CN116098879A - 一种控释药物植入剂及其制备方法与其在制备胰腺癌术后辅助治疗药物中的应用 - Google Patents

一种控释药物植入剂及其制备方法与其在制备胰腺癌术后辅助治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种控释药物植入剂及其制备方法与其在制备胰腺癌术后辅助治疗药物中的应用。将聚丙交酯溶液通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到PDLLA阻隔层；将含有药物活性成分的聚三亚甲基碳酸酯溶液通过静电纺丝方式收集到PDLLA阻隔层上，得到PTMC药物负载层；将聚三亚甲基碳酸酯溶液通过静电纺丝方式收集到PTMC药物负载层上，得到PTMC延时层，即得控释药物植入剂。本发明设计制备的程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂相比以往只能提供药物缓释的植入剂而言，具有可控制药物在不同时间点释放的能力，因此可模拟临床给药方案，定制化、程序性控制抗胰腺癌药物吉西他滨的局部递送。

Description

一种控释药物植入剂及其制备方法与其在制备胰腺癌术后辅助治疗药物中的应用
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种控释药物植入剂及其制备方法与其在制备胰腺癌术后辅助治疗药物中的应用。
背景技术
胰腺癌是一种预后十分不良的癌症类型，其五年生存率低于5％。据2020年癌症数据统计，全球范围内胰腺癌导致的死亡人数(46.6万)与发病人数(49.6万)几乎相等。目前胰腺癌已成为全球第七大癌症死亡原因。在许多国家，胰腺癌的发病率和死亡率保持稳步上升的趋势，并且，一项对28个欧洲国家进行的预测研究表明，胰腺癌在2025年将超过乳腺癌，成为第三大癌症死亡原因。
胰腺导管腺癌(PDAC)是胰腺癌的主要类型，并且局部晚期和转移性肿瘤占所有胰腺癌病例的80％。胰腺癌的不良预后问题主要来源于于化疗、放疗引起的不良反应和原发肿瘤的不可切除性。目前，手术切除是治愈胰腺癌的唯一可能方法，但只有部分患者符合手术切除条件。由于胰腺癌局部肿瘤易侵犯重要的血管、导管和邻近器官，这显著增加了手术切除的难度。并且，接受手术的患者相比同分期、分型的患者虽然在总生存期方面可延长约10个月，但肿瘤的复发和转移几乎全部出现在所有病例中。
术后辅助化疗和放疗是当前临床胰腺癌术后疗法的标准方案，在一定程度上延长了病人生存期。但当前临床的全身性治疗方案仍存在重大挑战，全身性化疗的疗效往往受到胰腺癌独特的粗结缔组织增生反应的影响。胰腺肿瘤具有致密的促结缔组织增生间质，其周围长有有纤维结缔组织，可占据肿瘤体积的80％，这导致了低血液灌注和低氧微环境，极大限制了抗肿瘤药物的递送。开发可克服这一药物递送屏障的药物递送可为胰腺癌患者的局部肿瘤治疗提供实质性益处。
局部药物递送系统(local drug delivery systems，LDDSs)作为一类近年来受到广泛关注的给药系统，已被成功应用于临床局部肿瘤治疗。LDDSs最大的优势在于可将药物直接递送于局部植入部位，因此可在局部肿瘤组织内大量释放药物，并且降低全身性药物分布，从而提高癌症治疗效果，并且有效降低药物的全身性毒性。因此，相比临床全身给药方案，LDDSs具有克服胰腺肿瘤致密促结缔组织增生间质导致的药物运输屏障的潜力。
近年来，研究者开发了一系列LDDSs用于胰腺癌术后辅助治疗和晚期不可切除胰腺癌治疗。Wade等利用湿法纺丝技术制备了海藻酸钠/壳聚糖复合的微米纤维膜用于负载胰腺癌治疗药物吉西他滨，该纤维膜可提供维持数天的吉西他滨缓释，有效克服了胰腺癌细胞的扩增。Indolfi等开发了一种基于聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)的植入式药物洗脱装置。该装置能长期缓慢释放大剂量紫杉醇(约60天)，作者利用人源肿瘤异种移植模型(PDX)验证了局部与系统疗法的抗肿瘤效果，发现局部疗法相比全身给药对肿瘤生长的抑制效果提高了12倍，并降低了在脱靶器官的药物滞留率。作者在文中强调了局部治疗方法的有效性，因而有望作为胰腺癌患者的新型治疗策略。
