CN116139150A - 小分子化合物lz-09在制备治疗和/或预防多发性硬化的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种小分子化合物LZ‑09在制备用于治疗和/或预防多发性硬化的药物中的应用。本发明采用H₂O₂损伤OLN‑93细胞作为神经细胞氧化应激模型，结果发现LZ‑09处理显著减弱了由H₂O₂引起的细胞活力下降。利用MOG35‑55诱导C57BL/6小鼠制作经典EAE模型，发现LZ‑09干预后显著降低了小鼠神经功能缺损症状评分并延缓了疾病进展，同时脊髓组织HE和LFB染色发现炎症浸润和脱髓鞘情况减轻。因此，所述化合物能够有效缓解多发性硬化的症状，可以作为治疗多发性硬化的药物，具有广阔的开发应用前景。

Description

小分子化合物LZ-09在制备治疗和/或预防多发性硬化的药物 中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是关于一种小分子化合物LZ-09在制备治疗和/或预防多发性硬化的药物中的应用。

背景技术

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病。本病最常累及的部位为脑室周围白质、视神经、脊髓、脑干和小脑，具有时间多发(DIT)和空间多发(DIS)的特点。其病因尚不明确，可能与遗传、环境、病毒感染等多种因素相关。MS好发于青少年，女性更为多见，全球约有两百多万人罹患此病，且在我国的发病率逐年提高。实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(experimentally allergicencephalomyelitis,EAE)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，是MS经典的实验动物模型。EAE动物模型是研究MS病理过程、发病机制的重要途经，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。

中文专利CN103800412A，公开日2014.05.21，公开了竹节参提取物作为多发性硬化药物的一种新用途，所述竹节参提取物是将中药竹节参先进行乙醇水溶液提取，再进行水饱和正丁醇萃取，最后进行丙酮沉淀得到的物质，该发明对于多发性硬化的预防和/或治疗具有重大的应用价值。中文专利CN104072389A，公开日2014.10.01，公开了一种用于制备治疗多发性硬化症药物的化合物，该化合物作为制备治疗MS病药物的应用，具有更好抗炎效果；降低或减少对肝脏和肾脏的副作用，不会产生致畸性；是神经病变(包括MS)潜在的治疗剂。

现阶段，多发性硬化尚无确切疗法，故提倡早期治疗：急性期治疗以减轻症状、尽快改善残疾程度为主；缓解期治疗即疾病修正治疗(DMT)，以降低复发率、减少脑组织和脊髓病灶数目、延缓疾病进程，以及提高患者生活质量为主。目前，中国获批上市的DMT药物有口服特立氟胺、芬戈莫德、西尼莫德和注射用重组人β-1b干扰素。但这些药物价格高昂、副作用明显且疗效有局限性，部分患者虽规范用药但仍然无法控制疾病进展，故在临床应用中存在诸多问题。因此，寻找一种价格低廉、无副作用的药物是治疗MS的研究重点。

而目前关于本发明中的小分子化合物LZ-09在制备治疗和/或预防多发性硬化的药物中的应用还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种小分子化合物LZ-09在制备治疗和/或预防多发性硬化疾病的药物中的应用。

本发明的第二个目的是，提供一种制剂。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

如式(I)所示的小分子化合物LZ-09在制备治疗和/或预防小胶质细胞介导的疾病药物中的应用，所述的小分子化合物LZ-09为3-(3-(2,4-二氟苯基-)-3--羟基-4-(1H-1,2,4-三氮唑-1-基)丁-2-基)-6-碘苯并[d][1,2,3]三嗪-4(3H)-酮

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种小胶质细胞介导的神经炎症性疾病预防和/或治疗的制剂，所述制剂包括权利要求1所述的小分子化合物LZ-09或至少一种其药物上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

作为一个优选例，所述的制剂包括片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、注射液、脂质体或气雾剂中的一种或多种。

