CN116083271A - 一种小单孢属的新种及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种小单孢属的新种及其应用，属于微生物的技术方案。为了提供一种小单孢属的新种。本发明提供一种小单孢属菌Micromonosporasp.181，所述小单孢菌181保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.16626，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。小单孢属菌Micromonosporasp.181对山核桃干腐病病原菌有显著的抑制作用。

Description

一种小单孢属的新种及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种小单孢属的新种及其应用。
背景技术
小单孢菌属(Micromonospora)属于细菌域(Bacteria)-放线菌门(Actinobacteria)-放线菌纲(Actinobacteria_c)-放线菌目(Actinomycetales)-小单孢菌亚目(Micromonosporineae)-小单孢菌科(Micromonosporaceae)。
小单胞菌属的菌株首次于1905年被发现，Foulerton从空气中分离到一株菌，命名为Streptothrix chalcea，1923年通过对这株菌进行表型特征等研究分析，建立了小单孢菌属，并将其命名为Micromonospora chalcea，目前涵盖110个有效发表的物种(https://www.bacterio.net/genus/micromonospora)。小单孢菌属(Micromonospora)在分类学上属于放线菌门(Actinobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria_c)、放线菌目(Actinomycetales)、小单孢菌亚目(Micromonosporineae)、小单孢菌科(Micromonosporaceae)，小单孢菌属为小单孢菌科的典型菌属，小单孢菌属的典型菌种为青铜小单孢菌(Micromonospora chalcea)。
小单孢菌的生存环境较广泛，在土壤及水生环境、低温环境、碱性环境均有分布。从不同类型的土壤、植物根系、叶子、根瘤、海洋环境(沉积物，海沙，海绵)中都分离到小单孢菌。其中，红树林来源的小单孢菌占有较高的比例，如小单孢菌Micromonosporapattaloongensis，Micromonospora rifamycinica,Micromonospora rhizosphaerae，Micromonospora wenchangensis,Micromonospora haikouensis,Micromonosporamaritima，Micromonosporazhanjiangensis，Micromonospora ovatispora,Micromonospora sediminis均从红树林土壤分离得到，从红树林植物根系中分离到小单孢菌有Micromonospora sonneratiae。
山核桃主要分布在浙江省和安徽省，不仅可作为防护林、家具的用材，其核果除了可直接食用外，也可作为糕点的原料和食用油料，具有较高的营养价值和一定的保健功能。但是山核桃干腐病的爆发不仅使山核桃产量大幅度少，而且削弱了树势，导致树木死亡，给山核桃经济和环境的可持续发展带来了严重威胁。山核桃干腐病(Macrophoma caryae)又叫溃疡病，其主要病原菌为葡萄座腔菌(Botryosphaeria)的菌株，以Botryosphaeriadothidea为代表，在全世界分布广泛。田甜等人发现两株真菌(棘孢木霉和草酸青霉)是山核桃干腐病潜在的生防菌，其中草酸青霉(Penicillium oxalicum)主要通过代谢产生的抗菌素起作用。程敏等人发现解淀粉芽孢杆菌植物亚种对山核桃干腐病菌有抑制作用。葛康康等人发现1株具有抑菌活性的生防细菌BS111，经鉴定表明菌株BS111为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
小单孢菌可产生结构多样的具有生物活性的代谢产物，如大环内酯类、蒽醌类、生物碱类。小单孢菌属的一些菌株曾被报道可产生抑制植物病原菌的代谢产物，炭样小单孢菌JXNU-1所产抗生素对烟草赤星病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌等多种植物病原真菌有一定的抑制作用。小单孢菌产生的代谢产物在农林业中展现出一定的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种小单孢菌属的新种。
本发明提供一种小单孢菌Micromonospora sp.，所述小单孢菌Micromonosporasp.命名为小单孢菌Micromonospora sp.181保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.16626，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明提供上述的小单孢菌Micromonospora sp.181的微生物制剂。
