CN116083240A - 工程化细菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种工程化细菌及其制备方法和应用,制备方法包括亲水性高分子在引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成水凝胶的步骤。该制备方法涉及亲水性高分子在引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成水凝胶,从而制备菌内含水凝胶的工程化细菌,其能够用于制备细菌疫苗,不具生理活性,能够避免细菌致病性。同时,用该制备方法制备的工程化细菌,有效保留了细菌完整的膜结构和细菌膜蛋白,具有用作细菌疫苗的潜力,基于其膜结构和膜蛋白的完整性,用对制备的细菌疫苗,能延长对机体刺激时间并维持较长的免疫时间长,解决目前细菌疫苗的膜蛋白损失及变性的问题,增强细菌疫苗免疫疗效。基于免疫效果的提升,有助于降低接种剂量以及减少接种次数。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别是一种工程化细菌及其制备方法和应用。
背景技术
细菌感染性疾病是一类严重危害人类健康的疾病,目前临床上主要采用抗菌药物治疗细菌感染性疾病,但是抗菌药物的滥用或者过度使用,导致耐药菌尤其是多重耐药菌的出现,从而削弱抗菌药物的抗菌作用,无法有效控制感染,成为临床处理中的难题。
细菌疫苗能提高易感人群对病原菌的抵抗力,有效控制感染的发生,在预防细菌性感染疾病中发挥了巨大作用。但目前的细菌疫苗主要是灭活细菌疫苗,而灭活细菌疫苗的制备过程会破坏细菌的完整结构以及免疫蛋白损失,最终导致灭活细菌疫苗对身体刺激时间短,产生免疫力不强。因此,如何有效避免对细菌结构的破坏以及降低蛋白损失细菌疫苗研发中亟待解决的问题。
鉴于此,特提出本申请。
发明内容
本申请的目的之一包括提供一种工程化细菌的制备方法,用该制备方法制备的工程化细菌不具有生理活性且细菌结构完整,蛋白种类与活菌一致。
在本申请的第一方面,提供一种工程化细菌的制备方法,所述制备方法包括亲水性高分子在引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成水凝胶的步骤。
在本申请的一些实施方式中,所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成所述水凝胶的步骤包括:
将所述细菌置于包含所述亲水性高分子和所述引发剂的溶液A中,冷冻孵育;和
对冷冻孵育后的所述细菌进行解冻,对解冻后的所述细菌进行物理刺激,使所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于所述细菌内发生交联反应形成所述水凝胶,从而制备工程化细菌。
在本申请的一些实施方式中,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(A)冷冻孵育的温度为0℃~-160℃,冷冻孵育的时间在30s以上;
(B)每100mL所述溶液A中含有1g-60g的所述亲水性高分子;
(C)每100mL所述溶液A中含有0.01g-10g的所述引发剂;
(D)解冻的温度为20℃~30℃,解冻的时间在30s以上;
(E)物理刺激的条件包括:刺激源为光波、超声波、磁共振波、温度或/和pH值,刺激时间在1min以上;和,
(F)所述溶液A的溶剂包含磷酸盐缓冲液。
在本申请的一些实施方式中,所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成所述水凝胶的步骤包括:
将所述细菌置于包含所述亲水性高分子的溶液B中,冷冻孵育;和
对冷冻孵育后的所述细菌进行解冻,将解冻后的所述细菌置于包含所述引发剂的溶液C中进行交联孵育,使所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成所述水凝胶,从而制备工程化细菌。
在本申请的一些实施方式中,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(A)冷冻孵育的温度为0℃~-160℃,冷冻孵育的时间在30s以上;
(B)每100mL所述溶液B中含有1g-60g的所述亲水性高分子;
(C)每100mL所述溶液C中含有1g-60g的所述引发剂;
(D)解冻的温度为20℃~30℃,解冻的时间在30s以上;
(E)交联孵育的温度为20℃~30℃,交联孵育的时间在1min以上;和,
(F)所述溶液B的溶剂包含磷酸盐缓冲液;和
(G)所述溶液C的溶剂包含磷酸盐缓冲液。
在本申请的一些实施方式中,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(1)所述亲水性高分子包含多糖、醇、丙烯酸和丙烯酸衍生物中的一种或者多种;和,
(2)所述引发剂选自光引发剂、离子交联剂、共价交联剂和主客体作用介导的非共价交联剂中的一种或者多种。
