CN116120587A - 一种pH响应木质素及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种pH响应木质素及其制备方法和应用，具体涉及高分子材料和纳米医药技术领域。本发明所提供的pH响应木质素的制备方法，首先在木质素上接枝不同的氨基酸，其次采用甲基化试剂对氨基酸接枝木质素进行改性。采用不同的氨基酸进行接枝，能够使最终得到的pH响应木质素具有不同的等电点，进而具有不同的pH响应性，而基于甲基化改性，本发明成功使氨基酸接枝木质素的表面在中性环境下带有与木质素本身所带负电性不同的正电性，且正电性能够稳定存在。本发明所得pH响应木质素，其纳米粒子能够在达到等电点时因表面产生恢复为木质素原有负电性的趋势而发生结构失稳，进而当粒子中含有内容物时释放出内容物。

Description

一种pH响应木质素及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于高分子材料和纳米医药技术领域，具体地，涉及一种pH响应木质素及其制备方法和应用。

背景技术

木质素是木质纤维素的三种主要成分之一，用于构成植物细胞壁，是一种可再生的芳香聚合物，在植物中的含量从10％到30％不等，通常被认为是最丰富的绿色资源之一。然而，工业木质素通常是制浆和生物精炼的副产品，利用价值不高，大部分被燃烧或填埋，只有5％用于增值产品。根据木质素的提取方法又可将木质素分为碱木质素、磺酸盐木质素、预水解木质素等，随着木质纤维素生物精炼制备乙醇行业的兴起，大量毒性较低的酶水解木质素及预处理分离木质素被生产出来，如何对这一新兴的生物质资源进行高值化的利用受到广泛关注。

木质素具有丰富的酚羟基、羧基等亲水官能团，也具有疏水的主链，能够在水中形成两亲性结构，进而自组装形成胶束粒子，并且木质素毒性低，易于修饰，因此它是制备纳米载药粒子的良好材料。与此同时，大部分的木质素具有酚羟基、羧基、磺酸基团等阴离子基团，通过接枝阳离子基团可以提高木质素电位，再通过调控阴阳离子基团的比例可以进一步制备两性离子聚合物。两性离子聚合物是一种仿生聚合物，和天然蛋白质一样具有高度亲水性和防污性，能够增强纳米粒子的稳定性及循环时间，但通常制备阳离子接枝木质素过程中使用的溶剂及接枝分子有毒、易挥发，因此在纳米医药技术领域受到很大的限制。

现有技术公开了一种pH响应乙酰化组氨酸改性木质素载药粒子及其制备方法，选用正电性强的组氨酸接枝木质素，首先通过曼尼希反应合成组氨酸接枝木质素，再通过乙酰化反应进一步降低接枝木质素的电负性，最后通过真空旋蒸获得包载药物的改性木质素纳米粒子，具有初步的pH响应能力，然而其中两步合成过程需要大量的水洗涤及冷冻干燥，且乙酰化形成的酚酯比醇酯更容易水解，因此纳米粒子带的电荷不稳定。更重要的是，由于乙酰化改性对于接枝木质素表面正电性的增强能力弱，所以该现有技术只能实现组氨酸接枝木质素在弱酸性条件下的电荷反转；同时由于该现有技术只在木质素上接枝了一种氨基酸，所以最终制备得到的改性木质素虽然具有pH响应性，但只能够响应单一的pH条件。

发明内容

为了解决现有技术中难以采用同一种方法制备具有不同pH响应性的木质素的问题，本发明提供了一种pH响应木质素的制备方法，采用不同的氨基酸对木质素进行接枝，继而采用甲基化试剂封闭接枝木质素上的负电基团，增强接枝木质素表面的正电性，使得由不同氨基酸接枝的木质素都能够在pH＝7时实现稳定的电荷反转，在pH>7的不同等电点时又能够因其表面产生恢复为木质素原有负电性的趋势而发生结构失稳，将其制备成纳米胶束粒子后能够利用这一特性控制内容物的释放；与此同时，由于接枝了不同的氨基酸，所以该pH响应木质素具有不同的pH响应性，可被用于不同环境下的药物控释。

本发明的另一目的在于，提供一种pH响应木质素。

本发明的又一目的在于，提高一种pH响应木质素的应用。

本发明的再一目的在于，提供一种纳米载药粒子。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种pH响应木质素的制备方法，具体包括如下步骤：

