CN116124845A - 一种基于壳聚糖衍生物检测液体样品中食源性致病菌的方法 - Google Patents
一种基于壳聚糖衍生物检测液体样品中食源性致病菌的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含有壳聚糖衍生物的生物感应传感器在检测液体食品中的食源性致病菌中的应用，所述生物感应传感器的阴极上含有巯基化壳聚糖季铵盐。本发明还公开了一种检测液体样品中食源性致病菌的方法。本发明公开的生物感应传感器所用的巯基化壳聚糖季铵盐为阳离子抗菌聚合物，不仅可以通过静电吸附致病菌，还可以通过破坏细胞膜的组成杀死或抑制微生物的生长，在检测致病菌含量的同时可以减少液体样品中致病菌的含量；本发明公开的生物感应传感器在检测液体样品中食源性致病菌时，对于单菌或混合菌的检测都具备极高的灵敏度，检测限低至30 CFU。作为液体食品检测设备使用，操作简单、快速、高效，且制备成本低、便于携带，适用性更广泛。
Description
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种基于壳聚糖衍生物检测液体样品中食源性致病菌的方法，尤其涉及构建含有巯基化壳聚糖季铵盐的生物感应传感器用于检测液体样品中食源性致病菌的方法。
背景技术
据世界卫生组织报道，每年报告的食源性疾病高达6亿例，约10人中就有1人因食入被污染的食物而生病，引起腹泻、发热、恶心、呕吐等病症，甚至导致死亡，且这一数字仍在逐年增加，食品安全问题已经成为全社会共同关注的热点问题。我国常见的食源性致病菌主要有副溶血性弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等。这些致病菌的最适温度大多在30～37℃，对于不同酸碱冷热环境敏感性不同，所以引发相关食源性疾病的时节也不同，易污染的食物也不同。食源性致病菌常伴随着被污染的食物进入人体，食物污染可能出现在生产、加工、运输、销售、食用等任何一个环节，因此食源性致病菌的快速检测是其预防与控制的关键环节。
已有研究表明，电化学活性微生物具有胞外电子转移能力，其可以通过某些方式与电极界面产生电子转移，可能方式包括通过细胞膜蛋白色素、漆酶等的直接电子传递、通过细胞分泌电子中介体核黄素、绿脓菌素等的间接电子传递。其中，目前已知的电化学活性微生物主要来自变形菌门、厚壁菌门、酸杆菌和拟杆菌门，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌也包含其中，利用循环伏安法可以对其催化阴极氧还原能力进行研究。
此外，传统的食源性致病菌检测方法主要包括微生物培养法、分子检测技术和免疫学检测技术，但由于真实食品样本基质复杂、食源性致病菌浓度低等现状，造成检测过程中干扰大、信号弱的问题，加大了检测难度。新兴的生物传感器结合光学、温度、电化学、磁场、压电等多种技术，将生物反应或生物信号转换成电信号，相较于传统检测技术，其具有高灵敏度、高特异性、快速响应和多路复用等特点，这使得他们广泛应用于食品检测和生物制剂方向，但新型检测技术也存在重复性差或是仪器设备昂贵、不适合现场检测等问题，因此建立一种新型检测技术以弥补这些不足具有重要意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种含有壳聚糖衍生物的生物感应传感器在检测液体食品中的食源性致病菌中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供一种检测液体样品中食源性致病菌的方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种含有壳聚糖衍生物的生物感应传感器在检测液体食品中的食源性致病菌中的应用，所述生物感应传感器的阴极上含有巯基化壳聚糖季铵盐。
进一步地，所述液体食品包括牛奶、果汁、啤酒。
进一步地，所述的食源性致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌。
进一步地，所述的食源性致病菌的检测浓度范围为3×101～3×105 CFU。
本发明还提供了一种检测液体样品中食源性致病菌的方法，所述方法是：构建含有巯基化壳聚糖季铵盐的生物感应传感器；将不同浓度的待测菌标准液固定于阴极端，在阳极端加入电致化学发光试剂和共反应剂，对双极电极两端施加外接恒电压，阴极端上不同浓度的的致病菌催化氧还原反应，导致阳极端ECL信号随之变化，联用荧光仪得到ECL值，从而得到致病菌含量与ECL的标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中致病菌的含量。