然而，当前研究开发的LDDSs多依赖于被动扩散进行药物递送，仅能实现药物的缓释效果。由被动扩散引起的药物释放通常表现为药物前期突释和后期缓释的特征。研究指出药物前期的大量突释虽然在一定程度上有效杀灭了肿瘤细胞，但同时也会增加全身性毒性；而药物在后期的缓慢释放降低了抗肿瘤效果的同时，还可能诱发严重的耐药问题，从而导致不良后果。并且，胰腺癌术后辅助化疗通常使用的细胞毒性药物如5-氟尿嘧啶和吉西他滨等，在标准方案中通过间歇性、多疗程给药，且使用的剂量较大。因此，当前研究领域所具有的给药系统已难以满足临床需求，开发具有程序性可控的LDDSs有助于根据临床标准给药方案定制抗胰腺肿瘤药物的释放，从而提供更优异的治疗策略。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种基于程序性局部递送药物的控释药物植入剂，其可以程序性延迟药物的释放时间点，实现药物在不同时间点的释放。
本发明还要解决的技术问题是提供上述控释药物植入剂的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述控释药物植入剂在制备治疗胰腺癌术后药物中的应用。
发明思路：本发明采用可生物降解的聚丙交酯(PDLLA)、聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)和抗肿瘤药物作为基体材料，采用静电纺丝/喷雾技术加工成型，通过真空热处理干燥、固化样品，从而获得可生物降解、多层式、可程序性控制药物释放的植入剂。可程序性控制药物释放的植入剂的设计具有多层结构，PDLLA作为药物渗透阻隔材料，采用PTMC作为药物负载基体材料和药物延迟释放材料。PDLLA具有较高的玻璃化转变温度，在人体体温环境中处于玻璃态，PDLLA还具有较长的降解周期，对多种药物具有较低的渗透性；PTMC具有独特的表面降解行为，在人体环境中可经酶解作用进行表面溶蚀降解。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明公开了一种控释药物植入剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将聚丙交酯溶于第一溶剂，得到聚丙交酯溶液；将聚丙交酯溶液通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到PDLLA阻隔层；
(2)将聚三亚甲基碳酸酯和药物活性成分溶于第二溶剂，得到含有药物活性成分的聚三亚甲基碳酸酯溶液；将含有药物活性成分的聚三亚甲基碳酸酯溶液通过静电纺丝方式收集到步骤(1)的PDLLA阻隔层上，得到PTMC药物负载层；
(3)将聚三亚甲基碳酸酯溶于第三溶剂，得到聚三亚甲基碳酸酯溶液；将聚三亚甲基碳酸酯溶液通过静电纺丝方式收集到步骤(2)的PTMC药物负载层上，得到PTMC延时层，即得控释药物植入剂。
在一些实施例中，步骤(1)中，所述的第一溶剂为N,N-二甲基甲酰胺与碳酸二甲酯任意比例的混合物，优选为N,N-二甲基甲酰胺与碳酸二甲酯按照体积比为1：9的混合物；所述的聚丙交酯与第一溶剂的质量体积比为0.5g～1.0g：10mL，优选为0.8～1.0g：10mL，更优选为1.0g：10mL。
在一些实施例中，步骤(1)中，所述的静电喷雾，正高压为+4kV，负高压为-4kV，平移距离为10～15cm；所述的接收器，直径为0.5～2.0mm，优选为0.5mm；所述的PDLLA阻隔层，厚度为50～100μm，优选为50～80μm，更优选为50μm。
在一些实施例中，步骤(2)中，所述的药物活性成分为吉西他滨、氟尿嘧啶、伊立替康、盐酸阿霉素、紫杉醇和多烯紫杉醇中的任意一种。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体外药物释放实验中，所述的药物活性成分为盐酸阿霉素。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体内药物释放实验中，所述的药物活性成分为吉西他滨。
在一些实施例中，步骤(2)中，所述的第二溶剂为三氟乙醇或六氟异丙醇。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体外药物释放实验中，所述的第二溶剂为六氟异丙醇。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体内药物释放实验中，所述的第二溶剂为三氟乙醇。
在一些实施例中，步骤(2)中，聚三亚甲基碳酸酯和药物活性成分的总质量与第二溶剂的质量体积比为0.05g～0.3g：10mL
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体外药物释放实验中，聚三亚甲基碳酸酯和药物活性成分的总质量与第二溶剂的质量体积比为0.1g：10mL。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体内药物释放实验中，聚三亚甲基碳酸酯和药物活性成分的总质量与第二溶剂的质量体积比为0.2g：10mL。
