CN116124912A - 17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学药物分析方法技术领域，尤其是涉及一种17‑碘‑雄甾‑5,16‑二烯‑3β‑醇有关物质的检测方法和应用。17‑碘‑雄甾‑5,16‑二烯‑3β‑醇有关物质的检测方法，包括如下步骤：采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；所述高效液相色谱的检测条件包括：色谱柱：Agilent 5TC‑C18(2)；柱温：40℃；检测波长为198～202nm；以水作为流动相A，乙腈作为流动相B，进行一定梯度洗脱；梯度洗脱的流速为0.8～1.0mL/min。本发明的检测方法，能够实现一次性高效分离17‑碘‑雄甾‑5,16‑二烯‑3β‑醇中所控的多种有关物质，且专属性强，耐用性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及化学药物分析方法技术领域，尤其是涉及一种17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法和应用。
背景技术
17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇是由表雄酮-17-腙经碘代后生成的，其合成路线如下所示：
17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇作为中间体，如果其本身含有杂质，那么在进行原料药生产过程中，由于杂质的存在会影响原料药的质量。因此，对于17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇中的杂质控制至关重要。并且研究发现，根据17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的合成工艺路线，其中存在的杂质由于方方面面的原因，极性相近且极性均较低，不易进行分离检测，造成其杂质控制存在较大的难度。并且，目前各国药典均未收载17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，可一次性高效分离17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇及多种有关物质。
本发明的另一目的在于提供17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法在17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的质量控制中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；
所述高效液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)；
柱温：40℃；
检测波长为198～202nm；
以水作为流动相A，乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱的流速为0.8～1.0mL/min；
所述梯度洗脱的过程包括：
在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱的过程包括：
在本发明的具体实施方式中，所述有关物质包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中的至少两种、至少三种或四种；结构式分别如下：
其中，有关物质Ⅰ分子式为C19H30N2O，分子量为302.46；有关物质Ⅱ分子式为C19H28O2，分子量为288.42；有关物质Ⅲ分子式为C19H28I2O，分子量为526.24；有关物质Ⅳ分子式为C38H56N2O2，分子量为572.88；根据17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇合成工艺，对17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇中含有的有关物质进行控制，通过本发明的高效液相色谱检测条件，可以实现一次性高效的分离出上述多种有关物质，建立17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质研究方法。
根据17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇合成工艺路线，研究杂质性质，发现有关物质Ⅳ是由有关物质Ⅰ和有关物质Ⅱ缩合生成，有关物质Ⅰ和有关物质Ⅱ母体(甾体)较大，且醛和腙均为给电子共轭体系，故两者极性相差较小；有关物质Ⅳ为对称分子，极性较低，有关物质Ⅲ和17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇由于与碘相连，碘的电子云较为分散，可使整个分子体系共轭，进而导致有关物质Ⅲ和17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇极性降低，故三者极性相近且均较低。采用本发明的高效液相色谱检测方法，能够在保证各有关物质与有效成分高效分离的基础上，使其有良好的重复性与准确度，从而更好地实现17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的质量控制。
在本发明的具体实施方式中，所述检测波长可以为198nm、199nm、200nm、201nm、202nm等等，优选为199～201nm，更优选为200nm。
在实际操作中，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。
在本发明的具体实施方式中，所述流速为0.9～1.0mL/min，优选为1.0mL/min。
