CN116098916A - 马立巴韦在制备抗h13亚型aiv药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及马立巴韦在抗H13亚型AIV药物中的应用。本发明首次发现化合物马立巴韦能够有效抑制H13亚型AIV的增殖，且对细胞的毒性小，经实验证明，马立巴韦对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)是大于等于100μM，而对H13亚型AIV病毒的半数有效浓度(EC50)为19.03μM；马立巴韦对H13亚型AIV的治疗指数大于等于5.25，表明其具有开发成抗H13亚型AIV药物的前景，为马立巴韦开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗H13亚型AIV药物奠定实验基础并提供新的视野。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及马立巴韦在抗H13亚型AIV药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是禽流感的病原，根据病毒表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的不同，AIV被分为16种HA亚型和9种NA亚型。AIV主要感染禽类，但它同时也是一种重要的人兽共患病病原体，对公共卫生安全构成严重危害。
H13亚型AIV最早是由Hinshaw等人于1982年首次报道从环嘴鸥的粪便样品中分离获得，此外，Hinshaw等人还于1986年首次报道从领航鲸的肺脏和肺门淋巴结中分离到H13亚型AIV，证明H13亚型AIV可以自然感染哺乳动物。
马立巴韦是一种新型抗巨细胞病毒(CMV)药物，通过抑制pUL97蛋白激酶，阻断病毒的复制。该药物在全球多个国家和地区进行了Ⅲ期临床试验，并于2021年2月宣布Ⅲ期临床试验成功。但迄今尚未有关于马立巴韦用于预防或治疗H13亚型AIV的报道。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供马立巴韦在制备H13亚型AIV药物中的应用，本发明首次证实马立巴韦能够有效抑制H13亚型AIV的增殖，且对细胞的毒性小，因此具有开发成抗H13亚型AIV药物的前景。
本发明所述化合物马立巴韦，结构式如式(Ⅰ)所示；本发明提供了马立巴韦在制备H13亚型AIV药物中的应用，该应用是首次公开，与已知临床用药用途不同。
本发明建立了H13亚型AIV在细胞水平上药物筛选体系，发现化合物马立巴韦能够有效抑制H13亚型AIV的增殖，且对细胞的毒性小，经实验证明，马立巴韦对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)是大于等于100μM，而对H13亚型AIV病毒的半数有效浓度(EC50)为19.03μM；马立巴韦对H13亚型AIV的治疗指数大于等于5.25，表明其具有开发成抗H13亚型AIV药物的前景。
为了实现上述目的，本发明实施例提供了如下技术方案：
本发明第一方面提供一种马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在制备抗H13亚型AIV药物中的应用。
本发明第二方面提供一种马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在制备抑制H13亚型AIV病毒增殖的药物中的应用。
本发明第三方面提供一种马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在灭活H13亚型AIV病毒的药物中的应用。
本发明第四方面提供一种马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在阻止H13亚型AIV对细胞吸附的药物中的应用。
本发明第五方面提供一种抗H13亚型AIV的药物组合物，所述药物组合物由马立巴韦与至少一种其它非药物活性成分组成。
本发明第六方面提供一种抗H13亚型AIV的药物组合物，所述药物组合物由马立巴韦与至少一种其它药物活性成分组成。
本发明的一个或多个实施方式至少具有以下有益效果：
本发明首次发现化合物马立巴韦能够有效抑制H13亚型AIV的增殖，且对细胞的毒性小，经实验证明，马立巴韦对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)是大于等于100μM，而对H13亚型AIV病毒的半数有效浓度(EC50)为19.03μM；马立巴韦对H13亚型AIV的治疗指数大于等于5.25，表明其具有开发成抗H13亚型AIV药物的前景，为马立巴韦开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗H13亚型AIV药物奠定实验基础并提供新的视野。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明马立巴韦抗H13亚型AIV损伤细胞的作用图；
其中：其中图1A为病毒对照组；图1B为MDCK正常细胞组；图1C为感染细胞药物试验组(使用25μM马立巴韦)；
图2为实施例2中马立巴韦对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)图；
图3为实施例3中马立巴韦对H13亚型AIV的半数有效浓度(EC50)图；
图4为实施例5中马立巴韦对H13亚型AIV直接杀伤作用效果图。
图5为实施例5中马立巴韦对H13亚型AIV吸附的阻断作用效果图。
图6为实施例5中马立巴韦对H13亚型AIV复制的阻断作用效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中，马立巴韦是作为抗巨细胞病毒(CMV)药物进行使用，为了进一步扩大马立巴韦在医药领域的应用，探究马立巴韦在其他医药用途将具有重要意义。
有鉴于此，本发明提供马立巴韦在制备抗H13亚型AIV药物中的应用。
具体地，
第一方面提供一种马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在制备抗H13亚型AIV药物中的应用。
