CN116115630A - 一种基于人工合成寡核苷酸有效抑制hiv-1病毒组装的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于人工合成寡核苷酸有效抑制HIV‑1病毒组装的方法。该方法首先设计一系列人工合成的RNA寡核苷酸，使其自组装得到空间结构更加复杂、具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料。然后利用RNA寡核苷酸及其自组装纳米材料有效结合HIV‑1结构蛋白Gag分子，从而干扰病毒组装，有效抑制HIV‑1病毒的释放。本发明首次实现使用人工合成的RNA寡核苷酸以及自组装纳米材料抑制HIV‑1病毒的组装，拓展了RNA寡核苷酸在生物医学领域的应用，为疾病治疗提供了新的思路。

Description

一种基于人工合成寡核苷酸有效抑制HIV-1病毒组装的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种可在活细胞中有效干扰HIV-1病毒组装的方法。

背景技术

I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的组装和释放过程是其生命周期的重要阶段，该过程主要由Gag蛋白质介导，Gag以病毒RNA分子作为骨架，在细胞膜上发生聚合，组装形成病毒颗粒后从宿主细胞的细胞膜释放。迄今为止，有大量研究结果证明Gag-RNA相互作用对于病毒组装具有关键作用，细胞膜上组装中的Gag分子能够与多种RNA发生相互作用，包括病毒RNA和细胞内源的RNA(Selective and nonselective packaging of cellular RNAs inretrovirus particles.(J Virol.2007；81(12):6623-6631.))等。体外水溶液实验显示，在一定的RNA长度范围内，与Gag互作的RNA越长，Gag组装的程度越强(Self-assembly invitro of purified CA-NC proteins from Rous sarcoma virus and humanimmunodeficiency virus type 1(J Virol.1995；69(10):6487-6497.))。

2014年，Chen等提出了利用天然小RNA阻断病毒颗粒组装的概念。研究发现，细胞普遍存在的微小RNA(miRNA)分子能够结合Gag蛋白，扰乱Gag在病毒RNA上的多聚化过程，造成病毒颗粒组装失败。这些组装失败的Gag蛋白将被宿主细胞以内吞的途径运输到细胞质中，在溶酶体内进行降解(MicroRNA binding to the HIV-1 Gag protein inhibits Gagassembly and virus production(Proc Natl Acad Sci U S A.2014 Jul 1；111(26):E2676–E2683.))。2017年，Qu等进一步揭示了自噬在miRNA-Gag相互作用抑制病毒组装过程中的作用(Inhibition of retroviral Gag assembly by non-silencing miRNAspromotes autophagic viral degradation(Protein Cell.2018；9(7):640–651.))。

尽管具备上述优点，miRNA在用于抑制病毒组装时仍存在一些问题。例如，需要对细胞进行过表达miRNA的实验，但难以控制miRNA的表达量；所选miRNA局限于生物内源的分子种类，因此序列、结构、碱基构成、分子大小和化学修饰类型有限。

RNA分子碱基互补的特性可以帮助核酸链自组装形成复杂的纳米结构，作为一种天然的生物材料具有可修饰性高、热稳定性好、生物安全性高等优势。研究者已证实可基于碱基的互补特性设计多个核酸链，使其在水溶液中自组装形成大小可控的RNA纳米颗粒，并证实某些RNA颗粒可在细胞中甚至活体内具有生物学功能。目前，使用特殊RNA序列或结构作为自组装材料已经成为一个快速发展的研究领域(Advancement of the emergingfield of RNA nanotechnology(ACS Nano.2017；11(2):1142-1164.))。

发明内容

针对上述用miRNA抑制病毒组装的不足之处，本发明设计了一系列人工合成的RNA寡核苷酸，发现Gag蛋白在细胞膜上对茎环结构的RNA寡核苷酸具有结合倾向性，且该结合可以干扰病毒组装。将此概念引入设计可自组装的RNA原件，得到空间结构更加复杂、具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料，进一步提升人工合成的RNA寡核苷酸对HIV-1病毒组装的抑制效果。