在本申请的一些实施方式中,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(1)所述多糖选自淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸、壳聚糖和它们的盐中的一种或者多种;
(2)所述醇选自聚乙烯醇和聚乙二醇中的一种或者多种;和,
(3)所述丙烯酸衍生物选自聚丙烯酸和聚丙烯酸衍生物中的一种或者多种。
在本申请的一些实施方式中,所述细菌为葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌或者破伤风杆菌。
在本申请的一些实施方式中,所述细菌为大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、不动杆菌属,耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属菌、巴斯德菌属菌、霍乱弧菌、副溶血性杆菌或者类志贺吡邻单胞菌。
在本申请的第二方面,提供第一方面中所述的制备方法制备的工程化细菌。
在本申请的第三方面,提供第二方面中所述的工程化细菌在制备细菌疫苗中的应用。
相对于传统技术,本申请具有以下有益效果:
本申请提供一种工程化细菌的制备方法,该制备方法涉及亲水性高分子在引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成水凝胶,从而制备菌内含水凝胶的工程化细菌,其能够用于制备细菌疫苗,不具生理活性,能够避免细菌致病性。同时,用该制备方法制备的工程化细菌,有效保留了细菌完整的膜结构和细菌膜蛋白,具有用作细菌疫苗的潜力,基于其膜结构和膜蛋白的完整性,用对制备的细菌疫苗,能延长对机体刺激时间并维持较长的免疫时间长,解决目前细菌疫苗的膜蛋白损失及变性的问题,增强细菌疫苗免疫疗效。基于免疫效果的提升,有助于降低接种剂量以及减少接种次数。
另外,本申请制备工艺简单,能快速制备工程化细菌,有利于规模化和推广,且可长时间储存,在基于细菌疫苗的预防和治疗领域中展示出巨大应用潜力和转化价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对本领域技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的正常大肠杆菌的扫描电镜图;
图2为本发明实施例1的凝胶工程化大肠杆菌的扫描电镜图;
图3为本发明实施例1的正常大肠杆菌和凝胶工程化大肠杆菌的考马斯亮蓝全蛋白条带图;
图4为本发明实施例1的正常大肠杆菌和凝胶工程化大肠杆菌的生长曲线图;
图5为本发明实施例2的正常金黄色葡萄球菌的扫描电镜图;
图6为本发明实施例2的凝胶工程化金黄色葡萄球菌的扫描电镜图;
图7为本发明实施例2的正常金黄色葡萄球菌和凝胶工程化金黄色葡萄球菌的考马斯亮蓝全蛋白条带图;
图8为本发明实施例2的正常大肠杆菌和凝胶工程化大肠杆菌的生长曲线图;
图9为本发明对比例1的对照组大肠杆菌的扫描电镜图;
图10为本发明对比例1的对照组大肠杆菌的生长曲线图;
图11为本发明对比例2的对照组金黄色葡萄球菌的扫描电镜图;
图12为本发明对比例2的对照组金黄色葡萄球菌的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例,对本发明作进一步详细的说明。应理解,这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式和实施例,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改,得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外,在下文的描述中,给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解,应理解,本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处,本文中使用的术语或短语具有以下含义:
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目,也包括相关所列项目的任意的和所有的组合,所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是,当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时,应当理解,在本申请中,该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案,还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如,“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如,“A,及/或,B,及/或,C,及/或,D”的技术方案,包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案),也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合,也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合,还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等,如无特别限定,指在数量上大于2或等于2。