CN116144504A - 滇黄精根部内生真菌yafef086菌株及其应用 - Google Patents

滇黄精根部内生真菌yafef086菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物内生真菌技术领域，具体公开了一种滇黄精根部内生真菌YAFEF086菌株及其应用。本发明的一株滇黄精根部内生真菌YAFEF086菌株，该菌株为滇黄精根部内生真菌YAFEF086(Talaromycespurpurogenus)；保藏名称为紫属篮状菌(Talaromycespurpurogenus)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2022年5月12日；保藏编号CCTCCM 2022612。本发明对多种致病细菌有较好的抑制作用，为研究开发新的抗细菌药物提供新的途径，缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁。

Description

滇黄精根部内生真菌YAFEF086菌株及其应用
技术领域
本发明涉及植物内生真菌技术领域，尤其涉及一种滇黄精根部内生真菌YAFEF086菌株及其应用。
背景技术
滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.)属百合科多年生草本植物，主要分布在云南、四川、贵州等地，以其根状茎入药，药性平和，是中医临床最常用的滋补药，也是我国重要的药食两用资源之一，具有养阴润肺、健脾益气、肺虚咳嗽、内热消渴等功效。研究显示，黄精根状茎中功效成分众多，主要包括多糖、甾体皂苷、黄酮、生物碱、木质素等。
内生真菌是指生活史的某一个阶段能侵染定殖在健康植物组织内部，且不会引起宿主植物明显病症的一类真菌。包括那些在其生活史的某一阶段营表生的腐生菌，以及对宿主植物暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根真菌。内生真菌种类多，广泛存在于各种类型的植物之中，有些可以促进植物生长及显著提高寄主植物的抗逆能力，包括抗生物逆境和非生物逆境的能力。而植物体为真菌提供生长、栖息的保护场所，作为回报，真菌合成一些次生代谢产物用于促进植物的生长及防御。而这些次生代谢产物中有些则极具新药开发前景。随着现代化进程的加快，全球性的环境污染也随之加剧，由致病细菌、真菌引起的各种疾病极大地威胁着人类的健康。为了降低化学合成药物带来的毒副作用，人们一直热衷于从药用植物中研制天然药物。
发明内容
本发明的主要目的是提供了一株抗细菌活性强的滇黄精根部内生真菌YAFEF086及其应用，为研究开发新的抗菌药物提供新的途径，缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明的一株滇黄精根部内生真菌YAFEF086，该菌株由滇黄精根部分离得到；保藏名称为紫属篮状菌YAFEF086(Talaromycespurpurogenus YAFEF086)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2022年5月12日；保藏编号CCTCC M 2022612。
进一步的，所述内生真菌的ITS基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种菌剂，包含紫属篮状菌YAFEF086的培养物或其加工物。
优选的，所述培养物包括紫属篮状菌YAFEF086液体发酵物；紫属篮状菌YAFEF086菌株细胞的超声裂解上清或沉淀。
优选的，所述紫属篮状菌YAFEF086培养物使用的培养基为：OSMM培养基、PDA培养基、OMAM培养基。
另外，本发明验证了紫属篮状菌YAFEF086或其加工物及培养物在制备抑制致病菌的药物中的应用效果。
优选的，所述致病菌为蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌或铜尿假单胞菌。
最后，本发明还提供了一种医药组合物，含有紫属篮状菌YAFEF086或其加工及培养物。
优选的，所述OMAM培养基包括大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉1g/L，蔗糖20g/L。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供了一种新的紫属篮状菌(Talaromycespurpurogenus)YAFEF086菌株，申请人发现该菌株培养物的提取物具有广泛抗细菌活性，菌株培养物的发酵液提取物对蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、铜尿假单胞菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
附图说明
图1为本发明所述YAFEF086菌株菌丝体生长情况图；