具体的，本发明首先提供了一种可有效结合HIV-1结构蛋白Gag分子的人工合成茎环结构寡核苷酸，这种寡核苷酸可通过自组装(Controllable self-assembly of RNAtetrahedrons with precise shape and size for cancer targeting(Adv Mater.2016；28(34):7501-7.))的方法建立空间结构更加复杂的RNA自组装纳米材料。

可自组装成具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料的RNA寡核苷酸可以是具有如下特征的寡核苷酸链：

1、具有茎环结构，在茎环结构的5’或3’端具有延长的单链，该延长的单链长度优选为16～20nt；

2、茎环结构中的环结构由15～25个碱基组成，茎结构的长度至少为4个碱基对；可以通过UNAFold等软件验证设计的RNA寡核苷酸是否具有茎环结构；

3、不同RNA寡核苷酸之间通过位于茎环结构5’或3’端的单链进行互补，自组装形成空间结构更加复杂的RNA自组装纳米材料；可以通过自由设计单链的序列，以碱基互补配对的原理，实现两种、三种甚至更多RNA寡核苷酸之间的组装(参见图2)；

4、RNA寡核苷酸序列为无义寡核苷酸序列，即应当与人类基因组、病毒基因组没有同源性。

基于上述RNA寡核苷酸，本发明提供了一种抑制HIV-1病毒组装的方法，包括以下步骤：

1)设计能够自组装成具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料的至少两种RNA寡核苷酸，然后人工合成所述RNA寡核苷酸；

2)将步骤1)合成的多种RNA寡核苷酸在1×Tris缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris，pH 8.0)中等摩尔浓度混合后，进行高温解链-缓慢降温退火，通过各个RNA寡核苷酸单体中位于茎环结构5’或3’端的单链进行互补，从而实现自组装；然后对产物进行纯化，得到具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料；

3)用所述RNA自组装纳米材料转染感染了HIV-1病毒的细胞，干扰细胞内HIV-1病毒的组装。

步骤1)所设计的RNA寡核苷酸应为与人类基因组、病毒基因组没有同源性的无义寡核苷酸序列；具有茎环结构，并在茎环结构的5’或3’端具有延长的单链；在步骤2)中，各个RNA寡核苷酸单体通过位于茎环结构5’或3’端延长的单链进行互补来实现自组装，例如：两个RNA寡核苷酸单体自组装形成哑铃形结构的RNA自组装纳米材料，三个RNA寡核苷酸单体自组装形成“Y”形结构的RNA自组装纳米材料。

优选地，步骤1)设计的RNA寡核苷酸的茎环结构中，环结构由15～25nt组成，茎结构的长度至少为4个碱基对，所述延长的单链长度为16～20nt。

进一步地，为在细胞环境中抵抗核酸酶的降解，所述RNA寡核苷酸是所有碱基皆为2’-O-甲基化修饰的寡核苷酸。也可以使用其他具有抗核酸酶降解能力的化学修饰，例如硫代磷酸(phosphorothioate，PS)修饰、锁核酸(locked nucleic acid，LNA)修饰、吗啉基(morpholino)修饰等。

在本发明的实施例中，设计了如序列表中的SEQ ID No：1至SEQ ID No：4所示的四种RNA寡核苷酸，其中，将SEQ ID No：1和2所示的RNA寡核苷酸等量混合后自组装，可形成哑铃形结构的RNA自组装纳米材料；将SEQ ID No：1、3和4所示的RNA寡核苷酸等量混合后自组装，可形成“Y”形结构的RNA自组装纳米材料，如图2所示。

优选地，在步骤2)中使用3000NMWL纤维素过滤柱对自组装产物进行纯化。

优选地，在步骤3)采用电转染的方法使所述RNA自组装纳米材料转染细胞。

在本发明的实施例中，通过下述实验验证了本发明技术方案的可行性和有效性：

1)培养细胞，转染病毒基因载体pNL43ΔPolΔEnv-Gag，在细胞中表达病毒RNA与Gag蛋白质；

2)电转染RNA寡核苷酸或其自组装纳米材料，进行Gag-RNA寡核苷酸免疫共沉淀，测定二者的相互作用情况，即用特异性抗体提取细胞膜上的Gag蛋白质，检测免疫沉淀物中RNA寡核苷酸的富集程度，分析不同寡核苷酸与细胞膜上Gag分子结合的能力；