进一步地限定，小单孢菌Micromonospora sp.181以6％的接种量接种在发酵培养基中，在28℃条件下发酵7天。
进一步地限定，所述发酵培养基为：0.4％酵母抽提物、1.0％麦芽提取物、0.4％葡萄糖、0.1％FeSO4·7H2O和0.2％CaCO3，pH 7.2-7.4。
进一步地限定，所述发酵培养基为：1.0％可溶性淀粉、1.0％棉籽饼粉、0.5％酵母抽提物、0.5％麦芽抽提物、0.2％MgSO4·7H2O和0.2％CaCO3，pH 7.2-7.4。
进一步地限定，所述发酵培养基为：2.0％黄豆粉，2.0％葡萄糖、1.0％可溶性淀粉、0.2％牛肉膏、0.2％蛋白胨和0.5％K2HPO4，pH 7.2-7.4。
本发明提供上述的小单孢菌Micromonospora sp.181或上述的微生物制剂在制备抑制核桃干腐病的试剂中的应用。
本发明提供上述的小单孢菌Micromonospora sp.181或上述的微生物制剂在制备抑制核桃干腐病的药物中的应用。
进一步地限定，所述药物或试剂的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂中的任意一种。
本发明提供一种抑制核桃干腐病的方法，其特征在于，将上述的小单孢菌Micromonospora sp.181接种到含有核桃干腐病的培养皿中培养7天。
进一步限定，培养小单孢菌Micromonospora sp.181的培养基为：ISP2固体培养基。
进一步地限定，培养核桃干腐病的培养基为：PDA培养基。
有益效果：小单孢菌Micromonospora sp.181是小单孢菌属的一个新发现的种，小单孢菌Micromonospora sp.181对山核桃干腐病病原菌有较好的抑制效果。
【生物保藏信息】小单孢菌Micromonospora sp.菌种已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，获得的保藏号为CGMCC No.16626。通过多相分类学鉴定，菌株命名为181，为小单孢菌属的新种，保藏日期为2018年10月24日，保藏的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
附图说明
图1为小单孢菌Micromonospora sp.181在ISP2培养基28℃下培养21天的透射电镜图；
图2为小单孢菌Micromonospora sp.181的极性脂图，其中，DPG，二磷脂酰甘油；PE，磷脂酰乙醇胺；PI，磷脂酰肌醇；PG，磷脂酰甘油；PGL，磷糖脂；GL，糖脂；PL，磷脂；AL，氨基脂；
图3为小单孢菌Micromonospora sp.181与相似菌株的16S rRNA基因系统发育树(NJ)，其中，Bootstrap值基于1000个重复；仅显示≥50％的值。Bar，每个核苷酸位置0.005个取代。Actinoplanes regularis IFO 12514T作为外种；
图4为小单孢菌Micromonospora sp.181对Botryosphaeria dothidea的拮抗作用，其中，a为实验组，b为仅接种病原菌的对照组。
具体实施方式
通过多相分类学研究，从表型、基因型及化学分类特征等方面对小单孢菌Micromonospora sp.181进行鉴定，确定其分类地位。
(1)表型研究
菌株在不同培养基(ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7、营养琼脂和高氏一号固体培养基)上生长情况、菌落形态及细胞形态的观察参考文献。生长限制因子实验：小单孢菌Micromonospora sp.181的生长温度检测范围为4、10、15、20、25、28、30、32、35、37、40、45和50℃；生长盐浓度(NaCl)检测范围为0-10％的12个(0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10％)浓度梯度；生长pH检测范围为4-10之间的12个(pH 4.0、4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0)梯度。厌氧实验通过接种菌种至厌氧固体培养基，放于厌氧袋密封培养。菌株的革兰氏染色、氧化酶活性、接触酶活性、酯酶活性、淀粉水解、纤维素水解、明胶水解活性以及硝酸盐还原的测定。菌株的底物利用情况通过Biolog GN2试剂盒来检测。
(2)化学分类特征
1)脂肪酸
采用Sherlock(MIDI)全自动细菌鉴定系统对菌株的脂肪酸成分进行自动化检测分析。
2)呼吸醌
呼吸醌的提取按照【K.Komagata,and K.I.Suzuki.(1988)4Lipid and Cell-WallAnalysis in Bacterial Systematics.Methods in Microbiology 16,161-207】记载的方法进行，通过HPLC-MS分析确定其种类。
3)极性脂