图2为本发明所述YAFEF086菌株抗菌活性检测结果显示图；
图3为本发明YAFEF086菌株与已知抗生素活性检测结果显示图；(注：a.抗氨苄青霉素；b.YAFEF086菌株；c.四环素；d.卡拉霉素)
图4为本发明不同的培养基培养YAFEF086菌株抑菌效果图；(注：1.PDA液体培养基；2.JRMM固体培养基；3.OSMM固体培养基；4.PDA固体培养基；5.MY液体培养基；6.PSA液体培养基；7.CCMM固体培养基；8.SBMM固体培养基；9.OMAM固体培养基。)
图5为本发明所述的荧光显微镜下YAFEF086菌株菌丝体图；
图6为本发明的YAFEF086菌株对蜡样芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组。
图7为本发明的YAFEF086菌株对副溶血性弧菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组。
图8为本发明的YAFEF086菌株对无乳链球菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组。
图9为本发明的YAFEF086菌株对短小芽孢杆菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组。
图10为本发明的YAFEF086菌株对福氏志贺氏菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组。
图11为本发明的YAFEF086菌株对铜尿假单胞菌的抑制作用图，a、b、d表示对照组，c表示实验组。
图12为本发明的YAFEF086菌株系统进化树图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
如图6至图11所示，本发明筛选得到一种滇黄精根部内生真菌YAFEF086(紫属篮状菌Talaromycespurpurogenus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，该菌株是从滇黄精根部分离、纯化得到。其菌株培养物的发酵液提取物对蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、铜尿假单胞菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性。为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
本发明的一株滇黄精根部内生真菌YAFEF086，该菌株由滇黄精根部分离得到；保藏名称为紫属篮状菌YAFEF086(Talaromycespurpurogenus YAFEF086)；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2022年5月19日；保藏编号CCTCCM 2022612。该培养物于2022年05月12日由保藏中心收到，并登记入册，由该日起保存三十年，在期满前收到提供培养物样品的请求后再延续保存五年，该培养物的存活性由保藏中心于2022年05月19日检测完毕，结果为存活。
实施例1
滇黄精根部内生真菌：紫属篮状菌YAFEF086菌株的分离和鉴定
1、滇黄精根部内生真菌的分离
先用自来水冲洗滇黄精根部24h，然后转入超净工作台，先用1L无菌水冲洗，后用小刀切成0.5cm组织块。
将切好的组织块放于50mL离心管，倒入不同配比乙醇充分消毒，用灭菌水冲洗干净置于无菌滤纸吸干水分，晾干备用。取组织块等距离分别放在含有50ug/mL氨苄青霉素和卡那霉素的PDA培养基上(PDA培养基：马铃薯粉5g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L、葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、VB10.1g/L、琼脂16g/L)，每个培养皿放置8个组织块，把培养皿做好标记，将培养皿倒置放于27℃培养箱中培养，培养7d左右，期间不定期观察。待培养基中菌丝长满，把菌丝转接到PDA培养基，培养15d，将所挑取的菌株进行后续分子鉴定后得到滇黄精根部内生真菌：紫属篮状菌YAFEF086。
2、滇黄精根部内生真菌的鉴定
(1)形态的鉴定
真菌在PDA培养基上生长良好，菌丝前期白色呈放射状向周围生长，菌丝较密集，且菌层较厚，菌落呈规则的圆形状，生长到后期呈灰色，具体形态如图1所示。
(2)DNA提取
