CN116083465A - 乳糖负传感质粒及负反馈乳糖生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳糖负传感质粒，质粒上带有乳糖诱导表达的mf‑Lon蛋白酶基因和组成型表达的荧光蛋白‑pdt#3基因，还公开了负反馈乳糖生物传感器，是一个带有乳糖负传感质粒的大肠杆菌菌株。当样品中含有乳糖时，乳糖会诱导mf‑Lon蛋白酶的表达，通过识别荧光蛋白‑pdt#3的pdt#3标签靶向快速降解荧光蛋白。当培养环境中不含有乳糖时，mf‑Lon蛋白酶无法表达，荧光蛋白在细胞内稳定存在。利用此负反馈乳糖生物传感器，可以快速鉴定样品中是否含有乳糖，具有高敏感性和高效率等优势。同时，公布了负反馈乳糖生物传感器在筛选高产母乳寡糖菌株中的应用，包括自动化检测和微流控筛选等应用领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳糖负传感质粒及负反馈乳糖生物传感器，属于菌株筛选技术领域。
背景技术
乳糖是哺乳动物乳汁中特有的双糖，由葡萄糖和半乳糖组成。在婴幼儿生长发育过程中，乳糖不仅可以提供能量，还参与大脑的发育进程。母乳寡糖(human milkoligosaccharides，HMO)是母乳中第三丰富的固体成分(仅次于脂肪和乳糖)，含量为5～15g/L，具有调节免疫，帮助大脑发育及调节肠道菌群等功能，有助于婴幼儿成长发育。在人乳的200多种低聚糖中，包括岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-新六糖、唾液酸乳糖、乳酰-N-岩藻糖等，其中2’-岩藻糖基乳糖是HMO中含量最丰富的。这些低聚糖在机体中由特异的糖基转移酶合成，按照五种单体(N-乙酰葡萄糖胺、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-岩藻糖、N-乙酰神经氨酸)和乳糖分子以不同的组合排列构成，因此乳糖是母乳寡糖生物合成过程中的关键酶促反应底物。
乳糖是许多物质合成的关键原料，也是细胞内的关键能量来源。因此，原核生物在进化过程中演变成响应乳糖的操纵子(Lactose operon)。乳糖操纵子是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。在大肠杆菌的乳糖系统操纵子中，β-半乳糖苷酶，半乳糖苷渗透酶，半乳糖苷转酰酶的结构基因以LacZ(z)，Lac Y(y)，Lac A(a)的顺序分别排列在质粒上，在z的上游有操纵序列Lac O(o)，更前面有启动子Lac P(p)，这就是操纵子(乳糖操纵子)的结构模式。编码乳糖操纵系统中阻遏物的调节基因Lac I(i)位于p上游的邻近位置。当环境中存在葡萄糖时，乳糖操纵子会因为lacI和cAMP结合到启动子上抑制启动子的表达。当环境中不存在葡萄糖而存在乳糖时，乳糖被泄露的Lac启动子表达的LacZ分解成葡萄糖和半乳糖，半乳糖通过去阻遏LacI进一步开启乳糖操纵子的表达。除了传统的乳糖操纵子外，产气荚膜梭菌中也发现了能够响应乳糖的生物传感蛋白BgaR，能够在乳糖作为直接诱导物的条件下开启目的基因的表达。
虽然生物体内进化了多种响应乳糖的基因，但是目前仍缺乏高效灵敏的乳糖生物传感器。乳糖是母乳寡糖生物合成过程中关键的原料，监控乳糖的消耗，对于母乳寡糖的合成进程以及母乳寡糖高产菌株的筛选具有重要的意义。母乳寡糖的生物合成体系中一直缺乏有效地筛选系统，高效的乳糖生物传感器可以为母乳寡糖合成菌株的定向进化提供有效的工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳糖负传感质粒。
本发明采用的技术方案为：
一种乳糖负传感质粒，质粒上带有阻遏蛋白基因、乳糖诱导型启动子表达的mf-Lon蛋白酶基因和组成型启动子表达的荧光蛋白-pdt#3标签融合基因。
优选的，所述阻遏蛋白为LacIq或者BgaR，或者两者串联。
