CN110386963A - mf-ssrA多肽标签的缺失型突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及mf‑ssrA多肽标签的缺失型突变体及其应用。本发明通过改造mesoplasma florum(mf)的ssrA标签减少标记的靶蛋白在大肠杆菌内源蛋白降解酶存在下的泄漏降解，增加了系统的特异性和正交性。构建了缩短序列且生物活性增强的mf‑ssrA标签，进一步增强了它的工程性应用。

Description

mf-ssrA多肽标签的缺失型突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及mf-ssrA多肽标签的缺失型突变体及其应用。
背景技术
所有真细菌都有一个质量控制系统，即ssrA或tmRNA标记系统，它可以释放在截短的mRNAs的3’末端停滞的核糖体，并指导蛋白质的水解。ssrA标签是氨基酸编码而成，通过将其加到蛋白的C末端来实现在翻译过程中对异常蛋白的降解。
其中，mf-ssrA标签是来自于支原体，它是由27个氨基酸编码而成的ssrA标签。Tuet al.的体外实验表明，mf-ssrA标签能被支原体的Lon蛋白酶(mf-lon)降解，但不能被大肠杆菌中的Lon蛋白酶降解。Cameron和Collins利用mf-ssrA标签的这个特性，开发了一个工程化的正交性蛋白降解系统。他们优化了mf-ssrA标签在大肠杆菌体内降解的稳定性，并通过诱导mf-Lon的表达来调控对标记蛋白的降解。他们发现在mf-ssrA标签中numbers区域(残基24-27)与大肠杆菌的ssrA标签部分同源，从而导致了mf-ssrA标签也能被蛋白酶ClpXP部分降解。而mf-ssrA标签的另一个letters区域(残基13-15)仅能被mf-lon识别，而不能被大肠杆菌的内源性蛋白酶识别。因此，他们对影响mf-ssrA标签降解活性的区域(残基13-15)和影响mf-ssrA标签降解特异性的区域(残基24-27)进行突变，最终保留了letters区域，并优化了mf-ssrA标签的numbers区域，从而得到了mf-ssrA标签的突变体pdt#3标签，此标签在大肠杆菌体内的稳定性比突变前有所提高。
mf-ssrA标签介导的降解体系可以应用到生物防治方向，如Chan et al.等人设计了两种基因开关Deadman和Passcode kill switches。这种基因开关的原理是：将pdt#3标签添加到毒性蛋白的C末端，在诱导mf-Lon蛋白酶表达时可以对毒性蛋白进行降解从而使菌体正常生长，而当菌种逃离后不处于mf-Lon诱导条件下，则毒性蛋白会表达并对细胞有致死效果；mf-ssrA标签介导的降解体系还可以应用到基因存储电路中。通过诱导mf-Lon的表达使标签标记的蛋白(CcrM)停止甲基化，从而系统处于off-state状态，实现信号复位[7]；Zhang C等人将该系统用于工程基因电路中的生物不确定性的研究上。在这个系统中，利用不同生物的正交部分，如mf-ssrA标签介导的mf-Lon蛋白酶降解正交系统在的E.coli和L.catis中的应用可以减少与内源性宿主相互作用的机会，从而达到对工程部件的优化的目的；基于mf-ssrA标签介导的降解体系，王静等人在蓝细菌中建立可诱导的蛋白降解系统，并通过该系统对关键基因编码产物进行可控降解以研究其生理功能基因编码产物。
ssrA标签介导的降解系统有广阔的应用前景：(1)mf-ssrA标签介导的降解体系可以应用到生物防治方向，如Chan等人设计了两种基因开关Deadman和Passcode killswitches。这种基因开关的原理是：将pdt#3标签添加到毒性蛋白的C末端，在诱导mf-Lon蛋白酶表达时，系统可以对毒性蛋白进行降解从而使菌体正常生长；而当菌种逃离(不处于mf-Lon诱导条件下)，则毒性蛋白会表达并对细胞有致死作用。(2)mf-ssrA标签介导的降解体系可以应用到基因存储电路中。通过诱导mf-Lon蛋白酶的表达，使标记的蛋白(CcrM)终止甲基化，进而使系统处于off-state状态，实现信号复位。(3)Zhang C等人将该系统用于工程基因电路中生物不确定性的研究上。在这个系统中，利用不同生物的正交部分，达到对工程部件的优化目的，如在大肠杆菌和乳酸杆菌中，mf-Lon蛋白酶对mf-ssrA标签的正交性降解系统可以减少目标蛋白与内源性宿主之间的相互作用。然而还存在一些问题：第一，mf-ssrA标签介导的降解系统的特异性不高。在大肠杆菌内源蛋白酶的背景下，优化的mf-ssrA标签依然存在降解泄漏的情况，即大肠杆菌的内源蛋白酶会自发识别并降解被mf-ssrA标签标记的蛋白，尤其在细胞稳定时期降解泄漏情况较为明显。第二，mf-ssrA标签过长，不利于工程性应用。mf-ssrA标签是由27个氨基酸组成的，这个长度相对较长，导致它不能被广泛的应用于基因组编辑和工程应用。例如在多重自动化基因编辑技术(mage)这个基因组编辑系统中需要小于60bp的基因片段作为插入片段从而实现对基因组的编辑。