实验前先打开水浴锅，用于CTAB预热；取滇黄精根部内生真菌分离纯化培养的的菌丝体置于装有钢球的2mL离心管中，并将离心管放到装有液氮的不锈钢罐中浸泡6min，用细胞匀浆破碎机破碎1min，直至将菌丝体打碎；移离心管至通风处加入1mL的CTAB、200uLPVP和20uLβ-巯基乙醇，摇匀(15s)，放到水浴锅水浴1.5h，期间每隔10min摇一次；水浴结束后，放入低温离心机离心(4℃，10min，13000r/min)；吸取1mL上清液，加入500uL苯酚和氯仿-异戊醇混合物，振摇10min，随后离心(4℃，10min，13000r/min)；取900uL上清液至2mL新离心管，加入500uL苯酚和氯仿-异戊醇混合物重洗一次，摇匀继续低温离心；取700uL上清液至2mL新离心管，加入700uL氯仿-异戊醇混合物，振摇10min后再次低温离心；取500uL上清液至1.5mL离心管，加入50uL十分之一醋酸钠和1mL放置于-20℃的无水乙醇，上下缓慢摇晃4-6次；弄好后放入-20℃冰箱静置1h，结束之后倒出上清液，加入500uL酒精到装有沉淀物的离心管中，轻摇10次后静置3min；再次重复后常温离心3min，12000r/min；用100uL移液枪吸取残留乙醇，再次常温离心，后换10uL移液枪吸取残留乙醇，开盖放置15min；加入60uLTE buffer，放置2min，用手指轻弹至沉淀溶解，常温离心30s后做凝胶电泳检测。
(3)ITS分析鉴定
用真菌通用引物ITS1(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增真菌rDNA的间隔序列(含ITS1区、5.8S区、ITS2区)序列，所得ITS测序序列如SEQ ID NO:1所示。
(4)构建发育树
基于ITS构建了滇黄精根部内生真菌YAFEF086的系统发育树(图12)，综合菌株形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，该真菌与紫属篮状菌(Talaromyces purpurogenus)亲缘关系最近，所以将滇黄精根部内生真菌YAFEF086鉴定为Talaromyces purpurogenus。
实施例2
滇黄精根部内生真菌紫属篮状菌YAFEF086活性物质的提取
1、液体发酵培养
液体发酵培养基OMAM：大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉1g/L，蔗糖20g/L，纯净水1L，培养基分装。
刮取适量滇黄精根部内生真菌YAFEF086菌丝体放入2mL离心管，加入500uL无菌水，放入细胞破碎匀浆机破碎1min，取破碎液接种到每个装有OMAM液体培养基的锥形瓶中，置于恒温震荡培养箱培养8d(150r·min-1，28℃)；
2、培养物菌丝体提取
发酵培养完成后，用分液漏斗将菌丝体和菌液分离，在菌液中加入1:1乙酸乙酯摇匀，静置12h，充分萃取后取上清液溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得滇黄精根部内生真菌紫属篮状菌YAFEF086培养的发酵液提取物。
实施例3
滇黄精根部内生真菌YAFEF086培养物的发酵液提取物的抗菌活性检测
1、致病菌的活化
将购于广东省细菌耐药性监测和质量控制中心的致病菌蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、铜尿假单胞菌等致病细菌分别取少量加入2mL离心管中，再加入LB液体培养基，然后将离心管放入37℃恒温摇床中培养12h，得到致病菌菌液。
2、滤纸片法检测抗菌活性
取适量滇黄精根部内生真菌YAFEF086发酵液提取物，称重后加入适量20mg/uLDMSO(二甲基亚砜)溶液，稀释到50mg/mL。先在LB固体培养基反面做标记，后将活化得到的致病菌液分别均匀涂抹在LB固体培养基上，晾干后，用5mm滤纸吸取少量溶解的滇黄精根部内生真菌YAFEF086发酵液提取物，并放在培养基对应标记处，并用5mm滤纸圆片蘸取DMSO溶液作为阴性对照，将培养基正放置于37℃的恒温培养箱中培养12h，观察是否出现抑菌圈，并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小。
抑菌结果统计如图2所示，本发明筛选得到一种滇黄精根部内生真菌YAFEF086(紫属篮状菌Talaromyces purpurogenus)，其菌株培养物的发酵液初提物对蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、铜尿假单胞菌等致病细菌都具有较好的抗细菌活性，为缓解致病菌耐药性对人类健康构成的威胁，研究开发新的抗细菌药物提供新的途径。
除了通过培养菌株进行发酵液提取，其他培养或者加工方法，如滇黄精根部内生真菌YAFEF086细胞的超声裂解上清；滇黄精根部内生真菌YAFEF086细胞的超声裂解沉淀，基于真菌YAFEF086的抗菌效果，其加工物或者培养物均具备相应的抗菌活性，使用本菌制备相关抗菌活性药物、菌剂等，均在本发明的保护范围。
对比例
为进一步确定滇黄精根部内生真菌YAFEF086粗提物的抗菌效果，将YAFEF086菌株与其它已知抗生素做抑菌活性检测，并对不同培养基培养的YAFEF086菌株进行抑菌性检测，致病菌均为短小芽孢杆菌，同上述试验采用滤纸圆片法观察是否出现抑菌圈，并用十字交叉法量出抑菌圈的直径大小，结果如下所示：