优选的，所述LacIq的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；BgaR的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述乳糖诱导型启动子下游包含响应乳糖浓度的阻遏蛋白结合位点LacO。
优选的，乳糖诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
优选的，所述启动子是Lac启动子、Tac启动子、T7启动子或BglR启动子。
优选的，所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、BFP、dsRED、mCherry中的一种或多种串联。
优选的，所述mf-Lon蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。
优选的，所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选的，所述荧光蛋白为GFP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选的，所述pdt#3标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，核苷酸序列如SEQIDNO:11所示。
本发明还公开了一种负反馈乳糖生物传感器，为含有上述的乳糖负传感质粒的大肠杆菌菌株。
本发明还公开了上述的负反馈乳糖生物传感器在样品中乳糖含量中的应用。
优选的，将传感器加入到样品中，孵育1h以上，检测样品中的荧光值。
优选的，所述样品为发酵液、培养基或反应液。
本发明还公开了上述的负反馈乳糖生物传感器在产母乳寡糖菌株筛选中的应用。
本发明还公开了一种利用负反馈乳糖生物传感器自动筛选高产母乳寡糖菌株的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)诱变产母乳寡糖菌株，并涂布在平板上；
(2)将单克隆挑取到含乳糖培养基的细胞培养板中，恒温震荡培养，菌株利用乳糖合成母乳寡糖，乳糖被消耗；
(3)将(2)中培养的发酵液转移到另一细胞培养板中，往细胞培养板中加入上述的负反馈乳糖生物传感器，继续培养一段时间；在荧光酶标仪中检测GFP荧光强度。
使用上述利用负反馈乳糖生物传感器自动筛选高产母乳寡糖菌株的系统进行筛选的过程为：机械臂将菌株转移到诱变仪上进行诱变操作；诱变结束后，机械臂将菌株转移到自动移液装置上；自动移液装置将菌株液体吸取出来，转移到含有固体培养基的培养皿上；机械臂将含有固体培养基的培养皿转移到自动涂布仪上，将菌液进行均匀涂布；涂布结束后，机械臂将培养皿转移到恒温震荡培养系统中静置培养一段时间；培养结束后，机械臂将培养皿从恒温震荡培养系统中转移到自动化克隆挑取仪上，自动化克隆挑取仪识别培养皿中固体介质上的菌株团，并利用机械臂将菌株团挑取到相对应的培养板(含乳糖培养基)中，机械臂将培养板转移到恒温震荡培养系统中震荡培养一段时间；培养结束后，机械臂将培养板转移到自动移液装置上，自动移液装置将原始培养板中的菌株分装一部分到检测培养板中，往检测培养板中加入负反馈乳糖生物传感器，机械臂将培养板转移到恒温震荡培养系统中震荡培养一段时间；培养结束后，机械臂将培养板转移到酶标仪上，测定荧光的强度；测定结束后，根据检测培养板上的荧光信号值，机械臂将检测培养板中高荧光值样品对应的原始培养板菌株进行挑拣和转移，并使用HLPC检测培养基上清中母乳寡糖的含量。
优选的，所述母乳寡糖是岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-新六糖、唾液酸乳糖或乳酰-N-岩藻糖。
优选的，所述产母乳寡糖菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、氧化葡糖杆菌。