S1.将木质素和氨基酸溶解在碱性溶剂中，加入甲醛进行反应，得到氨基酸改性木质素；

S2.向氨基酸改性木质素中加入甲基化试剂，在碱性条件下反应后即可得到pH响应木质素。

步骤S1所发生的是曼尼希(Mannich)反应，也被称作胺甲基化反应。在这一步反应中，带有活泼氢的木质素与甲醛、氨基酸缩合，生成氨基酸改性木质素。

步骤S2所发生的是甲基化反应，甲基化试剂的加入能够将氨基酸改性木质素上的部分负电基团替换为甲基，封闭这部分负电基团，增强氨基酸改性木质素表面的正电性。氨基酸是一种两性化合物，在碱性溶液中Zeta电位为负值、氨基酸呈现负电性，而在酸性溶液中氨基酸带正电；当其所带的净电荷为0时，溶液的pH即为其等电点。由于每种氨基酸氨基与羧基的比例不同，所以用不同氨基酸接枝的木质素，等电点有高有低，但由于甲基化改性对于木质素表面正电性的提高效果优异，所以可以让接枝了不同氨基酸的木质素都能够将等电点提高到7以上，即在中性条件下pH响应木质素表面显示与木质素本身所带负电性不同的正电性，实现了在中性条件下木质素的电荷反转。但步骤S2需要在碱性条件下才能进行，这是因为在碱性条件下，氨基酸改性木质素才能与甲基化试剂相溶，确保反应能够进行。

由于木质素接枝的不同氨基酸等电点有所差异，所以本发明制备得到的pH响应木质素仍然具有不同的等电点，能够在大于7的不同等电点下发生木质素胶束粒子结构的失稳，进而当胶束中含有药物内容物时即可实现药物的释放。

经过甲基化后改性木质素与甲基之间形成的是醚键，不容易因水解而断裂，因此本发明所制备的pH响应木质素，在中性条件下表面的正电性是非常稳定的。

优选地，步骤S1中氨基酸任意地选自碱性氨基酸、中性氨基酸和酸性氨基酸中的任意一种或多种。

碱性氨基酸、中性氨基酸和酸性氨基酸，分别是具有不同等电点的氨基酸，在pH＝7的中性条件下Zeta电位呈现不同的电性。当采用上述氨基酸进行木质素的接枝时，能够使最终得到的pH响应木质素响应不同的碱性pH条件。除此之外，本发明还可以根据成本及功能选择合适的多种氨基酸修饰木质素，调节木质素表面的电荷，扩大氨基酸接枝木质素的pH响应范围。

在本发明的具体实施方式中，步骤S1中将木质素和氨基酸溶解在碱性溶剂中，加入甲醛进行反应的操作可以是：先将木质素和氨基酸分别加入到碱性溶剂中，配制成木质素溶液和氨基酸溶液，再将两种溶液混合，最后将甲醛水溶液滴加到木质素与氨基酸的混合溶液中。

通过将甲醛水溶液滴加到木质素与氨基酸的混合溶液中的操作来向体系中引入甲醛，是为了确保甲醛浓度在混合溶液中逐步上升，控制曼尼希反应的速度。

优选地，将甲醛水溶液滴加到木质素与氨基酸的混合溶液中时滴加时间为10～30min，滴加完后继续保温2.5～3.5h。

优选地，步骤S1中将pH调节为10～13。

优选地，步骤S1中木质素、氨基酸与甲醛的质量比为(1～10)：(1～15)：(0.4～7)。

将步骤S1中的pH和三种反应物的质量比限定在上述范围内，能够使步骤S1所发生的曼尼希反应具有更高的产率。

更优选地，步骤S1中木质素溶液的浓度为5～50mg/mL。

更优选地，步骤S1中氨基酸溶液的浓度为5～75mg/mL。

优选地，步骤S1中反应的条件为在70～100℃下反应1～4h。

在上述条件下进行步骤S1的曼尼希反应，所得氨基酸改性木质素的产率更高。

在本发明的具体实施方式中，步骤S1中的碱性溶剂可以任意地选自2～40mg/mL的氢氧化钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸钠溶液中的一种或多种。