进一步地，上述生物感应传感器的构建方法包括以下步骤：在丝网印刷双极电极表面镀金，清洗，晾干，在镀金后的阴极表面滴加巯基化壳聚糖季铵盐，常温过夜孵育，清洗，干燥，即得生物感应传感器。
进一步地，所述在镀金后的阴极表面滴加巯基化壳聚糖季铵盐的量为20 µL，所述清洗为超纯水清洗。
进一步地，所述巯基化壳聚糖季铵盐的制备方法为：（1）N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）分别溶于去离子水中，NAC和EDAC的质量比为3:8-1:2。
（2）上述溶液混合后加入1-羟基苯并三唑（HOBT），HOBT与EDAC摩尔比为1:1；室温避光反应30 min；
（3）壳聚糖季铵盐（TMC）溶于去离子水中，TMC与NAC的质量比为1:4-1:3，室温避光反应24 h，透析，冷冻干燥，得巯基修饰壳聚糖季铵盐（TMC-SH）。
进一步地，所述恒电压为4.8～5.9 V。
进一步地，所述将待测菌固定于阴极端的方法为将待测样品使用蠕动泵匀速流过阴极端，固定时间为5~90min。
进一步地，所述电致化学发光试剂为Ru(bpy)3Cl2·6H2O，所述共反应剂为TPA。
进一步地，所述的食源性致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌。
本发明利用双极电极工作原理，在闭合式双极电极的阴极端电沉积金纳米粒子，再通过Au-S将制备的巯基化壳聚糖季铵盐（TMC-SH）自组装在金电极上，构建生物感应传感器。其中，巯基化壳聚糖季铵盐带正电荷，能将表面带负电的致病菌通过静电吸附捕获。利用双极电极两端施加外加电压后发生氧化还原反应，联用电化学工作站和荧光仪，将电化学信号转换为光信号，并通过荧光仪将其捕获并进行分析，实现液体样品中致病菌含量超灵敏定量检测。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：
（1）本发明公开的生物感应传感器所用的巯基化壳聚糖季铵盐为阳离子抗菌聚合物，不仅可以通过静电吸附致病菌，还可以通过破坏细胞膜的组成杀死或抑制微生物的生长，在检测致病菌含量的同时可以减少液体样品中致病菌的含量；
（2）本发明公开的生物感应传感器在检测液体样品中食源性致病菌时，对于单菌或混合菌的检测都具备极高的灵敏度，检测限低至30 CFU。作为液体食品检测设备使用，操作简单、快速、高效，且制备成本低、便于携带，适用性更广泛。
附图说明
图1为本发明检测方法的流程图；
图2为巯基化壳聚糖季铵盐合成流程图；
图3为巯基化壳聚糖季铵盐表征图，其中A为傅立叶红外光谱，B为紫外光谱；
图4为验证大肠杆菌（A）、金黄色葡萄球菌（B）、沙门氏菌（C）催化氧还原的循环伏安法图，其中，（a）致病菌在PBS缓冲溶液中氮气鼓吹20分钟，（b）热致死致病菌搅拌20分钟，（c）PBS缓冲溶液不搅拌，（d）致病菌在PBS缓冲溶液中不搅拌，（e）致病菌在PBS缓冲溶液中搅拌20分钟；
图5为生物传感器扫描电子显微镜表征图；
图6为混菌样品流过电极片时间优化图（5 min、15 min、30 min、60 min、90 min），ECL发光信号随时间变化而变化；
图7为工作电压优化图（4.8 V、5.0 V、5.2 V、5.5 V、5.9 V），其中圆点折线图为空白对照，方点折线图为实验组；
图8为本发明生物传感器分别检测单菌样品的ECL光谱趋势图及标准曲线，其中A/D为大肠杆菌，B/E为金黄色葡萄球菌，C/F为沙门氏菌（ECL光谱图中单菌浓度a～f：3×101～3×105 CFU）；
图9为本发明生物传感器检测混菌样品的ECL光谱趋势图（A）及相应标准曲线（B）；
图10为本发明传感器检测实际样品中菌含量的ECL光谱趋势图及相应标准曲线，其中A/D为牛奶，B/E为果汁，C/F为啤酒（ECL光谱图中单菌浓度a～f：3×101～3×105 CFU）。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明所需要的试剂：
1、大肠杆菌O157:H7菌株（CICC 10907）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）系本实验室保藏，1-羟基苯并三唑（HOBT）购置于南京巨优科学器材有限公司，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）购置于上海麦克林生化科技有限公司，壳聚糖季铵盐（TMC）购置于北京伊诺凯科技有限公司，三联吡啶氯化钌六水合物（Ru(bpy)3(Cl)2·6H2O）、三正丙基胺（TPA）、氯化钠（NaCl）、葡萄糖（Glucose）、蛋白胨、牛血清白蛋白（BSA）、酵母浸粉、氯化钾、磷酸氢二钠，磷酸二氢钾均购置于上海阿拉丁生化科技有限公司；