1、YAFEF086菌株与已知抗生素活性检测结果显示(图3)，YAFEF086菌株对短小芽孢杆菌的抑菌活性结果明显，且抑菌圈直径达到18mm，具有显著的抑菌效果。
2、通过不同的培养基培养YAFEF086菌株，并对其粗提物进行抑菌活性检测，结果发现在OMAM培养基液体发酵培养菌株生长效果最佳，且对短小芽孢杆菌的抑菌活性最明显(图4)，OSMM培养基、PDA培养基次之，不同培养基所用碳源及其他成分搭配比例不一样，而不同菌株对培养基的利用程度也不一致，由本发明的实验效果，猜想同一菌株利用不同培养基发酵对发酵产物种类及产量影响很大，从而导致不同培养基下抑菌效果的差异。
液体培养基培养获取培养物方法与上述液体发酵获取培养物方法一样，而固体培养基获取培养物方法为滇黄精根部内生真菌YAFEF086在固体培养基上长满后，放于50℃烘箱烘7h左右，减少培养基水分，后加入1:1乙酸乙酯，浸提菌丝48h，充分浸提后溶液用旋转蒸发仪冷凝回流干燥，制得滇黄精根部内生真菌YAFEF086培养的提取物，活性检测方法与上述方法一致。不同的培养基培养YAFEF086菌株是为了筛选抑菌效果最好的培养基。
实验所用培养基配方：
PDA液体培养基：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B10.1g/L；
JRMM固体培养基：核桃渣8g瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)核桃渣为干的核桃仁榨油后的剩余油渣；
OSMM固体培养基：大米10g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)；
PDA固体培养基：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B10.1g/L，琼脂16g/L；
MY液体培养基：酵母麦芽浸粉肉汤21g/L；
PSA液体培养基：马铃薯浸粉5g/L，酵母粉5g/L，蔗糖20g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B10.1g/L；
CCMM固体培养基：山核桃渣8g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)山核桃渣为干的山核桃仁榨油后的剩余油渣；
SBMM固体培养基：高粱粉7g/瓶+MM培养基15mL/瓶(硝酸钠6g/L，氯化钾0.52g/L，七水硫酸镁0.52g/L，磷酸二氢钾1.52g/L)；
OMAM固体培养基：大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉1g/L，蔗糖20g/L。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (9)

1.滇黄精根部内生真菌，其特征在于，所述内生真菌具体为紫属篮状菌YAFEF086(Talaromyces purpurogenus YAFEF086)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏编号CCTCC M 2022612。
2.根据权利要求1所述的滇黄精根部内生真菌，其特征在于，所述内生真菌的ITS基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.一种菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的紫属篮状菌YAFEF086的培养物或其加工物。
4.根据权利要求3所述的一种菌剂，其特征在于，所述培养物包括紫属篮状菌YAFEF086液体发酵物；紫属篮状菌YAFEF086菌株细胞的超声裂解上清或沉淀。
5.根据权利要求3所述的一种菌剂，其特征在于，所述紫属篮状菌YAFEF086培养物使用的培养基为：OSMM培养基、PDA培养基或OMAM培养基。
6.根据权利要求1或2所述的紫属篮状菌YAFEF086或权利要求3-5任一所述的菌剂在制备抑制致病菌的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述致病菌为蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌或铜尿假单胞菌。
8.一种医药组合物，含有权利要求1或2所述的紫属篮状菌YAFEF086或权利要求3-5任一所述的菌剂。
9.根据权利要求5所述的一种菌剂，其特征在于，所述OMAM培养基包括大豆蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉1g/L，蔗糖20g/L。
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