CN116144459A - 一种发酵培养微生物的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种发酵培养微生物的方法及其应用，属于生物发酵技术领域。本发明独特设计了一种共轴双向旋转搅拌生物发酵罐，包括电机、上锥齿轮、中锥齿轮、下锥齿轮、空心外旋搅拌轴、内旋搅拌轴、发酵罐本体；电机通过联轴器驱动内旋搅拌轴，内旋搅拌轴与上锥齿轮固结，上锥齿轮与中锥齿轮以及中锥齿轮与下锥齿轮均成90°安装，下锥齿轮与外旋搅拌轴固结，内旋搅拌轴穿过空心外旋搅拌轴实现共轴反向旋转；内外搅拌轴之间和内外搅拌轴与发酵罐本体之间均装有滚子轴承；内旋搅拌轴下部以及外旋搅拌轴中部和上部均装有搅拌桨。本发明中的装置可通过单个电机实现生物发酵罐高效的混匀和氧气传递，且不会发生液体泄漏，对培养需氧微生物十分有利。

Description

一种发酵培养微生物的方法及其应用

本申请是名为《一种共轴双向旋转搅拌生物发酵罐》的专利申请的分案申请，原申请的申请日为2020年11月17日，申请号为202011284676.X。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种发酵培养微生物的方法及其应用，其中使用的发酵培养装置以单电机驱动共轴的旋向相反的搅拌桨，实现高效的混匀和氧气传递。

背景技术

目前的生物发酵罐一般采用一个电机带动搅拌装置一个方向旋转，这样生成的气泡不够丰富，氧气溶解速度也受限制。采用两个旋转方向相反的搅拌桨可以大大加速气泡生成和氧气溶解速度，但是采用上下两个电机方式不但使得发酵罐结构复杂、生产成本高，而且下面的电机轴与发酵罐本体之间的密封圈容易老化，产生液体泄漏。

如何实现高效、可靠、结构简单的共轴双向旋转搅拌发酵罐，并将其高效应用到微生物的发酵培养中已经成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种发酵培养微生物的方法，所述方法利用共轴双向旋转搅拌生物发酵罐进行，所述共轴双向旋转搅拌生物发酵罐通过以单电机驱动共轴且旋向相反的搅拌桨，从而实现高效的混匀和氧气传递。

本发明设计了特殊结构的共轴双向旋转搅拌生物发酵罐，能够实现单电机驱动旋向相反的共轴搅拌桨。

本发明解决技术问题所采用的方案是：共轴反向旋转搅拌器需要一个内旋搅拌轴和一个空心的外旋搅拌轴，内旋搅拌轴穿过空心的外旋搅拌轴，两轴共轴线；电机直接驱动内旋搅拌轴，同时电机驱动一个由锥齿轮或者平行轴齿轮组成的传动模块，使得传动模块输出轴旋向与电机相反，再输入到外旋搅拌轴，这样可以实现共轴反向旋转；同时，由于内旋搅拌轴和外旋搅拌轴比较细长，通过在内外轴之间安装滚动轴承增加刚度，而内外轴同时也通过滚动轴承与发酵罐本体联接，防止搅拌器旋转时摆动太大；最后通过电机的转速控制，实现不同功率的搅拌。

具体实施过程：电机(1)安装于发酵罐顶部，通过支架与传动模块箱体相连。电机(1)通过联轴器(2)带动内旋搅拌轴(3)同步匀速转动，内旋搅拌轴底部通过轴承5(17)与发酵罐本体联接进行支撑，同时内旋搅拌轴(3)通过锥齿轮传动模块带动外旋搅拌轴(8)反向转动。

通过锥齿轮系实现内外轴的共轴反向旋转的原理如图3所示，上锥齿轮(4)和内旋搅拌轴(3)通过过盈配合或者螺钉固定固结在一起，中锥齿轮(5)和固定轴(7)通过过盈配合或者螺钉固定固结在一起，下锥齿轮(6)和外旋搅拌轴(8)通过过盈配合或者螺钉固定固结在一起，固定轴(7)通过轴承5(18)与传动模块箱体联接进行支撑，中锥齿轮(5)与上锥齿轮(4)、下锥齿轮(6)皆成90o安装，并且各齿轮模数、齿数均相同，内旋搅拌轴(3)穿过空心外旋搅拌轴(8)实现共轴安装。内旋搅拌轴(3)正向转动，通过上锥齿轮(4)和中锥齿轮(5)的啮合带动固定轴(7)匀速转动，固定轴(7)通过中锥齿轮(5)和下锥齿轮(6)的啮合带动空心外旋搅拌轴的匀速反向转动，这样内外轴转速相同，方向相反。