极性脂的提取、层析及显色操作过程参考【Jia YY,Sun C,Pan J,et al.(2014)Devosia pacifica sp nov.,isolated from deep-sea sediment.InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64,2637-2641】。
(3)基因型特征
提取小单孢菌Micromonospora sp.181的基因组DNA进行测序，并将小单孢菌Micromonospora sp.181的16S rRNA基因序列(SEQ ID NO.1所示：
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTAGGCTTTGGGATAACCCTCGGAAACGGGGGCTAATACCGGATATGACCTTGCCCTGCATGGGGTTTGGTGGAAAGTTTTTCGGCCTGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGACCGTGAAAACTTGGGGCTCAACCCCAAGCCTGCGGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGGCCTCTCCGGTTCCCTGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGGCCGCAAAACTTCCAGAGATGGGAGGTCCTTCGGGGGCGGTCACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCGATGTTGCCAGCGCGTTATGGCGGGGACTCATCGAAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAATGGGTTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAACC)提交到细菌分类学分析数据库EzBioCloud网站(http://www.ezbiocloud.net/)上进行比对。用MEGAX软件中的Clustal W对所有的序列进行比对，通过邻接法(neighbor-joining，NJ)进行系统发育树的构建，确定菌株的分类地位。DNA-DNA同源性测定方法参考文献【Zhang X Q,YingY,Ye Y,et al.(2010)Thermusarciformis sp.nov.,a thermophilic species from a geothermalarea.International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology 60,834-839】进行。
实施例1.菌种分离和鉴定
1.小单孢菌Micromonospora sp.181分离筛选
小单孢菌Micromonospora sp.181分离自福建龙海市桐花树根系土壤。
具体分离操作如下：将土壤自然风干研磨后，称取10g土壤加90mL无菌水震荡混匀；在无菌环境下，用倍比稀释法涂布接种到葡萄糖天门冬素培养基(葡萄糖10g，天门冬素0.5g，K2HPO40.5 g，1000mL蒸馏水，pH 7.2-7.4，琼脂20g)上，28℃培养一周，从平板上挑取单菌落转接于新配制的ISP2平板上，反复纯化，得到纯菌。
2.菌种鉴定方法
小单孢菌Micromonospora sp.181为革兰氏阳性菌，好氧、形成发育良好的基内菌丝，单个孢子形成在基质菌丝上，直径0.5-0.8μm，孢子表面出现疣状(图1)。但没有气生菌丝，在琼脂平板上不产生可溶性色素。在ISP2平板上30℃培养，菌落颜色由橙色变为深棕色，随着培养时间增加，菌落变成黑色，表面凸起。菌株在不同培养基上生长状态如表1，菌株ISP2上生长良好，在ISP3、ISP4、ISP6和高氏一号上生长一般，在ISP2、ISP5、ISP7和营养琼脂培养基上生长较差，结果如表1所示。
表1小单孢菌Micromonospora sp.181在不同培养基28℃下培养14天的特征
小单孢菌Micromonospora sp.181的温度生长范围为15-45℃(最适生长温度为28-35℃)；pH生长范围为5.5-9.0(最适生长pH为7.0-8.0)；NaCl盐度生长范围为0-4.0％(最适为1.0％)。过氧化氢酶为阳性，小单孢菌Micromonospora sp.181可以水解淀粉、七叶苷、吐温40、吐温60和吐温80，但不能水解纤维素和明胶。不能产生H2S，牛奶胨化实验结果为阴性，牛奶凝固实验结果为阴性。
