CN116120214A - 一种利用色谱技术提取l-瓜氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种利用色谱技术提取L‑瓜氨酸的方法，包括如下步骤：（1）陶瓷膜过滤；（2）活性炭脱色；（3）脱色膜脱色；（4）色谱分离；（5）蒸发浓缩；（6）结晶；（7）离心干燥，得成品L‑瓜氨酸。本发明发酵效率高，提取过程基本实现了L‑瓜氨酸与蛋白质、糖、无机盐、杂酸之间的彻底分离，提取过程全自动化，劳动强度低，生产成本降低，适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用色谱技术提取L-瓜氨酸的方法。
背景技术
L-瓜氨酸（L-Citrulline）是一种非蛋白质ａ-氨基酸，又名氨基甲酰鸟氨酸，其纯品为白色结晶，呈柱状，其分子式为C6H13N3O3，分子质量为175.19，能溶于水，微溶于乙醇和乙醚，其熔点为222ºC，等电点为5.92，比旋光度为[α]D 25=21.0。
L-瓜氨酸是一种重要的非必需氨基酸，是尿素循环过程中的重要中间体，具有很多重要的生理功能如清除自由基、异体排斥效应指示剂、血管舒张作用、稳定血压以及诊断类风湿关节炎、抗氧化等；此外，它还有着非常显著的恢复精力和提高人体免疫力的作用。近年来L-瓜氨酸在食品、化妆品和药物等领域越来越来受到重视，具有广泛的开发应用前景。
L-瓜氨酸的生产方法目前主要有化学合成法，酶法，提取法和发酵法。
化学合成法生产瓜氨酸是在碱性条件下水解精氨酸得到瓜氨酸，生产过程难以准确控制，产物中含有D-瓜氨酸，影响产品纯度，并且污染环境。酶法合成瓜氨酸的优点是产物浓度高，纯化步骤少，但其缺点是很难满足工业生产的要求，原因是精氨酸脱亚氨基酶的活性较低，转化率较低，同时会产生杂酶，影响瓜氨酸的生产。提取法是指从富含有瓜氨酸的天然产物中分离提纯瓜氨酸，瓜氨酸在天然产物中的含量极其有限，生产规模小，分离纯化工艺复杂繁琐，产品收率低，成本高，经济收益低等缺陷使得提取法受到了很大的限制。
目前，L-瓜氨酸的生产方法主要是发酵法，发酵法生产L-瓜氨酸得以工业化生产还依赖于L-瓜氨酸分离提取技术，目前国内外L-瓜氨酸的分离提取几乎都采用以离子交换柱分离法，此法虽然可以进行大规模制备，但是产品成本高，且交换树脂用量庞大，洗脱和再生酸碱消耗太多，造成严重的环境污染，另外L-瓜氨酸在强碱和强酸环境容易导致收率低，纯度不高。
发明内容
为解决L-瓜氨酸提取工艺存在的问题，本发明提供了一种收率高，成本低，节能降耗的高效率L-瓜氨酸提取新工艺。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
一种利用色谱技术提取L-瓜氨酸的方法，其包括如下步骤：（1）陶瓷膜过滤；（2）活性炭脱色；（3）脱色膜脱色；（4）色谱分离；（5）蒸发浓缩；（6）结晶；（7）离心干燥。
进一步地，所述方法包括如下步骤 ：
步骤1）陶瓷膜过滤：将L-瓜氨酸发酵液调pH至3.0-5.0，经陶瓷膜过滤，除去菌体、大分子蛋白和其他颗粒杂质，收集陶瓷膜清液；
步骤2）活性炭脱色：将步骤1）所得陶瓷膜清液打往脱色罐，加入活性炭脱色，过滤，收集脱色液；
步骤3）脱色膜脱色：将步骤2）所得脱色液打往脱色膜中进行二次脱色处理，收集脱色清液；
步骤4）色谱分离：将步骤3）所得脱色清液经蒸发浓缩后加入弱酸阳离子树脂色谱柱进行吸附，收集L-瓜氨酸水溶液；
步骤5）蒸发浓缩：将步骤4）收集的L-瓜氨酸水溶液进行四效蒸发浓缩，当蒸发浓缩至浓度为400-600g/L，出现轻微结晶后打往双效进行浓缩，收集浓缩液；
步骤6）结晶：将步骤5）收集的浓缩液进行结晶，得到析出L-瓜氨酸晶体的溶液；
步骤7）离心干燥：将步骤6）所得析出晶体的溶液打往离心机进行离心处理，将离心所得L-瓜氨酸湿品进行真空干燥，得L-瓜氨酸成品。
优选地，所述步骤 1）中，调pH为3.5-4.5。
优选地，所述陶瓷膜孔径大小为50nm，过膜温度控制在60-65℃，进膜操作压力控制在0.4-0.5Mpa。
优选地，所述脱色参数为：加入0.3-0.6%的活性炭，脱色时间为30-50min，脱色温度为50-70℃。
优选地，所述结晶工艺为：4℃条件下冷却结晶8-12h。
优选地，所述脱色膜的进膜压力0 .9Mpa，出膜压力0 .8Mpa，料液流速控制在120mL/min。
优选地，所述弱酸阳树脂型号为：PK-3211Na，上柱流速为2-5m3/h，PH为5.0-6.0，上柱及洗脱柱温度控制在40℃左右。
