CN116138164A - 一种非洲菊壮苗培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种非洲菊壮苗培育方法，包括以下步骤：Ⅰ.将非洲菊组培苗接种于生根培养基进行培养。Ⅱ.选择步骤Ⅰ培养后的非洲菊组培苗移栽于栽培基质。Ⅲ.定期为移栽于栽培基质的非洲菊组培苗浇灌菌悬液。该菌悬液的制备过程为，取在PDB液体培养基培养后的印度梨形孢菌液，离心后用ddH2O清洗，加入ddH2O并搅碎，调节吸光值。Ⅳ.对非洲菊幼苗进行缓苗处理。Ⅴ.将缓苗处理后的非洲菊幼苗充分浇透后采用自然干旱处理，干旱处理至非洲菊幼苗完全展开第三片叶。经过本发明非洲菊幼苗培育方法培育的非洲菊无论在冬天持续低温还是在夏天棚内高温等情况下，产量与切花品质都能保持稳定，在市场竞争中优势明显。
Description
技术领域
本发明涉及植物培育方法，具体涉及一种非洲菊壮苗培育方法。
背景技术
非洲菊（Gerbera jamesoniiL.）又名扶郎花，为菊科大丁草属多年生草本花卉，是世界五大鲜切花之一，是具有重要经济观赏价值的园艺植物。由于在实际生产中，非洲菊大多采用露地或简易大棚栽培，冬天的持续低温和夏天的棚内高温等原因均可导致非洲菊产量和切花品质下降，造成损失。
而印度梨形孢（Piriformospora indica）是印度科学家Verma在西北部沙漠地区灌木丛根部分离出的一种内生真菌，属于担子菌门层菌纲梨形孢属，其与丛枝菌根真菌的功能特性极为相似，在寄主植物的根际定殖，并产生复杂的互利共生作用。在如公开号为CN107155896B、CN108668896B等中国发明专利或者如本申请人在先申请的公开号为CN110235665A中国发明专利申请中公开了印度梨形孢有助于促进非洲菊生长和提高气抵御生物和非生物逆境胁迫的耐受力，但是仅通过上述公开的技术手段还是难以很好解决非洲菊栽培中遇到冬天的持续低温和夏天的棚内高温等原因导致非洲菊产量和切花品质下降的问题。
发明内容
本发明提供一种非洲菊壮苗培育方法，以解决上述问题。
本发明采用如下技术方案：
一种非洲菊壮苗培育方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将非洲菊组培苗接种于生根培养基进行培养。
Ⅱ.选择步骤Ⅰ培养后的非洲菊组培苗移栽于栽培基质。
Ⅲ.定期为移栽于栽培基质的非洲菊组培苗浇灌菌悬液。
该菌悬液的制备过程为，取在PDB液体培养基培养后的印度梨形孢菌液，离心后用ddH2O清洗，加入ddH2O并搅碎，调节吸光值。
Ⅳ.对浇灌菌悬液结束后的非洲菊幼苗进行缓苗处理。
Ⅴ.将缓苗处理后的非洲菊幼苗充分浇透后采用自然干旱处理，干旱处理至非洲菊幼苗完全展开第三片叶。
进一步地：
上述步骤Ⅰ的培养过程包括以下步骤：
ⅰ.预先在28℃的PDA培养基上在黑暗条件下培养印度梨形孢，培养时间两周。
ⅱ.在25℃/20℃（亮/暗）条件下在上述生根培养基培养非洲菊组培苗，其中光周期为16h，光强度为100μmolm-2s-1。上述生根培养基为含有浓度为0.5mg/L的NAA、0.5mg/L的激动素以及质量分数为1.5%的蔗糖、0.2%的活性炭、0.7%的琼脂的1/2*MS培养基，生根培养基PH为5.8。
ⅲ.上述非洲菊组培苗生根14d后，从预先培养有印度梨形孢的PDA培养基边缘取下印度梨形孢菌块与该非洲菊组培苗共同培养。
上述步骤Ⅲ中每周一次为每株非洲菊组培苗浇灌50ml上述菌悬液，浇灌四次。
上述步骤Ⅲ持续30d，步骤Ⅲ培养条件为温度25℃、湿度70%-75%、白天光照12h。上述步骤Ⅱ中的上述栽培基质由泥炭土、黄土、珍珠岩以质量比3∶1∶1配成。
上述步骤Ⅲ中的上述菌悬液的制备过程中印度梨形孢菌液在PDB液体培养基培养14d，离心为4℃、8000g离心15min，ddH2O清洗清洗三遍，吸光值调节为OD600至0.8。
上述步骤Ⅳ的上述缓苗处理持续7d。
上述步骤Ⅴ的上述自然干旱处理持续14d。
