CN116082486A - 一种具有抑制黑色素生成活性的多肽及其应用 - Google Patents
一种具有抑制黑色素生成活性的多肽及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抑制黑色素生成活性的多肽OA‑SR及其应用。该多肽的氨基酸序列为SRVVKCIGFDQGRLTPEGLVNKINLDWKSSDVEYYLAEC。所述多肽OA‑SR的应用为在制备黑色素生成抑制剂、皮肤美白剂及美白护肤品中的应用。本发明提供了一种具有39个氨基酸新的新的多肽OA‑SR,该多肽OA‑SR具有优异的抑制黑色素生成活性,在制备皮肤美白剂及美白护肤品中具有一定的市场应用价值。另外,本发明提供的多肽OA‑SR易合成,成本低,易于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种具有抑制黑色素生成活性的多肽OA-SR及其应用。
背景技术
黑色素是由表皮黑色素细胞合成的一组天然色素。人类的皮肤、眼睛和头发的颜色依赖于黑色素的产生,取决于黑色素的数量、质量和分布情况。黑色素在保护皮肤免受紫外线辐射和各种环境污染物的氧化应激方面发挥着巨大的作用。尽管如此,过度活跃的黑色素生成和在身体不同部位的长久积累会导致大量严重的皮肤问题,最常见的为色素沉着、黄褐斑、日光性雀斑等。肤色的异常变化会导致严重的皮肤美容问题,并对生活质量产生负面影响。
在不同的亚洲文化中,白皙的肤色一直为人所追求。特别是在中国、韩国和日本市场的推动下,各大护肤品公司对皮肤美白产品的投资每年都在增加。预计到2027年,全球美白产品市场的价值份额将达到123亿美元。目前用于皮肤美白的产品种类繁多,大多是通过抑制黑色素细胞成熟或干扰黑素生成过程来淡化肤色,如皮质类固醇、氢醌(HQ)、氨基汞和熊果苷(Arb)等,然而关于它们的副作用也均有报道,如刺激性、高毒性和敏感性。此外,当下对潜在的天然美白剂的研究还没有引起足够的关注,相关报道较少。因此,迫切需要研究和开发新型天然美白剂,使其在减少色素沉着的同时,又可以避免对正常黑色素细胞造成细胞毒性,为广大消费者和皮肤病患者提供更多选择。
黑色素生成涉及一系列复杂的酶和化学催化反应。黑色素细胞产生两种类型黑色素:真黑素(棕黑色)和褐黑素(红黄色),多巴醌(DQ)是两者的关键底物。而在L-酪氨酸/ L-二羟基苯丙氨酸(L-dopa)氧化成DQ的过程中,酪氨酸酶(TYR)不仅是关键的催化酶,更发挥着重要的限速酶作用。TYR是一种I型膜糖蛋白,以四聚体形式结合两个Cu2+来发挥其生物功能,分子量128±6.4 kDa,亚基分子量32 kDa,定位于黑色素小体膜上。TYR可将L-Dopa氧化为DQ,DQ发生自氧化转变为多巴与多巴色素,多巴色素的产物5,6-二羟基吲哚羧酸与5,6-二羟基吲哚进一步被氧化成真黑素。在半胱氨酸或谷胱甘肽的作用下,DQ还可形成半胱氨酰多巴进而合成褐黑素,真黑素和褐色素最终形成混合色素。因此,对TYR活性进行调节是调控黑色素生成的关键所在。
与小分子化合物药物相比,多肽类药物表现出活性更强、毒性更小,安全性更高、开发的成功率高、靶向性更强等特点。此外,多肽类药物的研发具有广阔的商业市场,已逐渐成为药物开发领域不容忽视的“潜力股”。两栖动物来源的活性肽在促组织再生药物研发领域崭露头角,有望成为新型促再生药物先导分子的重要来源之一,但相关报道较少,仍处于起步阶段。
本发明旨在提供一种具有抑制黑色素生成活性的多肽。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种多肽OA-SR,本发明的另一目的是提供所述多肽OA-SR的应用。
本发明的第一目的是这样实现的,一种多肽OA-SR,其氨基酸序列为SRVVKCIGFDQGRLTPEGLVNKINLDWKSSDVEYYLAEC,如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二目的是这样实现的,所述多肽OA-SR的应用为在制备黑色素生成抑制剂、皮肤美白剂及美白护肤品中的应用。
本发明的有益效果为:本发明提供了一种具有39个氨基酸新的新的多肽OA-SR,该多肽OA-SR具有优异的抑制黑色素生成活性,在制备皮肤美白剂及美白护肤品中具有一定的市场应用价值。另外,本发明提供的多肽OA-SR易合成,成本低,易于推广应用。
附图说明
图1为本发明多肽OA-SR的一级结构图;
图2为本发明多肽OA-SR的TYR直接抑制活性图;