2、牛奶、果汁、啤酒均购置于当地超市。
本发明选用的仪器：
1、电化学工作站（CHI750E）；
2、荧光分光光度计（日立F-4700）；
3、混合涡旋仪（IKA German）；
4、离心机（Eppendorf German）；
5、组合式摇床（HYL-C2）；
6、蠕动泵（TS500-RZ1030-4）。
实施例1：巯基化壳聚糖季铵盐的合成与表征
取0.327 g N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）溶于5 mL去离子水，加入0.609 g 1-羟基苯并三唑（HOBT），于室温避光氮气保护下搅拌混匀，0.767 g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC）溶于3 mL去离子水中，两者混合搅拌30 min。0.1 g 壳聚糖季铵盐溶于2 mL去离子水中，混合于室温避光氮气保护下搅拌24 h，反应完毕后置于4℃过夜，沉淀析出，得到巯基化壳聚糖季铵盐。用傅立叶红外光谱及紫外对其进行表征，N-乙酰-L-半胱氨酸的红外特征峰显示了羟基键（3374 cm-1）、巯基键（2547 cm-1）和羰基键（1718 cm-1）的拉伸带。与TMC相比，TMC-SH在2520 cm-1处出现巯基键吸收峰，由于3300 cm-1左右-OH宽频带伸缩振动的影响，巯基特征峰部分被覆盖，变得不明显；且分别在1646 cm-1、1560 cm-1处显示C-O伸缩振动峰和N-H弯曲振动峰（即酰胺I带和酰胺II带），这些特征峰证明了巯基成功地连接到TMC上；此外，N-乙酰-L-半胱氨酸的不饱和酰胺在200 nm处产生吸收峰；TMC含有非键电子的杂原子饱和基团-NH2（为助色团），含有不饱和键的基团为生色团（C=O），两者结合后导致溶液极性增大，吸收峰红移，吸收强度增强，TMC-SH在304 nm有一明显吸收峰，也能证明巯基成功地连接到TMC上。
实施例2：菌液样品的培养与制备
挑取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌落分别接种到10 mL肉汤液体培养基中，置于37℃、160 rpm恒温摇床中过夜活化，取100 µL转接后置于37℃、160 rpm恒温摇床中培养2.5～3 h，浓度约为108 CFU/mL，分别取4 mL菌液至10 mL离心管中，4℃、10000 rpm离心10 min，弃上清液得菌体沉淀，加入4 mL无菌生理盐水（0.85% NaCl）重悬菌液，将得到的菌液进行10倍梯度稀释，取稀释4～8次溶液（浓度约为100～104 CFU/mL）备用。
实施例3：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌催化氧还原能力验证
采用三电极体系，工作电极（玻碳电极）、辅助电极（铂电极）、参比电极（饱和甘汞电极），用循环伏安法（CV）来表征大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的氧化还原能力。所有致病菌浓度为104 CFU/mL。电解液为0.1M PBS缓冲液，电压：0.7～-1V，扫速：100 mV/s，电解液体积为50 mL。以有氧条件下不搅拌的纯PBS缓冲溶液（图4，曲线c）为空白，可以得到一个还原波，证实了O2的电化学还原；若在有氧条件下，加入正常致病菌后不搅拌（图4，曲线d）也有氧化还原峰出现，且其产生的电流与空白相比增大，证实了致病菌的存在能改变电流-电位曲线的轨迹；加入致病菌后再搅拌20分钟（图4，曲线e），则观察到明显的氧还原波，且其产生的电流明显高于纯PBS缓冲溶液，可以证实O2的增加进一步催化了氧还原反应；而加入致病菌后氮气鼓吹20分钟（图4，曲线a）只显示出极其微弱的峰值电流；加入热致死致病菌后有氧搅拌20分钟（图4，曲线b）也无明显氧化还原峰，这一实验验证了催化效果与O2的还原有关。
实施例4：生物感应传感器的制备与表征
生物感应传感器的的制备：利用双极电极工作原理，在闭合式双极电极的阴极端滴加20 µL浓度为1% HAuCl4溶液，阳极端滴加20 µL浓度为10 mM PBS缓冲溶液，两极施加6.5 V恒定电压60 s电沉积金纳米粒子，超纯水清洗后重复上述操作1次，再在镀金电极表面滴加20 µL实施例1中制备的巯基化壳聚糖季铵盐TMC-SH，常温过夜孵育，用超纯水清洗未结合的聚合物，干燥，成功构建生物感应传感器。