上述步骤Ⅳ包括在进行上述缓苗处理前抽取非洲菊新鲜根部并对印度梨形孢是否浸染非洲菊根部进行鉴别。该鉴别包括RT-PCR鉴别，RT-PCR鉴别所用引物序列分别为PiTef1-F（5'-GGCCACCGTGACTTTATCAAGAAC-3’）、PiTef1-R（5’-TTCCTTGACGATTTCGTTGAAGCG-3’）和GjActin-F（5’-ATGGTGAACTCCCACACTCAGAAG-3’）、GjActin-R（5’-CAGGATGAAGATGAGGATGACAAGA-3’）。
上述抽取非洲菊新鲜根部为随机抽出非洲菊幼苗并采集其健康新鲜的根部样本，迅速放入液氮，混合均匀后磨样，置于-80℃冰箱低温保存。
上述鉴别还包括染色鉴别。该染色鉴别为将根部切片先用体积分数为2%的氢氧化钾浸泡3min，再用体积分数为0.05%的台盼蓝染色7min，再用ddH2O缓慢冲洗后制片，用光学显微镜观察印度梨形孢在非洲菊幼苗根部的定殖情况。
由上述对本发明的描述可知，和现有技术相比，本发明具有如下优点：
经本申请人研究发现，非洲菊培育中，冬天的持续低温和夏天的棚内高温等原因会造成非洲菊干旱或者间歇性干旱。本发明通过印度梨形孢有助于促进植物生长和提高气抵御生物和非生物逆境胁迫的耐受力，即通过步骤Ⅲ中浇灌令印度梨形孢在非洲菊幼苗根部定殖，促进非洲菊幼苗生长、提高非洲菊幼苗抗干旱能力，令非洲菊幼苗能够大概率可以承受一定程度干旱胁迫，再配合缓苗后的步骤Ⅴ自然干旱处理，刺激非洲菊幼苗SOD、POD、CAT活性和渗透调节物质的累积，令非洲菊无论在冬天持续低温还是在夏天棚内高温等情况下，产量与切花品质都能保持稳定。并且该步骤Ⅴ自然干旱处理能够人为筛选出具备能够在非洲菊未来培育中的冬天持续低温和夏天棚内高温等情况下保证产量和切花品质的个体。
而本发明进一步方案中，本发明通过在步骤Ⅰ的非洲菊生根培养基培养阶段与印度梨形孢菌块共同培养，提升非洲菊个体对一定程度的耐受能力，令非洲菊个体对后续培育过程的耐受力更强且能够进一步保证非洲菊未来培育中的冬天持续低温和夏天棚内高温等情况下的产量和切花品质。步骤Ⅴ自然干旱处理循序渐进起到炼苗作用，令本发明的非洲菊幼苗培育方法培育的非洲菊在冬夏以高产量高品质获取极大市场竞争优势。而两次印度梨形孢的加入方式，在自然干旱处理前最大程度提升植株个体耐受力，而且组合起来在特定阶段增强印度梨形孢效果，进而利用其促生作用促进植株生成，提升培育效率。
附图说明
图1为本发明的非洲菊幼苗培育方法中步骤Ⅲ浇灌对比示意图。
图2为本发明的非洲菊幼苗培育方法中步骤Ⅴ自然干旱处理效果对比示意图。
图3为本发明的非洲菊幼苗培育方法中RT-PCR鉴别结果对比示意图。
图4为本发明的非洲菊幼苗培育方法中染色鉴别结果示意图。
具体实施方式
下面参照附图说明本发明的具体实施方式。
一种非洲菊壮苗培育方法，包括以下步骤：
Ⅰ.将非洲菊组培苗接种于生根培养基进行培养。
该培养过程包括以下步骤：
ⅰ.预先在28℃的PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基上在黑暗条件下培养印度梨形孢，培养时间两周。
ⅱ.在25℃/20℃（亮/暗）条件下在上述生根培养基培养非洲菊组培苗，其中光周期为16h，光强度为100μmolm-2s-1。即一天24h中16h光照且温度为25℃，其余8h黑暗且温度为20℃。上述生根培养基为含有浓度为0.5mg/L的NAA（α-NAA）、0.5mg/L的激动素以及质量分数为1.5%的蔗糖、0.2%的活性炭、0.7%的琼脂的1/2*MS（Murashige and Skoog）培养基，生根培养基PH为5.8。本具体实施方式中，非洲菊组培苗以云南农科院的云南红非洲菊组培苗为材料，该云南红是我国最受欢迎的红花切花品种之一。
ⅲ.上述非洲菊组培苗生根14d后，从预先培养有印度梨形孢的PDA培养基边缘取下印度梨形孢菌块与该非洲菊组培苗共同培养。
上述培养后，抽取非洲菊幼苗新鲜根部并对印度梨形孢是否浸染非洲菊组培苗根部进行鉴别。该鉴别包括RT-PCR鉴别与染色鉴别，优选此处采用染色鉴别，RT-PCR鉴别参考后序描述。该染色鉴别为将根部切片先用体积分数为2%的氢氧化钾浸泡3min，再用体积分数为0.05%的台盼蓝染色7 min，再用ddH2O缓慢冲洗三四遍后制片，用BX53光学显微镜观察印度梨形孢在非洲菊幼苗根部的定殖情况，具体观察非洲菊根部（距根尖3-5cm）中的厚垣孢子。
