次发酵条件下分泌人表皮生长因子的效率和能力，人表皮生长因子产量得到稳定提高，分泌生产效率提高效果更佳稳定。在固定化连续发酵中，改造菌株较BL21-hEGF的hEGF产量提高1-2倍，节约了培养资源和发酵成本。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为过表达dgcC、csgD、bcsA、bcsB的质粒图谱。
图2为挑取阳性转化子进行菌落PCR验证的核酸胶验证结果。其中，泳道2-5分别为重组菌BL21-dgcC+，BL21-csgD+，BL21-bcsA+和BL21-bcsB+的验证结果。
图3为96孔板结晶紫染色生物量，图中对照为基因组整合表达人表皮生长因子的菌株BL21-hEGF。
图4为使用LB培养基，以棉纤维为固定化载体时固定化反复批次发酵发酵液中的菌体光密度OD600。
图5为使用LB培养基，以棉纤维为固定化载体时固定化反复批次发酵使用高效液相色谱对hEGF进行定量分析的结果。
具体实施方式
在本发明所述的技术方案为前提进行实施，实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程。下属实施例中所用试剂均可从商业途径获得。下属实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所涉及的重组菌BL21-dgcC+，BL21-csgD+，BL21-bcsA+和BL21-bcsB+分别是以表达人表皮生长因子的大肠杆菌BL21-hEGF为起始菌。
以下实施例中所述的对照菌为大肠杆菌BL21-hEGF，是根据中国发明专利CN111471636A构建得到的，命名为BL21-hEGF。即在大肠杆菌BL21(DE3)基因组中插入产人表皮生长因子的基因构建得到的。
将表达目的基因的质粒pET28a导入构建成功的底盘菌株BL21-hEGF中，得到卡那抗性的单质粒菌株。
实施例中的分子生物学实验包括感受态细胞制备、转化等按照《分子克隆实验指南》进行。
在实验室前期研究中，已通过在质粒游离表达hEGF的菌株中改造成膜相关基因构建重组菌株，并利用固定化连续发酵技术实现了hEGF分泌生产效率上的提高，但提高效果不稳定且hEGF产量较低。因此本研究在此基础上，利用前期研究中效果较好的csg、bcs系列基因，以及后期发现的与纤维素合成有关的基因dgcC，通过在基因组整合表达hEGF的菌株中强化dgcC、csgD、bcsA、bcsB基因的表达，以期实现hEGF产量的进一步提高，和强化成膜基因表达后hEGF的分泌生产效率提高效果更佳稳定。实施例1：构建通过质粒过表达dgcC、csgD、bcsA、bcsB基因的重组菌BL21-dgcC+,BL21-csgD+,BL21-bcsA+和BL21-bcsB+
大肠杆菌BL21-hEGF的构建过程已公开在专利CN111471636A中。
重组质粒pET28a-dgcC，pET28a-csgD，pET28a-bcsA和pET28a-bcsB的构建过程如下：
1.1按照质粒提取试剂盒(Axygen AxyPrep Plasmid Miniprep Kit)的步骤提取质粒pET28a。
1.2以质粒pET28a为模板，以pET28a-F和pET28a-R为上下游引物进行线性载体片段PCR，引物核苷酸序列如SEQ ID No.5-SEQ ID No.6所示(表1)。
1.3以大肠杆菌MG1655基因组为模板，以dgcC-F和dgcC-R为上下游引物进行目的基因片段的PCR，引物核苷酸序列如SEQ ID No.7-SEQ ID No.8所示(表1)。
其中，PCR体系(100μL分装为5管)：5×PS Buffer 20μL，dNTP Mix 10μL，上、下游引物各1μL，模板1μL，Prime STAR酶1μL，dd H2O 67μL。
其中，PCR条件：98℃，10min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，10min(延伸时间根据片段长度而变化)，38个循环。
1.4将步骤1.2得到的线性化载体片段与步骤1.3得到的目的基因片段按照ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒的说明书步骤相连接，得到重组质粒pET28a-dgcC。
1.5将dgcC基因替换成csgD、bcsA、bcsB基因，重复1.1-1.4操作，得到重组质粒pET28a-csgD，pET28a-bcsA和pET28a-bcsB，引物核苷酸序列如SEQ ID No.9-SEQ IDNo.14所示(表1)。重组质粒pET28a-dgcC，pET28a-csgD，pET28a-bcsA和pET28a-bcsB的质粒图谱如图1所示。