本发明还提供了一种利用负反馈乳糖生物传感器的微流控技术高通量筛选高产母乳寡糖菌株的方法，其步骤包括：
(1)诱变产母乳寡糖菌株，将菌株用含乳糖的发酵培养基进行稀释；
(2)将菌株转移到微液滴制备仪中制备微液滴；
(3)制备的液滴孵育一段时间后，转移到液滴注射仪中注射上述的负反馈乳糖生物传感器；
(4)获得的液滴继续培养一段时间，转移到液滴分选仪中分选荧光强度达到一定阈值的液滴；
(5)将收集的液滴涂布在平板上，将单克隆挑取到含乳糖培养基的细胞培养板中；
通过恒温震荡培养，菌株利用乳糖合成母乳寡糖，乳糖被消耗；
(6)将步骤(5)培养的发酵液转移到另一细胞培养板中，往细胞培养板中加入负反馈乳糖生物传感器，继续培养一段时间；在荧光酶标仪中检测GFP荧光强度。
优选的，所述母乳寡糖是岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-新六糖、唾液酸乳糖或乳酰-N-岩藻糖。
优选的，所述产母乳寡糖菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、氧化葡糖杆菌。
本发明的生物传感器是一个带有乳糖负传感质粒的大肠杆菌菌株，质粒上带有乳糖诱导表达的mf-Lon蛋白酶基因和组成型表达的荧光蛋白-pdt#3基因。当样品中含有乳糖时，乳糖会诱导mf-Lon蛋白酶的表达，通过识别荧光蛋白-pdt#3的pdt#3标签靶向快速降解荧光蛋白。当培养环境中不含有乳糖时，mf-Lon蛋白酶无法表达，荧光蛋白在细胞内稳定存在。利用该负反馈乳糖生物传感器，可以快速鉴定样品中是否含有乳糖，具有高敏感性和高效率等优势。该负反馈乳糖生物传感器可以用于高效快速筛选高产母乳寡糖菌株，包括自动化检测和微流控筛选等应用领域。
附图说明
图1负反馈乳糖生物传感器基因示意图。
图2乳糖浓度、处理时间和GFP荧光强度之间的关系。
图3乳糖生物传感器检测母乳寡糖发酵液中乳糖的含量。
图4自动化工作站筛选高产母乳寡糖菌株突变体布局图。
图5自动化工作站筛选产母乳寡糖菌株突变体流程示意图。
图6热图展示乳糖生物传感器在自动化工作站中检测产母乳寡糖菌株突变体荧光结果。
图7热图展示乳糖生物传感器在自动化工作站中检测产母乳寡糖菌株突变体产量结果。
图8相关性图检测荧光和产量之间的关系。
图9微流控工作站高通量筛选高产母乳寡糖菌株突变体布局图。
图10微流控工作站高通量筛选产母乳寡糖菌株突变体流程示意图。
图11热图展示乳糖生物传感器在微流控工作站中检测产母乳寡糖菌株突变体产量结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
实施例1
在本实施例中，我们公布了负反馈乳糖生物传感器的制备方法。
为了提高传感器对乳糖的灵敏度，我们利用靶向蛋白切割技术来将荧光蛋白信号与乳糖浓度偶联。我们用BgaR-LacIq阻遏蛋白(BgaR的氨基酸序列见SEQ ID NO:2,核苷酸序列见SEQ ID NO:1；LacIq的氨基酸序列见SEQ ID NO:4,核苷酸序列见SEQ ID NO:3)控制蛋白酶mf-lon基因(氨基酸序列见SEQ ID NO:56，核苷酸序列见SEQ ID NO:5)的启动子(BglR启动子，核苷酸序列见SEQ ID NO:7)表达，同时，我们用组成型启动子T7(核苷酸序列见SEQ IDNO:8)来介导GFP蛋白(氨基酸序列见SEQ ID NO:10，核苷酸序列见SEQ ID NO:9)的表达。在GFP蛋白的C端，我们融合了mf-lon识别并降解的pdt#3标签(氨基酸序列见SEQID NO:12，核苷酸序列见SEQ ID NO:11)，使得GFP蛋白的稳定性受到mf-lon蛋白的负反馈调控。当反应液中不含有乳糖时，BgaR-LacO操纵子不能开启mf-lon蛋白酶的表达，GFP稳定存在于细胞中。当溶液中含有乳糖时，乳糖能够诱导mf-lon蛋白酶的表达，GFP会被mf-lon降解。乳糖的浓度越高，表达的mf-lon蛋白酶越多，GFP被降解越严重，溶液中的荧光信号越弱。阻遏蛋白响应乳糖开启mf-lon蛋白酶的表达，没有乳糖时，阻遏蛋白结合在乳糖诱导型启动子上阻止mf-lon蛋白的表达。当环境中存在乳糖时，乳糖会结合在阻遏蛋白上，让阻遏蛋白不能结合乳糖诱导型启动子，mf-lon基因的表达打开。