本发明优点在于：

1、本发明公开了小分子化合物LZ-09在制备用于治疗和/或预防多发性硬化的的药物中的应用，对于多发性硬化的药物开发及应用具有重要意义。

2、本发明采用H₂O₂损伤OLN-93细胞作为神经细胞氧化应激模型，将不同浓度的LZ-09与H₂O₂损伤的OLN-93细胞共同培养，观察细胞增殖情况及LZ-09的神经保护作用，结果发现LZ-09处理显著减弱了由H₂O₂引起的细胞活力下降。本发明还利用MOG35-55诱导C57BL/6小鼠制作经典EAE模型，评估LZ-09对EAE模型的防治作用。结果发现EAE小鼠出现体质量下降，肢体不协调甚至残疾等症状，脊髓组织HE和LFB染色发现有炎症浸润和脱髓鞘发生。给予LZ-09治疗后，降低了小鼠神经功能缺损症状评分并延缓了疾病进展，同时脊髓组织HE和LFB染色发现炎症浸润和脱髓鞘发生降低。以上结果说明LZ-09能够有效缓解多发性硬化的症状，可以作为治疗多发性硬化的药物，具有广阔的开发应用前景。

附图说明

图1为LZ-09对OLN-93细胞存活率的影响；

图2为各浓度H₂O₂对OLN-93细胞存活率影响(与空白组相比，*P<0.05,**P<0.01)；

图3为不同浓度LZ-09对H₂O₂损伤OLN-93细胞的存活率的影响(与对照组相比，**P<0.01)；

图4为各组小鼠神经功能缺损评分的比较(与EAE模型组比较*P<0.05)；

图5为各组小鼠脊髓组织苏木精-伊红染色图片(×200)；

图6为各组小鼠脊髓组织劳克坚牢蓝染色图片(×20)。

具体实施方式

作为一个优选例，下述实施例中用于治疗和/或预防小胶质细胞介导的疾病小分子化合物LZ-09为(E)-3-(3,4-二羟基苯基)-N-(4-氟苯乙基)丙烯酰胺(式I)，

本领域技术人员可以理解的是，3-(3-(2,4-二氟苯基-)-3--羟基-4-(1H-1,2,4-三氮唑-1-基)丁-2-基)-6-碘苯并[d][1,2,3]三嗪-4(3H)-酮为商业购买筛选获得的化合物产品。

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.药物配置

LZ-09粉末用药学上可接受的载体配制成为1g/L的母液。

2.细胞培养

OLN-93细胞正常培养用DMEM高糖培养基中补充10％热灭活胎牛血清(FBS)于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养，每2～3天更换培养液。根据细胞生长情况，取合适的细胞液进行培养传代。

3.细胞分组与给药

将OLN-93细胞分为空白组和实验组，实验组分别加入浓度为1、10、50μg/ml的LZ-09，空白组加入等量的DMSO，继续培养细胞。

4.CCK-8法检测细胞活力

OLN-93细胞均匀接种至96孔板中，按照上述方法进行分组和给药处理；培养24h后，按说明书要求加入CCK-8溶液，继续培养4h，然后用酶标仪在450nm处检测各孔光密度(OD)值，再统计每组的细胞存活率。

5.CCK8法检测LZ-09对H2O2损伤细胞的存活率的影响

按照步骤4同样的方法接种细胞，继续培养24h后，弃去上清，加入终浓度分别为50、100、150μg/ml的H₂O₂作用12h后，按照上述方法在450nm处测定吸光度值，计算细胞存活率。最终确定H₂O₂的损伤浓度为100μg/m，并将其作为对照组，实验组分别加入浓度为1、10、50μg/ml的LZ-09，作用2h后，再加入终浓度为100μg/ml的H₂O₂，继续作用12h，按照上述方法在450nm处测定吸光度值，计算细胞存活率。

6.实验结果

CCK-8检测显示与对照组相比，不同浓度LZ-09处理OLN-93细胞后，其细胞活力无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，表明LZ-09对少突胶质细胞活力无影响(图1)。H₂O₂作用后发现其对细胞的损伤呈现一定的浓度依赖性，并随着过氧化氢浓度增加损伤程度增大，在100μg/m损伤率达到约55％(H₂O₂作用12h)，故选用浓度为100μg/ml的H₂O₂的进行下一步药效实验(图2)。而不同浓度的LZ-09(1、10、50μg/ml)处理则显著减弱了由H₂O₂引起的细胞活力下降(图3)。