优选地，所述蒸发浓缩的温度控制在60-85℃。
优选地，所述步骤7）中，分离时间控制在20-60min，真空干燥的温度控制在120-145℃。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性：
1、本发明采用色谱分离技术分离L-瓜氨酸发酵液，得到L-瓜氨酸产品。与传统的离子交换柱分离法相比收率提高，且分离得到的L-瓜氨酸纯度更高，可达到99%以上。
2、本发明采用树脂对L-瓜氨酸与蛋白质、糖、色素、无机盐等杂质的吸附性不同，基本实现L-瓜氨酸、蛋白质、糖、色素、无机盐等杂质的完全分离。
3、本发明生产过程全自动化，劳动强度低，节约成本。
4、本发明生产过程中不产生离子交换，可以将发酵废液制成菌体蛋白饲料和有机无机复混肥，全过程没有污染产生，绿色环保。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例 1
一种利用色谱技术提取L-瓜氨酸的方法，具体步骤如下：
步骤1）陶瓷膜过滤：将L-瓜氨酸发酵液调pH至4.0，经陶瓷膜过滤，除去菌体、大分子蛋白和其他颗粒杂质，收集陶瓷膜清液；所述陶瓷膜孔径大小为50nm，过膜温度控制在60℃，进膜操作压力控制在0.4Mpa；
步骤2）活性炭脱色：将步骤1）所得陶瓷膜清液打往脱色罐，加入0.5%的活性炭（即活性炭的加入量为清液重量的0.5%）进行脱色，脱色时间为30min，脱色温度为50℃，过滤，收集脱色液；
步骤3）脱色膜脱色：将步骤2）所得脱色液打往脱色膜中进行二次脱色处理，收集脱色清液；所述脱色膜的进膜压力0 .9Mpa，出膜压力0 .8Mpa，料液流速控制在120mL/min；
步骤4）色谱分离：将步骤3）所得脱色清液经蒸发浓缩后加入弱酸阳离子树脂色谱柱进行吸附，收集L-瓜氨酸水溶液；所述弱酸阳树脂型号为：PK-3211Na，上柱流速为2-5m3/h，PH为5.0-6.0，上柱及洗脱柱温度控制在40℃左右；
步骤5）蒸发浓缩：将步骤4）收集的L-瓜氨酸水溶液进行四效蒸发浓缩，当浓缩至浓度为400g/L，出现轻微结晶后打往双效进行浓缩，收集浓缩液；
步骤6）结晶：将步骤5）收集的浓缩液在4℃条件下冷却结晶10h，得到析出L-瓜氨酸晶体的溶液；
步骤7）离心干燥：将步骤6）所得析出晶体的溶液打往离心机进行离心处理，将离心所得L-瓜氨酸湿品进行真空干燥，得L-瓜氨酸成品；所述分离时间控制在60min，真空干燥的温度控制在120℃。经过检测，L-瓜氨酸收率为 81.4%，纯度为99.3%。
实施例2
一种利用色谱技术提取L-瓜氨酸的方法，具体步骤如下：
步骤1）陶瓷膜过滤：将L-瓜氨酸发酵液调pH至4.5，经陶瓷膜过滤，陶瓷膜的孔径为 500nm，除去菌体、大分子蛋白和其他颗粒杂质，收集陶瓷膜清液；所述陶瓷膜孔径大小为50nm，过膜温度控制在65℃，进膜操作压力控制在0.5Mpa。
步骤2）活性炭脱色：将步骤1）所得陶瓷膜清液打往脱色罐，加入0.4%的活性炭进行脱色，脱色时间为40min，脱色温度为55℃，过滤，收集脱色液；
步骤3）脱色膜脱色：将步骤2）所得脱色液打往脱色膜中进行二次脱色处理，收集脱色清液；所述脱色膜的进膜压力0 .9Mpa，出膜压力0 .8Mpa，料液流速控制在120mL/min；
步骤4）色谱分离：将步骤3）所得脱色清液经蒸发浓缩后加入弱酸阳离子树脂色谱柱进行吸附，收集L-瓜氨酸水溶液；所述弱酸阳树脂型号为：PK-3211Na，上柱流速为2-5m3/h，PH为5.0-6.0，上柱及洗脱柱温度控制在40℃左右；
步骤5）蒸发浓缩：将步骤4）收集的L-瓜氨酸水溶液进行四效蒸发浓缩，当浓缩至浓度为450g/L，出现轻微结晶后打往双效进行浓缩，收集浓缩液；
步骤6）结晶：将步骤5）收集的浓缩液在4℃条件下冷却结晶12h，得到析出L-瓜氨酸晶体的溶液；
步骤7）离心干燥：将步骤6）所得析出晶体的溶液打往离心机进行离心处理，将离心所得L-瓜氨酸湿品进行真空干燥，得L-瓜氨酸成品；所述分离时间控制在30min，真空干燥的温度控制在135℃。经过检测，L-瓜氨酸收率为 81.1%，纯度为99.0%。
实施例3
一种利用色谱技术提取L-瓜氨酸的方法，具体步骤如下：
步骤1）陶瓷膜过滤：将L-瓜氨酸发酵液调pH至3.5，经陶瓷膜过滤，陶瓷膜的孔径为 500nm，除去菌体、大分子蛋白和其他颗粒杂质，收集陶瓷膜清液；所述陶瓷膜孔径大小为50nm，过膜温度控制在65℃，进膜操作压力控制在0.4Mpa；