传感器质粒(图谱见图1)合成于广州艾基生物科技有限公司，合成的质粒转入Transsetta(DE3)大肠杆菌感受态(北京全式金生物科技有限公司)中，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min后，涂布在100mg/l的氨苄固体培养基中，37℃培养过夜，挑取单克隆菌团于100mg/l的氨苄液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养至OD600值达到0.6-0.8。
在反应液中添加终浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10g/l的乳糖，37℃处理0、2、4、6、8、10、12h后，在酶标仪上检测GFP的荧光强度。结果见图2，乳糖的浓度可以根据不同的反应时间来进行测定。
实施例2
在本实施例中，我们利用制备好的乳糖生物传感器来检测不同样品中乳糖的浓度。
取产2’-岩藻基乳糖菌株不同发酵时期的发酵液，HPLC检测其中的乳糖和2’-岩藻基乳糖的浓度。
取产乳酰-N-新四糖菌株不同发酵时期的发酵液，HPLC检测其中的乳糖和乳酰-N-新四糖的浓度。
取发酵液100ul，加入100ul负反馈生物传感器，37℃处理4h后，在酶标仪上检测GFP的荧光强度。结果见图3和图4，随着菌株发酵时间的延长，发酵液中乳糖的浓度逐渐降低，2’-岩藻基乳糖和乳酰-N-新四糖的浓度逐渐升高，负反馈乳糖生物传感器中GFP的荧光强度也逐渐升高。
实施例3
在本实施例中，我们验证了自动化工作站在产母乳寡糖菌株育种上的应用。所述自动化工作站的布局图见图5，流程示意图见图6。所述流程如下：
ARTP诱变：产2’-岩藻基乳糖或者产乳酰-N-新四糖的菌株200ul(1000-5000个细胞/ml)，放置到ARTP诱变仪上诱变45s。冰浴5min后，37℃静置1h。
克隆分离：利用指令操作机械臂将菌株转移到自动移液装置上，吸取100ul添加到固体培养皿上。利用指令操作机械臂将固体培养皿转移到自动涂布仪上，利用涂布仪滚筒将液体均匀涂布在培养皿上。利用机械臂将培养皿转移到恒温培养箱中，37℃静置培养过夜。
克隆挑取：在自动移液装置上往96孔板中加入100ul含乳糖培养基，转移到克隆挑取仪上。培养好的固体培养皿转移到克隆挑取仪上，利用克隆挑取仪的图像识别系统进行克隆识别，再利用针头挑取对应的菌株克隆团，转移到96孔板中。将96孔板转移到恒温培养箱中，37℃，100rpm震荡培养48h。
传感器检测：将培养后的96孔板转移自动移液装置上，取20ul转移到384孔板中，往384孔板中加入10ul负反馈乳糖生物传感器，混匀后转移到恒温培养箱中，37℃，100rpm震荡培养12h；孵育结束后，将反应板转移至荧光酶标仪中，检测GFP荧光强度。高荧光值的孔中即包含高产母乳寡糖的菌株突变体。结果见图7和图8，我们制备的负反馈乳糖生物传感器与母乳寡糖的产量具有明显的相关性。
实施例4
在本实施例中，我们验证了微流控分选和自动化平台在产母乳寡糖菌株育种上的应用。所述微流控分选和自动化平台的布局图见图9，流程示意图见图10。所述流程如下：
ARTP诱变：产2’-岩藻基乳糖或者产乳酰-N-新四糖的菌株100ul(107个细胞/ml)，放置到ARTP诱变仪上诱变45s。冰浴5min后，37℃静置1h。利用机械臂转移到自动移液工作站中，取10ul诱变后的菌株，加入1ml含乳糖培养基稀释，并混匀。