实施例2

1.造模方法

EAE模型的诱导按目前公认的方法进行。将MOG33-35粉末溶解于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)中至质量浓度为2.5mg·mL^-1，与等体积CFA和结核分枝杆菌(H37RA)混合，使得结核杆菌质量浓度保持在4mg·mL^-1，采用电动匀浆制成乳白色油包水样抗原乳液。在小鼠背部腰脊两侧皮下分4点注射抗原乳剂，共200μL/只，将免疫当天记录为第0天，并于第0天及第2天，腹腔注射百日咳毒素(PTX)500ng/只。

2.动物分组、用药及神经功能评分

8～10周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠，实验前小鼠自由饮食喂养1周。随机分为正常对照组、EAE组和LZ-09干预组，每组9只。除对照组外，其他组按上述方式造模。LZ-09干预组在小鼠EAE造模后从免疫当日开始，每天2次按20mg/kg腹腔注射LZ-09，正常对照组和EAE组用等量生理盐水代替LZ-09。每日同时间给药并记录神经功能评分。神经功能评分标准如下：0分，无临床症状；1分，尾部拖地，轻度后肢无力；2分，中度后肢无力；3分，重度双后肢无力；4分，四肢全瘫；5分，抽搐、濒死或死亡。如小鼠的症状处于两评分标准之间，据实际±0.5计分。小鼠神经功能评分≥1分，即为发病。

3.组织学染色

各组动物在免疫后发病高峰期(第21d)通过腹腔注射2％戊巴比妥钠(50mg/kg,2.5m L/kg)麻醉小鼠，冰上取小鼠脊髓组织于灭菌EP管中，液氮速冻后-80℃冰箱保存。分别取EAE模型组和LZ-09干预组部分脊髓组织经4％多聚甲醛固定、石蜡包埋后切片，每隔25μm间断连续切片，进行苏木精-伊红染色(HE)染色和劳克坚劳蓝(luxol fastblue,LFB)染色。光镜下观察炎症浸润和脊髓脱髓鞘病变区域。

4.实验结果

(1)LZ-09对EAE模型小鼠神经功能评分影响

神经功能评分结果(图1)显示，正常对照组活动正常，无临床症状，EAE模型组在造模第9天起开始相继发病，可见小鼠精神萎靡，饮食活动减少，并逐渐出现神经功能损伤症状，表现为尾尖拖地或全尾瘫痪，步履蹒跚，单侧或双侧后肢瘫痪，前肢瘫痪甚至全身瘫痪。与EAE模型组相比，LZ-09干预组在给药第12～21天平均临床评分显著低于EAE组平均临床评分(P<0.05)，提示LZ-09可有效降低EAE小鼠的临床评分。

(2)LZ-09对EAE小鼠脊髓组织炎症浸润及脱髓鞘的影响

HE和LFB染色结果显示，EAE模型组小鼠脊髓组织炎症细胞浸润明显，发现大量单核细胞聚集，小鼠脱髓鞘病变明显，髓鞘组织发生脱失，结构密度疏松；LZ-09干预组小鼠脊髓组织单核细胞浸润聚集数量和区域明显减少，小鼠脊髓组织结构连接紧密，髓鞘组织没有发生明显的脱髓鞘病变，见图2、图3。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.小分子化合物LZ-09(式I)在制备治疗和/或预防多发性硬化的药物中的应用，其特征在于，所述小分子化合物为3-(3-(2,4-二氟苯基-)-3--羟基-4-(1H-1,2,4-三氮唑-1-基)丁-2-基)-6-碘苯并[d][1,2,3]三嗪-4(3H)-酮。

2.一种治疗和/或预防多发性硬化的药物制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求1所述小分子化合物LZ-09和至少一种其药物上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述制剂包括片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、注射液、脂质体或气雾剂中的一种或多种。

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