CN116120315A

CN116120315A - 一种kras g12c抑制剂及其应用

Info

Publication number: CN116120315A
Application number: CN202310416052.6A
Authority: CN
Inventors: 叶亮; 田京伟; 马明旭; 王文艳; 王洪波; 白信法; 张剑钊
Original assignee: Shandong Luye Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong Luye Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2023-04-19
Filing date: 2023-04-19
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2043-04-19
Also published as: CN116120315B

Abstract

本发明提供了一种式I所示的KRAS G12C抑制剂化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体。本发明还提供了含有化合物I的药物组合物，以及化合物I及其药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。

Description

一种KRAS G12C抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种作为KRAS G12C抑制剂化合物或其药学上可接受的盐，以及作为KRAS G12C突变蛋白抑制剂在预防或治疗相关性疾病中的用途。

背景技术

RAS是最为熟知的癌基因之一。在人类中，三种RAS基因(HRAS、KRAS和NRAS)编码四种高度同源的RAS蛋白(HRAS、KRAS-4A、KRAS-4B和NRAS)。RAS蛋白是小GTP酶，它们作为二元分子开关发挥作用，参与细胞外生长和分化信号传导的转导。

MAPK/ERK信号通路将细胞外刺激传递至细胞核，从而调节包括细胞增殖、分化和凋亡在内的多种细胞响应。KRAS蛋白是MAPK/ERK信号通路的起始因子，并且发挥负责诱导细胞分裂的开关的作用。KRAS 蛋白有“失活”和“激活”两种状态。KRAS与鸟甘三磷酸（GTP）结合时处于激活状态，随后 GTP 酶激活蛋白（GAP）可以将与 KRAS 结合的GTP 水解为 GDP促使 KRAS 处于失活状态。KRAS功能突变增益表现出GTP结合度增加和将GTP转化为GDP的能力下降，结果是MAPK/ERK信号增加，促进癌细胞生长。

KRAS突变种类多，分布范围广。在KRAS第12位的密码子突变中，主要有KRAS G12C、KRAS G12V、KRAS G12D。其中，KRAS突变中约有44%为KRAS G12C，非小细胞肺癌在KRAS G12C突变中最常见，约占14%，其次是大肠癌，占3%-4%；胰腺癌占2%。

目前获批上市的KRAS G12C抑制剂仅安进公司开发的Sotorasib和Mirati公司开发的Adagrasib。同时，仍有多个KRAS G12C抑制剂尚处于临床前或临床研究，如授权公告号为CN112876471B的中国发明专利实施例19公开了具有如下结构式的KRAS G12C抑制剂。

鉴于庞大的临床需求，仍需要继续研究开发更加有效的KRAS G12C抑制剂。

发明内容

经过不断深入研究，本发明提供了一种全新的KRAS G12C抑制剂化合物及其在制备预防或治疗与KRAS G12C突变蛋白抑制剂相关疾病药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种式I所示的化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体，

在一些实施方式中，所述立体异构体具有式I-1所示结构，

本发明还提供了一种药物组合物，包括化合物I或I-1、其药学上可接受的盐或立体异构体以及药学上可接受的载体。所述载体，包括本领域中常规的辅料成分，例如、填充剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂、抗氧化剂和润湿剂等。

所述药物组合物可以制备成药学上可接受的各种剂型，如片剂、胶囊剂、口服液剂、混悬液、颗粒剂、粉剂、微粒剂、丸剂、微型片剂、速溶膜剂、鼻喷雾剂、透皮贴剂、注射剂或各种缓控释制剂等。所述药物组合物可以经口服、经粘膜、经直肠或肠胃外（包括血管内、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内和胸骨内）给药，优选以口服给药。给药剂量可根据患者的年龄、性别和疾病类型进行适当调整。

对于口服给药，所述药物组合物可呈例如片剂、胶囊、液体胶囊、悬浮液或溶液等形式。所述药物组合物优选以含有特定量活性成分的剂量单位形式制得。例如，所述药物组合物可以包含约0.1至1000mg，优选约0.25至250mg，且更优选约0.5至100mg范围内量的活性成分的片剂或胶囊提供。用于人类或其它哺乳动物的适合日剂量可根据患者的病况及其它因素而广泛变化，但可使用常规方法确定。