图3为本发明多肽OA-SR对B16细胞的活力影响及B16细胞中TYR活性变化图,其中,图3A为多肽OA-SR对B16细胞的活力影响量化图,图3B为Arb对B16细胞TYR活性影响量化图,图3C为多肽OA-SR对B16细胞TYR活性影响量化图;
图4为本发明多肽OA-SR对B16细胞黑色素含量影响的作用图,图4A为OA-SR作用于B16细胞的黑色素含量变化表观图,图4B为Arb作用于B16细胞的黑色素含量变化量化图,图4C为OA-SR作用于B16细胞的黑色素含量变化量化图;
图5为本发明多肽OA-SR对紫外线B段(UVB)诱导的C57B/6小鼠耳皮色素沉着模型的皮肤美白效果表观图与耳部组织切片黑色素染色图;其中第一行图片为多肽OA-SR对UVB诱导的C57B/6小鼠耳皮色素沉着模型的皮肤美白效果表观图,第二至四行图片为C57B/6小鼠耳部组织切片黑色素染色图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变换或改进,均落入本发明的保护范围。
本发明一种多肽OA-SR,其氨基酸序列为SRVVKCIGFDQGRLTPEGLVNKINLDWKSSDVEYYLAEC,如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了所述多肽OA-SR在制备黑色素生成抑制剂中的应用,所述黑色素生成抑制剂可用于预防、改善或者治疗皮肤的色素沉淀的症状。
本发明另外提供了所述多肽OA-SR作为主要活性物质或活性物质之一在制备皮肤美白剂中的应用。
所述皮肤美白剂还含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
本发明进一步提供了所述多肽OA-SR在制备美白护肤品中的应用。
所述美白护肤品为护肤霜、防晒霜、乳液、精华、爽肤水、洗面奶、面膜或沐浴露。
实施例1多肽OA-SR的筛选及合成
第一步:将成体云南臭蛙(来自中国云南省)饲养在一个 21 cm ×21 cm ×15 cm的饲养缸中 7 天以适应环境,定期换水并以面包虫作为饲料喂食。再用去离子水冲洗云南臭蛙皮肤后,通过捣毁脑髓的方式快速处死并获取其皮肤。
第二步:云南臭蛙cDNA文库的构建:将获取的皮肤组织使用总RNA提取试剂盒(TIANGEN, 中国)提取皮肤组织中的RNA,提取完成后将RNA分子逆转为cDNA分子,建立云南臭蛙皮肤组织来源的多肽cDNA文库。
第三步:为筛选编码成熟Nigrocin-OA27的cDNA,聚合酶链反应(PCR)模板来自以SMART技术合成的cDNA以及BGI公司(中国)合成的5'PCR引物(5'-CCAAA(G/C)ATGTTCACC(T/A)TGAAGAA-3')和3'PCR引物(5'ATTCAGGCCGAGGCC GACA TG-3')。获取的PCR产物被克隆到大肠杆菌DH5a活性细胞中,并使用Applied Biosystems DNA测序仪(美国加利福尼亚州福斯特市ABI 3730XL)进行DNA测序,结果如图1所示,cDNA序列全长258 bp (含有258个碱基),编码86个氨基酸残基,成熟肽序列为“SRVVKCIGFDQGRLTPEGLVNKINLDWKSSDVEYYLAEC”(图1中碱基序列下划线部分)。经检索,该肽是一种新肽,将其命名为OA-SR。
该多肽OA-SR由武汉百意欣生物技术有限公司合成。
实施例2 多肽OA-SR活性检测
1、TYR直接抑制活性检测
反应体系适应于96孔板,最终体积为200 μL。每孔含TYR (200 U/mL) 50 μL; L-dopa (1 mg/mL) 50 μL;不同浓度的OA-SR (20 μM-200 μM) 100 μL,所有试剂均溶于PBS中。96孔板在37℃孵育20 min。使用分光光度计在475 nm处测量吸光值。使用GraphPadPrism 8.0软件计算IC50值并绘制浓度反应曲线,Arb作为阳性对照。
结果:从图2可知,多肽OA-SR对TYR的直接活性作用强于Arb,且作用时间更持久。120 min时,多肽OA-SR对TYR的直接抑制活性强度约为Arb的1.5倍。
2、多肽OA-SR对B16细胞活力影响及TYR抑制活性检测
2.1小鼠黑色素瘤细胞(B16)在含10 %胎牛血清(FBS)和1 %青霉素/链霉素(PS)的DMEM培养基中培养。所有细胞均置于37℃恒温,5 % CO2的加湿培养箱中培养。采用MTS法检测细胞活力。取对数生长期的B16细胞使用胰酶消化后离心,DMEM培养基重悬细胞并使用血球计数板计数,以4000个/每孔的密度接种于96孔板中,每孔加入180 μL细胞悬液。待24小时细胞贴壁后,加入20 μL不同浓度的多肽OA-SR/阴性对照(ddH2O),每组3个平行,继续培养72小时后加入MTS染液20 μL,再继续培养4小时,使用分光光度计于490 nm处测量每孔吸光值。