例如,“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中,“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”,以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中,“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例,应当理解,并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中,“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的,表示内容上的差异,但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中,“可选地”、“可选的”、“可选”,指可有可无,也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”,如无特别说明,且无矛盾之处或相互制约关系,则每项“可选”各自独立。
本发明中,“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中,术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的,不能理解为指示或暗示相对重要性或数量,也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的,应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中,涉及到数值区间(也即数值范围),如无特别说明,可选的数值分布在上述数值区间内视为连续,且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值),以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明,当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时,包括该数值范围的两个端点整数,以及两个端点之间的每一个整数,在本文中,相当于直接列举了每一个整数,比如t为选自1~10的整数,表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外,当提供多个范围描述特征或特性时,可以合并这些范围。换言之,除非另有指明,否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数,如无特别限定,既允许为恒温处理,也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是,所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中,%(w/w)与wt%均表示重量百分比,%(v/v)指体积百分比,%(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突,否则,本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时,相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时,被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中,但以能够实施本发明为限。应当理解,当引用内容与本申请中的描述相冲突时,以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请的第一方面
本申请提供一种工程化细菌的制备方法,所述制备方法包括亲水性高分子在引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成水凝胶的步骤。
细菌类灭活疫苗使用时间比较早,其制备方式主要是将细菌或/及其代谢物通过物理、化学方法使其失去毒力保留免疫原性,接种后在机体内不生长繁殖。但是这些制备方式容易导致菌体结构破坏以及免疫原性蛋白的丢失、空间位置改变甚至发生变性,从而导致细菌疫苗免疫原性减低,无法达到预期疗效。本申请通过在菌内使亲水性高分子在引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成水凝胶,有效保留完整细菌膜结构和细菌膜蛋白,为解决目前细菌疫苗的膜结构损伤、膜蛋白损失及变性的问题提供了新的解决方案,有利于增强细菌疫苗免疫疗效。本申请提供的细菌可以根据需求进行自适应调整,其应用范围广。