如在不同实施方式中，所述流速可以为0.9mL/min、0.92mL/min、0.94mL/min、0.95mL/min、0.96mL/min、0.98mL/min、1.0mL/min等等。
在本发明的具体实施方式中，所述供试品溶液的进样量可以为5～20μL，如5μL、10μL、15μL或20μL。
在本发明的具体实施方式中，所述检测条件包括：
色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)，4.6mm×250mm，5μm；
柱温：40℃；
检测波长为200nm；
梯度洗脱的流速为1.0mL/min；
所述梯度洗脱的过程包括：
在本发明的具体实施方式中，所述供试品溶液的制备包括：采用甲醇溶解所述供试品。如在不同实施方式中，所述供试品溶液中，17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的浓度可以为0.5～5mg/mL，如可以为1mg/mL。在实际操作中，供试品溶液中17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的浓度不局限于此。
在本发明的具体实施方式中，所述供试品包括含17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的中间体。
在本发明的具体实施方式中，所述方法还包括：采用自身对照法对所述供试品中的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇和/或有关物质的含量进行计算。
在本发明的具体实施方式中，所述自身对照法包括：
将供试品溶液、对照溶液分别注入高效液相色谱仪，在所述高效液相色谱的检测条件下测定相应的色谱，以自身对照法计算得到所述供试品中17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇和/或有关物质的含量。
本发明还提供了上述任意一种所述17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法在17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的质量控制中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的检测方法，能够实现一次性高效分离17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇中所控的四种有关物质，且专属性强，耐用性好，灵敏度高；
(2)本发明的检测方法可用于17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的质量控制中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的空白溶液的色谱图；
图2为本发明实施例1提供的有关物质Ⅰ定位溶液的色谱图；
图3为本发明实施例1提供的有关物质Ⅱ定位溶液的色谱图；
图4为本发明实施例1提供的有关物质Ⅲ定位溶液的色谱图；
图5为本发明实施例1提供的有关物质Ⅳ定位溶液的色谱图；
图6为本发明实施例1提供的三氯甲烷定位溶液的色谱图；
图7为本发明实施例1提供的系统适用性溶液的色谱图；
图8为本发明实施例1提供的供试品溶液的色谱图；
图9为本发明实施例提供的有关物质Ⅰ的线性关系图；
图10为本发明实施例提供的有关物质Ⅱ的线性关系图；
图11为本发明实施例提供的有关物质Ⅲ的线性关系图；
图12为本发明实施例提供的有关物质Ⅳ的线性关系图；
图13为本发明实施例提供的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的线性关系图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
具体实施方式中对系统适用性、检测限与定量限、重复性、线性与范围、准确度、溶液稳定性等项目的验证，按照《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》、《化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则》、《化学药物杂质研究技术指导原则》、《化学药物残留溶剂研究技术指导原则》以及现行版《中华人民共和国药典》附录中有关的指导原则进行方法学验证。
下述实施例中的系统适用性溶液主要是以17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇、有关物质Ⅰ、有关物质Ⅱ、有关物质Ⅲ和有关物质Ⅳ配制而成，实际检测中，将待检测样品2109101批17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇溶解稀释配制成供试品溶液即可。
实施例1
本实施例提供了17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，包括如下步骤：
(1)溶液配制
溶剂：甲醇；
空白溶液：甲醇；
有关物质Ⅰ的贮备液(1mg/mL)：取有关物质Ⅰ约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅱ的贮备液(1mg/mL)：取有关物质Ⅱ约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅲ的贮备液(1mg/mL)：取有关物质Ⅲ约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅳ的贮备液(1mg/mL)：取有关物质Ⅳ约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加2mL三氯甲烷超声使溶解，并用溶剂稀释至刻度，摇匀。