结果:如图3A所示,多肽OA-SR在1 nM-100μM浓度范围内对B16细胞活力无显著影响。
2.2 B16细胞按5×104个/每孔的密度接种于6孔板,使用含10 %FBS的DMEM培养基中培养24小时,待细胞完全贴壁后,更换基础培养基(不含FBS)并加入5 μM、10 μM、20 μM的多肽OA-SR或Arb共孵育72小时。PBS清洗细胞3遍后,用含1 % Triton X-100的0.1 M磷酸钠缓冲液(pH 6.8)裂解细胞。收集裂解液后于4 ℃,12 000 rpm下离心20 min。取上清液按100 μL/每孔体积加入96孔板,再加入100 μL L-dopa(1 mg/mL)。将96孔板在37 ℃孵育1小时后,使用分光光度计测定475 nm处的吸光值。
结果如图3B和3C所示:在5 μM、10 μM和20 μM浓度下,OA-SR抑制TYR活性且作用效果比Arb更为显著。Arb和OA-SR在20 μM时对B16细胞中TYR的活性抑制率分别为22.0±0.9%和34.7±0.7 %。
3、OA-SR对B16细胞黑色素含量抑制活性检测
3.1 B16细胞按5×104个/每孔的密度接种于6孔板,使用含10 %FBS的DMEM培养基中培养24小时,待细胞完全贴壁后,更换基础培养基(不含FBS)并加入5 μM、10 μM、20 μM的多肽OA-SR或Arb共孵育72小时。每个孔用PBS洗3遍,然后用4 %的甲醛溶液固定细胞20min。用去离子水冲洗3遍后,用显微镜观察并拍照,观察各组B16细胞黑色素含量。
结果:图4A显示,多肽OA-SR可以显著抑制B16细胞的黑色素含量,且在20 μM浓度下效果最为明显。
3.2 B16细胞按5×104个/每孔的密度接种于6孔板,使用含10 %FBS的DMEM培养基中培养24小时,待细胞完全贴壁后,更换基础培养基(不含FBS)并加入5 μM、10 μM、20 μM的多肽OA-SR或Arb共孵育72小时。每个孔用PBS洗3遍,使用胰酶消化后离心收集于离心管中,细胞计数调整每管细胞个数相同,加入500 μL 1M NaOH,37℃避光过夜后,使用分光光度计在475 nm处测量吸光值。ddH2O作为空白对照,Arb作为阳性对照。每组3个平行。黑色素相对含量(%)=样本吸光值/空白吸光值×100%。
结果:在相同浓度下,多肽OA-SR对黑色素合成的抑制效果优于Arb(图4B和C),在20 μM浓度下,多肽OA-SR对B16细胞黑色素合成的抑制率为38.3±0.8 %,远高于Arb的抑制率17.9±0.8 %。
4、多肽OA-SR对UVB诱导C57B/6小鼠耳部色素沉着的美白作用
将小鼠随机分为5组(Control组、Model组、丙二醇(PG)组、Arb组与OA-SR组)。除Control组外,其他各组小鼠的耳朵均使用UVB灯进行辐射。每次UVB总剂量为100 mJ/cm2。使用UVB辐射计监测辐射强度。UVB照射每周5次,共2周。使用PG作为溶剂混合1 mM Arb或OA-SR,每次照射前3小时按分组名称对应进行局部涂抹(每只耳朵10 μL)以确保完全吸收,Model组不涂抹任何试剂。最后一次照射后3天,使用异氟烷过量麻醉并处死所有小鼠,切除两侧耳朵并进行进行病理组织学分析。
结果:如图5所示,Model组和PG组小鼠在UVB辐射14天后耳部皮肤出现明显黑色素沉着,而使用OA-SR可显著抑制UVB诱导的C57B/6小鼠耳部皮肤黑色素的沉积。
结论:本发明提供的活性肽OA-SR具有优异的TYR抑制活性和抗黑色素生成活性,同时可以抑制UVB诱导的C57B/6小鼠耳部皮肤黑色素的沉积,具有开发成新型皮肤美白剂的前景。
Claims (6)
1.一种多肽OA-SR,其氨基酸序列为SRVVKCIGFDQGRLTPEGLVNKINLDWKSSDVEYYLAEC。
2.权利要求1所述多肽OA-SR在制备黑色素生成抑制剂中的应用,其特征在于,所述黑色素生成抑制剂可用于预防、改善或者治疗皮肤的色素沉淀的症状。
3.权利要求1所述多肽OA-SR作为主要活性物质或活性物质之一在制备皮肤美白剂中的应用。
4.根据权利要求3所述应用,其特征在于,所述皮肤美白剂还含有一种或至少两种药学上可以接受的载体。
5.权利要求1所述多肽OA-SR在制备美白护肤品中的应用。
6.根据根据权利要求5所述应用,其特征在于,所述美白护肤品为护肤霜、防晒霜、乳液、精华、爽肤水、洗面奶、面膜或沐浴露。
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