1.6将构建得到的重组质粒热转至BL21-hEGF感受态中，在含有50μg/mL硫酸卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性转化子。
1.7挑取阳性转化子进行菌落PCR验证，核酸胶验证结果如图2所示(泳道2-5分别为重组菌BL21-dgcC+，BL21-csgD+，BL21-bcsA+和BL21-bcsB+的验证结果)。最终得到重组菌株BL21-dgcC+，BL21-csgD+，BL21-bcsA+和BL21-bcsB+。
表1引物列表
实施例2：96孔板结晶紫染色法表征生物膜形成效果
2.1具体实验步骤
a.将实施例1所构建的重组菌株以及相应的对照菌大肠杆菌BL21(DE3)-hEGF在LB培养基中(通过质粒表达目的基因的菌株需添加50μg/mL的硫酸卡那霉素抗性)37℃、200rpm培养至对数期，再用无菌水稀释菌液至OD600＝0.1。
b.96孔板中加入200μL的LB液体培养基(添加终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导)，再将20μL稀释后菌液接入到培养基中，37℃下静置培养使大肠杆菌在96孔板底部成膜。
c.之后倒掉LB液体培养基，用PBS冲洗2-3遍后，用甲醇4℃下固定15min后，倒掉晾干，加入1％的结晶紫染色15min；倒掉结晶紫染液，用PBS冲洗，加入200μL 33％的冰醋酸并轻微震荡30min，使结晶紫脱色溶解，然后利用酶标仪在OD570下读数，比较底部成膜生物量。
2.2实验结果：如图3所示，通过质粒表达dgcC、csgD、bcsA、bcsB四个基因可以明显促进96孔板底部成膜。
实施例3刚果红结合法表征生物膜形成效果
3.1实验步骤
a.挑实施例1所构建的重组菌株以及对照菌大肠杆菌BL21(DE3)-hEGF的单点至5mL LB液体(通过质粒表达目的基因的菌株需添加50μg/mL的硫酸卡那霉素抗性)培养过夜，取1％转接至5mL LB培养基培养至对数生长期，加入0.5mM IPTG诱导25℃培养20h。
b.稀释到相同OD值后，取2mL菌液离心，用PBS轻轻悬浮2次，离心。
c.加入1mL PBS悬浮将菌体悬浮，加入刚果红(CR)染色(1g溶于100ml，加10μl)，150rpm摇床，25℃反应10min，离心后观察沉淀及上清的颜色并对上清进行全波长扫描读取OD＝485nm处数值。
3.2实验结果：质粒表达dgcC、csgD、bcsA、bcsB四个基因的重组菌与刚果红发生了明显的结合。其中，刚果红结合率＝1-OD485/OD485(PBS+CR)，改造菌株的刚果红结合率如表2所示。
表2改造菌株的刚果红结合率
| 基因改造方式 | 刚果红结合率 |
| Control | 0.37 |
| dgcC+ | 0.51 |
| csgD+ | 0.47 |
| bcsA+ | 0.69 |
| bcsB+ | 0.72 |
实施例4固定化连续发酵
4.1活化：将甘油菌(实施例1所构建的重组菌株以及对照菌大肠杆菌BL21-hEGF)分别接种于5mL LB培养基中(其中，LB培养基含有胰蛋白胨5-15g/L，酵母粉提取物2-8g/L，氯化钠5-15g/L，重组菌株另加入50μg/L硫酸卡那霉素抗性)，接种量10μL，于37℃摇床中培养12h，转速200rpm。
4.2接种：将发酵培养基分装于500mL摇瓶灭菌，装液量100mL，加入固定化载体(棉纤维，40g/L)，然后加入相应抗性，接种量为1％v/v，摇床转速200rpm，37℃培养。
其中，发酵培养基为TB培养基，含有：含有胰蛋白胨5-15g/L，酵母粉提取物20-30g/L，磷酸氢二钾5-12g/L，磷酸二氢钾0-5g/L，甘油0-10mL/L。
4.3诱导：待OD600＝0.6-0.8，加入0.5mM的IPTG于20℃诱导发酵。
4.4在每一批发酵结束时全部放出发酵液，并同时补充新鲜发酵培养基，持续7个批次。
4.5每隔12h取样测定发酵液中OD600数值，结果如图4所示。从图中可以发现通过质粒表达dgcC、csgD、bcsA、bcsB四个基因重组菌的发酵液中细胞密度较对照均有所降低，通过质粒表达bcsA基因重组菌，在第五和第六批次中观察到发酵液中的细胞密度明显下降。这可能表明dgcC、csgD、bcsA、bcsB基因的表达有效地促进了细胞外基质的合成，使细胞能更好地吸附在载体上。
4.6产物检测：将每次取样的发酵液进行离心，取上清液利用高效液相色谱进行产物浓度定量分析：使用的仪器为Agilent 1100HPLC仪，