本发明还提供了化合物I或I-1、其药学上可接受的盐或立体异构体，或其药物组合物在制备预防或治疗与KRAS G12C突变蛋白抑制剂相关疾病药物中的应用。所述KRASG12C突变蛋白抑制剂相关疾病包括癌症，所述癌症包括肺癌、胰腺癌、结直肠癌、胆管癌、肠癌、子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肝癌、腹膜癌、软组织癌、白血病、淋巴癌、乳腺癌、睾丸癌、皮肤癌、食道癌、甲状腺癌、食管癌、骨癌和口腔癌。

定义和说明

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐、有机酸盐，还包括氨基酸（如精氨酸等）的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。

本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，盐的制备方法为：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。

本发明的某些化合物可以具有不对称碳原子（光学中心）或双键。外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单个的异构体都包括在本发明的范围之内。

本发明的化合物可以存在特定的几何或立体异构体形式。本发明设想所有的这类化合物，包括顺式和反式异构体、(-)- 和 (+)-对映体、(R)- 和 (S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些混合物都属于本发明的范围之内。烷基等取代基中可存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物，均包括在本发明的范围之内。

可以通过手性合成或手性试剂或者其他常规技术制备光学活性的(R)-和(S)-异构体以及D和L异构体。如果想得到本发明某化合物的一种对映体，可以通过不对称合成或者具有手性助剂的衍生作用来制备，将所得非对映体混合物分离，并且辅助基团裂开以提供纯的所需对映异构体。或者，当分子中含有碱性官能团（如氨基）或酸性官能团（如羧基）时，与适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构体的盐，然后通过本领域所公知的常规方法进行非对映异构体拆分，然后回收得到纯的对映体。此外，对映异构体和非对映异构体的分离通常通过色谱法完成，所述色谱法采用手性固定相，并任选地与化学衍生法相结合（例如由胺生成氨基甲酸盐）。

本发明意欲包括存在于本发明化合物中的原子的所有同位素。同位素包括原子数相同但质量数不同的那些原子。作为一般实例且非限制性地，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括¹³C和¹⁴C。本发明的同位素标记化合物一般可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于本文所述的方法，使用适当同位素标记试剂代替另外使用的非标记试剂来制备。

化合物经手工或者ChemDraw®软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。

具体实施方式

下面结合具体实施例和试验例，进一步阐述本发明，但不以任何形式限制本发明的范围。

实施例1：化合物I-1的合成

1.1 中间体1-2的合成

将化合物1-1（15.07g, 0.109 mol）溶于N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛（38.5 g,0.324 mol）中，加热至85℃搅拌反应20 h。反应液减压浓缩，得中间体1-2（21.9 g，粗品，棕黄色油状）。直接用于下一步反应。

1.2 中间体1-3的合成

将化合物4-氨基-2,6-二羟基嘧啶（21.0 g, 0.165 mol）溶于乙酸（250 mL）和水（180 mL）的混合溶剂中，加热至90℃，滴加中间体1-2（16.0 g, 82.9 mmol）的二甲基亚砜（70 mL）溶液。90 ℃搅拌反应16 h。反应液过滤，滤饼用乙醇（70 mL）洗涤两次，30 ℃真空干燥，得中间体1-3（20.1 g，收率94.6%，粉红色固体状）。MS (ESI) m/z = 258.1 [M+H]⁺。

1.3 中间体1-4的合成

将中间体1-3（5.04g, 19.6mmol）加至三氯氧磷（125 g）中，加热至105℃搅拌反应18 h。反应液浓缩得油状物，加入二氯甲烷（130 mL）稀释，冷却至-10℃，滴加冰水（50 mL）淬灭，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，用硅胶过滤，滤液浓缩，得中间体1-4（3.59g，收率62.8%，黄色固体状）。MS (ESI) m/z = 294.1 [M+H]⁺。

1.4 中间体1-6的合成

将化合物1-5（75.0 g, 0.481 mol，购自四川嘉瑛莱科技有限责任公司）溶于乙腈（2.25 L），搅拌下加入碳酸钾（200 g，1.45 mol）25 ℃搅拌0.5 h。0 ℃缓慢滴加溴化苄（80.8 g, 0.472 mol）。25 ℃搅拌反应6 h。将反应液过滤，滤液浓缩，所得粗品经硅胶柱层析（石油醚:乙酸乙酯=2:1）纯化，得中间体1-6（60.2g，收率60.9%，黄色油状）。MS (ESI) m/z = 210.1 [M+H]⁺。