3)电转染RNA寡核苷酸或其自组装纳米材料，进行病毒颗粒释放效率分析，即通过western blot方法测定HIV-1病毒受到RNA寡核苷酸或其自组装纳米材料干扰后的释放效率，证实本方法的有效性。

本发明的有益效果：

本发明通过自组装的方法构建了具有复杂空间结构的RNA自组装纳米材料，进一步提高了人工合成的RNA寡核苷酸抑制病毒组装的能力。利用人工合成小分子RNA易操作、可控性高的特性，有效抑制HIV-1病毒的释放，拓展了RNA寡核苷酸在生物医学领域的应用。这是首次实现使用人工合成的RNA寡核苷酸以及自组装纳米材料抑制HIV-1病毒的组装，为疾病治疗提供了新的思路。

附图说明

图1.(A)茎环结构寡核苷酸与细胞膜上HIV-1病毒Gag蛋白质的相互作用(B)茎环结构寡核苷酸对HIV-1病毒释放的抑制效果。图中数值代表平均值±标准误。星号(*)代表显著性差异(独立样本T检验，**P<0.01,***P<0.001)。

图2.茎环结构寡核苷酸自组装纳米颗粒示意图。DB由等量混合MoD#1和MoD#2组成，TB由等量混合MoD#1，MoD#3和MoD#4组成。

图3.茎环结构寡核苷酸、自组装纳米颗粒对HIV-1病毒释放效率的影响。图中数值代表平均值±标准误。星号(*)代表显著性差异(单因素ANOVA检验、雪费事后比较，*P<0.05,***P<0.001)。

图4.自组装纳米颗粒对HIV-1病毒释放的抑制效果与作用浓度有关。图中数值代表平均值±标准误。星号(*)代表显著性差异(单因素ANOVA检验、雪费事后比较，**P<0.01,***P<0.001)。

具体实施方式

下面的实施例对本发明开发的茎环结构寡核苷酸对于HIV-1病毒释放的抑制作用进行说明。

病毒RNA与Gag蛋白质的相互作用对于病毒组装具有关键作用，介导了数千个Gag蛋白质在细胞膜上组装。本实施例通过转入人工合成的RNA寡核苷酸，使其结合细胞膜上的Gag蛋白质，从而与病毒RNA形成竞争，干扰病毒RNA-Gag相互作用，最终抑制病毒颗粒的组装和释放。具体实施方式如下。

1试剂与仪器

1.1主要试剂与材料

1)无义寡核苷酸序列(可委托Integrated DNA Technologies公司合成)

表1

表1中，具有茎环结构的寡核苷酸Module 1和Module 2等量混合自组装成哑铃形结构的纳米颗粒，如图2中Dumbbell所示；具有茎环结构的寡核苷酸Module 1、Module 3和Module 4等量混合自组装成分叉的“Y”形结构的纳米颗粒，如图2中Tribell所示。

2)质粒pNL43ΔPolΔEnv-Gag(用于表达Gag蛋白质以及病毒RNA)(MicroRNAbinding to the HIV-1 Gag protein inhibits Gag assembly and virus production(Proc Natl Acad Sci U S A.2014；111(26):E2676–E2683.))。

3)质粒提取试剂盒(可购于Omega Bio-tek公司)。

4)人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)。

5)含10％(vol/vol)胎牛血清(可购于PAN^TM Biotech公司)和1×GlutaMAX^TM(可购于Thermo Fisher公司)的DMEM培养基(可购于CORNING公司)；10×PBS(可购于CORNING公司)；胰蛋白酶(可购于Thermo Fisher公司)。

6)转染试剂

6(可购于Promega公司)。

7)