三氯甲烷的定位溶液：精密量取三氯甲烷溶液1mL，置25mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅰ的定位溶液(40μg/mL)：精密量取有关物质Ⅰ的贮备液0.4mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅱ的定位溶液(10μg/mL)：精密量取有关物质Ⅱ的贮备液0.1mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅲ的定位溶液(300μg/mL)：精密量取有关物质Ⅲ的贮备液3mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅳ的定位溶液(200μg/mL)：精密量取有关物质Ⅳ的贮备液2mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液(1mg/mL)：取待测样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照溶液(10μg/mL)：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液(待测样品1mg/mL、有关物质Ⅰ4μg/mL、有关物质Ⅱ1μg/ml、有关物质Ⅲ30μg/ml、有关物质Ⅳ20μg/ml)：取待测样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，精密量取有关物质Ⅰ的定位溶液、有关物质Ⅱ的定位溶液、有关物质Ⅲ的定位溶液、有关物质Ⅳ的定位溶液各1mL，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
(2)高效液相色谱检测条件
色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；
流动相A：纯化水；流动相B：乙腈；
按表1进行梯度洗脱；
流速：1.0mL/min；
检测波长：200nm；
柱温：40℃；
进样量：10μL。
表1梯度洗脱程序表(体积分数)
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 55 | 45 |
| 15 | 30 | 70 |
| 40 | 30 | 70 |
| 41 | 55 | 45 |
| 50 | 55 | 45 |
(3)检测步骤：
取空白溶液、对照溶液、系统适用性溶液、供试品溶液及各有关物质的定位溶液等各10μL，进样检测，具体进样顺序及针数要求见表2，记录色谱图。其中图1～图8分别不同溶液对应的的色谱图。
表2进样顺序及针数要求
实施例2～8
实施例2～8分别提供了17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的不同的检测方法，分别对实施例1中的检测方法的某个参数条件等进行改变得到的。具体的改变参数信息见表3。
表3实施例2～8改变的参数信息
| 编号 | 相较实施例1改变的参数 |
| 实施例2 | 柱温38℃ |
| 实施例3 | 柱温42℃ |
| 实施例4 | 流速0.9mL/min |
| 实施例5 | 流速1.1mL/min |
| 实施例6 | 波长199nm |
| 实施例7 | 波长201nm |
| 实施例8 | 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 4.6mm×250mm，5μm |
实施例1～8的测试结果见表4～7。
表4相对保留时间(相对主峰的相对保留时间)
| 编号 | 有关物质Ⅰ | 有关物质Ⅱ | 有关物质Ⅲ | 有关物质Ⅳ |
| 实施例1 | 0.18 | 0.32 | 0.84 | 0.88 |
| 实施例2 | 0.18 | 0.31 | 0.84 | 0.87 |
| 实施例3 | 0.18 | 0.32 | 0.85 | 0.89 |
| 实施例4 | 0.18 | 0.32 | 0.84 | 0.88 |
| 实施例5 | 0.18 | 0.32 | 0.85 | 0.88 |
| 实施例6 | 0.18 | 0.32 | 0.84 | 0.88 |
| 实施例7 | 0.18 | 0.32 | 0.84 | 0.88 |
| 实施例8 | 0.18 | 0.27 | 0.83 | 0.91 |
表5理论塔板数
表6拖尾因子
| 编号 | 主峰 | 有关物质Ⅰ | 有关物质Ⅱ | 有关物质Ⅲ | 有关物质Ⅳ |
| 实施例1 | 0.89 | 0.94 | 0.90 | 1.02 | 0.92 |
| 实施例2 | 0.97 | 1.08 | 1.49 | 1.10 | / |
| 实施例3 | 0.97 | 1.50 | 0.97 | 1.06 | / |
| 实施例4 | 0.91 | 0.95 | 0.91 | 1.04 | 0.93 |
| 实施例5 | 0.95 | 1.01 | 0.94 | 1.05 | 0.98 |
| 实施例6 | 0.89 | 0.93 | 0.91 | 1.02 | 0.92 |
| 实施例7 | 0.89 | 0.93 | 0.88 | 1.02 | 0.92 |
| 实施例8 | 0.79 | 1.05 | 0.91 | 0.84 | 0.75 |
表7分离度
| 编号 | 主峰 | 有关物质Ⅰ | 有关物质Ⅱ | 有关物质Ⅲ | 有关物质Ⅳ |
| 实施例1 | 3.83 | 9.62 | 2.19 | 1.97 | 1.78 |
| 实施例2 | 3.29 | 5.97 | 1.69 | 1.41 | 1.41 |
| 实施例3 | 3.08 | 6.76 | 1.81 | 1.73 | 1.24 |
| 实施例4 | 3.49 | 9.55 | 2.36 | 1.73 | 1.70 |
| 实施例5 | 3.32 | 8.92 | 1.82 | 1.70 | 1.46 |
| 实施例6 | 3.83 | 9.54 | 2.23 | 1.97 | 1.78 |
| 实施例7 | 3.83 | 10.13 | 2.21 | 1.97 | 1.78 |