水凝胶是一类极为亲水的三维网络结构凝胶,它在水中迅速溶胀并在此溶胀状态可以保持大量体积的水而不溶解,凡是水溶性或亲水性的高分子,通过一定的化学交联或物理交联,都可以形成水凝胶。关于水凝胶,特别是对具有增强型物理化学性能的工程水凝胶的研究越来越深入,从具有新型化学性质及组分的水凝胶的设计,到对具有复杂结构的水凝胶进行动态模拟。水凝胶具有的亲水特性和机械韧性,可使其作为细菌的理想型骨架结构,维持菌内凝胶工程化的细菌形态和蛋白结构。凡是水溶性或亲水性的高分子,通过一定的化学交联或者物理交联,都可以形成水凝胶。这些高分子按其来源可分为天然和合成两大类。天然的亲水性高分子包括多糖类(淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸,壳聚糖等)和多肽类(胶原、聚L-赖氨酸、聚L-谷胺酸等)。合成的亲水高分子包括醇、 丙烯酸及其衍生物类(聚丙烯酸,聚甲基丙烯酸,聚丙烯酰胺,聚N-聚代丙烯酰胺等)。具体是采用化学交联,还是采用物理交联,相应地选取哪些交联原料,本申请不做特别限定。
上述化学交联的反应可以选自包括但不限于硫醇-烯/炔加成、硫醇-环氧反应、叠氮-炔环加成、席夫碱反应、环氧-胺反应、硫醇-二硫化物交换反应。上述物理交联可以选自包括但不限于静电作用、氢键、主客体作用、疏水相互作用。
可选地,所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成所述水凝胶的步骤包括:
将所述细菌置于包含所述亲水性高分子和所述引发剂的溶液A中,冷冻孵育;和
对冷冻孵育后的所述细菌进行解冻,对解冻后的所述细菌进行物理刺激,使所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于所述细菌内发生交联反应形成所述水凝胶,从而制备工程化细菌。
可选地,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(A)冷冻孵育的温度为0℃~-160℃(例如0、-5、-10、-15、-20、-30、-40、-50、-60、-70、-80、-90、-100、-110、-120、-130、-140、-150、-160℃),冷冻孵育的时间在30s以上(例如为0.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200min);
(B)每100mL所述溶液A中含有1g-60g(例如为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60g)的所述亲水性高分子;
(C)每100mL所述溶液A中含有0.01g-10g(例如为0.01、0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10g)的所述引发剂;
(D)解冻的温度为20℃~30℃(例如为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃),解冻的时间在30s以上(例如为0.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200min);
(E)物理刺激的条件包括:刺激源为光波、超声波、磁共振波、温度或/和pH值,刺激时间在1min以上(例如为1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200min);和,
(F)所述溶液A的溶剂包含磷酸盐缓冲液。
可选地,所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成所述水凝胶的步骤包括:
将所述细菌置于包含所述亲水性高分子的溶液B中,冷冻孵育;和
对冷冻孵育后的所述细菌进行解冻,将解冻后的所述细菌置于包含所述引发剂的溶液C中进行交联孵育,使所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成所述水凝胶,从而制备工程化细菌。
可选地,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(A)冷冻孵育的温度为0℃~-160℃(例如0、-5、-10、-15、-20、-30、-40、-50、-60、-70、-80、-90、-100、-110、-120、-130、-140、-150、-160℃),冷冻孵育的时间在30s以上(例如为0.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200min);
(B)每100mL所述溶液B中含有1g-60g(例如为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60g)的所述亲水性高分子;
(C)每100mL所述溶液C中含有1g-60g(例如为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60g)的所述引发剂;