其中，“抗H13亚型AIV药物”表示一种物质，其对H13亚型AIV具有明显的抑制杀灭作用，对病毒的直接杀灭、吸附阻断等方面都有很好的效果。
本发明第二方面提供一种马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在制备抑制H13亚型AIV病毒增殖的药物中的应用。
本发明第三方面提供一种马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在灭活H13亚型AIV病毒的药物中的应用。
本发明第四方面提供一种马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在阻止H13亚型AIV对细胞吸附的药物中的应用。
上述药物中，马立巴韦取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，马立巴韦对H13亚型AIV的半数有效浓度(EC50)为19.03μM；马立巴韦对H13亚型AIV的治疗指数大于等于5.25；当然，当马立巴韦与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭H13亚型AIV等与本发明内容中所提及的相同应用的药物或活性成分联合使用时，其药物浓度理论上可以低于上述半数有效浓度，但也不排除特殊的例外情况。
作为其它药物活性成分的替代或补充，马立巴韦还可以与其它非药物活性成分组合使用。
对此，本发明第五方面提供一种抗H13亚型AIV的药物组合物，所述药物组合物由马立巴韦与至少一种其它非药物活性成分组成。
所述其他非药物活性成分包括药学上可接受的辅料和/或载体。
所述在药学上可接受的辅料包括溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。
所述药物组合物可以单位剂量形式给药；给药剂型可以是液体剂型、固体剂型；液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型；其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。
使用马立巴韦与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强抗H13亚型AIV的作用。
为此，本发明第六方面提供一种抗H13亚型AIV的药物组合物，所述药物组合物由马立巴韦与至少一种其它药物活性成分组成。
所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭H13亚型AIV或者协助抑制和/或杀灭H13亚型AIV的物质。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1病毒TCID50的测定
将MDCK细胞消化后以每孔1×105个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将H13亚型AIV连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10-1～10-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设3个重复，待不再继续发生细胞病变时，用96孔V型板做血凝试验，每孔加入50微升细胞液，然后加入50微升0.75％鸡红细胞，室温静置20分钟，看鸡血是否凝集，读取血凝结果并记录，按Karber法计算病毒TCID50。
表1TCID50 of H13亚型AIV
注：TCID50，Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量。
结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的血凝孔数，并计算出不同浓度的血凝比率，并按Karber法计算H13亚型AIV的TCID50值：
LgTCID50＝L-D(S-0.5)
(L:最高稀释度的对数；D:稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)
LgTCID50＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(3-0.5)＝-3.5
TCID50＝10-3.5/0.1mL
即将该病毒稀释103.5接种100μL可使50％的细胞发生病变。
实施例2马立巴韦对MDCK细胞的毒性实验：
MDCK细胞是H13亚型AIV的易感细胞；因此，首先检测马立巴韦对MDCK细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
(1)在96孔板内接种100μL细胞(MDCK 1×104个/孔)。
(2)培养至MDCK单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度(第一孔为200μM/mL，第二孔为100μM/mL，依次2倍倍比稀释，直至第八孔的1.5625μM/mL)的无血清DMEM，每个浓度做3个平行；同时对照孔：加100μL无血清DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。
(3)在37℃，5％CO2条件下培养72h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)37℃，5％CO2条件下继续培养1h后，在450nm测定吸光值；将正常生长细胞的A450nm设为100％细胞对照。
(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算马立巴韦的半数细胞毒性浓度(CC50)值。其结果如图2所示。
结果：马立巴韦出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定马立巴韦半数中毒浓度为≥100μM。
实施例3马立巴韦对H13亚型AIV的抑制实验：
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个MDCK细胞，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