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种mf-ssrA多肽标签的缺失型突变体及其应用。为了缩短标签以增加标签的工程性应用以及解决泄露降解的问题，在保留mf-ssrA标签的13-15和24-27残基的基础上，系统地删除了标签的两个尚未被研究区域(残基1-12和16-23)，获得了缩短的mf-ssrA标签变异体。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了mf-ssrA标签的缺失型突变在提高mf-Lon蛋白酶介导的大肠杆菌内蛋白降解的特异性中的应用；所述缺失型突变位于残基1-12和/或残基16-23。mf即是Mycoplasma florum菌的简称。
本发明还提供了mf-ssrA标签的缺失型突变在基因组编辑中的应用；所述缺失型突变位于残基1-12和/或残基16-23。
在上述研究的基础上，本发明提供了mf-ssrA标签突变体，其选自至少一种以下序列或其任一组合：
(I)、所述mf-ssrA标签的残基1-12和/或残基16-23具有缺失型突变；所述突变的个数为1～16个；作为优选，所述突变的个数为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个；更优选的，所述突变的个数为8或10个。
或(II)、如(I)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
或(III)、与(I)或(II)所述氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，其选自至少一种以下序列或其任一组合：
(I)、所述mf-ssrA标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示；
或(II)、如(I)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
或(III)、与(I)或(II)所述氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
此外，本发明还提供了编码所述mf-ssrA标签突变体的核苷酸。
本发明还提供了一种表达载体，包括编码所述mf-ssrA标签突变体的核苷酸。
本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主。
本发明还提供了所述的核苷酸、所述的表达载体或所述的宿主在基因组编辑中的应用。
本发明还提供了所述的核苷酸、所述的表达载体或所述的宿主在降解蛋白中的应用。
在上述研究的基础上，本发明还提供了降解蛋白的方法，将所述的核苷酸或所述的表达载体与待降解蛋白转染或转化入宿主内，培养。
本发明提供了mf-ssrA标签的缺失型突变在提高mf-Lon蛋白酶介导的大肠杆菌内蛋白降解的特异性中的应用；所述缺失型突变位于残基1-12和/或残基16-23。本发明还提供了mf-ssrA标签的缺失型突变在基因组编辑中的应用；所述缺失型突变位于残基1-12和/或残基16-23。本发明与现有的mf-ssrA标签相比有显著的进步，其主要优点如下：(1)迄今为止使用的mf-ssrA标签，在大肠杆菌内源蛋白酶的背景下存在降解泄漏，即大肠杆菌的内源蛋白酶会自发识别并降解被mf-ssrA标签标记的蛋白，尤其在细胞稳定时期泄漏降解的情况较为明显。这里通过改造mf-ssrA标签减少标记的靶蛋白在大肠杆菌内源蛋白降解酶存在下的泄漏降解，增加了系统的特异性和正交性。(2)首次构建了缩短序列且生物活性增强的mf-ssrA标签，进一步增强了它的工程性应用。
综上，本发明构建了缩短序列且生物活性增强的mf-ssrA标签，进一步增强了它的工程性应用。(H1缩短了8个氨基酸序列，H2缩短了10个氨基酸序列，不仅减少了泄露降解，增加了降解系统的特异性和正交性，而且序列长度首次<60bp)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示pdt#3标签的氨基酸序列和该标签介导的蛋白降解原理示意图；
图2示携带pZE27GFP3和pZA16mflon质粒的大肠杆菌MG1655Z1内的蛋白降解(诱导降解6h)；
图3示OD600与荧光值的线性回归分析；
图4示mf-ssrA突变体H1、H2的降解效果。
具体实施方式
本发明公开了一种mf-ssrA多肽标签的缺失型突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的mf-ssrA多肽标签的缺失型突变体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