在一些实施例中，步骤(2)中，所述的聚三亚甲基碳酸酯与药物活性成分的质量比为4～9：1。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体外药物释放实验中，所述的聚三亚甲基碳酸酯与药物活性成分的质量比为9：1。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体内药物释放实验中，所述的聚三亚甲基碳酸酯与药物活性成分的质量比为4：1。
在一些实施例中，步骤(2)中，所述的静电纺丝，正高压为+6kV，负高压为-2kV，平移距离为5～10cm。
在一些实施例中，步骤(2)中，所述的PTMC药物负载层，厚度为20～100μm。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体外药物释放实验中，所述的PTMC药物负载层，厚度为80～100μm，更优选为100μm。
在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体内药物释放实验中，所述的PTMC药物负载层，厚度为20～80μm，更优选为40μm。
在一些实施例中，步骤(3)中，所述的第三溶剂为三氟乙醇、六氟异丙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺体积比为9：1的混合物和氯仿与N,N-二甲基甲酰胺体积比为9：1的混合物中的任意一种或几种的组合，优选为三氟乙醇；所述的聚三亚甲基碳酸酯与第三溶剂的质量体积比为0.05g～0.3g：10mL，优选为0.2g：10mL。
在一些实施例中，步骤(3)中，所述的静电纺丝，正高压为+6kV，负高压为-2kV，平移距离为5～10cm。
在一些实施例中，步骤(3)中，所述的PTMC延时层，厚度为35～300μm。
在一些实施例中，优选地，步骤(3)中，体外药物释放实验中，所述的PTMC延时层，厚度为100～300μm，更优选为100μm、200μm或300μm。
在一些实施例中，优选地，步骤(3)中，体内药物释放实验中，所述的PTMC延时层，厚度为35～85μm，更优选为35μm或85μm。
上述的制备方法制备得到的控释药物植入剂也在本发明的保护范围之内。
上述的控释药物植入剂在制备治疗胰腺癌术后药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
除非另有说明，本发明中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
术语“术后治疗”是指肿瘤切除后，将植入剂直接放置于肿瘤手术切除处，缝合；植入剂在瘤床处局部释放药物，即达到局部递送效果。
术语“胰腺癌术后辅助治疗”是指胰腺癌手术切除后的辅助治疗，通常是手术后给予的治疗，如化疗，放疗，靶向药治疗和内分泌药治疗等等，以消灭体内任何仍然残余的癌细胞。
术语“控释”是指通过调节控释药物植入剂中PTMC延时层的厚度，提前人为设定、调控药物的开始释放时间，即达到药物的“程序性”释放控制。
其中，上述控释药物植入剂的体外药物释放实验中，PTMC延时层的厚度与PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间之间的关系如图1(C)所示，当PTMC延时层的厚度为0μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第0天；当PTMC延时层的厚度为100μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第2天；当PTMC延时层的厚度为200μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第4天；当PTMC延时层的厚度为300μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第6天。
其中，上述控释药物植入剂的体内药物释放实验中，PTMC延时层的厚度与PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间之间的关系如图3(A)所示，当PTMC延时层的厚度为0μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第0天；当PTMC延时层的厚度为35μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第4天；当PTMC延时层的厚度为85μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分药物的开始释放时间为第9天。