优选地，步骤S1中的木质素任意地选自生物质精炼乙醇残渣中酶解木质素(EL)、碱法制浆黑液中碱木质素(AL)中的一种或两种。

上述木质素，来源广泛，绿色环保。

优选地，步骤S2中氨基酸改性木质素和甲基化试剂的质量比为1：(15～20)。

将步骤S2中氨基酸改性木质素和甲基化试剂的质量比限定为1：(15～20)，能够确保氨基酸改性木质素在甲基化试剂中有着最大的溶解度，进而提高反应速率。

优选地，步骤S2中将pH调节为10～13。

当pH大于10时，氨基酸改性木质素在甲基化试剂中的溶解度更大，有利于反应的进行；然而，在pH>13的强碱性条件下进行氨基酸改性木质素的甲基化反应，会使氨基酸改性木质素的结构发生解聚，影响木质素的分子量，所以将步骤S2的pH范围优选为10～13。

优选地，步骤S2中反应的条件为在130～170℃下反应1～2h。

更优选地，步骤S2中反应的条件为在145～165℃下反应1h。

反应时间过短，温度太低，反应不充分；反应时间太长，温度太高，副产物多。

优选地，步骤S2中甲基化试剂任意地选自磷酸三甲酯和碳酸二甲酯中的一种或两种。

上述甲基化试剂绿色低毒，生成的副产物磷酸和甲醇容易被环境中的微生物降解和吸收，并且磷酸能够在步骤S2的碱性反应环境下被中和，使最终所得的pH响应木质素，不需要进一步加酸中和即可用于制备木质素的纳米胶束粒子，简化了工艺，极大地降低了成本。与此同时，上述甲基化试剂还能够溶解所得pH响应木质素，因而直接将所得木质素滴入水中即可制备粒径均一且为100nm左右的纳米木质素粒子，不需要用其他试剂重新分散所得木质素再制备粒径更小且均一的纳米粒子。

更优选地，步骤S2中甲基化试剂为磷酸三甲酯。

采用碳酸二甲酯进行甲基化时，虽然能够使所得pH响应木质素表面具有更强的正电性，但反应条件更严格，需要在封闭体系、高温高压下进行，因此，本发明优选用磷酸三甲酯进行氨基酸接枝木质素的甲基化。

在本发明的具体实施方式中，步骤S2中用于调节反应pH条件所用的试剂可以是氢氧化钠。

优选地，步骤S2中在得到pH响应木质素后对其进行纯化。

在本发明的具体实施方式中，步骤S2中的纯化方法为：将所制得的pH响应木质素加入到3500DA的透析袋中透析1～2天。

本发明还保护一种由上述制备方法制备得到的pH响应木质素。

本发明还保护一种上述pH响应木质素在药物控释方面的应用。

本发明所制备的pH响应木质素，在水溶液中分散即可得到纳米胶束粒子。在小于pH响应木质素的等电点的pH条件下，该纳米胶束粒子能够稳定存在；而当溶液的pH增大到pH响应木质素的不同等电点时，由于木质素表面具有恢复为原有负电性的倾向，所以木质素胶束粒子会发生结构的失稳。当胶束中含有药物内容物时，这种结构的失稳即可实现药物的释放。

本发明还保护一种组成包括上述pH响应木质素的纳米载药粒子。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

此发明通过甲基化封闭氨基酸及木质素表面的负电基团，不仅可以使碱性氨基酸接枝的木质素实现中性条件下的电荷反转，还可以使中性和酸性氨基酸接枝的木质素实现同样效果。由于不同的氨基酸等电点有高有低，因此所得pH响应木质素的等电点也有所不同，能够对不同的碱性pH具有响应性。本发明制备的pH响应木质素带电稳定，不易水解，正电性强，可通过静电作用负载大量一般带负电的药物，还可通过与未甲基化的氨基酸接枝木质素混合调节表面电荷，扩大所得pH响应木质素的pH响应范围，用于药物的控释。

附图说明

图1为木质素与实施例1及对比例1产物的红外光谱图。

图2为实施例1及对比例1产物在不同pH下的Zeta电位图。

图3为实施例1～3所提供木质素纳米胶粒的粒径及其多分散系数(PDI)对比图。

具体实施方式

以下给出本发明的具体实施案例，对本发明做进一步的详细说明。但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。

实施例1

一种pH响应木质素的制备方法，具体包括如下步骤：

S1.称取1g酶解木质素溶于10mL的4mg/mL的氢氧化钠溶液中，称取1.2g精氨酸溶于5mL的4mg/mL的氢氧化钠，将精氨酸溶液与木质素溶液混合均匀加入三口烧瓶。然后，在90℃下将1.5mL的37％质量浓度的甲醛溶液用滴液漏斗滴加入三口烧瓶(控制30min滴加完)，继续在90℃下保温，敞口反应2.5h，反应过程中不断搅拌，反应结束冷却至室温，得到精氨酸接枝木质素。