本实验中选用了大肠杆菌MG1655Z1菌株(来自于元英进老师实验室)、大肠杆菌DH5αλpir菌株以及大肠杆菌XL10Gold菌株。其中，大肠杆菌MG1655Z1菌株用于mf-Lon蛋白酶对mf-ssrA标签标记的蛋白的降解实验；大肠杆菌DH5αλpir和大肠杆菌XL10Gold菌株均自于本实验室，用于质粒的克隆实验与菌种的保存。实验中所用质粒pZA16mflon，pZE27GFP购自于GenBank。用于Quickchange的引物订购于金唯智公司。
在pZE27GFP3质粒的基础上，使用了Quickchange的方法构建了不带标签标记的GFP表达载体pZE27GFP0和mf-ssrA突变体，mf-ssrA突变体即对pZE27GFP3质粒的mf-ssrA基因片段进行了缺失型突变，从而产生了被不同mf-ssrA突变体标记的降解底物。
大肠杆菌MG1655Z1内蛋白降解实验检测：
该降解实验的操作步骤如下所述：
(1)挑取携带不同mf-ssrA突变体标记的GFP表达载体的质粒和pZA16mflon质粒的大肠杆菌MG1655Z1的单菌落于3mL的LB培养基中，在37℃摇床中过夜培养。
(2)第二天，按照1:100的比例转接到新的3mL的LB培养基中，当OD600到达0.6时加入终浓度为1mM的阿拉伯糖诱导Lon蛋白酶的表达。
(3)诱导培养6个小时后，取1mL的菌液到2mL的离心管中，离心(5000rpm,10min),然后轻轻吸出850μL的LB培养基，并加入850μL的PBS缓冲液将菌液重悬起来。
用酶标仪对其OD600值和荧光值进行测量，其中酶标仪检测参数的设置为：激发波长为485nm，发射波长为535nm，gain＝70。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1用Quickchange方法制备mf-ssrA突变体
在pZE27GFP3质粒的基础上，使用了Quickchange的方法构建了不带标签标记的GFP表达载体pZE27GFP0和mf-ssrA突变体，mf-ssrA突变体即对pZE27GFP3质粒的mf-ssrA基因片段进行了缺失型突变，从而产生了被不同mf-ssrA突变体标记的降解底物。
采用Quickchange的方法来首先系统的删除pdt#3(优化的mf-ssrA)标签上的残基1-12(命名为L region)和残基16-23(命名为Rregion)的相邻的氨基酸，并产生了2个mf-ssrA标签的突变体。
为了方便对突变标签的命名，分别将L region的12个氨基酸和Rregion的8个氨基酸进行编号，每两个氨基酸被编为一组，所以L region内有“1-6”号被编码的氨基酸，Rregion内有“1-4”号被编码的氨基酸。如突变体R3-6表示为：Rregion内编码为1和2的四个相邻的氨基酸被删除后所产生的mf-ssrA标签的突变体。
在pZE27GFP3质粒的基础上对mf-ssrA标签的L region和Rregion内氨基酸序列进行缺失型突变，得到2个mf-ssrA标签的突变体。对L region的氨基酸和Rregion的氨基酸进行删除，分别得到H1、H2的突变体。
其中，H1突变体为L3-6R1-3；H2突变体为L3-6R1-2。
pdt#3(如SEQ ID No.3所示)：AANKNEENTNEVPTFMLNAGQANRRRV；
H1(如SEQ ID No.1所示)：ENTNEVPTFMLNAGQRRRV；
H2(如SEQ ID No.2所示)：ENTNEVPTFMLNARRRV。
实施例2可行性
分别将实施例1获得的2个突变体加到绿色荧光蛋白(GFP)蛋白的C末端，并与Lon蛋白酶的表达载体一起转入大肠杆菌MG1655Z1中，通过测量Lon蛋白酶对标签标记的GFP降解后的荧光剩余量来表征降解效果，并通过与不带标签的GFP的降解后荧光剩余量比较来表征各突变体的降解特异性。其中，pdt#3标签的氨基酸序列和该标签介导的蛋白降解原理如图1所示。
为了验证该技术的可行性，证明现阶段的mf-ssrA标签介导的大肠杆菌内蛋白降解和之前研究中描述一致，即存在泄露降解的情况。将pZE27GFP3和pZA16mflon质粒同时转化到大肠杆菌MG1655Z1中并在LB培养基中培养，当菌液OD600到达0.6时诱导Lon蛋白酶的表达，诱导降解6h后测量被pdt#3标签标记的GFP的荧光剩余量。结果如图2所示，此图中“标签”指pdt#3标签。“不诱导”代表Lon蛋白酶不诱导表达的情况，“诱导”代表在OD600为0.6时诱导Lon蛋白酶表达的情况。以不带标签且不诱导Lon蛋白酶表达的组的荧光值为100％，其他组的荧光值除以该组荧光值来表征各自的降解效果。其结果表明，带pdt#3标签且在Lon蛋白酶不诱导降解的情况下，确实存在泄露降解的情况。
用酶标仪测定大肠杆菌内蛋白降解效果，为了进一步证明此检测方法的可行性，对菌液进行2倍梯度稀释至2048倍，然后测量每组稀释的样品的荧光值和OD600值，最后以OD600值为横坐标，样品的荧光值为纵坐标，做线性回归方程，查看两个参数的相关系。结果如图3所示。结果表明，荧光值和OD600值有很强的线性回归关系，所以用该方法对大肠杆菌MG1655Z1内的蛋白降解效果进行检测。