其中，上述的聚丙交酯(PDLLA)可以按照现有技术其他方法制备，也可以按照以下方法进行制备：
将聚合管预先加热干燥，然后迅速转移到干燥器中，冷却至室温；称量丙交酯(DL-LA)装入聚合管中，加入辛酸亚锡(SnOct2)，在室温下真空干燥。抽真空、通氮气，循环三次后，于真空状态下用喷枪高温火焰封管，再将反应体系完全浸入在油浴中进行加热反应。反应完毕后，将反应聚合管取出，冷却到室温，通过液氮冷冻破碎玻璃聚合管，再将取出的产物溶解于二氯甲烷中，于乙醇中沉淀提纯，并置于真空环境中干燥，即得PDLLA材料。
其中，所述的PDLLA材料，数均分子量为50～500kDa，分子量分布为1.0～2.5。
其中，上述的聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)可以按照现有技术其他方法制备，也可以按照以下方法进行制备：
将聚合管预先加热干燥，然后迅速转移到干燥器中，冷却至室温；称量三亚甲基碳酸酯(TMC)装入聚合管中，加入辛酸亚锡(SnOct2)，在室温下真空干燥。抽真空、通氮气，循环三次后，于真空状态下用喷枪高温火焰封管，再将反应体系完全浸入在油浴中进行加热反应。反应完毕后，将反应聚合管取出，冷却到室温，通过液氮冷冻破碎玻璃聚合管，再将取出的产物溶解于二氯甲烷中，于乙醇中沉淀提纯，并置于真空环境中干燥，即得PTMC材料。
其中，所述的PTMC材料，数均分子量为200～500kDa，分子量分布为1.0～2.5。
有益效果：
(1)本发明基于静电纺丝/喷雾法制备了用于胰腺癌术后辅助治疗的程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂。本发明利用静电纺丝/喷雾微制造技术，可在微米尺度上精确调节控释药物植入剂的多层结构尺寸，该方法具有可定制化和精确化控制效果，可制备复杂多层结构，因此赋予了植入剂程序性调控药物释放的能力。
(2)本发明设计制备的程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂相比以往只能提供药物缓释的植入剂而言，具有可控制药物在不同时间点释放的能力，因此可模拟临床给药方案，定制化、程序性控制抗胰腺癌药物吉西他滨的局部递送。
(3)本发明利用PTMC作为药物延时释放控制器，PTMC独特的表面降解性能赋予了其药物控释能力，在PTMC延时层完全降解之前，药物保持稳定不释放；而当PTMC层降解后，分散在PTMC(GEM)药物层的吉西他滨一接触到体液，便大量释放出来。因此，通过PTMC延时层的厚度调节，可有效调控吉西他滨药物在不同的时间点进行释放。
(4)本发明设计的程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂可在手术瘤床处大量释放吉西他滨，具有有效突破胰腺肿瘤致密促结缔组织增生间质的能力，局部高浓度的药物有效杀灭了手术残留的肿瘤组织。并且大幅度降低的脱靶器官药物浓度有效避免了系统性给药带来的严重全身毒性问题。
(5)本发明设计的程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂相比传统的缓释植入剂，还具有潜在的降低药物系统性毒性和降低耐药风险等优势。
(6)本发明利用的聚合物PDLLA和PTMC均为FDA批准的生物可降解医用高分子材料，生物安全性高，在体内可完全降解，避免了以往不可降解植入剂需要二次取出的问题，降低了手术风险，提高了患者依从性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为延时药物释放的控释药物植入剂的示意图及药物释放性能图。
图2为程序性局部递送吉西他滨的植入剂的示意图及扫描电镜图像。
图3为程序性局部递送吉西他滨的植入剂的体内药物释放和组织药物分布图。
图4为程序性控制吉西他滨释放植入剂的抗胰腺癌术后肿瘤复发效果、动物体重变化和生存率评估图。
图5为胰腺癌术后肿瘤复发照片及肿瘤组织染色、免疫组化分析图；其中，G1为静脉注射生理盐水组，G2为静脉注射GEM组，G3为空白植入剂植入组，G4为程序性控制GEM释放植入剂植入组。
图6为实施例1制备得到的PDLLA材料的核磁氢谱图。