在内旋搅拌轴(3)下部安装搅拌桨1(16)，在外旋搅拌轴(8)中部和上部分别安装搅拌桨2(14)和搅拌桨3(12)，这样搅拌桨1(16)和搅拌桨2(14)、搅拌桨3(12)的转动方向相反；通过调整搅拌桨1(16)和搅拌桨2(14)、搅拌桨3(12)之间的距离，在发酵罐内液体较少时，保证搅拌桨1(16)和搅拌桨2(14)都处于液面以下，在发酵罐内液体较多时，保证搅拌桨1(16)、搅拌桨2(14)和搅拌桨(12)都处于液面以下，也可以调整搅拌桨的桨叶长度、数量和类型，使得搅拌桨1和搅拌桨2、3之间生成更多的气泡，提高溶氧速度；同时，为了防止内外搅拌轴之间发生干涉，在内外轴之间安装轴承1(9)和轴承4(15)，轴承1(9)和轴承4(15)的内圈与内旋搅拌轴(3)过盈配合联接，轴承1(9)、轴承4(15)的外圈和外旋搅拌轴(8)过盈配合联接，这样内外轴即可正反两个方向旋转，同时提高相互之间的刚度，并且使得相互旋转产生的摩擦损耗较小。

本发明还提供了一种所述方法在需氧微生物发酵培养中的应用，使用所述共轴双向旋转搅拌生物发酵罐发酵培养所述需氧微生物前，培养基不经过灭菌处理，直接接种活化后的种子液即可。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

本发明可以通过单个电机实现发酵罐的共轴双向旋转搅拌，提高搅拌效率，实现高效的混匀和氧气传递，该装置还具有结构简单，可靠性高，易于实现的优点。

附图说明

图1为本发明中共轴双向旋转搅拌生物发酵罐的原理示意图；

图2为本发明中采用平行轴轮系的共轴反向原理图；

图3为本发明中采用锥齿轮系的共轴反向原理图。

具体实施方式

一种共轴双向旋转搅拌生物发酵罐

所述共轴双向旋转搅拌生物发酵罐如图1所示。

电机(1)为可通过电压进行无级变速的正反转伺服电机，并安装于发酵罐顶部，通过支架与传动模块箱体相连进行支撑。电机(1)通过联轴器(2)带动内旋搅拌轴(3)同步匀速转动，内旋搅拌轴底部通过轴承5(17)与发酵罐本体联接进行支撑，同时内旋搅拌轴(3)通过锥齿轮传动模块带动外旋搅拌轴(8)反向转动。

如图3所示，通过锥齿轮系实现内外轴的共轴反向旋转，上锥齿轮(4)和内旋搅拌轴(3)通过过盈配合或者螺钉固定固结在一起，中锥齿轮(5)和固定轴(7)通过过盈配合或者螺钉固定固结在一起，下锥齿轮(6)和外旋搅拌轴(8)通过过盈配合或者螺钉固定固结在一起，固定轴(7)通过轴承5(18)与传动模块箱体联接进行支撑，中锥齿轮(5)与上锥齿轮(4)、下锥齿轮(6)皆成90o安装，并且各齿轮模数、齿数均相同，内旋搅拌轴(3)穿过空心外旋搅拌轴(8)实现共轴安装。内旋搅拌轴(3)正向转动，通过上锥齿轮(4)和中锥齿轮(5)的啮合带动固定轴(7)匀速转动，固定轴(7)通过中锥齿轮(5)和下锥齿轮(6)的啮合带动空心外旋搅拌轴的匀速反向转动，这样内外轴转速相同，方向相反。