实施例3 mf-ssrA突变标签的降解效果
选取用pCSH1质粒代替pZE27GFP3质粒，并同pZA16mflon质粒一起转化到大肠杆菌MG1655Z1中，以作为无GFP表达的空白对照组，进而可以检测被mf-ssrA标签标记的GFP蛋白是否完全降解。降解效果如图4、表1所示。
表1
由本例平行实验，SAS软件进行显著性分析，结果为：
不诱导组：No tag-Cc、pdt#3-Dd、H1-Bb、H2-Aa、Control-Ee；
诱导组：No tag-Aa、pdt#3-Cc、H1-Cc、H2-Bb、Control-Cc。
实验结果表明，删除mf-ssrA标签的多个残基(多达10个氨基酸)不会彻底地丢失mf-Lon蛋白酶对标记蛋白的降解功能，反而删除某些特定氨基酸会提高被mf-ssrA标签标记的蛋白的稳定性，减少蛋白泄漏情况。此外，与mf-ssrA标签的N末端上游区域的1-12残基的相比，删除其C末端的附近区域—16-23残基—内的氨基酸会在很大程度上削弱mf-Lon蛋白酶对标记蛋白的降解活性。所以在mf-ssrA标签的1-12残基的区域内对特定氨基酸的删除不仅会提高稳定性、减少降解泄漏，还会使mf-ssrA标签变的更短从而加强其工程性应用。
H1突变体和H2突变体不仅没有改变mf-Lon蛋白酶对mf-ssrA标记的底物的完全降解的效果，而且在不诱导的情况下其荧光值超过了100％，解决了降解泄漏的情况，即很大程度上减少了大肠杆菌内源性蛋白酶对mf-ssrA标签标记的目标蛋白的降解。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> mf-ssrA多肽标签的缺失型突变体及其应用
<130> MP1907367
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Asn Thr Asn Glu Val Pro Thr Phe Met Leu Asn Ala Gly Gln Arg
1 5 10 15
Arg Arg Val
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Asn Thr Asn Glu Val Pro Thr Phe Met Leu Asn Ala Arg Arg Arg
1 5 10 15
Val
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> pdt#3(pdt#3)
<400> 3
Ala Ala Asn Lys Asn Glu Glu Asn Thr Asn Glu Val Pro Thr Phe Met
1 5 10 15
Leu Asn Ala Gly Gln Ala Asn Arg Arg Arg Val
20 25

Claims (10)

1.mf-ssrA标签的缺失型突变在提高mf-Lon蛋白酶介导的大肠杆菌内蛋白降解的特异性中的应用；所述缺失型突变位于残基1-12和/或残基16-23。
2.mf-ssrA标签的缺失型突变在基因组编辑中的应用；所述缺失型突变位于残基1-12和/或残基16-23。
3.mf-ssrA标签突变体，其特征在于，其选自至少一种以下序列或其任一组合：
(I)、所述mf-ssrA标签的残基1-12和/或残基16-23具有缺失型突变；所述突变的个数为1～16个；
或(II)、如(I)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
或(III)、与(I)或(II)所述氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的mf-ssrA标签突变体，其特征在于，其选自至少一种以下序列或其任一组合：
(I)、所述mf-ssrA标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或2所示；
或(II)、如(I)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；
或(III)、与(I)或(II)所述氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
5.编码如权利要求1所述mf-ssrA标签突变体的核苷酸。
6.一种表达载体，包括编码如权利要求3或4所述mf-ssrA标签突变体的核苷酸。
7.转化或转染如权利要求6所述表达载体的宿主。
8.如权利要求5所述的核苷酸、如权利要求6所述的表达载体或如权利要求7所述的宿主在基因组编辑中的应用。
9.如权利要求5所述的核苷酸、如权利要求6所述的表达载体或如权利要求7所述的宿主在降解蛋白中的应用。
10.降解蛋白的方法，其特征在于，将如权利要求5所述的核苷酸或如权利要求6所述的表达载体与待降解蛋白转染或转化入宿主内，培养。
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