小单孢菌Micromonospora sp.181与亲缘关系相近的三种参比菌株M.rifamycinica AM105T、M.wenchangensis CCTCCAA2012002T和M.mangrovi 2803GPT1-18T相比，一些特征可将小单孢菌Micromonospora sp.181与参比菌株区分开。例如，与三种参比菌株不同，小单孢菌Micromonospora sp.181硝酸盐还原的实验结果为阴性；小单孢菌Micromonosporasp.181可以在pH 5.5和9.0下生长，但是M.rifamycinica AM105T和M.mangrovi2803GPT1-18T不可以；与不同，小单孢菌Micromonospora sp.181过氧化氢酶为阳性。在底物利用的实验中，小单孢菌Micromonospora sp.181可以利用棉籽糖，与三株参比菌株不同；在D型木糖、乳糖和蜜二糖的利用上，小单孢菌Micromonospora sp.181与M.wenchangensis CCTCCAA2012002T不同；而在D型果糖、麦芽糖和蔗糖的利用上，菌株与M.rifamycinica AM105T结果不同；小单孢菌Micromonospora sp.181可以利用D型果糖，但菌株M.mangrovi2803GPT1-18T不可以，结果如表2所示。
表2小单孢菌Micromonospora sp.181与Micromonospora属内参比菌株的特征差异
(菌株1，小单孢菌Micromonospora sp.181；2，M.wenchangensisCCTCCAA2012002T；3，M.rifamycinica AM105T；4，M.mangrovi2803GPT1-18T。+，反应阳性；-，反应阴性；w，反应弱阳性。)
(2)化学分类特征
在小单孢菌Micromonospora sp.181中检测到的主要呼吸醌是MK-10(H4)、MK-9(H6)和MK-10(H6)，含量分别为83.1％、10.7％和6.2％。与三种参考菌株相比，小单孢菌Micromonospora sp.181最主要的成分为MK-10(H4)，而参比菌株均为MK-10(H6)。经Sherlock系统测定，小单孢菌Micromonospora sp.181中主要的脂肪酸(占总脂肪酸的含量≥5.0％)是iso-C16:0(29.7％)，iso-C15:0(16.9％)，10-methyl-C18:0(11.5％)和C18:1ω9c(6.3％)，具体成分及含量见表3。从一些主要的含量占比上看，有一些特征将小单孢菌Micromonospora sp.181与参考菌株区分开来，10-methyl-C18:0是小单孢菌Micromonospora sp.181的主要脂肪酸，但在参比菌株M.rifamycinica AM105T和M.mangrovi 2803GPT1-18T中不是。小单孢菌Micromonospora sp.181与M.wenchangensisCCTCCAA2012002T相比，C18:1ω9c是一个主要成分，但C18:0不是主要成分。小单孢菌Micromonospora sp.181的主要极性脂质是二磷脂酰甘油(DPG)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇磷脂(PI)，磷脂(PL)，磷糖脂(PGL)，糖脂(GL)和氨基脂(AL)，见图2。小单孢菌Micromonospora sp.181不含磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)，与参比菌株M.wenchangensis CCTCC AA2012002T和M.rifamycinicaAM105T不同；磷脂酰甘油(PG)和磷糖脂(PGL)可区分小单孢菌Micromonospora sp.181与M.mangrovi 2803GPT1-18T，结果如表3所示。
表3小单孢菌Micromonospora sp.181与参比菌株的脂肪酸比较
(菌株：1，小单孢菌Micromonospora sp.181；2，M.wenchangensisCCTCCAA2012002T；3，M.rifamycinica AM105T；4，M.mangrovi 2803GPT1-18T。在4个菌内含量均小于1％的脂肪酸未显示，ND，未检测到。)(3)基因型分析
将小单孢菌Micromonospora sp.181的16S rRNA基因序列提交到EzBioCloud网站上进行比对，并获得GeneBank上的登录号MK108078，发现小单孢菌Micromonospora sp.181与Micromonospora属的相似度比较高，其16S rRNA基因与M.wenchangensis CCTCCAA2012002T，M.rifamycinicaAM105T和M.mangrovi 2803GPT1-18T的菌株有99.5％，99.4％和99.1％的相似性。小单孢菌Micromonospora sp.181在NJ树中与M.rifamycinica AM105T形成一簇(图3)。小单孢菌Micromonospora sp.181的G+C含量为72.8mol％，与参比菌株类似。DNA-DNA杂交结果显示小单孢菌Micromonospora sp.181与M.wenchangensis CCTCCAA2012002T，M.rifamycinicaAM105T和M.mangrovi 2803GPT1-18T的杂交率分别为63.5％，55.9％和52.8％。这些结果低于确定细菌种类的阈值(70％)。这些结果表明，本发明小单孢菌Micromonospora sp.181是小单孢菌属的一个新发现的基因种。