生物感应传感器的表征：分别取三个电极片编号1-3作为阴极，1号裸电极作为空白对照，2号为仅镀金未添加TMC-SH电极，3号为上述构建的含TMC-SH的生物感应传感器，将大肠杆菌通过静电吸附固定到电极表面，选取10 mA电子流，喷金时长45s。再利用扫描电子显微镜（SEM）对1、2、3号电极分别进行表面形貌结构的检测。结果显示裸电极表面较为光滑平整；电极镀金后，表面形成大量均匀分布的小颗粒，表明金纳米颗粒成功沉积到电极上；在聚合物上固定大肠杆菌后，可以看到直杆状大肠杆菌均匀致密地分布其上，因此说明大肠杆菌成功地吸附到构建的电极表面。
实施例5：检测致病菌工作条件优化
一、待测样品流过时间的优化：
1、同实施例2所述的制备方法，以大肠杆菌为例，制得单菌菌液，浓度为102 CFU/mL（菌含量约为3×103 CFU）；
2、同实施例4的方法，在制备好的电极片阴极上泵过30 mL浓度为102 CFU/mL的大肠杆菌菌液，分别改变泵过时间为5 min、15 min、30 min、60 min、90 min，其他条件不变，1h后用PBS清洗，空气中干燥待用；
3、在制备好的电极片阴极端滴加10 µL浓度为10 mM PBS缓冲溶液，阳极端滴加10µL电致化学发光试剂和共反应剂（50 mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250 mM TPA），联用荧光仪检测电致化学发光信号值，结果如图6所示，流动时间为5 min时，ECL发光信号较弱，与背景信号相比所差不多，而当流动时间提高到30 min和60 min时，ECL发光信号有明显提升，最终选择30 min作为实验条件，缩短检测时间。
二、工作电压的优化：
1、同实施例2所述的制备方法，以大肠杆菌为例，制得单菌菌液，浓度为102 CFU/mL（菌含量约为3×103 CFU）；
2、同实施例4的方法，在制备好的电极片阴极上泵过30 mL磷酸盐缓冲溶液，1 h后清洗晾干，作为空白组；其次，在另一电极片阴极端泵过30 mL浓度为102 CFU/mL的大肠杆菌菌液，1 h后用PBS清洗，空气中干燥待用，作为实验组；
3、分别在制备好的电极片阴极端滴加10 µL浓度为10 mM PBS缓冲溶液，阳极端滴加10 µL电致化学发光试剂和共反应剂（50 mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250 mM TPA），依次改变电化学工作站恒定电压为4.8 V、5.0 V、5.2 V、5.5 V、5.9 V，联用荧光仪检测电致化学发光信号值，将空白组与实验组所得信号差值进行对比。结果如图7所示，空白组随电压升高，其ECL信号值低且升高缓慢；实验组随电压升高，其ECL信号值变化明显，5.5 V后趋于平缓。比较其∆ECL可知，恒定电压为5.0 V和5.2 V时，A、B两曲线信号差值较明显，而5.0 V时背景信号更低，对检测干扰更小，最终选择5.0 V。
实施例6：联用荧光仪和电化学工作站对液体样品进行检测
一、单菌
在优化条件下（样品流过时间为30min，恒电压为5.0 V），采用实施例4制备的生物传感器分别对实施例2中制备的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的单菌菌液进行检测，检测浓度为3×101～3×105 CFU。如图8（A、B、C）所示，随着阴极上致病菌含量的增加，ECL发光信号逐步增大。结果表明，ECL信号值随致病菌含量的增加而增加，两者呈正相关。三种致病菌含量与ECL发光信号值的标准曲线如图8（D、E、F）所示，可以得到该方法对三种致病菌的检出限都达到3×101 CFU左右，动态检测范围为3×101～3×105 CFU。
二、混菌
在优化条件下（样品流过时间为30min，恒电压为5.0 V），采用实施例4制备的生物传感器对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的混合菌液（混合比例为1:1:1）进行检测，检测浓度为3×101～3×105 CFU。如图9A所示，随着阴极上致病菌含量的增加，ECL发光信号也逐步增大，与单独检测某一种菌时规律一致。结果表明，ECL信号值随致病菌含量的增加而增加，两者呈正相关。混菌含量与ECL发光信号值的标准曲线如图9B所示，可以得到该方法对混菌检出限也能达到3×10 CFU左右，动态检测范围为3×101～3×105 CFU。