在内旋搅拌轴(3)下部安装搅拌桨1(16)，在外旋搅拌轴(8)中部和上部分别安装搅拌桨2(14)和搅拌桨3(12)，这样搅拌桨1(16)和搅拌桨2(14)、搅拌桨3(12)的转动方向相反，通过调整搅拌桨1(16)和搅拌桨2(14)、搅拌桨3(12)之间的距离，也可以调整搅拌桨的桨叶长度、数量和类型，使得搅拌桨1和搅拌桨2、3之间生成更多的气泡；同时，为了防止内外搅拌轴之间发生干涉，在内外轴之间安装轴承1(9)和轴承4(15)，轴承1(9)和轴承4(15)的内圈与内旋搅拌轴(3)过盈配合联接，轴承1(9)、轴承4(15)的外圈和外旋搅拌轴(8)过盈配合联接，这样内外轴即可正反两个方向旋转，同时提高相互之间的刚度，并且使得相互旋转产生的摩擦损耗较小。

五升共轴双向旋转搅拌生物发酵罐培养微生物嗜盐单胞菌试验

培养基的配制及发酵培养方法

本实验所用细菌培养基一般用去离子水配制，发酵罐实验可用自来水配制。配制固体培养基时，在相应液体培养基中于灭菌前加入15g/L琼脂。糖类需在115℃下高压蒸汽灭菌20min，其余培养基高压蒸汽灭菌条件为121℃，20min。配制含抗生素的培养基，需待培养基灭菌后冷却至60℃以下，再按相应工作浓度加入抗生素储液。

本实验常用培养基如下：

60LB培养基(适于活化盐单胞菌TD)：60g/L氯化钠，5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨。

50MMG培养基(适于培养盐单胞菌TD)：84％(v/v)基底，2％(v/v)组分I，2％(v/v)组分II，2％(v/v)组分III&IV混合液(其中，组分III、组分IV和去离子水按体积比10:1:9混合)，6％(v/v)葡萄糖储液(500g/L)。所有成分单独灭菌，在接种前混合，并用5M氢氧化钠溶液调节pH至9。接种菌液OD₆₀₀在2-3之间，接种比例为4％(v/v)。本培养基成分如表1所示：

表1矿物培养基50MMG成分列表

如无特别说明，盐单胞菌的摇瓶培养方法均为：以4％(v/v)接种量将活化后的菌液接入50mL的50MMG培养基中(使用500mL圆底锥形瓶)，置于37℃恒温振荡培养箱中，200rpm培养48h。

本实验中使用的五升发酵罐起始培养基总体积为2.7L，由下列成分组成：0.73g硫酸镁，12g尿素，11.6g磷酸二氢钾，69g十二水合磷酸氢二钠，360mL玉米浆(约含49.5g玉米浆粉，价格低廉，用以替代酵母提取物)，60g葡萄糖，150g氯化钠，30mL组分III，3mL组分IV以及水。发酵培养前，培养基不经过灭菌处理，pH值调节至9.0，直接接种300mL活化后的种子液。

细胞生长的量化测量：细胞干重测量

1.使用精密分析天平称取50mL空离心管(移除管盖)的质量，记为m空管；

2.用第1步中的离心管收集一定体积(V)经摇瓶或发酵罐培养后的菌液，经10000×g离心10min收集菌体；

3.用无水乙醇洗涤菌体，以10000×g离心10min，弃去上清。此步骤对含有脂溶性碳源(如十二酸等)的培养液有必要。对只含有水溶性碳源(如葡萄糖等)的培养液，跳过此步骤；

4.用去离子水洗涤菌体，以10000×g离心10min，弃去上清；

5.将第4步得到的湿菌体置于-80℃低温冰箱预冷2h后，置于真空冷冻干燥机内干燥24h以完全除去水分；

6.使用精密分析天平称量第5步离心管(移除管盖)和管内干燥菌体的总质量，记为m总重。

7.细胞干重(CDW，cell dry weight，单位：g/L)直观反映了每升培养液中细胞总质量的多寡，计算公式如下：

结果显示：经过10个小时的发酵，本发明五升共轴双向旋转搅拌生物发酵罐中细胞生长干重达到了8克/升，在同样条件下，同向旋转搅拌生物发酵罐中细胞生长干重只能达到5克/升。经过24个小时的补料发酵，本发明共轴双向旋转搅拌生物发酵罐和同向旋转搅拌生物发酵罐中的细胞干重分别达到了18和10克/升。结果充分证明了本发明中共轴双向旋转搅拌生物发酵罐相对于同向旋转搅拌生物发酵罐来说，供氧优越性显著，细胞生长更好。

Claims (7)