S2.将19g磷酸三甲酯与1g步骤S1的反应产物混合，将pH调节为13，超声分散混合溶液，升温至150℃，反应1h，反应过程中不断搅拌，反应结束后冷却至室温，得到经过精氨酸(ARG)接枝改性、甲基化后的pH响应木质素(Me-EHL-ARG)，产物用3500Da透析袋透析1天进行纯化。

实施例2

一种pH响应木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

步骤S1所采用的氨基酸为甘氨酸(GLY)，所得产物为经过甘氨酸接枝改性并甲基化后的pH响应木质素(Me-EHL-GLY)。

实施例3

一种pH响应木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

步骤S1所采用的氨基酸为谷氨酸(GLU)，所得产物为经过谷氨酸接枝改性并甲基化后的pH响应木质素(Me-EHL-GLU)。

实施例4

一种pH响应木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

步骤S2中加入的氨基酸改性木质素的质量为0.5g，氨基酸改性木质素和甲基化试剂的质量比为1：38。

实施例5

一种pH响应木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

步骤S2中加入的磷酸三甲酯的质量为10g，氨基酸改性木质素和甲基化试剂的质量比为1：10。

实施例6

一种pH响应木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

步骤S2中的pH为14。

实施例7

一种pH响应木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

步骤S2中反应的温度为180℃。

实施例8

一种pH响应木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

步骤S2中反应的温度为120℃。

对比例1

一种氨基酸改性木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

S2.将步骤S1所得精氨酸改性木质素(EHL-ARG)用3500Da透析袋透析1天进行纯化。

对比例2

一种甲基化木质素的制备方法，具体包括如下步骤：

S1.用19g磷酸三甲酯与1g酶解木质素混合加于三口烧瓶中，加入0.4g氢氧化钠，超声分散混合溶液，升温至150℃，反应1h，反应过程中不断搅拌，反应结束后冷却至室温，得到甲基化木质素，将产物滴入100mL水分散中得到甲基化木质素。

S2.将步骤S1所得甲基化木质素(Me-EHL)用3500Da透析袋透析1天进行纯化。

对比例3

一种乙酰化氨基酸改性木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

S2.取步骤S1的产物加入60mL冰醋酸中，加入3mL乙酰溴，超声分散，升温至45℃，反应2h，反应过程中不断搅拌，反应结束后冷却至室温，真空旋转蒸发去除乙酰溴和冰醋酸，将产物用大量水洗涤至中性，冷冻干燥，得到Ace-EHL-ARG固体，用3500Da透析袋透析1天进行纯化。

对比例4

一种pH响应木质素的制备方法，与实施例1的不同之处在于：

步骤S2中的pH为7。

性能测试

对实施例1～8和对比例1～4得到的不同改性木质素进行表征及性能测试。

测试方法如下：

Zeta电位测试：将实施例1及对比例1提供的改性木质素滴入100mL水中进行分散，用20wt％氢氧化钠及盐酸溶液调节体系pH至不同值，在25℃下利用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定不同pH下的Zeta电位。

粒径及多分散系数(PDI)测试：将实施例1-3提供的改性木质素滴入100mL水中进行分散，分别取1mL液体样品，用超纯水稀释至3mL，在25℃下利用纳米粒度分析仪通过动态光散射法测定纳米粒子的直径。

红外光谱测试：将实施例1及对比例1提供的改性木质素冻干，取两者粉末及酶解木质素粉末各1mg，分别与100mg溴化钾混合均匀，放置在红外干燥器中，快速干燥去除水分后，采用压片机在10MPa下压片1min，使用红外光谱仪进行红外光谱测试。样品扫描的波数范围为4000-400cm^-1。