电转试剂盒(可购于英潍捷基公司)、Minute^TM细胞膜蛋白分离试剂盒(可购于英文特公司)。

8)Gag-RNA寡核苷酸的免疫共沉淀(IP)所需试剂：IP裂解液、Brij缓冲液、Brij封闭液(所有配方见具体实验步骤)。

9)RNA自组装纳米颗粒的合成和纯化所需试剂：10×Tris缓冲液、1×TBM缓冲液、RNA胶(所有配方见具体实验步骤)。

10)Western Blot检验病毒释放效率所需试剂：细胞裂解缓冲液、电泳缓冲液、转膜缓冲液、TBST溶液、封闭液(所有配方见具体实验步骤)。

11)抗体：HIV-Ig(来自NIH)、抗p24抗体(可购于EMD Millipore)、抗化学染料FAM抗体(可购于Abcam)。

1.2主要仪器

1)凝胶电泳仪、生化培养箱、摇床、恒温孵化器、PCR仪。

2)细胞培养箱、生物安全柜。

3)电转仪、照胶仪。

2实验方法

2.1细胞转染

在T25培养瓶中HeLa细胞生长至50％-70％覆盖率时，根据说明书使用

6将5μg pNL43ΔPolΔEnv-Gag转染进入HeLa细胞。

2.2电转RNA寡核苷酸

转染24小时后，用胰酶处理培养的HeLa细胞，用1×PBS洗后重悬，加入100μL电转1×PBS缓冲液，使溶液中HeLa细胞总数达到50万个(病毒释放效率分析)或200万个(免疫共沉淀)，加入0.1nmol RNA寡核苷酸STL1/UN1、0.1nmol MoD、0.05nmol DB或0.03nmol TB纳米颗粒(用于病毒释放效率分析)或是0.5nmol FAM修饰的STL1/UN1(用于免疫共沉淀分析)。使用

电转系统，参数分别设置为1005V、35ms脉冲宽度、2次脉冲。在电转后的细胞中分别加入10mL培养基洗一次，离心得到细胞，重悬后放入六孔板中培养。

2.3 Gag-RNA寡核苷酸的免疫共沉淀(IP)

所需试剂：

①IP裂解液：

取0.5mL vanadyl ribonucleoside complexes溶液加热到60℃，加入上述裂解液。分装后在-20℃保存，使用前加入1×蛋白酶抑制剂和SUPERase-In^TM RNA酶抑制剂(使最终浓度为10U/μl)。

②Brij缓冲液：

5×Brij                       50mL

10×PBS                       50mL

去离子水                      定容至500mL

常温保存。

③Brij封闭液：

脱脂奶粉                    1g

Brij缓冲液                  定容至20mL

配置后即刻使用。

实验步骤：细胞在电转RNA寡核苷酸后培养4小时，用Minute^TM细胞膜蛋白分离试剂盒提取细胞膜组分，加入500μL IP裂解液混匀。使用nProtein A-Sepharose^TM微珠(GEHealthcare)，进行预吸附4小时。取上清加入8μg HIV Ig抗体(NIH)，4℃培养过夜。加入20μL nProtein A-Sepharose^TM微珠(GE Healthcare)，4℃培养4小时。沉淀微珠，用IP裂解液和加入1M尿素的IP裂解液分别清洗3次，取五分之一做Western Blot，用抗p24抗体(EMDMillipore)检验蛋白质含量。其余微珠加入100μL(0.1％SDS)IP裂解液和30μg蛋白酶K，放入50℃反应器培养30分钟。加入100μL苯酚-氯仿溶剂，迅速充分震荡混合，21000×g离心10分钟，取出萃取得到的上层无色透明溶液，加入100％冰乙醇、醋酸钠，放入-20℃冰箱过夜。21000×g离心30分钟，抽去上清，获得RNA沉淀物，用RNase-free水溶解后，在尼龙膜进行斑点杂交(dot blot)。在紫外交联仪中以强度2800J/cm²照射1分钟。使用抗荧光蛋白(FAM)抗体(Abcam)检测RNA信号，通过Fiji软件进行密度分析，比较免疫沉淀物中的Gag含量与RNA含量。Gag-RNA结合率＝RNA含量/Gag含量。