| 实施例8 | 2.54 | 1.51 | 3.33 | 1.89 | 1.16 |
从上述结果可知，采用实施例1～8的检测条件下，空白溶液均不干扰主成分和有关物质的测定；
当改变流速(-0.1ml/min)、波长(±1nm)条件时，系统适用性溶液中，主峰及各已知有关物质峰与相邻有关物质峰之间分离度均不小于1.5，拖尾因子均不大于2.0，主峰理论板数均不小于5000，说明本发明的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质检测方法在改变流速(-0.1ml/min)、波长(±1nm)时耐用性良好；
当改变柱温(±2℃)时，系统适用性溶液中，有关物质Ⅲ与有关物质Ⅳ、有关物质Ⅳ与其后未知单杂之间分离度不符合要求，故该方法限定柱温40℃用于17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测；
当改变流速(+0.1ml/min)、更换不同类型色谱柱时，系统适用性溶液中，有关物质Ⅳ与其后未知单杂之间分离度不符合要求，故该方法限定色谱柱Agilent 5TC-C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)用于17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测；
因此本发明的检测方法能稳定有效地检测17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的有关物质。
比较例1
比较例1参考实施例1的检测方法，区别在于：梯度洗脱程序不同。
比较例1的梯度洗脱程序见表8。
表8梯度洗脱程序表(体积分数)
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 60 | 40 |
| 10 | 60 | 40 |
| 20 | 20 | 80 |
| 35 | 20 | 80 |
| 36 | 60 | 40 |
| 45 | 60 | 40 |
当采用上述梯度洗脱程序时，有关物质Ⅲ保留时间为28.590min，有关物质Ⅳ保留时间为29.627min，主峰保留时间为30.943min，仪器显示主峰纯度为988(纯品峰纯度对应1000)，峰不纯，在主峰保留时间内包含有关物质Ⅲ所带杂质，无法保证17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇及各已知有关物质与相邻有关物质之间的分离度。
实验例1
灵敏度试验
(1)溶液配制
溶剂：甲醇；
空白溶液：溶剂；
有关物质Ⅰ的定位溶液配制过程同实施例1；
有关物质Ⅱ的定位溶液、有关物质Ⅲ的定位溶液、有关物质Ⅳ的定位溶液、系统适用性溶液采用实施例1项下所配制的溶液。
17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇对照品贮备液(1mg/mL)：精密称取17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇10mg，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇对照品溶液(10μg/mL)：精密量取17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇对照品贮备液1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的定量限贮备液：即17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇对照品溶液。
有关物质Ⅰ的定量限贮备液(4μg/mL)：精密量取有关物质Ⅰ的定位溶液1mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅱ的定量限贮备液(1μg/mL)：精密量取有关物质Ⅱ的定位溶液1mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅲ的定量限贮备液(3μg/mL)：精密量取有关物质Ⅲ的定位溶液1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅳ的定量限贮备液(2μg/mL)：精密量取有关物质Ⅳ的定位溶液1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
定量限溶液(S/N≥10)：分别精密量取有关物质Ⅰ的定量限贮备液、有关物质Ⅱ的定量限贮备液、关物质Ⅲ的定量限贮备液、关物质Ⅳ的定量限贮备液、17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的定量限贮备液0.3mL、3.5mL、1.2mL、1.8mL、0.48mL，置同一10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
检测限溶液(S/N≥3)：精密量取定量限溶液3mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1。
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液及定量限溶液、检测限溶液各10μL，进样检测，记录色谱图。具体进样顺序及针数要求见表9。
表9进样顺序及针数要求
(4)分析结果
试验结果见表10～表15。
表10有关物质Ⅰ定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 0.0506 | 0.0494 | 0.0475 | 0.0466 | 0.0490 | 0.0486 | 0.0486 | 2.92 |
| 保留时间(min) | 6.017 | 6.020 | 6.030 | 6.037 | 6.040 | 6.030 | 6.029 | 0.15 |