操作温度为25℃，分析柱为安捷伦300SB-C18色谱柱(4.6x150mm)，流动相A为0.1％TFA，流动相B为0.1％TFA/CAN，以初始90％A+10％B到100％B梯度洗脱45min，进样量为50μL，检测波长为280nm，流速为0.8ml/min。HPLC结果如图5所示。从图5可以看出，使用实施例1制备得到的基因工程菌可实现hEGF的固定化连续发酵，通过质粒表达dgcC、csgD、bcsA、bcsB四个基因重组菌的固定化连续发酵效果更好，hEGF产量较对照有所提高，BL21-hEGF，BL21-dgcC+，BL21-csgD+，BL21-bcsA+和BL21-bcsB+在固定化连续发酵7个批次中的hEGF平均产量分别为：37.55mg/L，40.63mg/L，46.19mg/L，43.43mg/L，48.09mg/L，各批次发酵终点时改造菌株hEGF产量较对照菌株hEGF产量提升倍数如表3所示。
表3基于生物被膜的固定化连续发酵hEGF产量提升倍数
本发明提供了一种重组大肠杆菌及其在连续分泌产人表皮生长因子中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以分泌生产hEGF大肠杆菌为BL21-hEGF为宿主，对大肠杆菌BL21-hEGF采用以下方式继续进行改造：强化dgcC基因、csgD基因、bcsA基因、bcsB基因中的任意一个基因的表达。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的dgcC基因、csgD基因、bcsA基因、bcsB基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-SEQ ID No.4所示。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌BL21-hEGF宿主是大肠杆菌BL21(DE3)的改造菌株，即在出发菌株大肠杆菌BL21(DE3)的基因组上整合表达了人表皮生长因子基因。
4.权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在大肠杆菌BL21(DE3)基因组中插入人表皮生长因子基因构建得到产人表皮生长因子的大肠杆菌BL21-hEGF；
(2)将dgcC基因、csgD基因、bcsA基因和bcsB基因中的任意一个基因导入质粒中，获得重组质粒；
(3)将步骤(2)获得的重组质粒热转至步骤(1)构建的大肠杆菌BL21-hEGF感受态中，在含有50μg/mL硫酸卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性转化子，得到重组菌株BL21-dgcC+，BL21-csgD+，BL21-bcsA+或BL21-bcsB+。
5.权利要求1-3任意一项所述的重组大肠杆菌在发酵制备人表皮生长因子中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将权利要求1-3任意一项所述的重组大肠杆菌于37℃下活化后，接种到LB培养基中进行培养，得到活化后的重组大肠杆菌；
(b)将步骤(a)中活化后的重组大肠杆菌以0.5％-2％v/v的接种量接种于发酵培养基进行固定化反复批次发酵。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(b)中，所述的发酵培养基为TB培养基，含有胰蛋白胨5-15g/L，酵母粉提取物20-30g/L，磷酸氢二钾5-12g/L，磷酸二氢钾0-5g/L，甘油0-10mL/L。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(b)中，所述的固定化反复批次发酵，其发酵条件为：发酵的温度为20-37℃。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(b)中，所述的固定化反复批次发酵，其发酵过程中，当OD600＝0.6-0.8时，加入0.01-1.5mM的IPTG于20℃诱导发酵6-10个批次。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(b)中，所述的固定化反复批次发酵为在发酵培养基中加入40g/L棉纤维载体，当发酵一个周期结束后，将发酵液全部放出，保留载体，然后加入新的发酵培养基继续进行下一批次的发酵，如此反复进行。
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