2.4 RNA自组装纳米颗粒的合成和表征

RNA自组装纳米颗粒的合成和纯化所需试剂：

①10×Tris缓冲液：

1M Tris                    5mL

5M NaCl                    2mL

去离子水                   定容至10mL

常温保存。

②1×TBM缓冲液：

③RNA胶：

在60℃水浴中配置，加入TEMED后快速滴加到固定的胶板中，插入梳子，等待30分钟后胶凝固。

Western Blot所需试剂——MOPS缓冲液、转膜缓冲液、TBST缓冲液、封闭液等，配置方法参见2.5“检验病毒颗粒释放效率”。

实验步骤：RNA寡核苷酸底物在1×Tris缓冲液中混合(一共50μL体系，对于合成Dumbbell，使用Module1和Module2各5μM；对于合成Tribell，使用Module1、Module3和Module4各3.3μM)，使用PCR仪器，设定程序为：

①95℃加热5分钟；

②每分钟下降1℃，缓慢降温到25℃；

③25℃恒温10分钟。

合成产物在6％native PAGE胶上样，放入1×TBM缓冲液恒压90V电泳一小时。使用低分子量单链RNA marker(ss RNA marker，NEB)作为分子量标记物。PAGE胶用1X

Gold(Life Technologies)染色10分钟。使用ChemiDoc XRS+(Bio-Rad)照胶仪成像。使用ImageJ软件分析条带亮度，计算RNA自组装纳米结构的合成效率。

为了纯化所得产物，切下RNA PAGE胶的产物条带放入EP管，用无菌塑料棍捣碎。使用1×Tris-NaCl缓冲液浸泡过夜，上清液转移到3000NMWL纤维素过滤柱，以14000×g加速度离心30分钟，回收过滤柱内剩余液体，得到纯化产物。所得产物需再次用RNA凝胶电泳验证，步骤如前文所述。

2.5检验病毒释放效率

所需试剂：

①细胞裂解缓冲液：

室温下保存，加1X蛋白酶抑制剂后在-20℃冰箱保存。

②转膜缓冲液：

20×转膜缓冲液             50mL

无水甲醇                   200mL

去离子水                   定容至1L

4摄氏度下保存。

③TBST溶液：

10×TBS溶液                50mL

10％Tween                  2.5mL

去离子水                   定容至500mL

室温保存。

④电泳缓冲液：

20×SDS MOPS               50mL

去离子水                   定容至1L

室温保存。

⑤封闭液：

TBST溶液                   50mL

脱脂奶粉                   2.5g

充分摇晃溶解，配制后即刻全部使用。

实验步骤：细胞在电转RNA寡核苷酸后培养8小时，分别收集病毒颗粒与细胞样品。培养基以1000×g离心10分钟，用450nm针头过滤器去除细胞碎片，按比例加入

280磁珠(2μL/mL)后在超速离心机中以100000×g离心50分钟，抽去上清液得到病毒颗粒。

病毒颗粒与细胞样品均用加入蛋白酶抑制剂(10μL/mL)的细胞裂解缓冲液在4℃裂解半小时，在4℃以21,000×g离心30分钟，去除沉淀。对两种样品均进行Western Blot实验，用HIV-Ig抗体检测Gag蛋白质，通过Fiji软件进行密度分析，比较Gag含量与HIV-1病毒释放效率。病毒释放效率＝类病毒颗粒Gag含量/(类病毒颗粒Gag含量+细胞Gag含量)。

2.6本技术对于抑制HIV-1病毒组装的效果评估

1)将pNL43ΔPolΔEnv-Gag转染于HeLa细胞。细胞转染24小时后，分别电转具有茎环结构的RNA寡核苷酸探针(STL1)与无结构的RNA寡核苷酸探针(UN1)。电转4小时后，提取细胞膜组分进行Gag-RNA寡核苷酸的免疫共沉淀实验，计算Gag-RNA结合率(如图1中A所示)。免疫共沉淀结果显示，Gag在膜上主要结合STL1。并在电转8小时后测试其对HIV-1病毒释放的抑制效果(如图1中B所示)。