Ⅱ.选择步骤Ⅰ培养后的非洲菊组培苗移栽于栽培基质。
上述栽培基质由泥炭土、黄土、珍珠岩以质量比3∶1∶1配成。
本具体实施方式中，设置对照组来对比本发明非洲菊幼苗培育方法效果。即具体的，选取48株长势均匀且大致一致的非洲菊组培苗分别移栽于48个直径9cm、高8cm的塑料盆中。将48株非洲菊组培苗分成两组，一组为处理组，一组为对照组。
Ⅲ.定期为移栽于栽培基质的非洲菊组培苗浇灌菌悬液。该浇灌过程中非洲菊组培苗培养条件为温度25℃、湿度70%-75%、白天光照12h（即12小时/每天）。
该菌悬液的制备过程为，取在PDB液体培养基培养后的印度梨形孢菌液，离心后用ddH2O清洗，加入ddH2O并搅碎，调节吸光值。优选的，菌悬液的制备过程中印度梨形孢菌液在PDB液体培养基培养14d，离心为4℃、8000g离心15min，ddH2O清洗清洗三遍，吸光值调节为OD600至0.8。该菌悬液可以预先制备存放。
该定期优选为每周一次，且每次每株非洲菊组培苗浇灌50ml上述菌悬液。浇灌过程大致持续30d（即30天），大致浇灌四次。该浇灌处理为针对上述处理组24株的非洲菊组培苗处理，对照组24株的非洲菊组培苗则同时且等量浇灌ddH2O。
参考图1，30d浇灌结束后，由处理组与对照组随机抽取数株非洲菊幼苗进行比对，处理组非洲菊幼苗比对照组植株更粗壮、叶片更绿、生长更旺盛。
对抽取的处理组与对照组非洲菊幼苗进行具体称量，比对结果如下表：
注：* 表示0.05 水平差异显著，** 表示0.01 水平差异显著。
Ⅳ.对浇灌菌悬液结束后的非洲菊幼苗进行缓苗处理，缓苗处理持续7d。
即无论是浇灌菌悬液结束后的处理组24株的非洲菊组培苗，还是浇灌ddH2O结束后的对照组24株的非洲菊组培苗，均同步以同等条件进行后序处理。
上述缓苗处理前抽取非洲菊幼苗新鲜根部并对印度梨形孢是否浸染非洲菊幼苗根部进行鉴别。优选的，该抽取非洲菊幼苗新鲜根部为随机抽出非洲菊幼苗并采集其健康新鲜的根部样本，迅速放入液氮，混合均匀后磨样，置于-80℃冰箱低温保存。
该鉴别包括RT-PCR鉴别与染色鉴别，其中RT-PCR鉴别可以更加准确确定印度梨形孢是否浸染非洲菊幼苗根部，便于掌控非洲菊培育过程以及推动培育技术进步等；而染色鉴别操作方便快捷，三五分钟即可确定，有助于在大规模培育非洲菊中对培育过程的控制，避免如印度梨形孢浸染失败导致非洲菊培育失败损失以及如后续缓苗、自然干旱处理等操作的浪费等等。
参考图3，具体的，该RT-PCR鉴别操作为：
第一，提取非洲菊幼苗根部总RNA，优选采用Triol法分别提取处理组与对照组非洲菊根部组织RNA。
第二，由非洲菊根部总RNA合成cDNA。该合成为通过SMART一步法逆转录cDNA，具体应用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成。
第三，设计并合成引物。上述引物包括PiTef1-F、PiTef1-R、GjActin-F、GjActin-R，PiTef1-F、PiTef1-R为用于鉴别的引物，GjActin-F、GjActin-R为用于对照的引物。其中，PiTef1-F的核苷酸序列为5'-GGCCACCGTGACTTTATCAAGAAC-3’。PiTef1-R的核苷酸序列为5’-TTCCTTGACGATTTCGTTGAAGCG-3’。GjActin-F的核苷酸序列为5’-ATGGTGAACTCCCACACTCAGAAG-3’。GjActin-R的核苷酸序列为5’-CAGGATGAAGATGAGGATGACAAGA-3’。引物通过外部合作公司合成。
第四，以上述cDNA为模板，分别加入用于鉴别的引物以及用于对照的引物进行PCR扩增，分别获得扩增产物。即如将上述cDNA分别两份，分别进行PCR扩增。两个PCR扩增中一个采用PiTef1-F、PiTef1-R且另一个采用GjActin-F、GjActin-R。