图7为实施例1制备得到的PTMC材料的核磁氢谱图。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
吉西他滨，≥99％，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
盐酸阿霉素，纯度99％，购于上海毕得医药科技有限公司。
本发明实施例中所用的脂肪酶来自于米曲霉，该脂肪酶中酶活单位1U的定义是在给定的标准条件下，每分钟释放1μmol可滴定丁酸的酶量。
实施例1：聚丙交酯和聚三亚甲基碳酸酯的制备
聚丙交酯(PDLLA)的制备：将聚合管预先在100℃下干燥6h，然后迅速转移到干燥器中，冷却至室温。称量50g丙交酯(DL-LA)装入聚合管中，加入0.05g辛酸亚锡(SnOct2)，在室温下真空干燥1h，随后抽真空、通氮气，循环三次后，于真空状态下用喷枪高温火焰封管，再将反应体系完全浸入在130℃的油浴中反应12h。反应完毕后，将反应聚合管取出，冷却到室温，通过液氮冷冻破碎玻璃聚合管，再将取出的产物溶解于二氯甲烷中，于乙醇中沉淀提纯，并置于40℃的真空环境中干燥48h，获得纯化的PDLLA材料。
制备得到的PDLLA材料，数均分子量为120kDa，分子量分布为1.89；PDLLA材料的核磁氢谱图见图6。
聚三亚甲基碳酸酯(PTMC)的制备：将聚合管预先在100℃下干燥6h，然后迅速转移到干燥器中，冷却至室温。称量三亚甲基碳酸酯50g(TMC)，装入聚合管中，加入0.025g辛酸亚锡(SnOct2)，在室温下真空干燥1h，随后抽真空、通氮气，循环三次后，于真空状态下用喷枪高温火焰封管，再将反应体系完全浸入在130℃的油浴中反应12h。反应完毕后，将反应聚合管取出，冷却到室温，通过液氮冷冻破碎玻璃聚合管，再将取出的产物溶解于二氯甲烷中，于乙醇中沉淀提纯，并置于40℃的真空环境中干燥48h，获得纯化的PTMC材料。
制备得到的PTMC材料，数均分子量为430kDa，分子量分布为1.56；PTMC材料的核磁氢谱图见图7。
实施例2：延时药物释放的控释药物植入剂的制备及药物释放检测
延时药物释放的控释药物植入剂的制备：采用静电纺丝/喷雾技术制备延时药物释放的控释药物植入剂，盐酸阿霉素(DOX)为模型药物。具体实验条件如下：环境温度40℃，湿度30％～50％RH；接收器为不锈钢丝(直径0.5mm)，接收器转速为60rpm，接收距离为5cm；注射针筒5mL，针头26G，工作液推注速度为2mL/h，针筒平移移速50cm/min。将实施例1制备的PDLLA材料和PTMC材料用于本实施例中，按照如下顺序进行延时药物释放的控释药物植入剂的制备：
(1)将1.00g的PDLLA溶解于10mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与碳酸二甲酯(DMC)混合溶剂(DMF：DMC＝1：9v/v)，得到PDLLA溶液(10％g/mL)。将PDLLA溶液在推注体积0.18mL、正高压+4kV、负高压-4kV、平移距离15cm的条件下，通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到PDLLA阻隔层，厚度为50μm。
(2)将0.09g的PTMC和0.01g的盐酸阿霉素(DOX)溶解于10mL的六氟异丙醇，得到PTMC(DOX)溶液(1％g/mL)。将PTMC(DOX)溶液在推注体积3.10mL、正高压+6kV、负高压-2kV、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(1)的PDLLA阻隔层上，得到PTMC(DOX)药物负载层，厚度为100μm。
(3)将0.2g的PTMC溶解于10mL的三氟乙醇，得到PTMC溶液(2％g/mL)。将PTMC溶液在正高压+6kV、负高压-2kV、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(2)的PTMC(DOX)药物负载层上，得到PTMC延时层，即得程序性局部递送药物的控释药物植入剂；其中，在静电纺丝过程中，为获得不同厚度(0μm、100μm、200μm、300μm)的PTMC延时层，推注体积分别设置为0mL、1.99mL、4.43mL、7.31mL。
反应结束后，将载有样品的接收器取出，置于100℃的真空环境下干燥、固化4h。待自然冷却后，取下样品，切割成长度为1cm的延时药物释放的控释药物植入剂。控释药物植入剂的长度由游标卡尺测量得到，厚度由千分尺测量得到。