实施例7：实际样品检测
根据中国国家食品安全标准（GB 7101-2022 饮料）选取牛奶、果汁、啤酒作为实际样品检测对象，根据中国国家食品安全标准（GB 4789.2-2022）食品微生物学检验菌落总数测定法处理实际样品。
1、取上述实施例2中101 CFU/mL的三种菌悬液各1 mL加入27 mL液体样品中，制得浓度为100 CFU/mL的样品液，其菌含量约为3×101 CFU。以此类推分别制得菌含量为3×102～3×105 CFU的样品液。所述的液体样品为牛奶、果汁、啤酒，该实际样品均购自于当地超市；
2、将各样品液混合均匀，用蠕动泵将样品液匀速流过双极电极阴极端30分钟，致病菌通过静电吸附结合到电极表面，用PBS洗去表面未结合菌液，空气中干燥待用；
3、在本发明所述双极电极传感器阴极端滴加10 µL浓度为10 mM PBS缓冲溶液，阳极端滴加10 µL电致化学发光试剂和共反应剂（50 mM Ru(bpy)3Cl2·6H2O，250 mM TPA）；
4、使用电化学工作站在电极上施加5.0 V恒电位并检测阳极端ECL发光信号，结果如图9。三种实际样品的ECL检测值与混菌纯培养液的ECL检测值（标准曲线）重合度较高，结果表明液体样品中复杂基质对该传感器的影响较小，可以忽略不计，且食品基质对O2的电化学还原没有催化活性，说明本发明所设计的生物传感器可用于液体食品的快速检测。另外，由图10（A、B、C）可知，当实际样品中含有相同致病菌总量时，三种不同样品检测所得ECL发光信号值非常接近，对菌含量和相应ECL发光信号值绘制标准曲线，拟合度良好。中国国家食品安全标准（GB 7101-2022 饮料）中规定，碳酸饮料及果蔬汁类及其饮料在5个采样数中，允许有小于等于2个样品其菌落总数超100 CFU/mL，固体饮料在5个采样数中，允许有小于等于2个样品其菌落总数超104 CFU/mL，该方法的检出限（3×101 CFU）小于其检验值。结果表明，该发明所述生物传感器有较好的准确性和便携性，且能超灵敏检测液体样品，可为液体样品中菌落总数的快速定量检测提供一种可行方法。
Claims (10)
1.一种含有壳聚糖衍生物的生物感应传感器在检测液体食品中的食源性致病菌中的应用，其特征在于，所述生物感应传感器的阴极上含有巯基化壳聚糖季铵盐。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述液体食品包括牛奶、果汁、啤酒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的食源性致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的食源性致病菌的检测浓度范围为3×101～3×105 CFU。
5.一种检测液体样品中食源性致病菌的方法，其特征在于，所述方法是：构建含有巯基化壳聚糖季铵盐的生物感应传感器；将不同浓度的待测菌标准液固定于阴极端，在阳极端加入电致化学发光试剂和共反应剂，对双极电极两端施加外接恒电压，阴极端上不同浓度的的致病菌催化氧还原反应，导致阳极端ECL信号随之变化，联用荧光仪得到ECL值，从而得到致病菌含量与ECL的标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中致病菌的含量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，生物感应传感器的构建方法包括以下步骤：在丝网印刷双极电极表面镀金，清洗，晾干，在镀金后的阴极表面滴加巯基化壳聚糖季铵盐，常温过夜孵育，清洗，干燥，即得生物感应传感器。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述恒电压为4.8～5.9 V。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述将待测菌固定于阴极端的方法为将待测样品使用蠕动泵匀速流过阴极端，固定时间为5~90min。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电致化学发光试剂为Ru(bpy)3Cl2·6H2O，所述共反应剂为TPA。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的食源性致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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