(D)解冻的温度为20℃~30℃例如为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃),解冻的时间在30s以上(例如为0.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200min);
(E)交联孵育的温度为20℃~30℃(例如为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30℃),交联孵育的时间在1min以上(例如为0.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200min);
(F)所述溶液B的溶剂包含磷酸盐缓冲液;和
(G)所述溶液C的溶剂包含磷酸盐缓冲液。
可选地,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(1)所述亲水性高分子包含多糖、醇、丙烯酸和丙烯酸衍生物中的一种或者多种;和,
(2)所述引发剂选自光引发剂、离子交联剂、共价交联剂和主客体作用介导的非共价交联剂中的一种或者多种。
可选地,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(1)所述多糖选自淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸、壳聚糖和它们的盐中的一种或者多种;
(2)所述醇选自聚乙烯醇和聚乙二醇中的一种或者多种;和,
(3)所述丙烯酸衍生物选自聚丙烯酸和聚丙烯酸衍生物中的一种或者多种。
本申请对细菌的种类不做特别限定,可以为革兰氏阳性菌,也可以为革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌可以选自包括但不限于葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌或者破伤风杆菌等。革兰氏阴性菌可以选自包括但不限于大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、不动杆菌属,耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属菌、巴斯德菌属菌、霍乱弧菌、副溶血性杆菌或者类志贺吡邻单胞菌。不同的细菌类型具有不同的致病性,因此可根据感染性疾病的病理特点,确定感染菌株的类型,并选择该特定菌种进行菌内凝胶工程化。本申请提供的菌内凝胶工程化细菌可以根据需要选择相应的菌种类型。
本申请的第二方面
本申请提供第一方面中所述的制备方法制备的工程化细菌。
本申请的第三方面
本申请提供第二方面中所述的工程化细菌在制备细菌疫苗中的应用。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本发明中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以按照制造厂商所建议的条件,或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
本实施例提供了一种菌内凝胶工程化细菌及其制备方法。
本实施例中,细菌为大肠杆菌,聚乙二醇(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA,亲水性高分子)、光引发剂ir2959和PBS速溶颗粒购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
该菌内凝胶工程化大肠杆菌的制备方法包括如下步骤:
(1)将大肠杆菌置于含有20%(重量百分比)PEGDA和1%(重量百分比)ir2959的PBS溶液中,于-80℃条件下孵育15分钟。
(2)孵育后,室温溶解1分钟,洗去多余的PEGDA,再经紫外光照(10W)15分钟,制得菌内凝胶工程化大肠杆菌。
将制得的菌内凝胶工程化大肠杆菌进行扫描电镜成像、蛋白分析和增殖能力测试。正常大肠杆菌的扫描电镜图参照图1所示。菌内凝胶工程化大肠杆菌的扫描电镜图参照图2所示。正常大肠杆菌和菌内凝胶工程化大肠杆菌的考马斯亮蓝全蛋白条带图参照图3所示。正常大肠杆菌和菌内凝胶工程化大肠杆菌的生长曲线图参照图4所示。根据图示结果可知:菌内凝胶工程化大肠杆菌的物理形貌与正常大肠杆菌保持一致,且蛋白种类也与正常大肠杆菌相同,有效保留了细菌完整的膜结构和细菌膜蛋白的免疫原性。但是,生长曲线显示菌内凝胶工程化大肠杆菌无增殖能力,表面其不具生理活性,能够避免细菌致病性,因此有潜力作为细菌疫苗,刺激机体产生免疫反应,并且不会引发细菌感染性疾病。
实施例2
本实施例提供了一种菌内凝胶工程化细菌及其制备方法。
本实施例中,细菌为金黄色葡萄球菌,二茂铁修饰的聚丙烯酸和β-环糊精修饰的聚丙烯酸为实验室自制,PBS速溶颗粒购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
(1)将金黄色葡萄球菌置于含有40%(重量百分比)二茂铁修饰聚丙烯酸的PBS溶液中,于-20℃条件下孵育180分钟。
(2)孵育后,室温溶解30秒,洗去多余的二茂铁修饰聚丙烯酸,再加入30%(重量百分比)β-环糊精修饰聚丙烯酸的PBS溶液,继续室温孵育15分钟。