第四中每一上述PCR扩增中加入的上述模板体积为1μL，重量为500ng。每一该PCR扩增中加入的两种上述引物的体积均为1μL，四种引物的浓度均为10mmol/L。每一该PCR扩增中还加入10µL的2*Taq Master Mix for PAGE以及12µL的ddH2O。
第四中的上述PCR扩增的反应流程为先94℃预变性2min，然后94℃变性30s退火30s72℃延伸2min并重复30个循环，最后72℃再延伸4min。
第五，分别电泳检测上述扩增产物获取鉴别结果，如分别将扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
参考图3，若采用GjActin-F、GjActin-R引物进行扩增的扩增产物出现234bp大小的阳性对照的引物条带且采用PiTef1-F、PiTef1-R引物进行扩增的扩增产物出现570bp大小的阳性条带，则表示非洲菊新鲜根部被印度梨形孢定殖。而如果仅有234bp大小的阳性对照的引物条带，而无570bp大小的阳性条带则说明非洲菊新鲜根部没有被印度梨形孢定殖。若采用GjActin-F、GjActin-R引物进行扩增的扩增产物没有出现234bp大小的阳性对照的引物条带，则鉴别结果无效。而后续常见的还有将570bp大小的阳性条带切胶回收进行基因测序，以排除如两个引物发生自连而产生的引物二聚体出现假阳性等。
参考图4，具体的，该染色鉴别为将根部切片先用体积分数为2%的氢氧化钾浸泡3min，再用体积分数为0.05%的台盼蓝染色7 min，再用ddH2O缓慢冲洗三四遍后制片，用BX53光学显微镜观察印度梨形孢在非洲菊幼苗根部的定殖情况。其中，图4为印度梨形孢在非洲菊根部的定殖（400倍）示意图。
Ⅴ.将缓苗处理后的非洲菊幼苗充分浇透后采用自然干旱处理，干旱处理至非洲菊幼苗完全展开第三片叶，自然干旱处理大致持续14d。
参考图2，14d自然干旱处理结束后，由处理组与对照组随机抽取数株非洲菊幼苗进行比对，对照组非洲菊幼苗叶片出现了严重萎蔫与褪绿，处理组非洲菊幼苗叶片轻微下垂，褪绿现象不明显。即经过前序步骤处理可以令非洲菊幼苗能够承受该自然干旱处理，在本发明非洲菊幼苗培育方法大规模应用中避免在该自然干旱处理造成损失。而经过本发明非洲菊幼苗培育方法培育的非洲菊无论在冬天持续低温还是在夏天棚内高温等情况下，产量与切花品质都能保持稳定，在市场竞争中优势明显。
上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
<110>三明市农业科学研究院
<120>一种非洲菊壮苗培育方法
<160>4
<170>
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物PiTef1-F
<222>
<223>
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ggccaccgtg actttatcaa gaac
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物PiTef1-R
<222>
<223>
<400>2
ttccttgacg atttcgttga agcg
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物GjActin-F
<222>
<223>
<400>3
atggtgaact cccacactca gaag
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>引物GjActin-R
<222>
<223>
<400>4
caggatgaag atgaggatga caaga
Claims (10)
1.一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：包括以下步骤：
Ⅰ.将非洲菊组培苗接种于生根培养基进行培养；