性能测试结果如下表1～2及图1～3所示：

表1.实施例及对比例的Zeta电位测试数据

表2.实施例1～3所提供木质素的粒径及多分散系数测试数据

由表1可以看出，实施例1～3中由不同氨基酸制备的pH响应木质素，在中性条件下Zeta电位都呈正电，而这三个实施例中所用于接枝的精氨酸、谷氨酸和甘氨酸分别是碱性、酸性和中性的氨基酸，其中接枝了精氨酸的pH响应木质素在中性条件下正电性最强，形成的胶束粒子能较稳定存在。根据实施例1、4～8的结果看来，通过步骤S2的甲基化反应制备pH响应木质素，当反应的温度为本发明优选的130～170℃时，所得pH响应木质素在中性条件下的正电性最强；当反应物的配比为氨基酸接枝木质素和甲基化试剂的质量比为本发明优选的1：15～20时，所制备的pH响应木质素在中性条件下呈现出最强的正电性，虽然根据实施例4，当氨基酸接枝木质素和甲基化试剂的质量比为1：38时，所得pH响应木质素的Zeta电位也较高，但在此反应条件下另一反应物即甲基化试剂并未被最大化利用，造成一定的浪费；除此之外，当反应的pH过高时，由于氨基酸改性木质素与甲基化试剂相溶时发生解聚，结构有所变化，因此最终得到的pH响应木质素，正电性减弱。从实施例1和对比例1～3的结果看来，单一的氨基酸接枝或甲基化改性不能实现木质素在中性条件下的电荷反转，与此同时，根据现有技术制备的乙酰化氨基酸改性木质素，在中性条件下也不能实现电荷反转。

图1分别为木质素、对比例1所得精氨酸改性木质素(EHL-ARG)和实施例1所得pH响应木质素(Me-EHL-ARG)的红外光谱图，从图中可以看出Me-EHL-ARG在1126cm^-1出现明显的C-N伸缩振动峰，在750cm^-1及680cm^-1出现明显的苯环三取代特征峰，说明实施例1成功进行曼尼希反应。从图中还可以看出Me-EHL-ARG在2952cm^-1处有甲基的伸缩振动峰，在1248cm^-1出现明显的Ar-OMe伸缩振动峰，在1040cm^-1出现明显的O-Me伸缩振动峰，并且在1219cm^-1的Ar-OH峰减弱，说明实施例1成功进行了甲基化反应。

图2为实施例1所得pH响应木质素与对比例1所得精氨酸改性木质素在不同pH下的Zeta电位图，从图2可见，两种木质素的Zeta电位随着pH增加而降低，实现了电荷反转，但未甲基化的精氨酸改性木质素等电点在5.5，经过甲基化改性的pH响应木质素等电点在10.5，这是由于实施例1所得pH响应木质素的负电基团被甲基化封闭，木质素表面显现出正电性。

图3为实施例1～3所提供木质素纳米胶粒的粒径及其多分散系数(PDI)对比图，表2为实施例1～3所提供木质素的粒径及多分散系数的具体测试数据。从表2和图3中可以看出，由于精氨酸中的胍基离子化能力较强，接枝精氨酸的pH响应木质素即实施例1产物(Me-EHL-ARG)水溶性较好，因此其纳米粒子的最小粒径较小，但粒径的多分散系数(PDI)较大，即接枝精氨酸的pH响应木质素纳米粒子粒径范围较宽；而实施例2～3所提供的甘氨酸及谷氨酸接枝的pH响应木质素(Me-EHL-GLY及Me-EHL-GLU)亲水性较差，粒径较大，但粒径的多分散系数PDI较小，即粒径范围较窄，粒径大小更均一。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种pH响应木质素的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1.将木质素和氨基酸溶解在碱性溶剂中，加入甲醛进行反应，得到氨基酸改性木质素；

S2.向氨基酸改性木质素中加入甲基化试剂，在碱性条件下反应后即可得到pH响应木质素。

2.如权利要求1所述pH响应木质素的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中氨基酸任意地选自碱性氨基酸、中性氨基酸和酸性氨基酸中的任意一种或多种。

3.如权利要求1所述pH响应木质素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中氨基酸改性木质素和甲基化试剂的质量比为1：(15～20)。

4.如权利要求1所述pH响应木质素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中将pH调节为10～13。

5.如权利要求1所述pH响应木质素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中反应的条件为在130～170℃下反应1～2h。

6.如权利要求5所述pH响应木质素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中反应的条件为在145～165℃下反应1h。

7.如权利要求1所述pH响应木质素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中甲基化试剂任意地选自磷酸三甲酯和碳酸二甲酯中的一种或两种。

8.一种pH响应木质素，其特征在于，所述pH响应木质素由权利要求1～7任一项所述pH响应木质素的制备方法制备得到。

9.一种权利要求8所述pH响应木质素在药物控释方面的应用。

10.一种纳米载药粒子，其特征在于，所述纳米载药粒子的组成包括权利要求8所述pH响应木质素。

Images