| S/N | 24.9 | 17.6 | 22.2 | 24.1 | 18.6 | 19.6 | / | / |
表11有关物质Ⅱ定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 0.0701 | 0.0748 | 0.0680 | 0.0651 | 0.0647 | 0.0756 | 0.0697 | 6.71 |
| 保留时间(min) | 10.627 | 10.637 | 10.650 | 10.657 | 10.667 | 10.650 | 10.648 | 0.13 |
| S/N | 26.6 | 19.0 | 24.3 | 25.4 | 19.5 | 21.1 | / | / |
表12有关物质Ⅲ定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 0.1457 | 0.1558 | 0.1394 | 0.1300 | 0.1237 | 0.1406 | 0.1392 | 8.14 |
| 保留时间(min) | 28.273 | 28.337 | 28.333 | 28.407 | 28.357 | 28.350 | 28.343 | 0.15 |
| S/N | 21.3 | 15.3 | 19.2 | 18.9 | 15.1 | 16.0 | / | / |
表13有关物质Ⅳ定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 0.1237 | 0.1285 | 0.1401 | 0.1298 | 0.1246 | 0.1263 | 0.1288 | 4.64 |
| 保留时间(min) | 29.560 | 29.567 | 29.580 | 29.643 | 29.650 | 29.597 | 29.599 | 0.13 |
| S/N | 18.4 | 13.3 | 18.3 | 18.8 | 14.7 | 15.0 | / | / |
表14 17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇定量限测试结果
| 名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 0.1212 | 0.1109 | 0.1229 | 0.1173 | 0.1365 | 0.1350 | 0.1240 | 8.55 |
| 保留时间(min) | 33.570 | 33.597 | 33.607 | 33.653 | 33.660 | 33.610 | 33.616 | 0.10 |
| S/N | 14.1 | 10.0 | 13.3 | 14.1 | 11.7 | 11.9 | / | / |
表15灵敏度测试结果
计算公式：
定量限/检测限浓度(μg/mL)＝称样量×杂质含量/稀释倍数；
定量限/检测限(ng)＝浓度×进样量；
定量限占供试品比(％)＝定量限浓度/供试品浓度×100％。
从上述灵敏度试验结果可知：定量限溶液连续测试6次，17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇与各有关物质峰面积RSD均不大于10.0％，保留时间RSD均不大于2.0％；定量限均小于报告限度(0.05％的供试品浓度)。
实验例2
线性试验
(1)溶液配制
溶剂：甲醇；
空白溶液：溶剂；
有关物质Ⅰ的贮备液配制过程同实施例1；
有关物质Ⅱ的贮备液、有关物质Ⅲ的贮备液、有关物质Ⅳ的贮备液、系统适用性溶液采用实施例1项下所配制的溶液。
17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇对照品贮备液采用实验例1项下所配制的溶液。
线性贮备液(各物质浓度分别约为100μg/mL)：分别精密量取17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇对照品贮备液、有关物质Ⅰ的贮备液、有关物质Ⅱ的贮备液、有关物质Ⅲ的贮备液、有关物质Ⅳ的贮备液各2mL，置同一20mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性溶液1(定量限溶液)：配制同实验例1项下的定量限溶液。
线性溶液2(相当于供试品浓度的0.05％)(浓度约0.5μg/mL)：精密量取线性贮备液0.1mL，置20mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性溶液3(相当于供试品浓度的0.1％)(浓度约1μg/mL)：精密量取线性贮备液0.2mL，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性溶液4(相当于供试品浓度的0.2％)(浓度约2μg/mL)：精密量取线性贮备液0.4mL，置20mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性溶液5(相当于供试品浓度的0.4％)(浓度约4μg/mL)：精密量取线性贮备液0.8mL，置20mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性溶液6(相当于供试品浓度的1.0％)(浓度约10μg/mL)：精密量取线性贮备液1mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性溶液7(相当于供试品浓度的2.0％)(浓度约20μg/mL)：精密量取线性贮备液2mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性溶液8(相当于供试品浓度的3.0％)(浓度约30μg/mL)：精密量取线性贮备液3mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性溶液9(相当于供试品浓度的5.0％)(浓度约50μg/mL)：精密量取线性贮备液5mL，置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1。