Ⅱ.选择步骤Ⅰ培养后的非洲菊组培苗移栽于栽培基质；
Ⅲ.定期为移栽于栽培基质的非洲菊组培苗浇灌菌悬液；
该菌悬液的制备过程为，取在PDB液体培养基培养后的印度梨形孢菌液，离心后用ddH2O清洗，加入ddH2O并搅碎，调节吸光值；
Ⅳ.对浇灌菌悬液结束后的非洲菊幼苗进行缓苗处理；
Ⅴ.将缓苗处理后的非洲菊幼苗充分浇透后采用自然干旱处理，干旱处理至非洲菊幼苗完全展开第三片叶。
2.根据权利要求1所述的一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：所述步骤Ⅰ的培养过程包括以下步骤：
ⅰ.预先在28℃的PDA培养基上在黑暗条件下培养印度梨形孢，培养时间两周；
ⅱ.在25℃/20℃（亮/暗）条件下在所述生根培养基培养非洲菊组培苗，其中光周期为16h，光强度为100μmolm-2s-1；所述生根培养基为含有浓度为0.5mg/L的NAA、0.5mg/L的激动素以及质量分数为1.5%的蔗糖、0.2%的活性炭、0.7%的琼脂的1/2*MS培养基，生根培养基PH为5.8；
ⅲ.所述非洲菊组培苗生根14d后，从预先培养有印度梨形孢的PDA培养基边缘取下印度梨形孢菌块与该非洲菊组培苗共同培养。
3.根据权利要求1所述的一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：所述步骤Ⅲ中每周一次为每株非洲菊组培苗浇灌50ml所述菌悬液，浇灌四次。
4.根据权利要求3所述的一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：所述步骤Ⅲ持续30d，步骤Ⅲ培养条件为温度25℃、湿度70%-75%、白天光照12h；所述步骤Ⅱ中的所述栽培基质由泥炭土、黄土、珍珠岩以质量比3∶1∶1配成。
5.根据权利要求1所述的一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：所述步骤Ⅲ中的所述菌悬液的制备过程中印度梨形孢菌液在PDB液体培养基培养14d，离心为4℃、8000g离心15min，ddH2O清洗清洗三遍，吸光值调节为OD600至0.8。
6.根据权利要求1所述的一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：所述步骤Ⅳ的所述缓苗处理持续7d。
7.根据权利要求1所述的一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：所述步骤Ⅴ的所述自然干旱处理持续14d。
8.根据权利要求2-7任一所述的一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：所述步骤Ⅳ包括在进行所述缓苗处理前抽取非洲菊新鲜根部并对印度梨形孢是否浸染非洲菊根部进行鉴别；该鉴别包括RT-PCR鉴别，RT-PCR鉴别所用引物序列分别为PiTef1-F（5'-GGCCACCGTGACTTTATCAAGAAC-3’）、PiTef1-R（5’-TTCCTTGACGATTTCGTTGAAGCG -3’）和GjActin-F（5’-ATGGTGAACTCCCACACTCAGAAG-3’）、GjActin-R（5’-CAGGATGAAGATGAGGATGACAAGA-3’）。
9.根据权利要求8所述的一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：所述抽取非洲菊新鲜根部为随机抽出非洲菊幼苗并采集其健康新鲜的根部样本，迅速放入液氮，混合均匀后磨样，置于-80℃冰箱低温保存。
10.根据权利要求8所述的一种非洲菊壮苗培育方法，其特征在于：所述鉴别还包括染色鉴别；该染色鉴别为将根部切片先用体积分数为2%的氢氧化钾浸泡3min，再用体积分数为0.05%的台盼蓝染色7min，再用ddH2O缓慢冲洗后制片，用光学显微镜观察印度梨形孢在非洲菊幼苗根部的定殖情况。
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