1.5 中间体1-7的合成

将Boc-1-氨基环丙基甲酸（70.1 g, 0.349 mol）溶于N,N-二甲基甲酰胺（700 mL）中，依次加入三乙胺（70.5g,0.698 mol）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（80.4 g, 0.419 mol）和1-羟基苯并三唑(56.6 g, 0.419 mol)，25 ℃搅拌反应1 h，加入中间体1-6（60.2g, 0.288 mol），继续搅拌反应18 h。加水（800 mL）淬灭，加乙酸乙酯（500mLx3）萃取。合并有机相，加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，剩余物硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚=20%~100%）纯化，得中间体1-7（46.5 g，收率41.2%，淡黄色油状）。MS (ESI) m/z= 393.2 [M+H]⁺。

1.6 中间体1-8的合成

将中间体1-7（46.5 g, 0.118 mol）溶于二氯甲烷（450 mL），0 ℃加入三氟乙酸（50 mL），25 ℃搅拌反应6 h。反应液浓缩，剩余物溶于二氯甲烷（500 mL），用饱和碳酸氢钠溶液调pH=8。分液，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得中间体1-8（31.7g，粗品，淡黄色油状）。MS (ESI) m/z = 279.2 [M+H]⁺。

1.7 中间体1-9的合成

将中间体1-8（2.00 g，7.18 mmol）加入封管中，氮气吹扫，密封，150 ℃反应20min。得中间体1-9（未处理，直接用于下一步）。

1.8 中间体1-10的合成

将上步所得中间体1-9（35.5 g，粗品）溶于四氢呋喃（600mL）溶解，加入硼氢化钠（24.8 g, 0.656 mol），-10 ℃滴加碘（67.3 g, 0.265 mol）的四氢呋喃（100 mL）溶液，加热至70 ℃搅拌反应16 h。滴加甲醇（30 mL）淬灭反应，浓缩。向所得粗品中加入氢氧化钾溶液（5 M, 200 mL），102 ℃搅拌反应6 h。加入二氯甲烷（200 mLx3）萃取，合并有机相，加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得中间体1-10（34.8 g，粗品，黄色油状）。MS (ESI) m/z =233.2 [M+H]⁺。

1.9 中间体1-11的合成

将中间体1-10（34.8 g，粗品）溶于乙腈（700 mL），加入二碳酸二叔丁酯（68.5 g,0.314 mol），25 ℃搅拌反应18 h。反应液浓缩，剩余物硅胶柱层析（石油醚:乙酸乙酯=10:1）纯化，得中间体1-11（20.5 g，收率47.5%，白色固体状）。MS (ESI) m/z = 333.2 [M+H]⁺。

1.10 中间体1-12的合成

将中间体1-11（20.5 g，0.0617 mol）溶于二氯甲烷（200 mL），0 ℃加入三乙胺（30.4 g，0.301 mol），滴加甲磺酰氯（17.2 g，0.150 mol）。25 ℃搅拌反应4 h。加水（200mL）淬灭，加入二氯甲烷（200 mLx3）萃取。合并有机相，加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，剩余物硅胶柱层析（石油醚:乙酸乙酯=2:1）纯化，得中间体1-12（20.3 g，收率93.6%，淡黄色油状）。MS (ESI) m/z = 351.2 [M+H]⁺。

1.11 中间体1-13的合成

将中间体1-12（20.0 g, 57.1 mmol）溶于乙腈（300 mL），加入碘化钠（10.2 g,68.3 mmol），三乙胺（17.3 g, 171 mmol），四丁基氟化铵（44.7 g, 171 mmol）和三甲基氰硅烷（17.0 g, 171 mmol）。加热至75 ℃搅拌反应18 h。加5%碳酸钠溶液（300 mL）淬灭，加乙酸乙酯（200 mLx3）萃取。合并有机相，加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，剩余物硅胶柱层析（石油醚:乙酸乙酯=5:1）纯化，得中间体1-13（17.8 g，收率91.5%，棕色油状）。MS(ESI) m/z = 342.2 [M+H]⁺。