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液、各线性溶液各10μL，进样检测，记录色谱图。具体进样顺序及针数要求见表16。
表16进样顺序及针数要求
| 顺序 | 样品名称 | 针数 |
| 1 | 空白溶液 | 1针 |
| 2 | 系统适用性溶液 | 1针 |
| 3 | 线性溶液1～9 | 各1针 |
(4)分析结果
试验结果见表17～表21。
表17 17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇线性测试结果
表18有关物质Ⅰ线性测试结果
表19有关物质Ⅱ线性测试结果
表20有关物质Ⅲ线性测试结果
表21有关物质Ⅳ线性测试结果
由上述测试结果可知，线性相关系数r均≥0.990；y轴截距均小于100％限度浓度峰面积的25％，相对剩余标准差均不大于10.0％。以浓度C(μg/mL)为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，得到线性回归方程，线性关系图如图9～图13所示。17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇及各有关物质的浓度与峰面积的线性关系良好，符合验证要求。
实验例3
准确度试验
(1)溶液配制
溶剂：甲醇；
空白溶液：溶剂；
系统适用性溶液采用实施例1项下所配制的溶液。
供试品溶液(1mg/mL)：取待测样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
有关物质Ⅰ的贮备液(1mg/mL，平行配制两份)：取有关物质Ⅰ约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅱ的贮备液(1mg/mL，平行配制两份)：取有关物质Ⅱ约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅲ的贮备液(1mg/mL，平行配制两份)：取有关物质Ⅲ约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
有关物质Ⅳ的贮备液(1mg/mL，平行配制两份)：取有关物质Ⅳ约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加2mL三氯甲烷超声使溶解，并用溶剂稀释至刻度，摇匀。
有关物质混合母液(有关物质Ⅰ浓度约40μg/mL、有关物质Ⅱ浓度约10μg/mL、有关物质Ⅲ浓度约300μg/mL、有关物质Ⅳ浓度约200μg/mL)：分别精密量取有关物质Ⅰ的贮备液、有关物质Ⅱ的贮备液、有关物质Ⅲ的贮备液、有关物质Ⅳ的贮备液各0.8mL、0.2mL、6mL、4mL置同一20mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。与贮备液一一对应，平行配制两份。
有关物质对照品溶液(有关物质Ⅰ浓度约4μg/mL、有关物质Ⅱ浓度约1μg/mL、有关物质Ⅲ浓度约30μg/mL、有关物质Ⅳ浓度约20μg/mL)：精密量取有关物质混合母液1mL置10mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。与有关物质混合母液一一对应，平行配制两份。
回收率溶液(取有关物质混合母液-1配制回收率溶液)
50％溶液：取待测样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密加入有关物质混合母液-1 0.5mL，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
100％溶液：取待测样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密加入有关物质混合母液-1 1mL，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
150％溶液：取待测样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密加入有关物质混合母液-1 1.5mL，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1。
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液、有关物质对照品溶液、供试品溶液及回收率溶液各10μL，进样检测，记录色谱图。具体进样顺序及针数要求见表22。
表22进样顺序及针数要求
计算公式：回收率％＝(测得量-样品中含量)/加入量×100％。
(4)分析结果
试验结果见表23～表26。
表23有关物质Ⅰ回收率测试结果
表24有关物质Ⅱ回收率测试结果
表25有关物质Ⅲ回收率测试结果
表26有关物质Ⅳ回收率测试结果
以有关物质限度浓度作为100％，按50％、100％和150％三种浓度向样品中定量添加有关物质，各浓度水平下，有关物质回收率均在90.0％～110.0％范围内，9份回收率RSD均小于5.0％，准确度良好。
实验例4
重复性试验
(1)溶液配制
溶剂：甲醇；
空白溶液：溶剂；
系统适用性溶液采用实施例1项下所配制的溶液。
供试品溶液(浓度约1mg/mL，平行配制6份)：取待测样品10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照溶液(浓度约10μg/mL，平行配制6份)：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1。
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液、对照溶液以及供试品溶液各10μL，进样检测，记录色谱图。具体进样顺序及针数要求见表27。
表27进样顺序及针数要求