(3)洗去多余的β-环糊精修饰聚丙烯酸,制得菌内凝胶工程化金黄色葡萄球菌。
将制得的菌内凝胶工程化金黄色葡萄球菌进行扫描电镜成像、蛋白分析和增殖能力测试。正常金黄色葡萄球菌的扫描电镜成像图参照图5所示。菌内凝胶工程化金黄色葡萄球菌的扫描电镜图参照图6所示。正常金黄色葡萄球菌和菌内凝胶工程化金黄色葡萄球菌的考马斯亮蓝全蛋白条带图参照图7所示。正常大肠杆菌和菌内凝胶工程化大肠杆菌的生长曲线图参照图8所示。根据图示结果可知:菌内凝胶工程化金黄色葡萄球菌的物理形貌与正常金黄色葡萄球菌保持一致,且蛋白种类也与正常金黄色葡萄球菌相同,有效保留了细菌完整的膜结构和细菌膜蛋白的免疫原性。但是,生长曲线显示菌内凝胶工程化金黄色葡萄球菌无增殖能力,表面其不具生理活性,能够避免细菌致病性,因此有潜力作为细菌疫苗,刺激机体产生免疫反应,并且不会引发细菌感染性疾病。
实施例3
本实施例提供了一种菌内凝胶工程化细菌及其制备方法。
本实施例中,细菌为大肠杆菌,海藻酸钠、氯化钙和PBS速溶颗粒购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
(1)将大肠杆菌置于含有1%(重量百分比)海藻酸钠的PBS溶液中,于-80℃条件下孵育30分钟。
(2)孵育后,室温溶解2分钟,洗去多余的海藻酸钠,再加入5%(重量百分比)氯化钙的PBS溶液,继续室温孵育45分钟,
(3)洗去多余的氯化钙PBS溶液,制得菌内凝胶工程化大肠杆菌。
实施例4
本实施例提供了一种菌内凝胶工程化细菌及其制备方法。
本实施例中,细菌为金黄色葡萄球菌,N1-(4-溴苄基)-N3-(4-溴苯基)-N1,N1,N3,N3-四甲基丙烷-1,3-二胺(TSPBA)为实验室自制,聚乙烯醇(平均分子量12000Da)和PBS速溶颗粒购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
(1)将金黄色葡萄球菌置于含有25%(重量百分比)聚乙烯醇的PBS溶液中,于-20℃条件下孵育10小时。
(2)孵育后,室温溶解10分钟,洗去多余的聚乙烯醇,再加入25%(重量百分比)TSPBA的PBS溶液,继续室温孵育60分钟。
(3)洗去多余的TSPBA,制得菌内凝胶工程化金黄色葡萄球菌。
对比例1
本对比例中,细菌为大肠杆菌,二茂铁修饰的聚丙烯酸和β-环糊精修饰的聚丙烯酸为实验室自制,PBS速溶颗粒购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
(1)将大肠杆菌置于含有40%(重量百分比)二茂铁修饰聚丙烯酸的PBS溶液中,于4℃条件下孵育30分钟。
(2)孵育后,洗去多余的二茂铁修饰聚丙烯酸,再加入30%(重量百分比)β-环糊精修饰聚丙烯酸的PBS溶液,继续室温孵育15分钟。
(3)洗去多余的β-环糊精修饰聚丙烯酸,收集大肠杆菌。
将制得的大肠杆菌进行扫描电镜成像和增殖能力分析。制得的大肠杆菌的扫描电镜成像图参照图9所示。制得的大肠杆菌的生长曲线图参照图10所示。根据图示结果可知:大肠杆菌并未发生菌内凝胶工程化修饰,且仍具有细菌增殖活性。这主要是因为凝胶材料与细菌的共孵育温度过高,不利于凝胶材料的菌内渗透。只有在零度以下进行共孵育,凝胶溶液才能形成冰晶,导致细菌壁膜穿孔,促进凝胶材料菌内渗透。
对比例2
本对比例中,细菌为金黄色葡萄球菌,二茂铁修饰的聚丙烯酸和β-环糊精修饰的聚丙烯酸为实验室自制,PBS速溶颗粒购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
(1)将金黄色葡萄球菌置于含有40%(重量百分比)二茂铁修饰聚丙烯酸的PBS溶液中,于4℃条件下孵育30分钟。
(2)孵育后,洗去多余的二茂铁修饰聚丙烯酸,再加入30%(重量百分比)β-环糊精修饰聚丙烯酸的PBS溶液,继续室温孵育15分钟。
(3)洗去多余的β-环糊精修饰聚丙烯酸,收集金黄色葡萄球菌。
将制得的金黄色葡萄球菌进行扫描电镜成像和增殖能力分析。制得的金黄色葡萄球菌的扫描电镜成像图参照图11所示。制得的金黄色葡萄球菌的生长曲线图参照图12所示。根据图示结果可知:金黄色葡萄球菌同样并未发生菌内凝胶工程化修饰,且仍具有细菌增殖活性。
综上,快速低温冷冻处理可使细菌膜通透性增加,促进水溶性或亲水性的高分子的菌内渗透,室温溶解后快速去除水溶性或亲水性的高分子溶液,可避免发生细菌外表面的交联。加入另一水溶性或亲水性的组分或者采用物理刺激方式,可诱导菌内渗透的水溶性或亲水性的高分子发生交联作用,获得菌内凝胶工程化的细菌。