1.12 中间体1-14的合成

将中间体1-13（1.72 g, 5.04 mmol）溶于二氯甲烷（20 mL），0 ℃加入三氟乙酸（5mL）。室温搅拌反应16 h。反应液浓缩，得中间体1-14 (1.05 g，粗品，棕色油状)。直接用于下一步反应。MS (ESI) m/z = 242.2 [M+H]⁺。

1.13 中间体1-15的合成

将中间体1-14（0.84g，粗品）溶于N,N-二甲基乙酰胺（10 mL），加入中间体1-4（1.05 g, 3.58 mmol）和二异丙基乙胺（1.42 g, 11.0 mmol）。室温搅拌16 h。加水（100mL）淬灭，加乙酸乙酯（50 mLx3）萃取，合并有机相，加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析（石油醚:乙酸乙酯=5:1）纯化，得中间体1-15（0.89g，收率49.7%，淡黄色固体状）。MS (ESI) m/z = 499.2 [M+H]⁺。

1.14 中间体1-16的合成

将N-甲基-L-脯氨醇（0.22 g, 1.91mmol）溶于四氢呋喃（10 mL），0 ℃加入氢化钠（0.078 g, 1.95 mmol），搅拌反应0.5 h，加入中间体1-15（0.71g, 1.42mmol）。室温搅拌反应18 h。反应液浓缩，剩余物硅胶柱层析（二氯甲烷:甲醇=10:1）纯化，得中间体1-16（0.68g, 收率82.9%，淡黄色固体状）。MS (ESI) m/z = 578.3 [M+H]⁺。

1.15 中间体1-17的合成

将中间体1-16（0.68 g, 1.18 mmol）溶于乙腈（15 mL）和水（3 mL）的混合溶剂中，加入硝酸铈铵（1.37 g, 2.34 mmol）。室温搅拌反应6 h。加入饱和碳酸氢钠溶液（30 mL）淬灭，加乙酸乙酯（30 mLx3）萃取。合并有机相，加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，硅胶柱层析（乙酸乙酯:甲醇=10:1）纯化，得中间体1-17（0.17g, 收率29.6%，淡黄色固体状）。MS(ESI) m/z = 488.2 [M+H]⁺。

1.16 化合物I-1的合成

将2-氟丙烯酸（37.1 mg，0.41 mmol）溶于四氢呋喃（20 mL），0℃加入1滴N,N-二甲基甲酰胺和草酰氯（56.6 mg, 0.44 mmol），搅拌反应1 h，加入中间体1-17（170 mg, 0.349mmol）。室温搅拌反应16 h。加入20%碳酸钠溶液（50 mL）淬灭，加乙酸乙酯（30 mLx3）萃取。合并有机相，加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，剩余物硅胶柱层析（二氯甲烷:甲醇=10:1）纯化，得化合物I-1（54.8 mg，收率28.8%，淡黄色固体状）。MS (ESI) m/z = 560.2 [M+H]⁺。¹H NMR (400MHz, CDCl₃) δ 8.29-8.25(m, 2H), 7.84 - 7.81(m, 1H), 7.51 - 7.46(m, 1H), 7.35 - 7.31(m, 1H), 7.24 - 7.19(m, 1H), 5.63 - 5.23(m, 2H), 5.17 -4.41(m, 4H), 3.95 - 2.65(m, 5H), 2.56(s, 3H), 2.44 - 1.66(m, 7H), 1.03 - 0.81(m, 4H)。

试验例1. 化合物I-1和KRAS G12C蛋白亲和实验

1.实验方法

首次解冻2×KRAS G12C缓冲液、DTT（0.5 M）和载有KRAS（G12C）的BODIPY-GDP。同时制备含有1mM DTT和所需初级反应溶液（15μL）的1×KRAS G12C缓冲液（5μL BODIPY-GDP与10μL 1×KRAS G12C缓冲溶液混合，用于一个孔所需的初级反应溶液），并向每个孔中加入15μL初级反应溶液。然后制备含有检测化合物的5%DMSO溶液，设定浓度梯度为10μM、3.33μM、0.37μM、0.12μM、0.04μM、0.13μM，0.005μM、0.0015μM、0.0005μM、0.00015μM。每孔加入5μL样品，离心以确保样品充分混合，然后将平板在室温下孵育2小时。然后解冻GTP（10μM）和EDTA（0.5 M），用水制备10μM GTP溶液，将GTP（10μM）与EDTA（25 mM）溶液按1:1的比例混合。在室温下孵育2小时后，通过加入5μL GTP/EDTA混合物引发反应，并在室温下培养1小时。1小时后测量Em470nm/Em525荧光强度。