| 顺序 | 样品 | 针数 |
| 1 | 空白溶液 | 1针 |
| 2 | 系统适用性溶液 | 1针 |
| 3 | 供试品溶液-1～6 | 各1针 |
| 4 | 对照溶液-1～6 | 各1针 |
(4)分析结果
重复性试验结果见表27。
表27重复性测试结果
6份供试品溶液，杂质检出基本一致，总杂及杂质个数无明显变化，重复性良好。
实验例5
溶液稳定性试验
(1)溶液配制
溶剂：甲醇；
空白溶液：溶剂；
系统适用性溶液采用实施例1项下所配制的溶液。
供试品溶液(浓度约1mg/mL)：取待测样品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。平行配制两份，取第一份考察系统适用性，第二份考察溶液稳定性。
对照溶液(浓度约10μg/mL)：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制两份，取第一份考察系统适用性，第二份考察溶液稳定性。
(2)高效液相色谱检测条件
同实施例1。
(3)检测步骤
取空白溶液、系统适用性溶液、对照溶液以及供试品溶液各10μL，进样检测，记录色谱图。具体进样顺序及针数要求见表28。
表28进样顺序及针数要求
(4)分析结果
溶液稳定性试验结果见表29～30。
表29供试品溶液稳定性测试结果
表30对照溶液稳定性测试结果
| 时间(h) | 保留时间(min) | 峰面积 |
| 1 | 33.500 | 2.4448 |
| 3 | 33.500 | 2.4636 |
| 5 | 33.493 | 2.4467 |
| 7 | 33.487 | 2.4537 |
| 9 | 33.490 | 2.4462 |
| 13 | 33.440 | 2.4594 |
| 17 | 33.403 | 2.4264 |
| 21 | 33.433 | 2.4511 |
| 25 | 33.467 | 2.4669 |
| 均值 | 33.468 | 2.4510 |
| RSD(％) | 0.10 | 0.49 |
供试品溶液室温放置24h，有关物质Ⅰ未检出；有关物质Ⅱ各时间点含量均值为0.05％，RSD为6.67％，小于20.0％；有关物质Ⅲ各时间点含量均值为2.19％，RSD为0.27％，小于5.0％；有关物质Ⅳ各时间点含量均值为0.45％，RSD为0.74％，小于10.0％；最大未知单杂各时间点含量均值为3.29％，RSD为0.38％，小于5.0％；总杂各时间点含量均值为7.46％，RSD为1.18％，小于5.0％；杂质个数无明显变化，供试品溶液室温放置24h稳定。对照品溶液室温放置25h，主峰峰面积RSD为0.49％，小于5.0％，表明对照溶液室温放置25h稳定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；
所述高效液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)；
柱温：40℃；
检测波长为198～202nm；
以水作为流动相A，乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱；梯度洗脱的流速为0.8～1.0mL/min；
所述梯度洗脱的过程包括：
2.根据权利要求1所述的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程包括：
3.根据权利要求1所述的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述有关物质包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中的至少两种，结构式分别如下：
4.根据权利要求3所述的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述有关物质包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。
5.根据权利要求1所述的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测波长为199～201nm；
优选的，所述检测波长为200nm。
6.根据权利要求1所述的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述流速为0.9～1.0mL/min；
优选的，所述流速为1.0mL/min。
7.根据权利要求1所述的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括：采用甲醇溶解供试品；
优选的，所述供试品包括含17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的中间体。
8.根据权利要求1所述的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：采用自身对照法对供试品中的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇和/或有关物质的含量进行计算。
9.根据权利要求1～8任一项所述的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测条件包括：
色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)，4.6mm×250mm，5μm；
柱温：40℃；
检测波长为200nm；
梯度洗脱的流速为1.0mL/min；
所述梯度洗脱的过程包括：
10.权利要求1～9任一项所述的17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇有关物质的检测方法在17-碘-雄甾-5,16-二烯-3β-醇的质量控制中的应用。
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