控释药物植入剂体外药物释放检测：将延时药物释放的控释药物植入剂浸没于20mL的脂肪酶溶液(1000U/mL)，置于温度37℃、转速100rpm条件下评估药物释放性能。每隔12小时取出体系中所有的脂肪酶溶液，再补充等量新鲜的脂肪酶溶液。通过多功能酶标仪检测取出的脂肪酶溶液在480nm的吸光度，利用DOX标准曲线计算控释药物植入剂的DOX累计释放率，药物释放延迟时间与PTMC延时层厚度的关系由药物累计释放曲线拟合得到，结果如图1所示，图1中的图1(A)为延时药物释放的控释药物植入剂的示意图。
如图1(C)所示，当PTMC延时层的厚度为0μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第0天；当PTMC延时层的厚度为100μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第2天；当PTMC延时层的厚度为200μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第4天；当PTMC延时层的厚度为300μm时，PTMC药物负载层中药物活性成分的开始释放时间为第6天。
由图1(B)和图1(C)可知，延时层的设计有效延缓了药物的起始释放点，控释药物植入剂的药物释放延迟时间与PTMC延时层厚度呈现良好的线性关系，具有程序性可控性，表明延时药物释放的控释药物植入剂可通过改变延时层厚度调控药物的起始释放点。
实施例3：程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂的制备及药物递送研究
程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂的制备：采用静电纺丝/喷雾技术制备程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂，吉西他滨(GEM)为药物，PTMC作为聚合物基质用于负载GEM；进一步地，PTMC还作为药物释放延时层。具体实验条件如下：环境温度40℃，湿度30％～50％RH；接收器为不锈钢丝(直径0.5mm)，接收器转速为60rpm，接收距离为5cm；注射针筒5mL，针头26G，工作液推注速度为2mL/h，针筒平移移速50cm/min。将实施例1制备的PDLLA材料和PTMC材料用于本实施例中，按照如下顺序进行控释药物植入剂的制备：
(1)将1.00g的PDLLA溶解于10mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与碳酸二甲酯(DMC)混合溶剂(DMF：DMC＝1：9v/v)，得到PDLLA溶液(10％g/mL)。将PDLLA溶液在推注体积0.18mL、正高压+4kV、负高压-4kV、平移距离15cm的条件下，通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到PDLLA阻隔层，厚度为50μm。
(2)将0.16g的PTMC和0.04g的吉西他滨(GEM)溶解于10mL的三氟乙醇，得到PTMC(GEM)溶液(2％g/mL)。将PTMC(GEM)溶液在推注体积0.56mL、正高压+6kV、负高压-2kV、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(1)的PTMC药物负载层上，得到PTMC(GEM)药物负载层，厚度为40μm。
(3)将0.2g的PTMC溶解于10mL的三氟乙醇，得到PTMC溶液(2％g/mL)。将PTMC溶液在正高压+6kV、负高压-2kV、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(2)的PTMC(GEM)药物负载层上，得到PTMC延时层，即得程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂。为获得不同厚度(0μm、35μm、85μm)的PTMC延时层，推注体积分别设置为0mL、0.55mL、1.44mL。
反应结束后，将载有样品的接收器取出，置于100℃的真空环境下干燥、固化4h。待自然冷却后，取下样品，切割成长度为1cm的程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂。植入剂的长度由游标卡尺测量得到，厚度由千分尺测量得到。