实施例2.制备含有小单孢菌Micromonospora sp.181的生物制剂
离体抑菌活性复筛：将小单孢菌Micromonospora sp.181接种在ISP2固体培养基上，28℃下培养7天，将培养好的菌株接种至种子液培养基中，28℃、200r/min培养2-3天。选择三种不同的发酵培养基(FA-FC)，见表4，将培养好的种子液以6％接种量分别接种至三种发酵培养基中，28℃、200r/min培养7d。发酵液加入等体积的乙醇超声处理60min，过滤得上清滤液，之后旋蒸至浓缩液剩5mL左右备用。
表4三种发酵培养基配方
实施例3.小单孢菌Micromonospora sp.181对山核桃干腐病的抑制活性
通过平板对峙法对山核桃干腐病病原菌Botryosphaeria dothidea(病原菌由浙江农林大学提供)进行初步活性筛选，将小单孢菌Micromonospora sp.181接种于ISP2固体培养基上，Botryosphaeria dothidea接种于PDA上培养，将小单孢菌Micromonosporasp.181接种在含有Botryosphaeria dothidea的培养基中，用十字交叉法测量真菌Botryosphaeria dothidea直径，抑菌率计算公式如下，表明小单孢菌Micromonosporasp.181对山核桃干腐病病原菌有较好的抑制效果(图4)。
抑菌率(％)＝(对照组真菌直径-实验组真菌直径)/对照组真菌直径×100％。
对照组为仅在PDA培养基的中间接种5mm的山核桃干腐病病原菌Botryosphaeriadothidea的菌饼；实验组为在PDA培养基中心接种Botryosphaeria dothidea的菌饼外，据中心2.5cm处等距离四点接种小单孢菌Micromonospora sp.181的菌饼(直径5mm)，对照组和实验组均置于28℃恒温培养7天后测定抑制率。
实施例2获得的浓缩的发酵滤液进行活性复筛试验，同时以空白培养基的旋蒸滤液为对照，通过十字交叉法测量Botryosphaeria dothidea的直径，并计算小单孢菌Micromonospora sp.181的发酵液对山核桃干腐病的抑制率，抑制率计算公式同上，结果如表5。
表5小单孢菌Micromonospora sp.181不同发酵液对Botryosphaeria dothidea的抑制作用

Claims (10)

1.一种小单孢菌Micromonosporasp.，其特征在于，所述小单孢菌Micromonosporasp.命名为小单孢菌Micromonosporasp.181保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.16626，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.含有权利要求1所述的小单孢菌Micromonosporasp.181的微生物制剂。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，小单孢菌Micromonosporasp.181以6％的接种量接种在发酵培养基中，在28℃条件下发酵7天。
4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述发酵培养基为：质量分数为0.4％的酵母抽提物、质量分数为1.0％的麦芽提取物、质量分数为0.4％的葡萄糖、质量分数为0.1％的FeSO4·7H2O和质量分数为0.2％的CaCO3，pH7.2-7.4。
5.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述发酵培养基为：质量分数为1.0％的可溶性淀粉、质量分数为1.0％的棉籽饼粉、质量分数为0.5％的酵母抽提物、质量分数为0.5％的麦芽抽提物、质量分数为0.2％的MgSO4·7H2O和质量分数为0.2％的CaCO3，pH7.2-7.4。
6.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述发酵培养基为：质量分数为2.0％的黄豆粉，质量分数为2.0％的葡萄糖、质量分数为1.0％的可溶性淀粉、质量分数为0.2％的蛋白胨和质量分数为0.5％的K2HPO4，pH7.2-7.4。
7.权利要求1所述的小单孢菌Micromonosporasp.181或权利要求2所述的微生物制剂在制备抑制核桃干腐病的试剂中的应用。
8.权利要求1所述的小单孢菌Micromonosporasp.181或权利要求2所述的微生物制剂在制备抑制核桃干腐病的药物中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述药物或试剂的的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂中的任意一种。
10.一种抑制核桃干腐病的方法，其特征在于，将权利要求1所述的小单孢菌Micromonosporasp.181接种到含有核桃干腐病的培养皿中培养7天。
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