(2)弃去培养基，每孔加入100μL 100TCID50的H13亚型AIV稀释液(用无血清DMEM细胞长满后加入病毒稀释液，再分别加入不同浓度的药物，按照第一孔100μM/mL初始浓度，第二孔50μM/mL，依次2倍倍比稀释，直至第七孔的1.5625μM/mL两倍浓度梯度稀释加药，5％CO2培养箱中培养；
(3)72h后，用96孔V型板做血凝试验，每孔加入50微升细胞液，然后加入50微升0.75％鸡红细胞，室温静置20分钟，看鸡血是否凝集，读取血凝结果并记录。
(4)分析数据，其结果如图3所示。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数TI值。
结果：通过血凝检测结果，可以计算出药物对H13亚型AIV的有效抑制率。从结果可以看出，马立巴韦在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，根据量-效关系方成，对数据进行拟合，得到马立巴韦对H13亚型AIV的半数有效浓度(EC50)为19.03μM。马立巴韦对H13亚型AIV的治疗指数≥5.25。
实施例4化合物不同时间加入对H13亚型AIV复制的影响
将马立巴韦分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
将等量的100TCID50病毒液与不同浓度的药物稀释液(按照第一孔50μM/mL初始浓度，第二孔25μM/mL，依次2倍倍比稀释，直至第七孔的0.78125μM/mL)混合均匀置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h后进行血凝试验检测结果，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC50。
结果：马立巴韦与H13亚型AIV预先作用的给药方式下，通过分析软件，马立巴韦对H13亚型AIV的作用效果如图4所示。从图4中可以看出，在这种作用式下，马立巴韦在安全浓度范围内≥12.5μM对H13亚型AIV表现出100％的完全抑制作用，表明马立巴韦对H13亚型AIV具有一定的直接灭活的作用。
(2)药物对H13亚型AIV吸附的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，(按照第一孔50μM/mL初始浓度，第二孔25μM/mL，依次2倍倍比稀释，直至第七孔的0.78125μM/mL)，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的100TCID50病毒液置于37℃、5％CO2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h后进行血凝试验检测结果，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。
结果：通过分析软件，马立巴韦对H13亚型AIV的作用效果如图5所示，结果显示，在安全浓度范围内，25μM及以上浓度对H13亚型AIV的有效抑制率能达到100％，表明马立巴韦能阻止H13亚型AIV对细胞的吸附作用。
(3)药物对H13亚型AIV复制的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的100TCID50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用1h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液(按照第一孔50μM/mL初始浓度，第二孔25μM/mL，依次2倍倍比稀释，直至第七孔的0.78125μM/mL)，每个药液梯度100μL/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，72h后进行血凝试验检测结果，分析数据，得出结论。
结果：通过分析软件，马立巴韦对H13亚型AIV的复制阻断作用效果如图6所示，结果显示，在安全浓度范围内，25μM及以上浓度马立巴韦对H13亚型AIV的有效抑制率为100％，表明马立巴韦能有效阻断H13亚型AIV在MDCK细胞内的复制。
本发明应用实施例以MDCK细胞为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现马立巴韦的新型抗病毒作用，对H13亚型AIV有一定的抑制作用。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在制备抗H13亚型AIV药物中的应用。
2.马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在制备抑制H13亚型AIV病毒增殖的药物中的应用。
3.马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在灭活H13亚型AIV病毒的药物中的应用。
4.马立巴韦或包含马立巴韦的组合物或其制剂在阻止H13亚型AIV对细胞吸附的药物中的应用。
5.权利要求1-4任一项所述药物中，马立巴韦取不低于半数有效浓度(EC50)的药物浓度，马立巴韦对H13亚型AIV的半数有效浓度(EC50)为19.03μM。
6.一种抗H13亚型AIV的药物组合物，所述药物组合物由马立巴韦与至少一种其它非药物活性成分组成。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述其他非药物活性成分包括药学上可接受的辅料和/或载体。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物以单位剂量形式给药；给药剂型是液体剂型、固体剂型。
9.一种抗H13亚型AIV的药物组合物，所述药物组合物由马立巴韦与至少一种其它药物活性成分组成。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：所述其它药物活性成分包括具有抑制和/或杀灭H13亚型AIV或者协助抑制和/或杀灭H13亚型AIV的物质。
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