2)将具有茎环结构RNA寡核苷酸作为基本组装模块，按照等分子量在1×Tris缓冲液中混合后，进行高温解链-缓慢降温退火，通过各个组成单位中位于茎环结构3’端的单链进行互补，从而实现自组装，合成具有多个茎环结构的RNA自组装纳米颗粒(如图2所示)，并测试其对HIV-1病毒释放的抑制效果。HeLa细胞转染pNL43ΔPolΔEnv-Gag 24小时后，分别进行空电转(MN)、电转RNA寡核苷酸基本组装模块(Module 1，图3中用MoD代表)、电转RNA自组装纳米颗粒(Dumbbell或Tribell，图3中分别用DB和TB代表)，并在8小时后检测HIV-1病毒释放效率(如图3所示)。病毒释放效率检测结果显示，具有茎环结构的RNA寡核苷酸基本组装模块能够有效抑制HIV-1病毒的释放。进一步的，由具有茎环结构的RNA寡核苷酸自组装形成的RNA纳米颗粒相比于单个的基本组装模块对HIV-1病毒的释放抑制有更显著的提升。

3)通过同样的方法电转不同浓度梯度的RNA自组装纳米颗粒TB并检测病毒释放效率，可以看到其对病毒释放抑制的效果与其作用浓度相关(如图4所示)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 一种基于人工合成寡核苷酸有效抑制HIV-1病毒组装的方法

<130> WX2021-03-228

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacagcguaa gugaugucgu gacugucgag cugcacgcug ccg 43

<210> 2

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacagcguaa gugaugucgu gacuguccgg cagcgugcag cuc 43

<210> 3

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacagcguaa gugaugucgu gacuguccgg cagcgacaug agg 43

<210> 4

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacagcguaa gugaugucgu gacugucccu cauguugcag cuc 43

<210> 5

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

gucaccucag cguaagugau gucgugac 28

<210> 6

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

cucagcguaa gugaugucgu 20

Claims (10)

1.一种抑制HIV-1病毒组装的方法，包括以下步骤：

1)设计能够自组装成具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料的至少两种RNA寡核苷酸，然后人工合成所述RNA寡核苷酸；

2)将步骤1)合成的多种RNA寡核苷酸在1×Tris缓冲液中等摩尔浓度混合，进行高温解链-缓慢降温退火，实现自组装；然后对产物进行纯化，得到具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料；

3)用所述RNA自组装纳米材料转染感染了HIV-1病毒的细胞，干扰细胞内HIV-1病毒的组装。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述RNA寡核苷酸为无义寡核苷酸序列，具有茎环结构，并在茎环结构的5’或3’端具有延长的单链；在步骤2)中，各个RNA寡核苷酸单体通过位于茎环结构5’或3’端延长的单链进行互补来实现自组装。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，两个RNA寡核苷酸单体通过位于茎环结构5’或3’端延长的单链进行互补，自组装形成哑铃形结构的RNA自组装纳米材料；或者，三个RNA寡核苷酸单体通过位于茎环结构5’或3’端延长的单链进行互补，自组装形成“Y”形结构的RNA自组装纳米材料。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述无义寡核苷酸序列是指与人类基因组和病毒基因组没有同源性的序列。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述RNA寡核苷酸的茎环结构中，环结构由15～25nt组成，茎结构的长度至少为4个碱基对，所述延长的单链长度为16～20nt。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RNA寡核苷酸选自序列表中的SEQ IDNo：1至SEQ ID No：4所示的寡核苷酸。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)将SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的寡核苷酸等量混合自组装成哑铃形结构的RNA自组装纳米材料，或者，将SEQ ID No：1、SEQID No：3和SEQ ID No：4所示的寡核苷酸等量混合自组装成“Y”形结构的RNA自组装纳米材料。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA寡核苷酸是所有碱基皆为2’-O-甲基化修饰的寡核苷酸；或者所述RNA寡核苷酸具有抗核酸酶降解能力的其他化学修饰，选自硫代磷酸修饰、锁核酸修饰、吗啉基修饰。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)只不过使用3000NMWL纤维素过滤柱对自组装产物进行纯化。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)采用电转染的方法使所述RNA自组装纳米材料转染细胞。

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