本申请实施例提供了一种菌内凝胶工程化的细菌及其制备方法,该制备方法基于低温菌内凝胶工程化技术,制备凝胶工程化细菌,作为细菌疫苗,用于降低病原菌感染的发生率,有利于感染性疾病的控制。凝胶工程化细菌不具生理活性,可避免细菌致病性,同时低温菌内凝胶工程化制备技术有效保留完整细菌膜结构和细菌膜蛋白的免疫原性,解决目前细菌疫苗的膜蛋白损失及变性的问题,增强细菌疫苗免疫疗效。本发明提供的凝胶工程化细菌的制备方法具有制备工艺简单、快速、规模化和普适性的优势,且可长时间储存,在基于细菌疫苗的预防和治疗领域中展示出巨大应用潜力和转化价值。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合,为使描述简洁,未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解,本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案,均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种工程化细菌的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括亲水性高分子在引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成水凝胶的步骤。
2.根据权利要求1所述的工程化细菌的制备方法,其特征在于,所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成所述水凝胶的步骤包括:
将所述细菌置于包含所述亲水性高分子和所述引发剂的溶液A中,冷冻孵育;和
对冷冻孵育后的所述细菌进行解冻,对解冻后的所述细菌进行物理刺激,使所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于所述细菌内发生交联反应形成所述水凝胶,从而制备工程化细菌。
3.根据权利要求2所述的工程化细菌的制备方法,其特征在于,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(A)冷冻孵育的温度为0℃~-160℃,冷冻孵育的时间在30s以上;
(B)每100mL所述溶液A中含有1g-60g的所述亲水性高分子;
(C)每100mL所述溶液A中含有0.01g-10g的所述引发剂;
(D)解冻的温度为20℃~30℃,解冻的时间在30s以上;
(E)物理刺激的条件包括:刺激源为光波、超声波、磁共振波、温度或/和pH值,刺激时间在1min以上;和,
(F)所述溶液A的溶剂包含磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的工程化细菌的制备方法,其特征在于,所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成所述水凝胶的步骤包括:
将所述细菌置于包含所述亲水性高分子的溶液B中,冷冻孵育;和
对冷冻孵育后的所述细菌进行解冻,将解冻后的所述细菌置于包含所述引发剂的溶液C中进行交联孵育,使所述亲水性高分子在所述引发剂作用下于细菌内发生交联反应形成所述水凝胶,从而制备工程化细菌。
5.根据权利要求4所述的工程化细菌的制备方法,其特征在于,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(A)冷冻孵育的温度为0℃~-160℃,冷冻孵育的时间在30s以上;
(B)每100mL所述溶液B中含有1g-60g的所述亲水性高分子;
(C)每100mL所述溶液C中含有1g-60g的所述引发剂;
(D)解冻的温度为20℃~30℃,解冻的时间在30s以上;
(E)交联孵育的温度为20℃~30℃,交联孵育的时间在1min以上;
(F)所述溶液B的溶剂包含磷酸盐缓冲液;和,
(G)所述溶液C的溶剂包含磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的工程化细菌的制备方法,其特征在于,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(1)所述亲水性高分子包含多糖、醇、丙烯酸和丙烯酸衍生物中的一种或者多种;和,
(2)所述引发剂选自光引发剂、离子交联剂、共价交联剂和主客体作用介导的非共价交联剂中的一种或者多种。
7.根据权利要求6所述的工程化细菌的制备方法,其特征在于,所述制备方法满足如下条件中的一个或者多个:
(1)所述多糖选自淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸、壳聚糖和它们的盐中的一种或者多种;
(2)所述醇选自聚乙烯醇和聚乙二醇中的一种或者多种;和,
(3)所述丙烯酸衍生物选自聚丙烯酸和聚丙烯酸衍生物中的一种或者多种。
8.根据权利要求1至5和7中任一项所述的工程化细菌的制备方法,其特征在于,所述细菌为葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌或者破伤风杆菌;或者,
所述细菌为大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、不动杆菌属,耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、志贺菌属菌、巴斯德菌属菌、霍乱弧菌、副溶血性杆菌或者类志贺吡邻单胞菌。
9.权利要求1至8中任一项所述的制备方法制备的工程化细菌。
10.权利要求9所述的工程化细菌在制备细菌疫苗中的应用。
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