控释药物植入剂体内药物递送研究：将程序性控制吉西他滨释放的控释药物植入剂(PTMC延时层厚度分别为0μm、35μm、85μm的样品各×1)经紫外灯灭菌1h后，通过16G组织穿刺针植入到雄性、20g的Panc02皮下荷瘤C57BL/6小鼠的瘤床。每隔24h取出样品(同一批实验中有多只小鼠参与，每24h检测一次同时牺牲一只小鼠，并取出其体内的样品)，溶解于0.5mL二甲基亚砜中，加入4.5mL去离子水稀释，3000rpm、3min离心后取上清液，通过多功能酶标仪分别检测上清液在270nm的吸光度，利用GEM标准曲线计算控释药物植入剂的GEM累计释放率。
体内药物分布：给药24h后，取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤，加入生理盐水匀浆(10％g/mL)。取匀浆液100μL，加入300μL乙酸乙酯，涡旋，经13000rpm、10min离心后，采用液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)检测上清液的GEM含量。
由图2可知，控释药物植入剂具有多层式结构，PDLLA阻隔层和PTMC延时层为致密的聚合物基质形貌，而PTMC(GEM)药物负载层可观察到PTMC聚合物和GEM药物的相分离。
如图3(A)、图3(B)所示，体内药物释放实验研究表明控释药物植入剂可实现三个周期的GEM释放，基于PTMC延时层的设计，PTMC(GEM)药物负载层中GEM的释放控制为：第0-1天为PTMC延时层厚度为0μm的植入剂释放，第4-6天为PTMC延时层厚度为35μm的植入剂释放，第9-11天为PTMC延时层厚度为85μm的植入剂的释放，如此形成了三个周期的GEM释放。
从图3(C)可知，给药24h后，控释药物植入剂给药方案的肿瘤内药物浓度可比静脉注射GEM(100μL，80mg/kg)组高17.1倍；而小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的药物浓度，植入剂组比静脉给药组低5.4～24.5倍。图3的结果表明，控释药物植入剂可实现在肿瘤内大量释放GEM，并且可有效降低全身药物浓度分布。
实施例4：程序性局部递送吉西他滨的控释药物植入剂在胰腺癌术后辅助治疗的应用
本发明进一步建立小鼠Panc02胰腺癌术后模型，以评估植入剂的抗肿瘤复发效果。
小鼠Panc02胰腺癌术后模型：将Panc02胰腺癌细胞离心(1000rpm，3min)收集，并用PBS(pH＝7.4，0.01M)洗涤后，将所得到的细胞悬浮液(细胞密度为2×106个每只小鼠)通过皮下注射到雄性C57BL/6小鼠(18g)的背部右后侧，观察肿瘤的生长情况并测量肿瘤的尺寸。肿瘤的尺寸用游标卡尺测量计算得到，具体计算公式如下：
V＝W2×L/2
其中，V代表肿瘤体积，W为肿瘤的宽度，L为肿瘤的长度。
当胰腺肿瘤长至约300mm3时，手术切除～90％体积的肿瘤，在手术的瘤床处直接植入PTMC延时层厚度分别为0μm、35μm、85μm的样品(实施例3制备得到)各×1个，缝合。
空白植入剂的制备：
(1)将1.00g的PDLLA溶解于10mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与碳酸二甲酯(DMC)混合溶剂(DMF：DMC＝1：9v/v)，得到PDLLA溶液(10％g/mL)。将PDLLA溶液在推注体积0.18mL、正高压+4kV、负高压-4kV、平移距离15cm的条件下，通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到PDLLA阻隔层，厚度为50μm。
(2)将0.2g的PTMC溶解于10mL的三氟乙醇，得到PTMC溶液(2％g/mL)。将PTMC溶液在推注体积1.56mL、正高压+6kV、负高压-2kV、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(1)的PDLLA阻隔层上，得到PTMC空白聚合物层，厚度为100μm，即得空白植入剂。
空白植入剂组的小鼠处理方法同上，植入的是不含药物的植入剂对照×3个。
生理盐水组、静脉注射GEM组的小鼠手术后直接缝合，然后在术后第1、4、7天分别通过尾静脉注射100μL生理盐水和GEM溶液(100μL，剂量80mg/kg)。
如图4(A)所示，当Panc02肿瘤增长到～300mm3时，切除～90％的原发肿瘤，并植入程序性控制吉西他滨释放的控释药物植入剂。实验结果表明，在术后36天的观察期内，控释药物植入剂显著抑制了Panc02肿瘤的复发，药物植入剂组的小鼠荷瘤测量尺寸在术后36天仅为117.2mm3，远小于生理盐水组(845.2mm3)、静脉给药组(443.4mm3)和空白植入剂组(781.8mm3)。