微液滴制备：利用指令操作机械臂将菌株转移到微液滴制备装置上，针头插入到菌株中，按照5ul/min的速度将菌液持续地泵入微液滴制备芯片的水相通道中。含2％7500表面活性剂的氟油以10ul/min的速度通过恒流泵持续注入到油相通道中。制备的微滴通过管道收集到培养瓶中。制备结束后，转移到37℃恒温培养箱中，静置培养48h。
液滴注射：利用指令操作机械臂将培养瓶转移到微液滴注射装置上，针头插入到液滴中，按照0.2ul/min的速度将液滴持续地泵入微液滴注射芯片的液滴通道中。含2％7500表面活性剂的氟油以1ul/min的速度通过恒流泵持续注入到油相通道中。负反馈乳糖传感器按照0.2ul/mim的速度通过恒流泵持续注入到水相通道中，并在高压电极上注入300V电压，制备的微滴通过管道收集到培养瓶中。制备结束后，转移到37℃恒温培养箱中，静置培养12h。
液滴分选：利用指令操作机械臂将培养瓶转移到微液滴分选装置上，针头插入到液滴中，按照0.2ul/min的速度将液滴持续地泵入微液滴注射芯片的液滴通道中。含2％7500表面活性剂的氟油以1ul/min的速度通过恒流泵持续注入到油相通道中。激发光使用488nm，发射光选用525nm。根据液滴的荧光信号强度施加一定比例的电压到高压电极，收集分选通道中的液滴。离心取下层菌株，加入1ml培养基进行扩培。
克隆分离：利用指令操作机械臂将扩培后的菌株转移到自动移液装置上，吸取100ul添加到固体培养皿上。利用指令操作机械臂将固体培养皿转移到自动涂布仪上，利用涂布仪滚筒将液体均匀涂布在培养皿上。利用机械臂将培养皿转移到恒温培养箱中，37℃静置培养过夜。
克隆挑取：在自动移液装置上往96孔板中加入100ul含乳糖培养基，转移到克隆挑取仪上。培养好的固体培养皿转移到克隆挑取仪上，利用克隆挑取仪的图像识别系统进行克隆识别，再利用针头挑取对应的菌株克隆团，转移到96孔板中。将96孔板转移到恒温培养箱中，37℃，100rpm震荡培养48h。
传感器检测：将培养后的96孔板转移到自动移液装置上，取20ul转移到384孔板中，往384孔板中加入10ul负反馈乳糖生物传感器，混匀后转移到恒温培养箱中，37℃，100rpm震荡培养12h；孵育结束后，将反应板转移至荧光酶标仪中，检测GFP荧光强度。高荧光值的孔中即包含高产母乳寡糖的菌株突变体。结果见图11，结合本生物传感器的微流控高通量筛选技术能够有效地筛选出高产母乳寡糖的菌株突变体。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (22)
1.一种乳糖负传感质粒，其特征在于质粒上带有阻遏蛋白基因、乳糖诱导型启动子表达的mf-Lon蛋白酶基因和组成型启动子表达的荧光蛋白-pdt#3标签融合基因。
2.根据权利要求1所述的乳糖负传感质粒，其特征在于：所述阻遏蛋白为LacIq或者BgaR，或者两者串联。
3.根据权利要求2所述的乳糖负传感质粒，其特征在于：所述LacIq的氨基酸序列如SEQID NO:4所示；BgaR的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述的乳糖负传感质粒，其特征在于所述乳糖诱导型启动子下游包含响应乳糖浓度的阻遏蛋白结合位点LacO。
5.根据权利要求4所述的乳糖负传感质粒，其特征在于乳糖诱导型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
6.根据权利要求1所述的乳糖负传感质粒，其特征在于所述启动子是Lac启动子、Tac启动子、T7启动子或BglR启动子。
7.根据权利要求1所述的乳糖负传感质粒，其特征在于所述荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、BFP、dsRED、mCherry中的一种或多种串联。
8.根据权利要求1所述的乳糖负传感质粒，其特征在于所述mf-Lon蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