步骤2）活性炭脱色：将步骤1）所得陶瓷膜清液打往脱色罐，加入0.3%的活性炭进行脱色，脱色时间为50min，脱色温度为60℃，过滤，收集脱色液；
步骤3）脱色膜脱色：将步骤2）所得脱色液打往脱色膜中进行二次脱色处理，收集脱色清液；所述脱色膜的进膜压力0 .9Mpa，出膜压力0 .8Mpa，料液流速控制在120mL/min；
步骤4）色谱分离：将步骤3）所得脱色清液经蒸发浓缩后加入弱酸阳离子树脂色谱柱进行吸附，收集L-瓜氨酸水溶液；所述弱酸阳树脂型号为：PK-3211Na，上柱流速为2-5m3/h，PH为5.0-6.0，上柱及洗脱柱温度控制在40℃左右；
步骤5）蒸发浓缩：将步骤4）收集的L-瓜氨酸水溶液进行四效蒸发浓缩，当浓缩至浓度为450g/L，出现轻微结晶后打往双效进行浓缩，收集浓缩液；
步骤6）结晶：将步骤5）收集的浓缩液在4℃条件下冷却结晶11h，得到析出L-瓜氨酸晶体的溶液；
步骤7）离心干燥：将步骤6）所得析出晶体的溶液打往离心机进行离心处理，将离心所得L-瓜氨酸湿品进行真空干燥，得L-瓜氨酸成品；所述分离时间控制在40min，真空干燥的温度控制在130℃。经过检测，L-瓜氨酸收率为 80.1%，纯度为99.4%。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种利用色谱技术提取L-瓜氨酸的方法，其包括如下步骤：（1）陶瓷膜过滤；（2）活性炭脱色；（3）脱色膜脱色；（4）色谱分离；（5）蒸发浓缩；（6）结晶；（7）离心干燥。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤 ：
步骤1）陶瓷膜过滤：将L-瓜氨酸发酵液调pH至3.0-5.0，经陶瓷膜过滤，除去菌体、大分子蛋白和其他颗粒杂质，收集陶瓷膜清液；
步骤2）活性炭脱色：将步骤1）所得陶瓷膜清液打往脱色罐，加入活性炭脱色，过滤，收集脱色液；
步骤3）脱色膜脱色：将步骤2）所得脱色液打往脱色膜中进行二次脱色处理，收集脱色清液；
步骤4）色谱分离：将步骤3）所得脱色清液经蒸发浓缩后加入弱酸阳离子树脂色谱柱进行吸附，收集L-瓜氨酸水溶液；
步骤5）蒸发浓缩：将步骤4）收集的L-瓜氨酸水溶液进行四效蒸发浓缩，当蒸发浓缩至浓度为400-600g/L，出现轻微结晶后打往双效进行浓缩，收集浓缩液；
步骤6）结晶：将步骤5）收集的浓缩液进行结晶，得到析出L-瓜氨酸晶体的溶液；
步骤7）离心干燥：将步骤6）所得析出晶体的溶液打往离心机进行离心处理，将离心所得L-瓜氨酸湿品进行真空干燥，得L-瓜氨酸成品。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤 1）中，调pH为3.5-4.5。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述陶瓷膜孔径大小为50nm，过膜温度控制在60-65℃，进膜操作压力控制在0.4-0.5Mpa。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱色参数为：加入0.3-0.6%的活性炭，脱色时间为30-50min，脱色温度为50-70℃。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述结晶工艺为：4℃条件下冷却结晶8-12h。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱色膜的进膜压力0 .9Mpa，出膜压力0 .8Mpa，料液流速控制在120mL/min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述弱酸阳离子树脂型号为：PK-3211Na，上柱流速为2-5m3/h，pH为5.0-6.0，上柱及洗脱柱温度控制在40℃左右。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蒸发浓缩的温度控制在60-85℃。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤7）中，分离时间控制在20-60min，真空干燥的温度控制在120-145℃。
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