从图4(B)可知，经静脉给药后，动物体重出现了一定程度上的下降，表明静脉给药具有一定的全身毒性；而控释药物植入剂治疗方案并不会引起动物体重的显著变化，表明其治疗方案具有良好的安全性。
从图4(C)可知，为期90天的动物生存率评估实验表明，经程序性控制吉西他滨释放植入剂方案治疗后的小鼠生存率可达66.7％，相比其他对照组，小鼠生存率得到了显著提升。
图5中G1为静脉注射生理盐水组，G2为静脉注射GEM组，G3为空白植入剂植入组，G4为程序性控制GEM释放植入剂植入组。将治疗过后的小鼠荷瘤取出，拍照进行对比，并对其进行苏木精-伊红(H&E)染色和细胞凋亡TUNEL、增殖细胞核抗原Ki67免疫组化分析。如图5(A)所示，结果表明，相比空白和静脉注射对照组，经控释药物植入剂治疗的小鼠的术后复发肿瘤体积显著降低了。如图5(B)所示，肿瘤组织切片表现出组织间隙增大、细胞坏死和凋亡的现象，程序性控制GEM释放植入剂植入组中肿瘤组织内的增殖性细胞(Ki67阳性)比例大幅度减少，表明经植入剂治疗后的肿瘤组织大面积坏死、大大失去其恶性增殖能力。
本发明提供了一种控释药物植入剂及其制备方法与其在制备胰腺癌术后辅助治疗药物中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种控释药物植入剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将聚丙交酯溶于第一溶剂，得到聚丙交酯溶液；将聚丙交酯溶液通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到PDLLA阻隔层；
(2)将聚三亚甲基碳酸酯和药物活性成分溶于第二溶剂，得到含有药物活性成分的聚三亚甲基碳酸酯溶液；将含有药物活性成分的聚三亚甲基碳酸酯溶液通过静电纺丝方式收集到步骤(1)的PDLLA阻隔层上，得到PTMC药物负载层；
(3)将聚三亚甲基碳酸酯溶于第三溶剂，得到聚三亚甲基碳酸酯溶液；将聚三亚甲基碳酸酯溶液通过静电纺丝方式收集到步骤(2)的PTMC药物负载层上，得到PTMC延时层，即得控释药物植入剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的第一溶剂为N,N-二甲基甲酰胺与碳酸二甲酯任意比例的混合物；所述的聚丙交酯与第一溶剂的质量体积比为0.5g～1.0g：10mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的静电喷雾，正高压为+4kV，负高压为-4kV，平移距离为10～15cm；所述的接收器，直径为0.5～2.0mm；所述的PDLLA阻隔层，厚度为50～100μm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的药物活性成分为吉西他滨、氟尿嘧啶、伊立替康、盐酸阿霉素、紫杉醇和多烯紫杉醇中的任意一种；所述的第二溶剂为三氟乙醇或六氟异丙醇。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，聚三亚甲基碳酸酯和药物活性成分的总质量与第二溶剂的质量体积比为0.05g～0.3g：10mL；所述的聚三亚甲基碳酸酯与药物活性成分的质量比为4～9：1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的静电纺丝，正高压为+6kV，负高压为-2kV，平移距离为5～10cm；所述的PTMC药物负载层，厚度为20～100μm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的第三溶剂为三氟乙醇、六氟异丙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺体积比为9：1的混合物和氯仿与N,N-二甲基甲酰胺体积比为9：1的混合物中的任意一种或几种的组合；所述的聚三亚甲基碳酸酯与第三溶剂的质量体积比为0.05g～0.3g：10mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的静电纺丝，正高压为+6kV，负高压为-2kV，平移距离为5～10cm；所述的PTMC延时层，厚度为35～300μm。
9.权利要求1～8中任意一项所述的制备方法制备得到的控释药物植入剂。
10.权利要求9所述的控释药物植入剂在制备治疗胰腺癌术后药物中的应用。
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