2、测试结果

化合物对KRAS G12C（GDP）的亲和力，IC₅₀见表1。

表1 化合物对KRAS G12C（GDP）的亲和力

*即CN112876471B实施例19公开的化合物

结论：本发明的化合物I-1相对于实施例19对KRAS G12C（GDP）具有更好的亲和力。

试验例2. 化合物对Mia-Pa-Ca-2胰腺癌细胞增殖的抑制作用

1、实验目的

测定化合物I-1对Mia-Pa-Ca-2胰腺癌细胞体外增殖的抑制作用，根据IC₅₀评价化合物的活性。

2、实验方法

Mia-Pa-Ca-2胰腺癌细胞采用含10%胎牛血清（Hyclone，SV30087.03）、1640培养基（Gibco，22400089）进行培养。实验第一天，离心、消化、收集细胞后，用完全培养基调整细胞浓度，以2400个/孔细胞密度接种于96孔板内，每孔100 μL细胞悬液，将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中过夜。第二天，化合物用100% DMSO配制成10 mM储备液，并用1640培养基进一步稀释至5 μM（10X），随后进行4倍浓度梯度稀释，共8个浓度点。于培养板内每孔加入10 μL对应化合物，37℃、5% CO₂培养箱中培养3天。培养板内每孔加入25 μLCellTiter-Glo（Promega，G7573），400转/分的转速在室温下孵育10分钟后，Envision（PerkinElmer）中读取发光信号。抑制率通过以下公式进行计算，即%Inhibition=（Assay well-Average_HC）/（Average_LC-Average_HC）*100%，采用Prism 5“log（inhibitor）vs. response --Variable slope”拟合剂量-效应曲线，计算IC₅₀。

3、测定结果

化合物对Mia-Pa-Ca-2细胞的增殖抑制作用通过CellTiter-Glo检测活细胞内ATP含量进行测定，测得的IC₅₀见表2。

表2 化合物对Mia-Pa-Ca-2细胞增殖的抑制作用

*即CN112876471B实施例19公开的化合物

结论：相对于实施例19，本发明公开的化合物I-1对Mia-Pa-Ca-2细胞的增殖具有更好的抑制作用。

试验例3. 渗透性及转运体底物评价

细胞：Caco-2细胞

仪器：纯水仪，ELGA LabWate；生物安全柜，Nuaire；恒温CO₂培养箱，Thermo；酶标仪，PerkinElmer；LC-MS/MS，AB SCIEX。

方法：本研究的目的是采用Caco-2单层细胞模型测定化合物的双向渗透性并评估其是否被P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）外排转运。实验中将Caco-2细胞接种到96孔细胞板，连续培养24天后用于转运实验。在含有或不含维拉帕米的情况下，化合物双向给药，给药浓度为2.00µM。孵育120分钟后，收集顶端A和基底端B的样品，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法来检测供试品在各样品中的含量。计算表观渗透系数以及外排率。数据汇总如表3。

表3 渗透性实验结果

*即CN112876471B实施例19公开的化合物

结论：本发明公开的化合物I-1在Caco-2细胞中表现出中等渗透性，外排率较低，显著优于实施例19。

Claims

1.式I所示的化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体，

。

2.根据权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体，其中所述立体异构体具有式I-1所示结构，

。

3.一种药物组合物，包括权利要求1-2任一所述的化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体和药学上可接受的载体。

4. 权利要求1-2任一所述化合物、其药学上可接受的盐或立体异构体或权利要求3所述药物组合物在制备治疗与KRAS G12C突变蛋白抑制剂相关疾病药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述疾病为癌症。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述癌症选自肺癌、胰腺癌、结直肠癌、胆管癌、肠癌、子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌、肝癌、腹膜癌、软组织癌、白血病、淋巴癌、乳腺癌、睾丸癌、皮肤癌、食道癌、甲状腺癌、食管癌、骨癌和口腔癌。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述癌症为肺癌、胰腺癌、结直肠癌。