9.根据权利要求1所述的乳糖负传感质粒，其特征在于所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
10.根据权利要求1所述的乳糖负传感质粒，其特征在于所述荧光蛋白为GFP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
11.根据权利要求1所述的乳糖负传感质粒，其特征在于所述pdt#3标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
12.一种负反馈乳糖生物传感器，其特征在于：为含有权利要求1-11中任一项所述的乳糖负传感质粒的大肠杆菌菌株。
13.权利要求12所述的负反馈乳糖生物传感器在样品中乳糖含量中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于将传感器加入到样品中，孵育1h以上，检测样品中的荧光值。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述样品为发酵液、培养基或反应液。
16.权利要求12所述的负反馈乳糖生物传感器在产母乳寡糖菌株筛选中的应用。
17.一种利用负反馈乳糖生物传感器自动筛选高产母乳寡糖菌株的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)诱变产母乳寡糖菌株，并涂布在平板上；
(2)将单克隆挑取到含乳糖培养基的细胞培养板中，恒温震荡培养，菌株利用乳糖合成母乳寡糖，乳糖被消耗；
(3)将(2)中培养的发酵液转移到另一细胞培养板中，往细胞培养板中加入权利要求12所述的负反馈乳糖生物传感器，继续培养一段时间；在荧光酶标仪中检测GFP荧光强度。
18.根据权利要求17所述的利用负反馈乳糖生物传感器自动筛选高产母乳寡糖菌株的方法，其特征在于所述母乳寡糖是岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-新六糖、唾液酸乳糖或乳酰-N-岩藻糖。
19.根据权利要求18所述的利用负反馈乳糖生物传感器自动筛选高产母乳寡糖菌株的方法，其特征在于所述产母乳寡糖菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、氧化葡糖杆菌。
20.一种利用负反馈乳糖生物传感器的微流控技术高通量筛选高产母乳寡糖菌株的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)诱变产母乳寡糖菌株，将菌株用含乳糖的发酵培养基进行稀释；
(2)将菌株转移到微液滴制备仪中制备微液滴；
(3)制备的液滴孵育一段时间后，转移到液滴注射仪中注射权利要求12所述的负反馈乳糖生物传感器；
(4)获得的液滴继续培养一段时间，转移到液滴分选仪中分选荧光强度达到一定阈值的液滴；
(5)将收集的液滴涂布在平板上，将单克隆挑取到含乳糖培养基的细胞培养板中；
通过恒温震荡培养，菌株利用乳糖合成母乳寡糖，乳糖被消耗；
(6)将步骤(5)培养的发酵液转移到另一细胞培养板中，往细胞培养板中加入负反馈乳糖生物传感器，继续培养一段时间；在荧光酶标仪中检测GFP荧光强度。
21.根据权利要求20所述的利用负反馈乳糖生物传感器的微流控技术高通量筛选高产母乳寡糖菌株的方法，其特征在于所述母乳寡糖是岩藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-新六糖、唾液酸乳糖或乳酰-N-岩藻糖。
22.根据权利要求20所述的利用负反馈乳糖生物传感器的微流控技术高通量筛选高产母乳寡糖菌株的方法，其特征在于所述产母乳寡糖菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、氧化葡糖杆菌。
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