1.一种发酵培养微生物的方法，其特征在于，所述方法利用共轴双向旋转搅拌生物发酵罐进行，所述共轴双向旋转搅拌生物发酵罐通过以单电机驱动共轴且旋向相反的搅拌桨，从而实现高效的混匀和氧气传递；

所述共轴双向旋转搅拌生物发酵罐由动力模块、传动模块、搅拌装置、固定支撑四部分组成：

所述动力模块包括电机(1)、联轴器(2)、内旋搅拌轴(3)：联轴器(2)一端与电机(1)同轴连接，另一端与内旋搅拌轴(3)联接，电机(1)通过联轴器(2)带动内旋搅拌轴(3)匀速转动，其中电机(1)为可以实现无级变速的正反转伺服电机；

所述传动模块包括内旋搅拌轴(3)、上锥齿轮(4)、中锥齿轮(5)、固定轴(7)、下锥齿轮(6)、外旋搅拌轴(8)：内旋搅拌轴(3)和上锥齿轮(4)固结在一起，中锥齿轮(5)和固定轴(7)固结在一起，下锥齿轮(6)和外旋搅拌轴(8)固结在一起，中锥齿轮(5)与上锥齿轮(4)、下锥齿轮(6)皆成90o安装，内旋搅拌轴(3)穿过空心外旋搅拌轴(8)实现共轴安装；

所述搅拌装置包括内旋搅拌轴(3)、外旋搅拌轴(8)、搅拌桨1(16)、搅拌桨2(14)、搅拌桨3(12)、轴承1(9)、轴承4(15)：搅拌桨1(16)固结于内旋搅拌轴(3)下部，搅拌桨2(14)固结于外旋搅拌轴(8)中部，搅拌桨3(12)固结于外旋搅拌轴(8)上部，轴承1(9)、轴承4(15)的内圈与内旋搅拌轴(3)固结，轴承1(9)、轴承4(15)的外圈和外旋搅拌轴(8)固结，这样即提高内外轴的刚度，又实现搅拌桨1(16)和搅拌桨2(14)、搅拌桨3(12)的正反向转动；

所述固定支撑包括传动模块箱体(10)、发酵罐本体(18)、轴承2(11)、轴承3(13)、轴承5(17)：发酵罐本体(18)通过轴承3(13)支撑外旋搅拌轴(8)，通过轴承5(17)支撑内旋搅拌轴(3)，传动模块箱体通过轴承2(11)支撑固定轴(7)。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内旋搅拌轴(3)正向转动，并通过上锥齿轮(4)和中锥齿轮(5)的啮合带动固定轴(7)匀速转动，固定轴(7)通过中锥齿轮(5)和下锥齿轮(6)的啮合带动空心外旋搅拌轴的匀速反向转动；且在一个电机的带动下，所述搅拌桨1(16)与搅拌桨2(14)、搅拌桨3(12)能实现共轴反向匀速转动搅拌，并通过伺服电机(1)的电压控制实现搅拌桨的无极变速。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述电机(1)安装于发酵罐上部，避免了安装在发酵罐底部导致的泄漏事故；所述电机(1)安装于发酵上部罐，并通过联轴器(2)与内旋搅拌轴(3)联接，在保证电机固定支撑的前提下，电机(1)也可以通过联轴器(2)与固定轴(7)相连。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述搅拌桨1(16)、搅拌桨2(14)、搅拌桨3(12)之间的轴向距离、桨叶长度、数量、类型可以调整，且不需要一致。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述滚动轴承1(9)、滚动轴承4(15)的内圈与内旋搅拌轴(3)、外旋搅拌轴(8)均过盈配合安装，这样内外轴可以相互旋转，且摩擦力很小。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述传动模块通过两对锥齿轮啮合实现内外轴的共轴反向转动，在实现共轴反向方面，也可以通过图2所示的平行轴轮系实现，在图2中齿轮1与齿轮2外啮合，齿轮2与齿轮3内啮合，齿轮1与齿轮3同轴反向，并可以通过调整齿轮1、齿轮2、齿轮3的齿数控制内外轴的转速比。

7.权利要求1～6任一所述的方法在需氧微生物发酵培养中的应用，其特征在于，使用所述共轴双向旋转搅拌生物发酵罐发酵培养所述需氧微生物前，培养基不经过灭菌处理，直接接种活化后的种子液即可。

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